（遗传学专业论文）黑腹果蝇种组cuznsod和mnsod基因的进化和分子系统学研究.pdf

摘要 黑腹果蝇种组隶属于果蝇属( d r o s o p h i l ag e n u s ) 、水果蝇亚属( s o p h o p h o r a s u b g e n u s ) ，至少包括1 8 0 余种，按形态特征归为1 2 个种亚组。到目前为止，已经有很 多基于形态学，地理生物学和分子生物学的研究对黑腹果蝇种组的系统关系进行了广泛 的探讨，但是由于缺少足够多的种的系统发育信息，它的分类和系统发生关系仍然存在 很多争议。 通过p c r 扩增和克隆测序的方法获得了黑腹果蝇种组2 0 个c u ，z n s o d 基因序列和 2 4 个m n s o d 基因的序列，分子进化分析结果表明这两个基因的编码区段高度保守， 明显表现出受到纯化选择的痕迹，其超高的蛐比值及g c l l i 含量都充分显示如此。 而这两个基因的内含子区存在明显的插入和缺失，包含有丰富的进化信息。 以拟暗果蝇( d r o s o p h i l ap s e u d o o b s c u r a ) 为外群，基于c u ，z n s o d 基因和m n s o d 基因的序列，以及两个基因的联合序列，运用邻接法、最大似然法和贝叶斯法三种方法 重建了m e l a n o g a s t e r 种组的系统进化树，对其系统发育关系进行了分析，并利用b o o t s t r a p 对分析结果进行了置信度检验。研究结果表明黑腹果蝇种组明显的聚集为三大系谱： ( 1 ) a n a n a s s a e 亚种组；( 2 ) m o n t i u m 亚种组( 3 ) m e l a n o g a s t e r 亚种组和所谓的东亚亚种组 s u z u k i i ，e l e g a n s ，f i c u s p h i i a ，e u g r a c i l i s 和t a k a h a s h i i 组成独立的第三枝。m e i a n o g a s t e r 亚 种组和东亚亚种组之间的进化关系令人迷惑，几种树的拓扑结构均有所差异。另外 m e l a n o g a s t e r 复合种中，d s i m u l a n s 和d s e c h e l l i a 亲缘关系最近。 关键词：系统发育；m e l a n o g a s t e r 种组；c u ，z n s o d 慕因；m n s o d 基因；分子进化 a b s t r a c t d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u ps u b j e c t s t og e n u sd r o s o p h i l a ，s u b g e n u s s o p h o p h o r a ，i n c l u d i n gm o r et h a n1 8 0s p e c i e s ，m o s to fw h i c hh a v eb e e nc l a s s i f i e di n t o l 2 s u b g r o u p sb a s e do nm o r p h o l o g i cc ：h a f a c t e r s s e v e r a ls t u d i e sh a v eb e e nd o n eb a s e do n m o r p h o l o g y ，b i o g e o g r a p h ya n dm o l e c u l a rb i o l o g yc h a r a c t e r sb yf a r ，b u ti t st a x o n o m ya n d p h y l o g e n yr e m a i n sc o n t r o v e r s i a l ，d u e t ot h el a c ko fk n o w l e d g eo ft h ep h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p so ft h es p e c i e s b yp c ra n dc l o n es e q u e n c i n gm e t h o d sw ea c q u i r e d2 0n u c l e o t i d es e q u e n c e so f c u ，z n s o dg e n ea n d2 4n u c l e o t i d es e q u e n c e so fm n - s o dg e n eo f ，”e 肠，l d g 口s 纪，s p e c i e s g r o u p m o l e c u l e re v o l u t i o nr e s u l t ss h o wt h ec o d i n gr e g i o n so ft h et w og e n e sa r eh i g h l y c o n s e r v e d t h ee v i d e n c e sf r o mh i 曲r a t i o so fk s k aa n dg c i i ic o n t e n t ss h o wt h a tt h ec o d i n g r e g i o n su n d e r g o e sp u r i f i c a t i o ns e l e c t i o n d e l e t i o n i n s e r t i o ns e g m e n t sa r ea l lo b s e r v e di nt h e i n t r o n so ft h et w og e n e s ，t h i sr e g i o ni n c l u d e sa b u n d a n ti n f o r r n a t i o n so ft h ep h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p so ft h es p e c i e s d r o s o p h i l ap s e u d o o b s c u r aw a ss e l e c t e d a st h e o u t g r o u p ，p h y l o g e n e t i c t r e e sa r c c o n s t r u c t e db a s e do nt h e s e q u e n c e d a t ao fc u ，z n - s o da n dm n s o d g e n e sw i t h n e i g h b o u r - j o i n i n g ( n i ) ，m a x i m u ml i k e l i h o o d ( m l ) a n db a y e s i a nm e t h o d s u p p o r t i n gv a l u e s w e r ec a l c u l a t e db yb o o t s t r a p t h er e s u l ts h o w st h a tm e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u pc l u s t e r e di n t h r e em a i nl i n e a g e s ：( 1 ) a n a n a s s a es u b g r o u p ；( 2 ) m o n t i u ms u b g r o u p ；0 ) m e l a n g a s t e r - s u z u k i i e l e g a n s - f i c u s p h i l a e u g r a c i l i s - t a k a h a s h i i t h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h em e l a n g a s t e r - s u z u k i i - e l e g a n s - f i c u s p h i l a e u g r a c i l i s - t a k a h a s i i l 豇l i n e a g e sa r eu n c l e a r ；i nt h e 掰e 肠聍肛s 把，s u b g r o u p ， d s i m u l a n sa n dd s e c h e l l i aa r ct h em o s tc l o s e l yr e l a t e ds p e c i e s k e yw o r d s ：p h y l o g e n y ；m e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u p ；c u ，z n s o dg e n e ；m n - s o dg e n e ； m o l e c u l a re v o l u t i o n 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名： 李压莉 日期：翮年多月，二日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子舨，并提供目录检索与阅览服务：学校可以允 许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名： 李六莉 指导教师签名： 日期：汐硒6 、i 日期：硝j f ，“ 刖磊 月i j旨 生命起源、物质起源、宇宙起源和脑力起源是当今世界四大科学前沿课题。在生命 起源中，核酸与蛋白质的起源问题、遗传密码起源及中性选择又为其中的几个最关键问 题。分子进化的研究将进一步阐明物种进化的分子基础，探索基因起源机制。1 9 9 9 年中 国科学院科学发展报告将生物信息与分子进化研究列为生命科学研究中的重要领域。 张春霆院士在2 0 0 0 年谈及生物信息学的现状与展望时也将分子进化和比较基因组学列 为生物信息学最重要的课题之一。他指出早期的工作主要是利用不同物种中同一种基因 序列的异同来研究生物的进化，构建进化树。这项工作既可以用d n a 序列也可以用其 编码的氨基酸序列来做，甚至于可通过相关蛋白质的结构比对来研究分子进化( 张春霆， 2 0 0 0 ) 。在生物信息学体系和工具建成之后，分子进化研究已经成为演化分子生物学的 一个热点。近年来由于较多模式生物基因组测序任务的完成，为从整个基因组的角度来 研究分子进化提供了条件。 1 分子系统学概述 1 1 分子系统学的定义 分子系统学( m o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ) 是检测、描述并解释生物在分子水平的多样j 生及 其演化规律的学科。它的研究对象是生物体内的各类分子，借助于生化方法及分子生物 学方法，通过比较不同种、种群、个体的某一种或某一类分子在质和量上的差异，再根 据一定的假设来推测这种分子的进化关系( 分子进化树) ，进而推论生物类群间的演化关 系( 系统发育树) 。 1 2 分子系统学的研究方法( d n a 水平) i 间接测序法 ( 1 ) 限制性内切酶片段长度多态性技术( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ， r f l p ) r f l p 是8 0 年代中期发展起来的一种d n a 多态分析技术，它将目标d n a 序列经 定数目和种类的限制性内切酶( 1 迮) 进行酶切，由于不同的目标d n a 的序列结构( 遗传 信息) 有差异，r e 在其上的识别位点的数目和距离就发生了改变，因而产生相当多的大 小不等的d n a 片段。然后通过s o u t h e r n 杂交可以把与被标记d n a 相关的片段检测出 来，从而构建出多态性图谱( 较简单的靶序列，如m t d n a 可以省却杂交直接用电泳方法 检测) ，进行系统进化和亲缘关系的分析。 湖北大学硕士学位论文 r f l p 分析数据多态信息量大，结果稳定可靠，重复性好，不受环境及物种发育阶 段影响，呈盂德尔遗传，可以有效区分纯合子和杂合子，而且非等位的r f l p 标记不存 在上位效应，只要有探针就可检测出不同物种或个体的同源d n a 分子的r f l p ，对于 物种间亲缘关系的研究特别有用。但r f l p 技术对样品纯度要求较高，当样品很少时要 结合应用p c r 扩增，探针的制备很费功夫，标准方法必需先构建c d n a 文库并筛选出 可用作探针d n a 序列，技术路线复杂，而且杂交中存在放射性安全问题，不宜为一般 的实验室所采用。另外，它无法检测靶序列中的重复序列区，多态性检测水平过分依赖 于所选用的r e 的种类和数目，由于不同的r e 识别位点的进化速率不同，因而，对于 不同的进化靶序列，如果选样不当就会导致分析结果出现偏差。 目前在分子系统学中用于r f l p 分析的靶序列主要是基因组d n a 和线粒体 d n a ( m t d n a ) ，其中m t d n a 是系统进化研究的个强有力的工具。尤其是动物线粒体， 因为它的碱基替换速率相对较快，而且高效的单倍体遗传和母系遗传方式减小了检测时 的有效种群大d 、( e f f e c t i v ep o p u l a t i o ns i z e ) ，提高了遗传漂变的敏感性，是目前分子系统 学上最佳的靶序列，主要用于研究种群的系统发生及群体间亲缘关系，并在许多物种中 得到广泛应用。 ( 2 ) 微卫星d n a 指纹图谱技术 微卫星d n a 也称简单串联重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) ，在所有真核生 物基因组中随机分布，由于重复次数和程度的不同使所在的基因座位呈现一定的多态 性。微卫星d n a 的重复在基因组的进化中起着非常重要的作用，因而，被认为是遗传 信息含量最高的遗传标记，并日益成为基因组分析和分子进化最普遍的工具。在分子系 统学研究中，可以利用某个微卫星d n a 两端的保守序列设计一对特异引物，通过p c r 扩增这个位点的微卫星序列，然后用探针如( g a g a ) 4 等寡核苷探针杂交检测微卫星d n a 的变异。 微卫星d n a 在基因组中多态性高，并且等位基因数目多，呈等显性遗传，其指纹 图谱有极高的多态性，结果稳定可靠，重复性好，适用于任何真核生物的系统进化研究。 但是，微卫星座位突变几率高，对变异反应极其灵敏，所以易受到趋同变异引起的平行 演化程度的影响，从而给物种间亲缘关系的评估带来误差；此外，这一技术耗时较长， 花费较大，并存在着放射性安全的问题，而且只能检测那些已知序列的微卫星d n a 。由 于微卫星d n a 具有许多等价基因并且表现高度的杂合性，在用其对人类、兽类和昆虫 进行种群间遗传测量时，都表现了高度的有效性，李云海等用此技术成功地检测了中国 2 前言 主要杂交水稻亲本间的遗传差异。在用蛋白电泳检测大熊猫( a i l u r o p o d om e l a n o l e u c a ) 的 遗传多样性时，得出遗传多样性贫乏的结论，而用微卫星d n a 指纹技术检测时，却发 现了极高的多态性。微卫星d n a 多态性在分析物种进化和系统发生、生物种群内遗传 变异以及种群问关系等方面均有重要意义。 ( 3 ) 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l i m o r p h i cd n a ，r a e d ) r a p d 技术是9 0 年代发展起来的建立在p c r 技术基础上的一种分子标记手段。它 利用一系列不同的随机排列的1 0 个碱基组成的寡核苷酸单链为引物，以生物的基因组 d n a 为模板进行p c r ( 与常规p c r 相比，退火温度较低，一般为3 6 c ) 扩增，当模板上 有引物的结合位点，并且一定范围内有与引物互补的反向重复序列时，此范围内的d n a 片段就可以被扩增出。r a p d 带的多态性是由引物与模板的结合位点数及可扩增区域片 段的长度决定的，基因组的遗传变异通过琼脂糖凝胶电泳检测r a p d 产物的多态性获 得。 r a p d 分析可在所有生物的基因组中进行，所需模板量少，并由于低温退火而在一 定程度上提高了检出分辨率，能够方便、快速地检出不同个体间大量的遗传差异i 增加 引物种类数还可以增加遗传变异检出率；它能检出r f l p 技术所不能检出的重复顺序区， 事先未知研究对象的任何遗传背景，可以提供大量位点上的非细节信息。另外，实验程 序简单灵敏，安全快速，花费不高，具有良好的可操作性和实用性。但是，r a p d 标记 为显性标记，不能有效地鉴定出杂合子，结果分析中的序列同源假设( 长度相等的扩增 片段视为同源性片段 ) 可能会高估不同样本间的亲缘关系：此外r a p d 还极易受反应条 件的影响，不同实验室和不同实验条件下的结果难以统一，而且r a p d 的单带有可能是 多个分子的混合物，这是r a p d 技术目前在应用上存在争议的原因。在分子系统学中， r a p d 方法已广泛应用于种群间系统亲缘关系、分类和系统发生等方面的研究，并表现 了一定的优越性。k r e m e r 用r a p d 对两种存在形态差别的栎树( q u e r c u s r o b u r 和 q p e t r a o a ) 进行了遗传变异分析，结果在4 5 个引物中有7 个在二者之间表现出现明显 的差异，这7 个引物所鉴别的3 6 条片段里，有1 4 个出现频率差异，而利用叶绿体 d n a ( c p d n a ) 和等位酶分析则无法在基因水平上找出两种树有差异的证据。可见，r a p d 能检测出等位酶和细胞器d n a 所不能检测出的遗传变异。 由于r a p d 技术本身存在的一些弱点，有人认为r a p d 技术在应用于种间乃至近 缘属之间亲缘关系的研究时有一定的局限性。对于r a p d 结果统计中弱带的取舍问题， 姚鸿等认为，当所分析的材料差异足够大，扩增产物数目足够多时，可以只分析主带； 3 湖北大学硕士学位论文 而汪小全等则认为，产物条带重复性的好坏才是最重要的取舍标准。解决p a p d 结果不 稳性的方法之一是采用序列特异性扩增区域( s e q u e n cc h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ， s c a r ) 技术，目前r a p d 技术还有待于进一步完善。 ( 4 ) 扩增片段长度多态性技术( a m p i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) a f l p 是r f l p 与p c r 技术相结合产生的迄今最为有效的分子标记。靶d n a 经可 产生黏性末端的r e 酶切，产生的片段被连接上通用接头( a d a p t e r ) ，连接产物作为p c r 扩增的模板，引物是在接头互补顺序和r e 识别位点的基础上增加1 3 个选择性核苷酸 设计而成的，这样，只有那些与引物的选择性碱基严格配对的酶切片段才被扩增出，通 过调整引物3 端选择碱基的数目可获得丰富的多态性，典型的a f l p 实验一次可获得 5 0 - - 一，1 0 0 条谱带。v o s 进行1 0 x 1 0 6 次的实验，充分证实了这项技术的可靠性。 a f l p 技术既有r a p d 技术的多态性，又有r f l p 技术的稳定性和可靠性，灵敏度 高，它所检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段间d n a 序列的变异，本质上与 r f l p 一致，不过，它可以通过控制引物随机苷酸的种类和数目来控制选择不同的d n a 片段及扩增片段的数目。a f l p 能检测到大量的基因位点，选用不同的引物组合能够检 出亲缘关系很近的品种的d n a 样品间极细微的差别，p a g e 的应用加强了它的灵敏性。 对于较复杂的基因组，还可以通过两步扩增法来提高指纹图谱的特异性和清晰度。但是， a f l p 技术是一项专利技术，目前分析试剂盒价格昂贵，引物的同位素标记又涉及到放 射性安全问题，此外，基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以对内切酶的质量要求 较高，这些都使它目前的应用带有一定的局限性。a f l p 技术用途广泛，已用于系统发 育、分类和品种间亲缘关系研究，陈洪等利用它构建了8 种疾病性念珠菌的指纹图谱， 多态性丰富，重复性好。a f l p 比r f l p 技术要灵敏得多，在r f l p 多态性很差的大麦 中进行a f l p 分析，只有1 6 个引物就定位出了1 1 8 个位点，这显示了它极高的灵敏性 和多态检出率。由于a f l p 技术的高效性和可靠性，尽管昂贵，仍然被不少学者应用于 系统学研究( 徐宏法等，2 0 0 1 ) 。 ( 5 ) 染色体原位杂交( c h r o m e o s o m ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 染色体原位杂交是细胞学方法和分子杂交技术相结合的产物，是指利用特异性核酸 片段作探针，直接同染色体的d n a 片段杂交，在染色体上显示特异的d n a 或r n a 。 最初是采用同位素标记探针：杂交后通过放射性自显影显示出杂交信号。以后发展了以 非放射性大分子如生物素、地高辛等标记特异性核苷酸片段，杂交信号经酶联显色荧光 4 刖再 显示的杂交技术，特别是荧光原位杂交技术( f l u o r e s c e n c e i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 。应 用这种方法鉴定出亲缘关系远近的有双翅目的蚊子：牛玲玲等( 1 9 9 0 ) 从中华暗蚊基因库 中筛选出一特异d n a 片段，可检测任何发育时期的中华暗蚊而不与嗜人血暗蚊杂交。 直接测序法 通过测定核酸一级结构中核苷酸序列组成来比较同源分子之间相关性的方法即为 核酸序列分析方法。以前常用的d n a 测序技术是双脱氧链( d d n t p ) 终止法，由于用到放 射自显影涉及到安全问题，现在多采用荧光标记的自动测序仪，而且有供序列比较的软 件的开发和利用。近年来，随着人类基因组计划的开展，在d n a 的序列测定上发生了 一系列重大的改进，国际上最新的如杂交法、质谱法和流动式单分子荧光检测法等。 在以上的各种分子系统学方法中，不同的研究目标对分子标记技术性质的要求不一 样。在研究生物的遗传多样性时，可以从物种特征、生长发育时期特征以及已有的研究 基础出发，将几种研究方法综合使用，扬长避短。系统进化研究方法的选择取决于所设 计的系统进化尺度，种内阶元和近缘种类可通过测定快速进化的同功酶座位或m t d n a 而获得有效的研究数据；而远缘种的类群间的系统发育只能靠保守基因的序列分析，通 常选择进化速率不同的几种序列以解决类群中不同年代分支系的系统发育关系( 徐宏法 等，2 0 0 1 ) 。 1 3 分子系统学的发展历史及趋势 分子系统学( m o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ) 是- - f 综合性很强的交叉学科。生命系统从分子、 细胞、个体、群体、种、群落和生态系统的不同层次表现出多样性，低层次的多样性是 高层次多样性的基础，高层次的多样性则是低层次多样性的表现，同时每个层次的多样 性又有其自身发展的规律。其中分子层次上的多样性构成分子系统学的研究领域，具有 最基本的意义。分子系统学的理论基础来源于系统学、分类学、遗传学、比较生物化学、 分子生物学和进化论，其方法来源于免疫学、仪器分析、生物化学和分子生物学。分子 系统学以下列一些基本原理为基础：( 1 ) 生命的生化一致性和多样性原理：生化一致性 表现在所有生物都具有相似的元素组成、相同的单体构件、相似的遗传、食物利用和能 量转化功能等。生化多样性表现在组成生物体的化合物种类繁多、分子组成和结构变化 大。( 2 ) 生物大分子进化速率恒定性原理：即“分子钟假说，以年计时的生物大分子 序列的改变速率大致保持恒定，或大分子序列之间的差异程度与其分歧后独立进化的时 间成正比。( 3 ) 表信息分子的进化原理：表信息分子是基因型在分子水平上的表现型。 5 湖北大学硕士学位论文 ( 4 ) 同源比较原理：分子系统学上的同源包括直源、并源、外源、并外源和复源。 ( 5 ) 样品同质性原理：样品同质性或称样品均一性，是指一个样品是纯的生物学单位( 黄原， 1 9 9 8 ) 。 几个世纪以来，博物学家和生物学家一直都在对生物多样性进行描述和解释。这种 工程及其结果便是生物系统学( s y s t e m a t i c s ) 。生物系统学是研究生物多样性以及它们中间 的任何一个类群和其他类群的各种关系的科学。系统学的研究是建立在分类学基础之上 的，而对生物进行分类是人类认识生物世界的第一步。3 0 0 0 年前我国的甲骨文已有了许 多动植物的名称，公元前4 世纪的亚里士多德对动植物的记述，1 6 世纪李时珍的本草 纲目等等都是人类对生物分类的初步总结。1 8 世纪林奈双名法的建立为对生物多样性 描述和分类奠定了基础，由于林奈这一系统的严谨性、科学性而很快得到公认，并被进 化学家拉马克、达尔文、海克尔f h a e c k e l ) 所采用。1 8 6 0 年海克尔提出了系统发生 ( 间的亲缘关系。但早期建立起来的生物系统发生史很少有客观标准。这样直到上世纪上 半叶人们关注的焦点仍然是物种、物种形成和地理变异而不是生物发生。1 9 4 2 年赫胥里 ( j h u x l e y ) 出版的进化论的现代综合中仍未出现系统发生这个词。后来德国植物学 家齐默尔曼( w z i m m e r m a n n ) 建立了顶枝学说( t e l o m e t h e o r y ) ，德国昆虫学家亨尼希 唧h e n n i g ) 仓l j 建了分支系统学说( c l a d i s t i y s t e m a t i c s ) 。他们都是基于现存生物和生物化 石的共同特征来概括提炼出一些客观标准来重新构建生物进化史的。6 0 年代开始，新的 系统发生数据逐渐积累，计算机硬件和软件的建立，使系统发生学取得了长足的进步， 同时蛋白质和核酸分子结构检测方法得到迅猛发展，并且这些方法很快被进化学家所接 受且采用，这样就产生了一门新的学科分子系统学。分子系统学是用分子生物学的 技术和方法来研究生物多样性，以及它们之间相互关系的科学。它主要包括两大领域， 即种群遗传学( p o p u l a t i o ng e n e t i c s ) 和系统发生学( p h y l o g e n e t i c s ) ，前者主要研究种内分 化，后者主要研究物种多样性及种间系统发生( 唐伯平，1 9 9 9 ) 。分子系统学( m o l e c u l a r s y s t e m a t i c s ) 是近3 0 年发展起来的- - f - j 综合性前沿学科，它在分子水平上对生物进行遗 传多样性、分类、系统发育和进化等方面的研究，其研究结果对于保护生物多样性( 尤 其是遗传多样性) ，揭示生物进化历程及机理具有十分重要的意义( 徐宏发，2 0 0 1 ) 。目前 分子系统学主要应用于生物分类学，构建生物分子树或生物进化树。昆虫分子系统学的 研究一是根据蛋白质与酶，二是根据核酸。分子系统学的研究首先是通过现代分子生物 学技术，获得物种特定遗传标记的大量数据，然后把这些数据进行相关的数学分析而对 6 前言 研究结果进行解释和说明。目前常用的核酸分析方法有d n a 杂交、串联重复序列数目 变异、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、限制性片段长度多态性、随机扩增多态性 d n a 、测序和克隆。蛋白质分析技术中常用的方法有：免疫学技术，同工酶电泳、蛋白 质电泳、氨基酸分析等。染色体分析中常用的方法有：核型分析、带型分析、荧光原位 杂交、染色体原位隐藏杂交、引物原位标记、多( 探针) 引物原位标记等，在上述方法中 主要以核酸分析为主。特别是近几年测序技术的推广和普及，自动测序技术的发展，序 列分析技术越来越多的地被采用。核酸序列分析是指通过测定核酸序列来比较同源分子 之间的相互关系的方法。比较不同类群个体的同源的核酸的核苷酸序列，据此建立分子 系统发育树，并推断类群间的演化关系，是目前分子进化和系统发育研究的热点。数据 分析中常用的一些方法有：1 ) 简约法，这种方法旨在确定最短的系统树，对该树核苷酸 或氨基酸的替代总数应取最小值。该方法中影响较大的有最大简约法，加权简约法和进 化简约法；2 ) 距离矩阵法，此处的距离指相对替代率、遗传距离或进化距离。常见的方 法有：不加权成对群算术平均法、f i t c h m a r g o l i a s h 法、转化距离法、邻接法等；3 ) 最大 似然法，以各种假设的进化数学模型对观测结果进行检验，选出具有最大似然函数的模 型构树。常见的方法有l a n g l e y 和f i t c h 法、f e i s e n s t e i n 法等，由于分子数据由抽样获得， 所以在用某种方法获得系统树后，还要用重抽样法来检验校正，常见的方法有折刀法和 自助法。总之，在数据处理时最好用多种方法进行比较，以期获得一致的结果，提高结 果的可靠性。 以前常用的d n a 测序技术是双脱氧链( d d n t p ) 终止法，由于用到放射自显影涉及到 安全问题，现在多采用荧光标记的自动测序仪，而且有供序列比较的软件的开发和应用。 近年来，随着人类基因组计划的开展，在d n a 的序列测定上发生了一系列重大的改进， 国际上最新的如杂交法、质谱法和流动式单分子荧光检测法等。直接测定d n a 序列可 以测出所有的d n a 变异，从而获得最为准确的遗传信息，但是这一技术耗资较大，目 前d n a 样品制备技术和d n a 序列图象的获得及数据分析方法都不十分理想，序列数 据本身存在的多重替换问题、协同进化问题和序列进化速率的变异等问题以及数据分析 中的序列对准方法的不足都使得它目前的应用受到一定的影响。在分子系统学研究中， 用来进行序列测定的靶d n a 序列主要是一些进化上的高变区。如m t d n a 的细胞色素b 区，李明等( 1 9 9 9 ) 通过测定其序列对4 种鹿属动物的系统进化关系进行了研究，王义权 等( 王义权，1 9 9 9 ) 对几种游蛇的演化关系进行了分析。 进入8 0 年代后，核酸的实验操作技术和分析方法上的巨大进步导致了对d n a 和 7 湖北大学硕士学位论文 r n a 差异上的广泛研究，序列分析主要来自核d n a 和线粒体d n a 等遗传物质( 徐宏发， 2 0 0 1 ) 。随着分子系统学的发展，一些有重大意义的问题的解决必将日益紧迫。首先， 如何用恒定进化速率和进化距离来更为准确地估计分歧时间和推断进化历史，是分子进 化遗传学中的一个重要的研究课题。其次，现阶段的分子系统学研究很少把基因组进化 与表型进化联系起来，在今后的研究中，为了追踪从d n a 进化到表型进化的途径，需 要研究结构基因和它们的调控基因间的关系及变化，需要分子水平的比较解剖学和比较 胚胎学，分析蛋白质( 主要是酶) 在结构和功能上如何进化，分析它们在生化调控途径中 的组织化如何出现，以及分析它们在不同组织或不同发育阶段中的表达是如何被调控 的，从而将分子水平与形态水平的研究有机地结合起来。随着分子生物学知识和技术的 积累发展，系统学家已将生物信息大分子看作重要的演化依据，人们在不断寻找新的、 有良好检测功能的分子标记及检测手段，随着技术的不断进步，来自分子方法的数据在 不久的将来可能成为系统学研究最主要的数据来源，并将引起分类、系统、发育和进化 研究中的又一次革命性的变化，而且关于种群遗传结构方面的研究必将为保护生物学提 供遗传变异证据，在生物多样性的研究和保护中起到重要指导作用( 徐宏发，2 0 0 1 ) 。随 着分子系统学的形成和发展，它在生物多样性，特别是在动物的多样性研究中得到了广 泛的应用。分子系统树在分析物种起源与分化中应用广泛( 李明，1 9 9 7 ) ，在种内及种间 系统进化关系研究中，分子系统学是应用最广的，利用物种在分子系统树的相应位置以 及物种之间的分歧时间，来解决一些分类问题。在属的水平上应用较多，即对一些物种 进行属的归类，分子系统学在动物保护中也得到应用。总之，分子系统学的产生和发展 为生物多样性研究带来了一次突破，解决了一些颇有争议的问题。 虽然利用一小片段的分子特征构建的分子系统树可能与作为一个整体的种或种群 的系统树不相同，但是通过对有代表性的样本大小的多基因的评估，就能推出种群和近 缘种间的系统进化关系，并且随着基因序列研究的不断深入，人们获得的分子信息量大 大增加，因此在动物系统进化研究中建立使用这些遗传信息的最佳方法就变得愈益重 要，这些将无疑使分子系统学为生物多样性及系统进化研究提供一条重要途径。 2 黑腹果蝇种组( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 的分子系统学研究进展 黑腹果蝇种组隶属于果蝇属( d r o s o p h i l ag e n u s ) 、水果蝇亚属( s o p h o p h o r as u b g e n u s ) ， 目前认为至少有1 8 0 余种，按形态特征归为1 2 个种亚组，其中m o n t i u m 种亚组是晟大的 种亚组，包括了将近8 0 多个种。多年来果蝇分类学家和进化生物学家对他们的系统关系 8 前言 进行了广泛的研究。d n a 序列分析是近几年生物系统与演化研究中最重要与最热门的工 具之一。p 6 1 a n d a k i s 和s o l i g n a c ( 1 9 9 3 ) 以r d n a 为标记，将整个黑腹果蝇种组分成5 个 聚类簇：a n a n a s s a e ，m o n t i u m ，f i c u s p h i l a - e l e g a n s ，( t a k a h a s h i i s u g u m i ) 一e u g r a c i l i s 和 m e l a n o g a s t e r 。i n o m a t a 等( 1 9 9 7 ) 以a m y 多基因家族为依据，指出e u g r a c i l i s 在a n a n a s s a e 后最先分化，而其余的种亚组分成两大支，但在部分种亚组之间有相互交叉现象。c l a r k 和k i m ( 1 9 9 8 ) 通过分析p 因子得出在a n a n a s s a e ，m o n t i u m 之后，m e l a n o g s t e r ，f i c u s p h i l a ， e l e g a n s ，t a k a h a s h i i ，s u z u k i i ，e u g r a c i l i s 是同时分化的。g o t o 和k i m u r a ( 2 0 0 1 ) 综合分析了 c o 和g p d h 两个基因，认为a n a n a s s a e 最先分化，然后依次是m o n t i u m ，m e l a n o g a s t e r ， e l e g a n s ，f i c u s p h i l a 一( s u z u k i i t a k a h a s h i i ) 的分化。本实验室的杨勇( 2 0 0 4 ) 以组蛋白基因间隔 区h 2 a - h 2 b 为标记，提出了a n a n a s s a e 是在m o n t i u m 之后分化的观点，东亚7 种亚组分 成两支：s u z u k i i - m k a h a s h i i ：e u g r a c i l i s - m e l a n o g a s t e r - r h o p a l o a 一( e l e g a n s - f i c u s p h i l a ) 。k o p p 和t m e ( 2 0 0 2 ) 只对东亚7 种亚组的分化关系提出了假设，但他们综合了两个线粒体基因 ( c o1 ，n d l ) 和四个核基因( r r n a , a m y ，g p d h ，k 1 3 ) 的信息，因此相对来说，对东亚7 种亚组的系统发育关系的分析更为合理和全面。类似的分析还有k a s t a n i s ( 采用部分 m t d n a 序列为标记) 、s c h a w a r o c h ( 以c o i i , h b ，a d h 为标记) 。此外，h a r r ( 2 0 0 0 ) 用微 卫星技术对黑腹果蝇种组的进化关系进行了分析。总之，他们所得结果因所选标记不同 而各异。 虽然对黑腹果蝇种组的进化关系取得了一些共识，但是由于该种组种类繁多，系统 关系复杂，至今还有诸多问题没有解决，如其起源问题、系统关系问题等，概括起来主 要有两个大的方面： ( 1 ) 亚种组之间的分化问题： 目前公认黑腹果蝇种组分为三大谱系：a n a n a s s a e 亚种组，m o n t i u m 亚种组， m e l a n o g a s t e r 亚种组和所谓的东亚6 亚种组e l e g a n s ，t a k a h a s h i i ，e u g r a c i l i s ，r h o p a l o a ， s u z u k i i 和f i c u s p h i l a 聚集成第三谱系：大多数研究认为a n a n a s s a e 亚种组首先分化出来， 接着是m o n t i u m 亚种组，m e l a n o g a s t e r 亚种组和所谓的东亚亚种组最后分化；而本实验 室的杨勇老师( 2 0 0 4 ) 以组蛋白基因间隔区h 2 a - h 2 b 为标记，提出了a n a n a s s a e 是在 m o n t i u m 之后分化的观点。对m e l a n o g a s t e r 亚种组和所谓的东亚亚种组之间的分化关系 也存在许多争论：c l a r k 和k i m ( 1 9 9 8 ) 通过分析p 因子提出m e l a n o g a s t e r 亚种组和所谓 的东亚亚种组之间是平行进化关系；本实验室的杨勇( 2 0 0 4 ) 以组蛋白基因间隔区 h 2 a - h 2 b 为标记，提出了东亚7 种亚组分成两支：s u z u k i i t a k a h a s h i i ；和e u g r a c i l i s 9 湖北大学硕士学位论文 m e l a n o g a s t e r - r h o p a l o a ( e l e g a n s - f i c u s p h i l a ) 。本实验室的牟少亮( 2 0 0 5 ) 等人则认为e l e g a n s 亚种组是东亚亚种组中最早分化的，m e l a n o g a s t e r s u z u k i i - e u g r a c i l i s - t a k a h a s h i i 单独聚为 一支；还有的研究认为e u g r a c i l i s 亚种组是东亚亚种组中最先分化出来的( i n o m a t a e ta 1 。 1 9 9 7 ) ，类似的研究还有很多，因此黑腹果蝇种组各亚种组之间的分化问题有待于进一 步研究。 ( 2 ) 亚种组内的分化问题： 黑腹果蝇亚种组内9 个种的分化问题一直存在很多争论，a s i m u l a n s ，d m e l a n o g a s t e r ，d m a u r i t i a n a 和d s e c h e l l i a 之间的分化也有很多争议：有研究 ( c a c c o n ee ta 1 ，1 9 8 8 ) 认为d m a u r i t i a n a 和d s e c h e l l i a 亲缘关系最近的，也有研究( c a r i o u ， 1 9 8 7 ) 认为d s e c h e l l i a 和d s i m u l a 万s 亲缘关系最近，或者d s i m u l a n s 和am a u r i f i a n a 亲缘关系最近( l a c h a i s ee ta 1 ，1 9 9 8 ；k l i m a ne ta 1 ，2 0 0 0 ；t i n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 m o n t i u m 亚种组，其种类最多，系统进化关系最复杂，至今仍有很多分歧。差异主 要存在于m o n t i u m 亚种组内各复合种之间的进化关系。 分子系统学的诞生和发展为黑腹果蝇种组的分类学研究带来了又一次突破，解决了 一些有争议的问题，为黑腹果蝇种组的分子系统学研究提供了重要的基础资料。随着基 因序列研究的不断深入，越来越多的分子标记被采用，人们分析时采用的信息量也越来 越大，因此在黑腹果蝇种组的系统发育关系的研究进程中建立使用遗传信息的最佳方法 就变的愈来愈重要了，这些无疑将为分类以及分子进化研究提供一条重要途径。 3 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 的分类及分子进化研 究现状 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a