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摘要 随着转基因农作物检测技术的不断发展，p c r 技术已经成为最主要的检测方法之 一。但是常规的p c r 每次只能扩增一个基因，而单独的多重p c r 和常规电泳相结合的 技术由于受多重p c r 技术自身限制，每次扩增的基因数目也很有限，因此不能满足当 前转基因农作物检测的要求。 寡核苷酸芯片是一种在基片上点有若干寡核苷酸探针的基因芯片，每个点都含有 序列特异的探针以和感兴趣的基因相互补结合。因此，寡核苷酸芯片可以和多重p c r 技术相结合用来同时检测多种目标基因。 在这篇论文中，我们开发了多重p c r 技术和d n a 芯片技术相结合的方法，在同一 个反应中同时检测多个目标基因，以达到检测转基因农作物的目的。 我们设计了两大类芯片，其中一类用来检测样本是否是转基因农作物，另一类用 来检测样本来自于哪一种转基因品系。 对于第一类芯片，我们使用了2 0 种探针用以检测转基因农作物，按照具体功能 可以分为三种：第一种，根据一些普通元件例如启动子、终止子、报告基因等来检测 是否为转基因农作物；第二种，根据目标基因例如抗除草剂或是抗虫害基因来做特定 基因的检测确认；第三种，根据物种特异性基因来检测该样本来自于哪种作物。为保 证方法的有效性，设立不同的阳性对照和阴性对照来鉴定该实验方法，并且通过常规 p c r 反应和测序来迸一步验证。结果表明这种方法可以快速识别样本是否为转基因农 作物，并且花费少，效率提高。这种方法可以检测目前9 5 以上的转基因作物，并且 对于大豆的最低检出率是0 5 ，玉米是1 。 对于第二类芯片，根据唯一的、品系特异的宿主与插入片断间连接区域的基因序 列，通过多重p c r 和寡核昔酸芯片相结合的技术，以达到检测出样本来自于哪种转基 因品系的目的。转基因农作物商品大豆( g t s4 0 - 3 2 ) 和六种转基因玉米( m o n 8 1 0 ， m o n 8 6 3 ，b t l 7 6 ，b t l l ，g a 2 1 和t 2 5 ) 通过这种方法进行检测。结果表明对于这些转 基因大豆和玉米，该方法均可以适用。 以上两种芯片被证明是一种新的转基因农作物检测的常规方法。 关键词：转基因农作物，寡核苷酸芯片，转基因农作物检测，多重p c r ，品系特 异，连接区域序列 a b s t r a c t w i t ht h ei n c r e a s i n gd e v e l o p m e n to fg e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m ( g m o ) d e t e c t i o n t e c h n i q u e s , t h ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) t e c h n i q u eh a sb e e nt h em a i n s t a yf o r g m od e t e c t i o n a n da no l i g o n u c l e o t i d em i c r o a r r a yi sag l a s sc h i pt ot h es u r f a c eo fw h i c h a l la r r a yo fo l i g o n u c l e o t i d e sw a sf i x e da ss p o t s ，e a c hc o n t a i n i n gn u l n e l o u sc o p i e so fa s e q u e n c e s p e c i f i cp r o b et h a ti sc o m p l e m e n t a r yt oag e n eo f i n t e r e s t s oi ti su s e dt od e t e c t e d t e n so rm o r et a r g e t ss y n c h r o n o u s l y i nt h i sr e s e a r c h , w ed e v e l o p e dam u l t i p l e xp o l y m c r a s cc h a i nr e a c t i o n ( m u l t i p l e x p c 鼢 c o u p l e dw i t had n am i c r o a r r a ys y s t e ms i m u l t a n e o u s l ya i m i n ga tm a n yt a r g e t si na c o n s e c u t i v er e a c t i o nt od e t e c tag m o w ed e s i g n e dt w ot y p e sd n a m i c r o a r r a y , o n et od e t e c tw h e t h e rt h es a m p l ew a sf r o m o m o ，t h eo t h e rt od e t e c tw h i c he v e n tt h es a m p l ew a sf r o m f o rt h ef i r s tt y p e ，t h e r ea r eat o t a lo f2 0p r o b e sf o rd e t e c t i n gag m oi nad n a m i c r o a r r a yw h i c hc a nb ec l a s s i f i e di n t ot h r e ec a t e g o r i e sa c c o r d i n gt ot h e i rp u r p o s e ：t h ef i r s t f o rs c r e e n i n gg m of r o mu n - t r a n s g e n i cp l a n t sb a s e do nt h ec o m m o ne l e m e n t ss u c ha s p r o m o t e r , r e p o r t e ra n d t e r m i n a t o rg e n e s ；t h es e c o n df o rs p e c i f i cg e n ec o n f i r m a t i o nb a s e do n t h et a r g e tg e n es e q u e n c e ss u c ha sh e r b i c i d e - r e s i s t a n c eo ri n s e c t - r e s i s t a n c eg e n e s ；t h et l l i r d f o rs p e c i e s - s p e c i f i cg e n e sw h i c ht h es e q u e n c e sa r cu n i q u ef o rd i f f e r e n tp l a n ts p e c i e s t o e l l s u r et h er e l i a b i l i t yo f t h i sm e t h o d , d i f f e r e n tk i n d so f p o s i t i v ea n dn e g a t i v ec o n s o l sw e r e u s e di nd n am i c r o a r r a y c o m m e r c i a lg ms o y b e a n , m a i z e , r a p e s e e da n dc o t t o nw e r e i d e n t i f i e db ym e a n so ft h i sm e t h o da n df u r t h e rc o n f i r m e db yp c r a n a l y s i sa n ds e q u e n c i n g t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h i sm e t h o dd i s c r i m i n a t e sb e t w e e nt h eg m o s v e r yq u i c k l ya n d i na c o s t - s a v i n ga n dm o r et i m ee f t i c i e mw a y i tc a l ld e t e c tm o r et h a n9 5 o fc u r r e n t l y c o m m e r c i a lg m o p _ l a n t sa n dt h el i m i t so f d e t e c t i o n a r c0 5 f o rs o y b e a na n d1 f o rm a i z e f o rt h es e c o n dt y p e ，a ne v e n t - s p e c i f i cd e t e c t i o ns t r a t e g yb a s e do nt h eu n i q u ea n d s p e c i f i ci n t e g r a t i o nj u n c t i o ns e q u e n c e sb e t w e e nt h eh o s tp l a n tg e n o m ed n aa n dt h e i n t e g r a t e dg e n ei sb e i n gd e v e l o p e df o ri t sh j i g hs p e c i f i c i t yu s i n gm u l t i p l e x - p c rt o g e t h e r w i t ho l i g o n u c l e o t i d em i c r n a r r a y c o m m e r c i a lg m s o y b e a n ( g t s4 0 一3 - 2 ) ，s i xg m m a i z e e v e n t s ( m o n 8 1 0 ，m o n 8 6 3 ，b t l 7 6 ，b t l l ，g a 2 1 ，a n dt 2 5 ) w c r cd e t e c t e db yt h i sm e t h o d t h er e s u l t si n d i c a t et h a ti ti sas u i t a b l em e t h o df o rt h ei d e n t i f i c a t i o no ft h e s eg m s o y b e a n a n dm a i z e s t h i sm e t h o di sp r o v e dt ob ean e wm e t h o df o rr o u t i n ea n a l y s i so f o m o s k e y w o r d s ：g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m ( g m o ) ，o l i g o n u c l e o t i d em i c r o a r r a y , o m o s c r e e n i n g ，m u l t i p l e x - p c r , e v e n t - s p e c i f i c ，i n t e g r a t i o nj u n c t i o ns e q u e n c e 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的肩发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：日期 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：导师签名：日期： 复旦大学博士论文 利用生物芯片技术检测转基因农作物 、 月! j 生物技术研究概况 1 1 生物技术的定义 1 一 口 2 0 世纪最后2 0 年间，生物技术( b i o t e c h n 0 1 0 9 y ) 以前所未有的速度迅猛发展， 一批新型的生物技术产业已经或正在形成。生物技术宛如斑斓夺目的奇葩，绽放在绚 丽多彩的高科技园地。毫无疑问，生物技术将成为2 1 世纪最具发展前景的高技术领 域和国民经济的支柱产业之一。 随着现代生物技术产品越来越多地进入市场和寻常百姓家，“生物技术”、“生物 工程”、“基因工程”这些术语逐渐家喻户晓。但究竟什么是生物技术? 却很少有人能 给以清楚明白的定义。 要准确定义生物技术，先要了解组成生物技术的基本内容有哪些。一般来说，生 物技术有三个互相关联的基本要素组成： ( 一) 采用现代生命科学的基础理论和技术 生命科学涉及生物学、医学和农学等与生命有关的学科领域。其中生物学理论和 技术是现代生物技术最重要的基础。在生物学中又有遗传学、生理学、生物化学、生 物物理学、细胞生物学、分子生物学、生物信息学( b i o i n f o r m a t i c s ) 等等许多学科 和分支学科，探讨的问题从d n a 到蛋白质、从染色体到细胞、从生理现象到遗传变异、 从受精到凋亡、从个体发育到物种进化等等，可谓琳琅满目，不胜枚举。 ( 二) 应用生物材料或生物系统 开发利用的生物材料可以是微生物、植物和动物体，或者他们的器官、组织、细 胞、细胞器，或无细胞系统、酶系统等。应用生物特有的方式，在适当的条件下，经 济的制备人类所需要的生物活性物质。 ( 三) 通过一定的工程系统( 生产工艺、设备等) 获得产品或提供服务 通过工程学途径，规模化的制备市场需要的生物产品，如药品、细胞或d n a 制品、 复旦大学博士论文利用生物芯片技术检测转基因农作物 组织或器官、动植物新品种、食品、饲料、肥料、试剂、材料等等，以及提供能治疗 预防疾病、改善自然生态环境、消除环境污染等方面的服务。 由此可见，生物技术不仅仅是- - f 3 与生命科学相关的技术，还包含工艺、制备等 工程学内容，故也称其为“生物工程( b i o e n g i n e e r i n g ) ”。 应该提及，对生物技术还有两种不同的定义。一种定义认为凡使用有机体或他们 的产物开发产品的技术，都是生物技术。由此认为生物技术自古就有。如人类千百年 来的酿酒、酿醋、制酱、腌制泡菜、发面、动植物育种和良种繁殖等传统生产活动， 都可称之为生物技术。这一定义强调了生物技术广义的概念，但与多数学者对生物技 术的理解有相当的距离，至多也只能称其为传统生物技术。另一种定义则认为生物技 术仅指基因工程，只有应用重组h a 的技术，才是生物技术。有人将这一定义称作“狭 义的生物技术”。客观地说，基因工程只是生物技术中十分重要的内容之一，但不是 现代生物技术的全部。 1 2 生物技术发展沿革 1 2 1 近代生物学发展历程 生物技术是现代生物科学发展的必然产物。说起近代生物学的发展，必须提及1 9 世纪在生物学领域的三项伟大成就，即细胞学说、达尔文生物进化论和孟德尔遗传定 律。 1 9 世纪3 0 年代末，德国人施莱登( s c h l e i d e n ) 和施旺( s c h w a n n ) 分别指出细 胞是植物和动物的基本结构单位和功能单位，共同建立了细胞学说。细胞学说第一次 将纷繁的动物界和植物界统一起来，1 8 5 5 年，德国医生和病理学家魏尔肖( v i r c h o w ) 结合病理学研究，提出“一切细胞来自细胞”这一著名论断。但是细胞是如何通过分 裂产生新的细胞，直到1 9 世纪7 0 年代以后才得到实验证据。这要归因于那时工业技 术的发展，已能为细胞学研究提供比较先进的显微镜、切片机、化学试剂和染料。 1 9 世纪另一重大科学发现，是达尔文( d a r w i n ) 的生物进化论。1 8 5 9 年，达尔 文完成了物种起源一书，认为物种之间都有共同的祖先，现存生物体中都携有其 祖先留下的原始痕迹。当代生物学发展的重大里程碑d n a 分子的发现，最终证明了 达尔文生物进化理论的正确性，同时也大大促进了生物技术的发展。 2 复旦大学博士论文利用生物芯片技术检测转基因农作物 1 8 5 7 年孟德尔( m e n d e l ) 开始豌豆杂交实验，并在1 8 6 5 年发表了著名的“植物 杂交实验”。他以敏锐的观察能力和科学的统计分析方法，发现了“遗传因子”，从而 奠定了遗传科学的基础。可惜盂德尔的重大发现被埋没了3 5 年。1 9 0 0 年，三位欧洲 植物学家几乎同时从各自的植物杂交实验证实了孟德尔发现的遗传定律。从而揭开了 遗传学研究的新纪元。整个2 0 世纪，遗传学以前所未有的速度向深度和广度发展。 1 9 1 0 年，摩尔根( m o r g a n ) 通过果蝇白眼突变研究，确认基因在染色体上，以后又创 立了基因论。1 9 3 3 年，由于对基因理论的重大贡献，摩尔根成为首位获得诺贝尔医学 和生理学奖的遗传学家。1 9 4 1 年，美国遗传学家比德尔( b e a d l e ) 通过红色面包霉营 养突变体研究，发现基因的功能是制造各种各样的蛋白质，提出“一种基因产生一种 酶”学说，因此获得诺贝尔奖。1 9 5 0 年，诺贝尔奖得主麦克林托克( m c c l i n t o c k ) 通 过对玉米斑驳性状遗传研究，发现了转座遗传因子，又称“跳跃基因”，它们可以在 染色体之间自由转移位置，调控基因的表达。这一重要发现导致了l o 年以后法国科 学家雅各布( j a c o b ) 和莫诺( m o n o d ) 从原核生物研究中得到另一项重大发现，存在 三种不同的基因，即结构基因、操纵基因和调节基因，他俩因此而分享了诺贝尔奖。 1 2 2 现代生物技术的兴起 1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 通过x 射线衍射试验，创立脱氧核糖核酸( d n a ) 双螺旋 模型，第一次揭示了d n a 分子的结构、组成及功能，开刨了从分子水平揭示生命现象 本质的新纪元。随后2 0 年，分子生物学发展突飞猛进。1 9 5 8 年c r i c k 证明了d n a 半 保留复制和中心法则。1 9 6 1 年，c r i c k 和n i r e n b e r g 发现d n a 携带的遗传密码是由3 个碱基组成的三联体。1 9 6 7 年k h o r a n a 和n i r e n b e r g 破译了遗传密码。他们制定的密 码子与氨基酸之间对应的密码子表，适用于所有生物。 1 9 7 0 年，s m i t h 、w i l c o x 和k e l l y 分离了第一个核酸限制性内切酶，使得有目的 地切割d n a 有了可能。1 9 7 2 年，j a c k s o n 和b e r g 利用限制性内切酶和连接酶，得到 了第一个体外重组的d n a 分子，从而建立了重组d n a 技术。重组d n a 技术从一开始就 显现出巨大的商业应用前景。1 9 7 6 年，世界上第一家应用生物技术开发新药的公司 ( g e n e t e c h 公司) 建立，拉开了现代生物技术产业发展的序幕。 1 9 7 5 年，淋巴细胞杂交瘤生产单克隆抗体技术问世。这是一项免疫学领域的细胞 工程技术。这项技术将可分泌单一抗体的淋巴细胞与可无限增殖的骨髓瘤细胞融合， 获得兼具两种细胞特性的杂交细胞。这种杂交细胞可以大量增殖并生产纯一的单克隆 抗体，为人类及畜、禽疾病的诊断和治疗，提供了新的手段。 复旦大学博士论文 利用生物芯片技术检测转基因农作物 “人类基因组计划”是生命科学史中最伟大的研究计划。最初的目标是对人类及 大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、拟南芥和小鼠等有代表性的六种模式生物的全部基因 组测序作图。这项包括我国在内的多国合作计划于1 9 8 5 年开始酝酿，1 9 9 0 年1 0 月正 式启动，预期2 0 0 5 年完成。1 9 9 8 年5 月，y e n t e r 等一批科学家在p e r k i ne l m e r 公 司支持下在美国组建c e l e r a 遗传公司，装备了2 3 0 台最新的3 7 0 0 测序仪，目标是到 2 0 0 1 年绘制出完整的人体基因组图谱，与政府资助的多国人类基因组计划展开竞争。 在竞争压力下，人类基因组计划完成时间曾两度宣布提前，预计提前4 年，可在2 0 0 1 年6 月全部完成。2 0 0 0 年6 月2 6 日，参与该项目的各国科学家公布了在科学史上具 有里程碑意义的第一张人类基因组工作草图，也就是人类基因组序列的“工作框架 图”，2 0 0 2 年2 月又公布了人类基因组“精细图”。在包括中国在内的有关国家科学家 的共同努力下，人类基因组序列的“完成图”现也已经完成。由于人类基因组计划而 兴起的基因组学( g e n o m i c s ) ，已经改变了生物技术商品化的内涵，基因本身即已成 为具有重要商业价值的高技术产品。一个重要基因的专利转让费可高达数千万美元。 相继出现了许多基因测序公司、基因克隆公司，其影响与规模进一步扩大。 2 0 世纪7 0 年代出现重组d n a 技术和淋巴细胞杂交瘤技术，加上9 0 年代兴起的基 因组学技术，再加上6 0 年代以来相继出现、近2 0 年迅速崛起的其他各类生物技术， 构成了缤纷多彩的现代生物技术群。它们包括：酶或细胞固定化技术、细胞或原生质 体融合技术、细胞大规模培养技术、生物反应器技术、花药和小孢子培养双单倍体育 种技术、植物茎尖脱毒技术、离体快速繁殖技术、动植物转基因技术、蛋白质工程技 术、胚胎工程技术、组织工程技术、动植物生物反应器技术、动物克隆技术、基因组 测序分析技术、基因治疗技术、p c r 扩增技术、d n a 分子标记技术、蛋白质组学技术、 生物芯片技术、生物信息学技术等等。建立在这样一群技术基础上的生物技术产业， 其范围遍及农业食品、医药卫生、化工环保，资源能源、海洋开发等许多领域，日益 显示出在解决人类面临的食物、健康，资源，环境等重大问题的巨大威力与潜力。本 论文主要涉及植物转基因技术、多重p c r 扩增技术和生物芯片技术。 1 3 生物技术发展概况 1 3 1 世界生物技术发展概况 自2 0 世纪8 0 年代以来，现代生物技术产业蓬勃发展，特别在医药、农牧业、食 品等方面，已经体现了巨大的经济效益和社会效益。9 0 年代以来，随着基因组计划的 4 复旦大学博士论文 利用生物芯片技术检测转基因农作物 发展，除了上述传统应用领域以外，生物技术不断融入化工、环境、能源、自动化和 计算机等领域。 ( 一) 生物技术产品销售额增长迅速 1 9 8 2 年世界上第一个基因工程药物一重组人胰岛素获准生产销售。之后，以基因 工程药物为主的各种基因工程产品和细胞工程产品陆续商品化。截至1 9 9 8 年，仅美 国就有5 3 种生物技术药品获f d a 批准上市，使数千万患者获益。正在进行人体临床 试验的药品和疫苗超过3 5 0 种。正在研究和开发的药品和疫苗达2 2 0 0 多种。生物技 术产品的销售额迅速增长。美国在1 9 8 0 年时现代生物技术产品的销售额还是零增长， 到1 9 9 1 年时为5 9 亿美元，1 9 9 6 年已达到1 0 1 亿美元，1 9 9 7 年为1 3 0 亿美元，预计 到2 0 0 0 年时将达到5 0 0 亿美元。据日本 日经生物技术编辑部对日本生物技术市 场的调查结果，1 9 9 1 年时日本市场的生物技术产品销售额达到2 6 4 8 亿日元，到1 9 9 6 年则达到了6 5 5 2 亿日元，5 年时间增长了一倍多。 ( 二) 新医药是当前生物技术的主体产品 单克隆抗体诊断试剂是应用淋巴细胞杂交瘤技术最先实行商品化的一类产品。自 1 9 8 1 年美国批准第一种单抗诊断试剂商品化生产以来，至今世界销售的单抗诊断试剂 已达数百种之多。美国单抗诊断试剂销售额1 9 8 5 年为2 亿美元，至1 9 9 6 年已增至1 8 亿美元。 现代生物技术研究最多，发展最快的是治疗药物。目前，美国大约1 3 0 0 家生物 技术公司的6 0 以上、欧洲大约7 0 0 家生物技术公司的4 3 以上，都在从事生物药品 的研究开发。应用现代生物技术，主要是开发那些可用于治疗癌症、心脑血管疾病、 艾滋病、遗传病等各种重大疾病面用常规方法又难于获得的药物。从1 9 8 6 年美国正 在开发的2 8 4 种生物技术药物来看，大体上分为细胞因子和生长因子( 7 2 种) 、疫苗 ( 6 2 种) 、单抗( 7 9 种) 、基因治疗( 2 8 种) 等几大类，其中2 0 是用于治疗各种癌 症的。1 9 9 8 年处于不同研发阶段的生物技术药物约3 5 0 种，治疗的疾病包括肿瘤、艾 滋病、心血管疾病、传染病、血液病、自身免疫病、糖尿病、神经系统疾病、呼吸系 统疾病、皮肤病，生长发育障碍、眼部疾病、遗传性疾病、器官移植等，其中4 3 用 于治疗肿瘤及相关疾病。 自1 9 8 2 年美国f d a 批准第一个基因工程药品重组入胰岛素正式生产以来，美国 现已有基因重组人生长激素、红细胞生成素、干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、 疫苗、单抗等5 0 余种生物技术药物获f d a 批准上市。日本到1 9 9 5 年底已批准3 1 个 复旦大学博士论文 利用生物芯片技术检测转基因农作物 产品( 其中8 0 9 6 为基因工程药物) 上市。1 9 9 6 年，美国基因工程药物的销售额为8 0 亿美元，年均增长1 3 ，预计到2 0 0 6 年可超过2 5 0 亿美元。目前，美国生物技术药物 的销售额占其生物技术产品总销售额的7 0 以上；日本1 9 9 6 年基因工程药物销售额约 4 8 9 1 亿日元，占其生物技术产品总销售额的2 5 。上世纪9 0 年代以来，全球生物药 品销售额以年均3 0 以上的速度增长，大大高于全球医药行业年均不到1 0 的增长 速度。2 0 0 2 年，全球生物技术产业的销售额约为4 5 0 亿美元，其中生物医药销售额约 为4 0 0 亿美元。生物医药产业正快速由最具发展潜力的高技术产业向高技术支柱产业 发展。 ( 三) 生物技术发展的“第二个浪潮”将在农业领域掀起 过去的十几年间，生物技术研究开发的6 0 一8 0 集中在医药领域，基因工程药物 的研究和商品化，被称为生物技术产业发展的“第一个浪潮”。近年来这一态势开始 发生变化。随着动植物转基因技术的不断成熟和发展，以及迄今尚未出现人们所担心 的环境释放安全性问题，农业生物技术迅速发展起来，围绕转基因农作物的竞争日趋 激烈，已在世界范围内掀起了生物技术及产业发展的“第二个浪潮”。 1 9 8 6 年全世界只有5 项转基因植物批准进入田间试验，1 9 9 2 年增加到6 7 5 件。 从1 9 8 7 年到1 9 9 9 年1 月底，美国共批准了4 7 7 9 项转基因农作物进入大田试验；其 中近1 9 9 8 年一年内就批准了1 0 7 7 项，增长速度之快，超出人们预料。 自1 9 9 4 年至1 9 9 7 年，短短的3 年时间里，国外已有包括抗虫棉花和玉米、抗除 草剂大豆、棉花、玉米和油菜、耐贮番茄、抗病毒南瓜等十数种植物的4 6 项转基因 植物获准商品化上市销售。美国、加拿大从1 9 9 6 年开始大规模种植转基因大豆、玉 米、棉花和油菜。1 9 9 8 年，世界转基因作物总面积已达2 7 8 0 万公顷，其中7 3 种植 在美国。美国、阿根廷分别种植转基因大豆1 0 2 0 万公顷和4 3 0 万公顷，分别占两国 大豆总面积的3 6 和6 0 以上。美国的转基因抗虫玉米面积达6 5 0 万公顷，占其玉米 总面积的2 2 * , 6 。加拿大种植转基因油菜2 4 0 万公顷，已达该国油菜总面积的一半。1 9 9 9 年美国种植的转基因大豆已达大豆总面积的5 5 ，超过半数，转基因棉花和转基因玉 米分别占其栽培总面积的5 0 0 , 6 和3 0 。转基因农作物产品世界市场的销售额1 9 9 5 年仅 0 7 5 亿美元，1 9 9 8 年达1 5 亿美元，4 年增长约2 0 倍。1 9 9 9 年达2 3 亿美元，预计到 2 0 1 0 年将增至2 5 0 亿美元。 2 0 0 0 年前，美国的农业生物技术产品销售额年均增长率达到5 0 ，2 0 0 0 年后， 美国生物技术产品的销售额平均每年以1 2 的速度扩展，2 0 0 0 年为1 5 8 5 亿美元，2 0 0 3 6 复旦大学博士论文 利用生物芯片技术检测转基因农作物 年为2 1 5 亿美元，预计到2 0 1 0 年将增加到4 9 0 亿美元，到2 0 2 5 年生物技术相关产品 将占g d p 的2 0 。 1 9 9 6 年开始，国际上一些大公司，如美国的孟山都公司( m o n s a n t o ) 、德国的赫 司特公司( h o e c h s t ) 、瑞士的诺华公司( n o v a r t i s ) ，都看中了转基因植物的商业价 值，围绕农业生物技术展开了激烈的竞争。大企业的参与，无疑将大大加快农业领域 生物技术研究开发及产业的发展速度。 1 3 2 我国生物技术研究和开发成就 我国生物技术研究起步较晚，但发展迅速。我国政府对这一新兴高科技领域一直 给予高度的重视。近十几年来已建成一批国家重点实验室、工程研究中心等研究开发 基地，为生物技术健康发展提供了较好条件。目前正在实施的国家科技攻关计划、 “8 6 3 ”计划、“9 7 3 ”计划、自然科学基金、火炬计划等科技及产业发展计划，均把 生命科学和生物技术列为优先发展的高技术和高技术产业。特别是1 9 8 6 年启动的 “8 6 3 ”计划和1 9 9 7 年启动的“9 7 3 ”计划，成为我国生物技术发展的重要里程碑。 列入“8 6 3 ”计划生物技术领域的重大研究项目有1 2 个，包括1 0 0 多项研究课题。在 “8 6 3 ”计划带动下，生物技术研究在我国迅速发展，生物技术开发体系逐步在农业、 医药、轻化工、环境和海洋等领域形成，取得了一系列辉煌成就。 其中在转基因植物领域，1 9 9 2 年，我国首先在大田生产上种植抗黄瓜花叶病毒转 基因烟草，成为世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。自1 9 9 6 年我国正式公 布实施农业生物基因工程安全管理实施办法以来，已批准6 种栽培植物共2 6 项 转基因品系通过商品化生产安全审定，其中2 3 项为我国自行开发。包括：抗鳞刺目 害虫的抗虫棉，可在常温下贮藏6 0 - 8 0 天的耐贮藏番茄以及抗黄瓜花叶病毒( c m v ) 的甜椒和西红柿等。此外，还有水稻、小麦、玉米、大豆、番木瓜、烟草、马铃薯、 白菜、杨树等1 0 余种植物的转基因品系获准进入中间试验或环境释放研究阶段，预 计再经5 年左右可进入商品化阶段。 我国的转基因农作物种植发展十分迅速。1 9 9 8 年我国种植各类转基因作物1 5 万 亩，1 9 9 9 年超过2 0 0 万亩；2 0 0 0 年仅转基因抗虫棉一项，便达约5 0 0 万亩。2 0 0 6 年， 中国有6 8 0 万小型农户种植了3 5 0 万公顷的抗虫棉。尽管转基因抗虫棉的种植面积增 长了2 0 万公顷，但转基因农作物依然稳定在6 6 的比例。 7 复旦大学博士论文 利用生物芯片技术检测转基因农作物 题 二、生物安全 2 1 普及生物科学知识，正确认识生物技术引起的安全性问 随着生物技术的不断发展，对其安全性的讨论也日益增多。 遗传科学研究一直是引起宗教界不安的因素。1 9 7 0 年基因工程问世后，担心它会 对人类伦理道德和环境产生有害影响者已超出宗教界。尤其在人类基因及基因组、试 管婴儿、人工受精和克隆人等敏感问题上，引发了许多法律和伦理道德问题，引起群 众热切关注。如处理不好，会产生意想不到的社会问题，直接影响生物技术的健康发 展。 人们对生物技术的态度主要受科学文化水平、自然观和个人宗教信仰的影响，同 时也受政府政策导向的影响。例如加拿大生物技术研究所1 9 9 3 年的一项调查表明， 按照对生物技术的态度可将调查人群分为三类：第一类约占四分之一，他们相信科学 技术能解决一切问题，认为生物技术对社会绝对是有益处的。第二类也约占四分之一， 他们认为生物技术是有害的，最有可能引起环境危害。他们不相信科学技术，认为世 界是上帝精心安排的。第三类占被调查人群的4 0 ，认为生物技术既有利也有害，他 们很少极端地从科学和宗教角度看待生物技术，而是针对每一特定的事物来评价生物 技术的好处和害处。 目前公众对生物技术大致存在以下争论：1 转基因生物是否会破坏自然生态系 统、威胁生物多样性? 2 利用转基因技术生产的食品是否会影响人类健康? 3 专利法 是否会使大型生物技术公司垄断农产品生产? 4 目前的生物技术法规是否有利于保 护农民和消费者的权益和保护生态环境? 5 是否有必要对转基因商品加注标签? 6 第三世界国家的基因资源是否应受到保护? 7 生物技术虽能治疗疾病或增加食品生 产，但患者或消费者是否有权拒绝使用? 2 2 生物技术专利权与伦理道德 ，在生物技术的专利权方面，分歧主要集中在人类基因专利权的道德问题和开发土 著居民、动植物基因资源得到的问题。 8 复旦大学博士论文 利用生物芯片技术检测转基因农作物 人类基因的价值，在于它能帮助研究者揭示生命的奥秘，阐明疾病发生的机理， 进而对疾病进行诊断和治疗，从而获得巨大经济利益。 当前一些国外的研究机构，非常感兴趣收集第三世界国家包括隔离人群在内的原 始基因资源，开展人类遗传基因的多样性研究。反对者担心这项研究将导致争夺人类 遗传资源的冲突。有人指责赋予人类基因专利权违背伦理道德，侵犯了人身权，是不 折不扣地“侵略”和“犯罪”。但美国和欧洲的专利局则认为：医疗上获取人类器官 和组织的行为，并不冒犯人类的尊严。为人类基因申请专利并不是不给基因的供应者 任何权利。人类基因的发现可视为一种特殊化学物质的发现，与其相应的功能和用途， 应该赋予发现者专利权。因此给一个结构与功能都清楚的基因赋予专利权，与给其他 人类物质( 例如人类蛋白质) 在类似情况下赋予专利权在道德上没有差异。 一些公司认为，他们需要用专利权来保护他们投入大量资金获得的研究成果。将 一项生物技术成果从研究到投放市场，他们需要花费几年甚至几十年时间和千百万美 元的风险投资。如果不能申请专利，那他们的投资将可能会付诸东流。但反对者认为， 如果为一种科学构思、基因组研究的基本信息或一群动、植物申请专利有可能限制 有些资源和研究成果的共享，不利于科学技术的发展。 2 3 亟待加强我国的生物技术安全性研究 生物技术的发展也存在利弊两个方面的问题，在给人类带来利益的同时，也存在 着被误用和滥用的风险。不断发展的生物技术有可能给哲学、伦理和法律等领域带来 巨大冲击，应及早制定相关对策，规范包括基因技术在内的各种新科技的发展，使其 沿着健康的道路前进。 最近十多年我国生物技术研究取得了重大成绩，基因工程产品已经开始批量上 市，但对生物技术安全性问题缺乏系统的研究。我国已有相当数量转基因生物释放或 即将释放到环境中，其安全性问题受到国内外广泛关注。实验研究中一些不显著的问 题，在形成产业规模并经过较长时间后，可能会暴露出来，直接或间接对人类社会、 生态和环境造成有害影响。专门设立生物安全研究项目，加强生物安全相关问题的研 究，逐步建立健全生物技术安全性的科学管理体系，及时评估和检测可能引起的风险， 研究制定有效的防范措施和补救措施，以确保生物技术沿着健康的道路发展。 我们认为，广义的“生物安全”是指在一个特定的时空范围内，由于自然或人类 9 复旦大学博士论文 利用生物芯片技术检测转基因农作物 活动引起的外来物种迁入，并由此对当地其他物种和生态系统造成改变和危害；人为 造成环境的剧烈变化而对生物的多样性产生影响和威胁；在科学研究、开发、生产和 应用中造成对人类健康、生存环境和社会生活有害的影响。凡此上述均属于“生物安 全”的范畴。国内外由于生物安全问题造成对人类以及对生态环境危害的事例不胜枚 举，本文所讨论的“生物安全”主要指通过基因工程技术所产生的遗传工程体及其产 品的安全性问题。 现代生物技术能够使人类直接操作生物的遗传物羼基因，改变微生物、植物和 动物的某些生物学性状、代谢产物甚至生命活动的某些过程。这就意味着人类可以在 一定程度上设计、并定向改造某种生物。由于生物技术的实验研究和商品产业化的快 速发展，在农业、医药、食品、环保、轻工等部门，生物技术将起到越来越大的作用， 甚至取代一些行业的原有技术和工艺，成为我国2 1 世纪的支柱产业之一。显然在这 之中蕴涵着巨大的商机。全世界目前已经有几十种转基因植物和现代生物技术药物进 入商业化生产，为一些国家带来巨大的商业利益。但是，在生物技术迅速发展的同时， 我们也必须清醒地看到现代生物技术主要是利用重组d n a 技术，而重组d n a 技术则可 能给我们带来一些潜在的、目前还难以预测的危险。 1 0 复旦大学博士论文 利用生物芯片技术检测转基因农作物 三、转基因生物的安全问题 3 1 世界范围内转基因生物安全问题发展概况 自2 0 世纪9 0 年代以来，多种转基因生物和基因工程药物进入大规模商业化应用 阶段，这对转基因生物的安全性评价提出了新的要求，毕竟大规模商业应用不同于小 范围的田间或室内实验，一些在小范围实验中不显著的问题会在大面积种植和大规模 使用中暴露出来，并会对人和环境产生直接或间接的影响。随着转基因生物的不断出 现和大规模应用，一些新的风险因素也不断被引入，所以生物安全性问题越来越引起 人们的关注。很显然，如何监测、管理和防范转基因生物的生物性安全问题是我们在 未来时代面临的一项重大课题。 1 9 7 5 年2 月2 4 2 7 日在美国加利福尼亚州举行的a s i l o m a r 会议，专门讨论了转 基因生物的安全性问题。这次会议是世界上第一次正式关于基因工程技术及转基因生 物安全性的会议，因而具有重要的意义，成为人类社会对转基因生物安全性关注的历 史性里程碑。 1 9 7 5 年a s i l o m a r 会议后，一些国家就开始着手制定有关生物安全的管理条例和 法规。现在世界上已有不少国家发布了一些法规、准则，以指导和监督转基因生物的 应用。最早的法规是美国国立卫生研究院( n i h ) 于1 9 7 6 年发布的重组d n a 分子研 究准则。随后德、法、英、日、澳大利亚等国也相继制定了有关重组d n a 技术安全 操作指南或准则。经济发展合作组织( o e c d ) 颁布了生物技术管理条例，欧盟也 颁布了关于控制使用基因修饰微生物的指令、关于基因修饰生物向环境释放的指 令等文件。 3 1 1 美国的转基因生物安全工作 美国有三个机构分工管理转基因生物安全工作。美国国家环保局( e p a ) 负责对 环境的保护，农业部( u s d a ) 负责作物及食品的安全性，食品与药物管理局( f d a ) 负责食品和药物的安全性检测，三个机构相互协调沟通。在转基因植物的管理上，为 了既要获得最大的利益，又要保护农业、环境和人体健康，美国于1 9 8 6 年6 月公布 了生物技术法规协调大纲，规定任何转基因植物，只要其供体、受体或所用载体 含有植物病原体基因片断，就要受到该法规的约束。由于1 9 8 6 年以前的重组d n a 工 作没有出现什么明显危害，所以在大纲公布后，审批田间释放申请的时间比以前 复旦大学博士论文利用生物芯片技术检测转基因农作物 快了近十倍，降至1 0 0 天左右。这是因为美国在安全性上的政策认为基因工程技术和 传统的杂交育种没有根本区别，不能因为一种产品获得过程的新奇而认为其有害，控 制和评价应针对其最终产品是否对人体健康和生态环境有危害。在这种基于对最终产 物进行评价的基础上，美国逐步放松了对转基因植物的控制。1 9 9 5 年美国环保局( e p a ) 第一次批准一批抗虫的转基因植物进行“有限的”商业化种植，它们包括汽巴种子 ( c i b as e e d s ) 公司的转b t 基因玉米，m y c o g e n 公司的转b t 基因土豆和孟山都 ( m o n s a n t o ) 公司的b t 抗虫棉，开始了转基因植物商业化的进程。美国农业部( u s d a ) 也进一步简化了对转基因植物的审查过程，使其可以更快地进入商业化阶段。如果涉 及药物、食品方面，还需得到食品与药物管理局( f d a ) 的批准，至1 9 9 5 年7 月，f d a 已确认c a l g e n e 公司、孟山都公司的土豆、汽巴种子公司的抗虫玉米等1 2 种作物的 安全性。在1 9 9 6 年，包括孟山都公司的转b t 基因的抗虫棉在内的数种转基因植物开 始大规模商业化种植，美国环保局的许可暂定为5 年，在此期间，要求各公司对目标 昆虫抗性的变化及其它生态风险作出监测和评价。 3 1 2 其他国家的转基因生物安全工作 目前，在对待转基因生物安全性的态度上，美国的开放和欧洲的小心翼翼形成了 鲜明的对比。在美国，从牛奶、奶酪到水果、蔬菜、玉米、大豆等主要作物以及牲畜 等，都有转基因生物存在。美国批准了3 5 种转基因作物进行田间试验，而欧洲只批 准了9 种转基因作物，而且都是1 9 9 8 年3 月之前批准的。欧盟近年来基于对转基因 生物安全性的考虑，没有批准多种转基因生物的释放。 美国的公众对科学的发展更有兴趣，对新生事物如转基因生物持乐观态度，他们 希望科学的发展能为社会提供更好的生活环境和条件，他们相信权威机构的认可。 1 9 9 9 年2 月，美国行业组织一国际食品信息委员会对1 0 0 0 名成年人就生物技术进行 了电话调查，结果显示，相对较少的人注意到了