（遗传学专业论文）人类丝氨酸苏氨酸激酶aik与细胞周期调控的关系探讨.pdf

摘要 肝癌是我国人群中高发的一类恶性肿瘤，寻找和鉴定肝癌相关基因并研 究它们的生物学功能，将有助于揭示肝癌的发生机制，a i k 2 ( a u r o r a i p l l d 激 酶2 ) 是我室在1 9 9 8 年克隆的一个丝氨酸苏氨酸激酶基因，新近的研究表明 它可能与细胞有丝分裂及肿瘤的发生过程有关。本研宄拟对a i k 2 和它的另两 个同源基因a i k l 和a i k 3 的功能进行研究。由于肿瘤恶性增殖过程中细胞周 期处于失控状态，为了探讨a i k 与肝癌发生过程的关系，我们首先用半定量 r t p c r 的方法检测了4 0 例肝癌组织标本中a i k 基因表达的丰度，结果发现 a i k 3 在多数肝癌标本中的表达没有显著变化，但a i k l 、a i k 2 分别在多数癌组 织中显著上调表达。这与脱往在其它癌组织中的表达变化检测结果相似，这 对关于a i k l 和a i k 2 属于原癌基因的观点给予了进一步支持。 为探讨a i k 激酶在肝癌中上调表达在细胞周期中的作用，首先需要再清 它们在细胞信号传递网络中所处的位置及相应的级联关系。为此，我们用a i k 2 作为诱饵用酵母双杂交方法筛选了它的互作蛋白，结果发现r a c k l ( 活性p k c d i i 结合蛋白) 、c d c 2 0 ( 细胞周期调控蛋白2 0 ) 、r c l ( c m y c 相关蛋白) 、i - i c 8 l 蛋白酶体蛋白8 ) 和c i b ( 钙离子、整合素结合蛋白) 几种蛋白能与其互作。 其中c d c 2 9 是一个已知的a i k 互作蛋白。它们二者互作可直接影响细胞g 2 m 期有丝分裂过程。经p u l ld o w n 和免疫共沉淀方法鉴定，确定r a c k l 、r c l 和h c 8 是新发现的a i k 2 互作蛋白，由于r a c k i 是一个与c d c 2 0 结构类似 的蛋白，我们对其与a i k 互作的生物学意义作了进一步研究。 r a c k l 是一个功能广泛的结合蛋白，能与细胞内多种蛋白相互作用，我 们用免疫共沉淀的方法研究了r a c k i 与a i k 2 的作用位点，结果发现a i k 2 的催 化区可以与r a c k l 的w d 5 一w d 6 区互相结合。已有的研究表明r a c k l 能与 活性p k cd i i 结合并对其在亚细胞水平的特异性定位起关键作用。我们推测p k c di i 有可能参与调控a i k 2 的激酶活性，并通过这条信号传导通路调控有丝分裂 的胞质分裂过程。为揭示这种相互作用的生物学意义，我们通过免疫共沉淀检 测了r a c k l 与a i k 2 的活性突变体的特异结合能力，发现这种结合与a i k 2 激 酶活性没有明显相关性。但体外磷酸化试验证实p k c0i i 能磷酸化a i k 2 ，并 激活a i k 2 的激酶活性。 我们还进一步研究了a i k 2 和r a c k l 的互作对n i h 3 t 3 细胞的影响。在 用p e g f p 作为细胞选择标记的条件下，以r a c k l ，a i k 2 、r a c k l w + a i k 2 、 r a c k l m l + a i k 2 和r a c k l m 2 + a i k 2 分别转染n i h 3 t 3 细胞，流式细胞仪检 测结果表明：r a c k l 的过量表达能够抑制细胞有丝分裂，而a i k 2 的过量表 达却促进有丝分裂，二者同时过量表达时也显示为促进有丝分裂。据此，我 们推测r a c k i 可能是通过与a i k 的结合，竞争性调节c d c 2 0 与a i k 的互作， 从而间接影响细胞周期。 目前已知一个细胞有丝分裂成为两个子细胞的过程是与细胞骨架蛋白的 组装和去组装过程相并行的。a i k 除了通过与c d c 2 0 的互作而调节纺锤体的 形成和遗传物质的对等分配之外，是否也参与了细胞骨架的组装和去组装过 程呢? 迄今未见有报道。但在细胞的分裂过程中，曾分别有人观察到a i k 2 或 s e p t i n 都位于细胞有丝分裂沟的区域。因此，依据这两种蛋白质在亚细胞水平 分布的时空一致性，我们推测它们很可能在功能上有某种内在联系。于是， 我们运用酵母双杂交和免疫共沉淀的方法对这一假设进行了验证，结果竟然 如我们所预期的那样，a i k 2 与s e p t i n l 、s e p t i n 2 和s e p t i n 6 三种骨架蛋白之问 均可分别相互作用。但a i k l 和s e p t i n l 之间没有相互作用，而a i k 3 则可以和 s e p t i n l 相结合。本研冤首次发现a i k 2 与s e p t i n 之问的特异性结合，强烈提示 a i k 激酶也参与了和细胞有丝分裂过程相并行的细胞骨架蛋白的组装和去组 装过程。 这项研究为进一步阐明a i k 激酶与肝癌发生的关系提供了有价值的材料， 并且对阐明细胞有丝分裂机制提供了新的思路。 关键词：a i k 2 ，r a c k l ，酵母双杂交，免疫共沉淀，g s t p u l l d o w n 体外磷酸化，肝癌，半定量r t p c r 4 a b s t r a c t l i v m c a n c e ri sak i n d o f m a l i g n a n tt u m o r ，w i t hh i g hp r e v a l e n c ea m o n g c h i n e s e s e e k i n gl i v e r c a n c e r r e l a t e d g e n e s a n d c h a r a c t e r i z i n g t h e i r b i o l o g i c a l f u n c t i o n sw i l l h e l p t or e v e a l t h em e c h a n i s mo fl i v e r t u m o r i g e n e s i s a i k 2i s a h u m a ns e r i n e t h r e o n i n e p r o t e i nk i n a s eg e n e ，c l o n e db yo u rl a b o r a t o r yi n 19 9 8 r e c e n ts t u d i e ss h o wt h a ti tm a yh ei n v o l v e di nt h ep r o c e s so fc e l lm i t o s i sa n dl i v e r t u m o r i g e n e s i s t h e nw e t r i e dt od ot h er e s e a r c ho ft h ef u n c t i o n so fa i k 2a n dt h e o t h e rm e m b e r so ft h ef a m i l y , a i k la n da i k 3 b e c a u s et h ec e l l c y c l e i so u to f c o n t r o l d u r i n g t h e m a l i g n a n tp r o l i f e r a t i o n o ft u m o rc e l l s ，t ou n d e r s t a n dt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e na i k sa n dl i v e rt u m o r i g e n e s i s ，w ef i r s tu s e dt h et h es e m ir t p c rt os t u d yt h ee x p r e s s i o na b u n d a n c eo fh s a i k sf a m i l yi n4 0c a s e so fl i v e r t u m o rt i s s u e sw ef o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o no fa i k 3d o e sn o tc h a n g ee v i d e n t l y , w h i l et h ee x p r e s s i o no fa i k 2a n da i k lo b v i o u s l yi n c r e a s ei nm o s to ft h et u m o r t i s s u e st h i sr e s u l ti ss i m i l a rt ot h o s ef o u n di no t h e rt u m o rt i s s u e sp r e v i o u s l y f r o mt h e s e f i n d i n g s w eh a v em o r er e a s o n st ob e l i e v et h a ta i kla n da i k 2a r e o n c o g e n e 。 t ol e a r nt h ef u n c t i o n so fi n c r e a s e de x p r e s s i o no fa i k sk i n a s ei nl i v e rt u i n o r ， f i r s tw es h o u l dk n o wt h e i rp o s i t i o n si nt h ec e l i s i g n a lt r a n s d u c t i o nn e t w o r ka n d t h e irc a s c a d eo r d e r s s ow eu s e da i k 2a s ab a i t p r o t e i n t oi s o l a t e p r o t e i n s ， i n t e r a c t i n gw i t hi tb yt h ey e a s tt w o h y b r i dl e x aa s s a y t h e nw ef o u n dr a c k l ， c d c 2 0 ，r c l ，h c 8 ，a n dc i bc a ni n t e r a c tw i t ha i k 2 a m o n gt h e m ，c d c 2 0i s a k n o w np r o t e i n w h i c hh a si n t e r a c t i o n sw i t ha i k l t h e i ri n t e r a c t i o n sc a na f f e c tt h e g 2 mp h a s ed u r i n gt h ec e l l m i t o s i s b yt h e m e t h o d so fg s t - p u l ld o w na n d c o ，i m m u n o p r e c l p i t a t i o n ，w ec o n f i r m e d t h a tr a c k l ，r c l ，a n dh c 8a r en e wf o u n d p r o t e i n s ，w h i c hc a ni n t e r a c tw i t ha i k 2 i t1 si n t e r e s t i n gt h a tr a c k1h a st h es i m i l a rs t r u c t u r eo fc d c 2 0r a c k 1i sa v e r yi m p o r t a n tb i n d i n gp r o t e i n ，w h i c h h a s m a n ys i g n i f i c a n t f u n c t i o n sa n d p a r t i c i p a t e s i n m a n yp r o t e i n i n t e r a c t i o n si nt h e c e i l st h er e s u l to f c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o ni n d i c a t e dt h eb i n d i n gd o m a i n s a r et h ec a t a l y t i cd o m a i no f a i k 2a n dw d 5 一w d 6d o m a i no fr a c k l r a c k li sk n o w nt oh a v ei n t e r a c t i o n s w i t hp k c j 3 i ia n dt op l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n t h ec e l ls u b l o c a l i z a t i o no fp k c 【3 1 i w ei n f e rt h a tp k c 3 i im a yr e g u l a t et h ea c t i v a t i o no fa i k 2a n dt h e nr e g u l a t et h e p r o c e s so f c e l lm i t o s i st h r o u g ht h i sp a t h w a yt or e v e a lt h eu n i q u es i g n i f i c a n c eo f t h i si n t e r a c t i o ni nt h em i t o s i s p r o c e s s ，w et e s t e d t h eb i n d i n ga b i l i t i e so fa i k 2 m u t a t i o n st or a c k1 b yc o i m m u n o d r e c i d i t a t i o n w e1 e a r n e dt h a t t h i si n t e r a c t i o n 复且 掌博士论文 i sn o tr e l a t e dt ot h ea c t l v a n o no ta i k 2 a n dt h ei hv i t r ok i n a s ea s s a yc o n f i r m e dt h e p h o s p h o r y l a t i o no fp k c 3 1 1t oa i k 2a n di t sf u n c t i o no fa c t i v a t i n ga i k 2 f u r t h e r m o r e ，w es t u d i e dt h ee f f e c to fa i k 2a n dr a c k l si n t e r a c t i o nt ot h e g r o w t h o fn i h 3 t 3c e l ll i n e sw ec a r r i e do u tt h en i h 3 t 3c e l l s t r a n s g e n e t i c e x p e r i m e n t s o f r a c k l ，a i k 2 ，r a c k l w 十a i k 2 ，r a c k l m i + a i k 2 ，a n d r a c k1m 2 + a i k 2w i t ht h ec e l ls e l e c t i o nm a r k e ro f p e g f p t h er e s u l t so f f l o w c y - t o m e t r y s h o wt h a tt h eo v e r e x p r e s s i o n o fr a c k lc a ni n h i b i tt h ec e l l m i t o s i s ，w h i l et h eo v e re x p r e s s i o no fa i k 2c a np r o m o t et h em i t o s i s t h ec e l l m i t o s i si s p r o m o t e da g a i n ，w h e na i k 2a n dr a c k lb o t ho v e re x p r e s s i n gi nt h e c e ll s t h u s ，w es p e c u l a t et h a tr a c k 1 m a yb i n dt ot h ea i k sa n dc o m p e t i t i v e l y r e g u l a t et h eb i n d i n go f c d c 2 0a n da i k s t h r o u g ht h i sw a y , i tc a na f f e c tt h ec e l l c y c l ei n d i r e c t l y w h e nac e l ld i v i d e si n t ot w od a u g h t e rc e i l s ，t h ec y t o s k e l e t o np r o t e i n sn e e dt o b ea s s e m b l e da n dd e a s s e m b l e d a i k sc a ni n t e r a c tw i t h c d c 2 0 ，r e g u l a t et h e f o r m a t i o no fs p i n d l ea n dt h es e g r e g a t i o no fc h r o m o s o m e t h e nw ew a n tt ok n o w w h e t h e ra i k sa r ei n v o l v e di nt h e p r o c e s s o f e y t o s k e l e t o na s s e m b l y a n d d e a s s e m b l y h o w e v e r ，t h e r ea r en or e p o r t sa b o u t i tb yn o wb u td u r i n gt h ep r o c e s s o fc e l lm i t o s i s ，s o m es c i e n t i s t sf o u n dt h a ta i k sa n ds e m i nb o t ha p p e a ri n t h e r e g i o no f f i s s i o nf u r r o w t h e s et w op r o t e i n s d i s t r i b u t i o na n dc o l o c a l i z a t i o ni nt h e c e l lr e g i o ns h o wt h a tt h e yh a v es o m er e l a t i o n s h i po nt h e i rf u n c t i o n s w eu s e dt h e m e t h o d sc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o na n dy e a s tt w o h y b r i d l e x aa s s a yt ot e s to u r s u p p o s i t i o n a sw es u p p o s e d ，a i k 2c a ni n t e r a c tw i t ht h es e p t i nl ，s e p t i n 2 ，a n d s e p t i n 6 ，a l lo fw h i c ha r ec y t o s k e l e t o np r o t e i n s a i k 3c a ni n t e r a c tw i t hs e p t i n l h o w e v e r ，a i k lc a n t i n t e r a c tw i t hs e p t i n l o u rr e s e a r c hf i r s tf o u n dt h eu n i q u e i n t e r a c tb e t w e e na i k 2a n ds e p t i n i ts h o w st h a ta i k sp r o t e i nk i n a s ei s p r o b a b l y i n v o l v e di nt h e p r o c e s so fc y t o s k e l e t o na s s e m b l ya n dd e a s s e m b l yd u r i n g c e l l m y t o s i s a l lt h er e s e a r c ha b o v ep r o v i d e st h ei m p o r t a n td a t af o rf u r t h e ru n d e r s t a n d i n g o ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e na i k sp r o t e i nk i n a s ea n dl i v e rt u m o r i g e n e s i s a n d t h e s e r e s u l t sa l s oc a ns h c dl i g h to nt h eu n d e r s t a n d i n ga b o u tt h e m e c h a n i s mo fc e l l m l t o s i s k e y w o r d s ：a i k 2 ，r a c k l ，p k c p l i ，s e p t i n ，s e m i r t p c r ， y e a s tt w o h y b r i da s s a y ，c o i m m u n o p e c i p j t a t i o n ， i nv i t r ok i n a s ea s s a y 复旦大掌博士诧。文 第一章a i k 在肝癌组织中的表达变化研究 及a i k 互作蛋白的筛选和鉴定 前言 肝癌是我国人群中高发的一类恶性肿瘤，寻找和鉴定肝癌相关基固并研究它 们的生物学功能，将有助于揭示肝癌的发生机制。a i k 2 是我室在1 9 9 8 年克隆 的一个丝氨酸苏氨酸激酶基因，g e n b a n k 登录号为a f 0 15 2 5 4 。a i k 2 属于丝氨 酸体氨酸激酶a i k ( a u r o r a i p l l pk i n a s e ) 家族。 大量研究表明a i k 家族的a i k l 和a i k 2 在多种肿瘤组织和癌细胞株中过量 表达，与肿瘤的发生机制有密切联系。a i k l 基固位于染色体2 0 q 1 3 【1 1 ，这一区 域在几种人类癌细胞中出现重复或基因扩增 2 , 3 1 。a i k l 在多种癌细胞中过量表 达。异常表达的a i k l 可以转化体外培养细胞，并伴随着中4 2 体数目异常，并 与基因组不稳定有关 4 j 】。提示a i k l 激酶活性和癌症之间存在着强烈的相关 性。a i k 2 基因位于染色体1 7 p 1 3 6 ，”，也在多种人类癌细胞中表达异常 引，例如： 在异常倍性的结肠癌细胞株中a i k 2 蛋白呈高量表达f 9 j 。这两种激酶无论有否 活性，过量表达都可以导致细胞形成多倍体d o , 9 。此外，a i k l 和a i k 2 蛋白的 过量表达或低表达都可导致有丝分裂检验点的失效和细胞无法形成分裂沟。 a i k 3 基因位于染色体1 9 q 1 3 3 一t e r ”】。虽然这一区域的易位、缺失或重复出现 在多种癌组织中“】。但a i k 3 的表达和肿瘤发生之间的关系还未有定论。基 于a i k s 家族的三个基因在多种癌细胞中均上调表达 9 , 1 0 , 15 - 1 7 ，故被认为可能 是一个癌基因家族，已受到广泛的关注。 为了探讨a i k 与肝癌发生过程的关系，我们首先用半定量r t p c r 的方 法检测了4 0 例肝癌组织标本中a i k 基因表达的丰度，为阐明a i k 激酶与肝癌 发生的关系提供新的试验依据。 黑腹果蝇的a u r o r a 激酶是在多细胞生物中发现的第一个i p i lp ( i n c r e a s ei n p l o i d y1 ) 同源激酶。之后，, k 4 l 在哺乳动物细胞中也发现了相关的同源激 酶 9 , 1 0 1 6 , 17 , 】。a i k s 蛋白具有类似的蛋白激酶结构，包含一个在家族内部十分 保守的的催化结构域1 0 , 1 9 。一个很短的c 端结构域和一个长度不同的n 端结 构域。a i k s 有一个保守的磷酸化位点r x t 序列【1 9 1 人类a i k s 激晦家族的三个成员中，a i k l 分布于有丝分裂中期的中心体和 纺锤体两极，抑制其活性会诱发形成单极纺锤体，因此它对中心体分离是必 须的8 , 2 0 l 。a i k 2 在有丝分裂后期分布于细胞中间区带，在末期分布于末期细 胞盘和后有丝分裂桥，a i k 2 参与有丝分裂后期事件。a i k 3 仅在有丝分裂后 期分布于中心体，它可能起到a i k l 之后和a i k 2 之前的中介作用i t 2 1 ，t s e n g 等人证实它只在睾丸组织中表达【2 ； 。a i k s 在有丝分裂过程中的分子作用机制 目前尚未完全清楚。a i k l 所参与的激酶级联反应，a i k 2 调控胞质分裂的分子 机制，以及a i k 3 的功能也都需要进一步研究。 真核细胞的有丝分裂阶段是细胞周期的关键阶段，细胞通过有丝分裂产 生两个遗传物质完全一致的予细胞。尽管有丝分裂所需时问很短，但细胞却 要迅速完成结构重组。多数有丝分裂事件的发生都和细胞内磷酸化和去磷酸 化过程的动态平衡紧密相关 2 2 , 23 2 4 1 。当细胞进入有丝分裂时，许多蛋白的磷酸 化状态会发生急剧变化。而蛋白质的可逆磷酸化则在中心粒分离，染色体分 离，及细胞质分裂中起着主要作用( 92 0 挪l 。完成这些有丝分裂事件的是一些在 细胞周期的调控中也起着重要的调节作用的蛋白激酶【2 4 1 。a i k 2 被认为是在有 丝分裂过程中，特别是染色体分离及胞质分裂过程中起关键作用的激酶之一 ”“。人类a i k s 与酵母归t 和果蝇a u r o r a 是同源基固。来自后两个基因的研 究也表明这些激酶的功能与中心体、纺锤体两极微管，中体微管和微管的动 态曼化密切相关，在有丝分裂过程中，特别是染色体分离及胞质分裂过程中 起关键作用。 为探讨a i k 激酶在肝癌中上调表达在细胞周期中的作用，首先需要弄清 它们在细胞信号传递网络中所处的位置及相应的级联关系。为此，我们选择 l e x a 酵母双杂交系统筛选编码与a i k 2 蛋白相互作用蛋白的基因，将a i k 2 与 酵母转录激活因子d n a b d 作为诱饵蛋白x ，以人胎。g - c d n a 丈库融合a d 作为捕获蛋白y ，进行蛋白质相互作用的初步研究。结果发现了a i k 2 能与 r a c k i ，c d c 2 0 ，r c l ，h c 8 和c i b 蛋白结合， g s t p u l ld o w n 试验是一种研究蛋白质体外结合能力的有效方法，并在 分子生物学试验中得到广泛的应用。免疫共沉淀结合s d s 聚雨烯酰胺凝胶电 泳是研究真核细胞所表达外源蛋白的理想技术。应用于蛋白质相互作用研究 的独特优点是它的选择性好，灵敏度高。免疫球蛋白与相应抗原反应的特异 性很高，因此可以从蛋白质混合物中分离出抗原一抗体复合物。我们采用上 述两种方法进一步鉴定了来自酵母双杂交的实验结果，以更加充分地证买 a i k 2 及其相关蛋白之间的相互作用。应用这两项技术，我们确认出除c i b 以 外的3 个蛋白均为a i k 2 的互作蛋白。 材料与方法 一、材料 1 肝癌组织样品 4 0 例取自国内的肝癌( 病理诊断为肝细胞癌) 及相应的癌用旰组织样 品、每例不少于05 9 ，由江苏启东肝癌研究所提供。临床病理资料见表l1 。 外科手术切除肿瘤后于半小时内将标本放入液氮，数，1 、时后取出，8 0 冰 箱保存。 2 ，c d n a 文库 2 1 克隆用的人肾e d n a 文库，购白c l o n t e c h 公司：文库戡体为噬菌 体；。g t ll ，滴度为3 - 9 x 1 0 9p f u m i 。 2 2 酵母双杂交用的人胎m a t c h m a k e rl e x ac d n a 文库，购自 c l o n t e c h 公司：文库载体为p b 4 2 a d ，滴度为 1 0 8c f u m l 3 质粒载体 质粒p g e m t 载体 质粒p g a d t 7 载体 质粒p g b k t 7 载体 4 宿主茵和细胞株 大肠秆菌j m l 0 3 大肠杆菌d h 5 c 大肠杆菌x l 一1 b l u e 大肠杆菌b l 2 1 h e l a 细胞株 5 m a t c h m a k e r l e x a 酵母双杂交体系 5l 菌株 ( p r o m e g a 公司产品) ( c l o n t e c h 公司产品) ( c l o n t e c h 公司产品) ( 本室保存) ( 本室保存) ( 本室保存) ( 本室保存) ( 购自中国科学院细胞研究所) ( c l o n t e c h 公司) 9 52 载体 载体特征 京当岸鎏。墨： 米源n 参考文献 山x a吣n ( 1 - 2 0 2 ，麟州m z 瑟4 8 怒d ，。， p b 4 2 a d 8 4 2 i , 。t r p 。, 。a m 9 i “4 s t j ：! ：；：j ，g ，4 - i 5 e po p ea g uuos ：。，。】l tt o ，0 0b yr lp d 1 j 7 0 p l e x a - 5 3 a 根m p 弱c _ ，麟ll l 搿2 1 w a b u c h i e ca 1 , 1 9 9 3 u - p b 4 2 a d - t 嘉端麓卜s s 鬻知嘶l i & 等f 1 掌e l n s , 1 9 嘲9 3 山1 5 8 。 。； p 8 0 p - l a c z 妻。2 l 淼赫，躺ms 警1 6 p c r 引物( 由上海生物工程公司合成) p s h l 8 - 3 4 ： c o l e m i se la l ，1 9 9 4 e 3 7 e s t o j a ke ta 1 ，1 9 9 5 2 6 6l 构建酵母表达载体的相关引物 基因 r a c k c i b 引物名称 r a c k r a c k u p d o w n c i b u o c i bd o w n 引物序列 5 一g c g t c g a c a a t g a c t g a g c a c a t g a c c c 一3 5 一c a g g g t a c c c t a g c g t g t g c c 从t g g t g 一3 5 一g t a g a a t t c t t a t g g g g g g c t c g g g c a g 一3 5 一g c g c t c g a g t c a c a g g a c m t c t t 从a g 一3 a ik 2 一u p 5 一g t c g a a t t c t g a t g g c c c a g a a g g a g a a c 一3 aik 2 5 ，一attgaagg一3a ik 2d o w n c a g c t c g a g t c a g g c g a c a g a t t g 3 一 5 一 一 r c l r a c k l ( 1 r c l u p r c i ，一d o w n r a c k l d u p r a c k l dd o w n 5 一g c g g a a t t c g c g a g g a c a g g a c g c t g t a c 一3 5 一g a g c t c g a g t c a a g t g g t t g g g t c a g g 一3 5 一c g g g a a t t c g c g a t a a a a c c a t c a a g c 一3 5 一c a g c t c g a g c t a g c g t g t g c c a a t g g t g 一3 h c 8 一u d 5 一g g a g a t t c g t g g c a c t g g g t a t g a c c t g 一3 h c 8 5t 一兀c a t a t ，3hc8d o w ng c g c t c g a g a c a t a ti a t c a t c a t c t g - 3 ， 一 5 一r r 复旦大掌博士让丈 62 用于r t - p c r 的a i k s 相关引物： 荩冈引物名称 引物序列 lk a i k l a a ik 卜b a ik 2 一n a a i k 2 a i k 2 一n b j 一a a t c t g g a g g c a a g g t t c g a c t g 5 一t g g g a g a t a a g t g g t t a a g g a g g g a t t g c t g a c t t c g g c t g g t c t g 一3 一g a c c a t c a g g c g a c a g a 丌g a a g 一3 a i k 3 一a5 一g a a c a g c c a t c c a g a g g g t t c a g 一3 ik 3 a i k 3 - e5 一c a c a t c t a c c t g a t g a g g c c a g g 一3 63 用于免覆共沉淀载体构建的相关引物 基因引物名称 引物序列 64 用于原核表达和g s t p u l ld o w n 载体构建的相关引物 l 且大掌博士论文 65l e x a 酵母双杂交体系表达载体上的鉴定引物 载体名称引物名称 p l e x a r 0 p l e x ap l e x a a o p l e x a b 5 。b 4 2 a d p b 4 2 a d a j p b 4 2 a d b5 引物序列 一c g i c a g c a g a g c t t c a c c a t t g 一3 一a t t a g c l t g g c t g c a g g t c g a 一3 一g m a t l c g c c c g g | 3 l a t t a g c 一3 一c c a g c c t c t t g c t g a g t c g a g a t g 3 a t g g c a a g g t a t a c a a g c c g a c 一3 7 实验材料及试剂盒 7ld n a 连接试荆盒 ( p r o m e g a 公司) 72p c r 产物纯化试剂盒 ( b o e h r i n g e r 公司) 73 凝胶回收纯化试剂盒 ( b o e h r i n g e r 公司) 74 质粒抽提试剂盒( r o c h e 公司) 7 5p c r 扩增试剂盒( 上海p r o m e g a 公司) 7 6 硝酸纤维素膜( a m e r s h a m 公司) 7 7f g - * 0 性内切酶( b i o l a b s 公司，b o e h r i n g e r 公司) 7 8酵母转化试剂盒( c l o n t e c h 公司) 79 蛋白标准分子量( i n v i t r o g e n 公司和上海西巴斯生物技术开发公司) 71 0l k b l a d d e r( p r o m e g a 公刮) 71 1新生小牛血清和胎牛血清( 杭州四季青生物工程材料公司) 7l2 鼠抗c m y c 的单克隆抗体， ( c l o n t e c h 公司) 71 3 兔抗h a 多克隆抗体，( c l o n t e c h 公司) 71 4 蛋白琼脂糖珠子( c l o n t e c h 公司) 7l5 抗鼠免疫球蛋白g ( h + l ) h r p 结合物( p r o m e g a 公司) 7l6 抗免免疫球蛋白g ( h + l ) h r p 结合物 ( p r o m e g a 公司) 717e c l 显色试剂盒 ( s a n t a c r u z e 公司) 718n t n 体外转录翻译试卉1 1 盒( p r o m e g a 公司) 二、主要仪器 i p c r 扩增仪：p t c 一15 0 ，p t c 一2 0 0 2 s u p r a f u g e2 2 型告高速冷冻离心机 3t g l 16 台式离心机 4a b l3 7 7 型全自动d n a 测序电泳仪 ( m j r s e a r c h 公司) ( 德国h e r a e u s 公司) ( 上海医用仪器厂) ( p e 公司) 复且大掌博士论文 5 m o d e l 4 0 0 l 型d n a 测序电泳仪 6m o d e ls a 型d n a 测序电泳槽 7 紫外检；州义 8 电泳；中仪 9 d s 一8 0 0 型凝胶成象系统及相应配置扫描仪 三、计算机分析软件 ( g i b c ob r l 公司) ( g i b c ob r l 公司) ( 上海复生公司) ( b i o r a d 公司) ( 美国b i o r a d 公司) 1 国际n c b i ( n a t i o n a lc e n t e r f o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ) 4 言息途径 1 1 人e s t 数据库：h t t p ：w w w n c b i n l mn i hg o v p o l a s t n e s t 12 非重复数据库( n o n r e d u n d a n td a t a b a s e ) b l a s t n ：h t t p ：l w w wn c b in l m n i h g o v b l a s t n n r b l a s t p ：h t t p ：h w w w n c b in l m n i h g o v b l a s t p n r 2 核酸及蛋白质序列分析软件 3 1 o m e g a ( 瑞士日内瓦大学，v e r s i o n 4 o ) 32w i s c o n s i np a c k a g ev e r s i o n9 1 ，g e n e t i c sc o m p u t e rg r o u p ( g c g ) m a d i s o n ，w i s c 3 蛋白质结构分析软件 s m a r t v i e wh t t p ：s m a r te m b l - h e i d e l b e r gd e 四、试剂 1 常用试剂 1 1s d s p a g e 胶配方： 1 2 分离胶( 2 0 m 1 )5 浓缩胶( 1 0 m 1 ) h = 0 66 m j 68 m l 3 0 g e l8o m l l7 m l t r is - h c l5 o m t ( 15 m p h 88 ) 12 5 m i ( 1o m ，p h 68 ) 1 0 s o s02 m l 01 m 1 l o a p s02 m 1 01 m l f e m e d8 u l 1 0 u l 1 2 5 x f r i s g l y 电泳缓冲液： 15i g t r i s 碱，9 4g g l y , 5 0 m l1 0 s d s ，加水至l l 。 1 32 x s d s p a g e 上样缓冲液： 20 m 1o5 mt r l s h c 】，2 0 m l - g - , 由，2 0 m l2 0 ( w v ) s d s 复且夫掌谇士论文 o 5 m lo l ( w v ) 溴酚蓝，i 0 m l 口巯基乙醇，25 m l d d h 2 0 i 4s d s p a g e 染色液： 9 0 m i 甲醇：水( 1 ：1 ，v v ) ；1 0 m i 冰乙酸 2 5 9 考马斯亮蓝r 2 5 0 。 1 5s d s p a g e 脱色液： 9 0 m l 甲醇：水( 1 ：1 ，v v ) ：】0 m l 冰乙酸。 1 6 丽春红染色液