（遗传学专业论文）拟果蝇细胞系建立及6种果蝇pvr基因的分子系统学研究.pdf

摘要 拟果蝇细胞系的建立：以拟果蝇早期胚胎为材料，采用常规方法获取发育4 6 h 的果 蝇胚胎细胞，用改良的地( b f ) 培养液体外培养，经5 0 d 左右的原代培养，当小细胞长满培 养皿后进行传代培养，以后平均每隔l o d 传代一次。在细胞系传至1 0 代左右时按照细胞 系建立标准检测细胞系的一系列生物学特性。结果显示：2 4 h 后细胞贴壁，开始分化， 先后依次观察到肌肉细胞，神经细胞，脂肪细胞，鳞状上皮细胞，血囊细胞的分化。2 个月后所有这些分化的细胞都逐渐消失，只剩下生长较为一致的圆形小细胞。当圆形小 细胞长满培养皿时进行传代。经液氮冻存的细胞复苏后活性达9 0 以上。细胞维持体外 生长将近2 年，传至6 0 代，是一株成功的拟果蝇细胞系，命名为l j y s i m 。 6 种果蝇p v r 基因的分子系统学研究：通过p c r 扩增和克隆测序的方法，获得了黑 腹果蝇种亚组内的6 个种的p v r 基因的序列。以细针果蝇( d r o s o p h y l ae u g r a c i l s ) 为 外群，运用邻接法，最大似然法和贝叶斯法三种方法构建了m e a n o g a s t e r 种亚组的系 统进化树，对其系统发育关系进行了分析，并利用b o o t s t r a p 对分析结果进行了置信度 检验。分子进化分析表明：这个基因的编码区段高度保守，明显表现出受到纯化选择的 痕迹，其超高的k s k a 比值及g c i i i 含量都充分显示如此。而这个基因的内含子区存在明 显的插入和缺失，包含有丰富的进化信息。基因树表明：d m e l a n o g a s t e r 最先分化出来， 然后是口s i m u l a n s 和口m a u r i t i a n a ，接着是，它们聚为单独的一个亚支系，口e r e c t a ， 历t e i s s i e r l 和口y a k u b a 聚为第二个亚支系，其中口e r e c t a 先分化出来。 关键词：拟果蝇；细胞系；系统发育；黑腹果蝇种亚组；p v r 基因；分子进化 a b s t r a c t e s t a b l i s h m e n to fd r o s o p h i l as i m u l a n sc e l ll i n e ：i no r d e rt oe s t a b l i s he u k a r y o t i cg e n e e s p r e s s i o ns y s t e m ，e m b r y o so fd r o s o p h i l as i m u l a n sw e r eu s e da so u re x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s w eb r o k et h ee m b r y o st h a th a dd e v e l o p e df o r4 6 hi n t oc e l l sb yu s i n gc o n v e n t i o n a lm e t h o d ， a f t e rt h a tw ec u l t u r e dt h ec e l l si ni m p r o v e dm 3 ( b f ) m e d i u mi nv i t r o a f t e ra b o u t5 0d a y so f p r i m a r yc u l t u r e ，w ep a s s a g et h ec e l l so n c ee v e r y10d a y s d u r i n gt h et i m e ，w et o o ks o m ec e l l s f r o z e n c o n c l u s i o n ：c e l l sl i n k e dt ot h ep l a t ea n ds t a r t e dd i f f e r e n t i a t i n ga f t e r2 4 h i nt u r n ，w e s a wt h ed i f f e r e n t i a t i o no fm u s c l ec e l l s ，n e u r o n s ，f a tc e l l s ，e p i t h e l i aa n db l o o dc e l l s a f t e r2 m o n t h , a l lt h ed i f f e r e n t i a t e dc e l l sd i s a p p e a r e ds l o w l yu n t i lt h e r ew e r eo n l yl i t t l er o u n dc e l l s p a r t so ft h ec e l l sb e c a m eh e t e r o p l o i d t h ev i a b i l i t yo ft h ec e l l sr e c o v e r e df r o ml i q u i dn i t r o g e n w a su pt o9 0 o ra b o v e t h ec e l ll i n ew a sas u c c e s s f u lc e l ll i n e ，n a m e dl j y - s i m m o l e c u l a rp h y l o g e n e f i cs t u d yo fp v r g e n ei ns i xm e l a n o g a s t e rs p e c i e s ：b yp c ra n d s e q u e n c i n g ，t h en u c l e o t i d es e q u e n c e so fp v rg e n ei ns i xs p e c i e so fm e l a n o g a s t e rs p e c i e s s u b g r o u pw e r ea c q u i r e d t h ed e u g r a c i l sw a ss e l e c t e da so u t g r o u p p h y l o g e n e t i ct r e e sw e r e r e c o n s t r u c t e du s i n gn e i g h b o u r i n g - j o i n i n g ( n j ) ，m a x i m u ml i k e l i h o o d ( m l ) a n db a y e s i a n m e t h o d s s u p p o r t i n gv a l u e sw e r ec a l c u l a t e db yb o o t s t r a p t h ee v i d e n c e sf r o mh i g hr a t i o so f k s k aa n dg c mc o n t e n t ss h o wt h a tt h ec o d i n gr e g i o n su n d e r g o e sp u r i f i c a t i o ns e l e c t i o n d e l e t i o n i n s e r t i o ns e g m e n t sa r eo b s e r v e di nt h ei n t r o no ft h i sg e n e ，t h i sr e g i o ni n c l u d e s a b u n d a n ti n f o r m a t i o no ft h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so ft h es p e c i e s t h et r e es h o w e dt h a t d s i m u l a n sa n dd m a u r i t i a n aa r et h em o s tr e l a t e ds p e c i e s d m e l a n o g a s t e r , d s i m u l a n sa n d d m a u r i t i a n ac o m b i n ea sac l a d e ，i nw h i c hd m e l a n o g a s t e rd e r i v e df i r s t w h a t sm o r e ， d e r e c t a ，d t e i s s i e r ia n dd y a k u b ac o m b i n ea st h es e c o n dc l a d e ，i nw h i c hd e r e c t ad e r i v e d e a r l i e r k e yw o r d s ：d r o s o p h i l as i m u l a n s ；c e l ll i n e ；p h y l o g e n y ；m e l a n o g a s t e rs u b g r o u p ；p v rg e n e ； m o l e c u l a re v o l u t i o n i i 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名： 日期：年月日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，e p - 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印 刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影印、缩印、数字 化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位 论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期： 第一部分文献综述 第一部分文献综述 1 动物细胞培养技术的应用现状及发展前景 1 1 动物细胞培养技术的应用现状 1 1 1 在生物学基础研究中的应用 离体培养的动物细胞具有培养条件可人为控制且便于观察检测的特点，因而可广泛 应用于生物学领域的基础研究中。在细胞生物学上，动物细胞培养可用于研究动物的正 常或病理细胞的形态、生长发育、细胞营养、代谢以及病变等微观过程。在遗传学研究 中，除可用培养的动物细胞进行染色体分析外，还可结合细胞融合技术建立细胞遗传学， 进行遗传分析和杂交育种。在胚胎工程中，通过体外培养卵母细胞并进行体外受精、胚 胎分割和移植已发展出了一种较成熟的技术而应用于家畜的繁殖生产中。 1 1 2 在临床医学上的应用 首先，动物细胞培养技术可用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断。其次，现在的一 些科学研究已能通过染色体对比分析检测出易患癌症的病人，以便进行及早安全可靠的 预防和治疗。再次，细胞培养还可用于临床治疗。目前已有将正常骨髓细胞经大量培养 后植入患造血障碍症患者体内进行治疗的报道。 1 1 3 在动物育种上的应用 目前，由于细胞培养技术、细胞融合技术、细胞杂交技术以及转基因技术的创建与 相互结合，使得人们能够在细胞水平操作并改变动物的基因，从而进行遗传物质的重组， 这样就可以按照人类的需要大幅度地改变生物的遗传组成，使新品种的培育在实验室中 即可完成，大大缩短育种进程，且使育种工作更加经济有效。 1 1 4 在生产大分子生物制品中的应用 随着大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应用，人们发现利用动物细 胞大规模培养技术来生产大分子药用蛋白比原核细胞表达系统更有优越性。随着大量永 久性细胞株的创建，在商业利益的刺激下，动物细胞大规模培养技术也迅速发展起来， 并被付之于应用。目前，用动物细胞可生产的生物制品有各类疫苗、干扰素、激素、酶、 生长因子、病毒杀虫剂、单克隆抗体等，其销售收入已占到世界生物技术产品的一半以 上。人们相信，随着动物细胞培养技术的发展，以后还会有更多的生物制品被开发，并 湖北大学硕十学位论文 用于造福人类。 1 2 动物细胞培养技术的发展前景展望 在目前和今后若干年内，动物细胞作为一种日趋成熟的表达系统会愈来愈受到研究 人员和生产人员的重视，并将成为基因工程和细胞工程中十分活跃的领域。展望未来， 动物细胞培养工程发展的总方向是： ( 1 ) 由于某些生长因子基因在导入哺乳动物细胞后，其表达产物有可能使细胞脱离 血清生长，因此这一途径对于今后的哺乳动物细胞基因工程有很大吸引力，并将推动无 血清培养基的开发进入一个崭新阶段。 ( 2 ) 研制更大规模的高无菌生物反应器和剪切力小、混合性能良好的新型搅拌系统。 ( 3 ) 开发细胞生长性能优良、解离细胞容易，并能重复使用的新型廉价微载体。 ( 4 ) 将其它领域( 诸如自动控制、传感器) 的高精尖技术移植于细胞培养工程领域， 以提高大规模培养的自动化、精巧化水平，并能更经济地设计流加或灌注培养过程。 ( 5 ) 开发能高密度生长、能分泌大量目标产品的细胞系，这些细胞系应具有放大的 目的基因或具有选择性标记，从而可以保持对特定产物的表达。 2 分子系统学研究进展 分子系统学( m o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ) 是近3 0 年发展起来的一门综合性前沿学科， 它在分子水平上对生物进行遗传多样性、分类、系统发育和进化等方面的研究，其研究 结果对于保护生物多样性( 尤其是遗传多样性) ，揭示生物进化历程及机理具有十分重要 的意义。 2 1 分子系统学的定义及发展简史 分子系统学是通过检测生物大分子包含的遗传信息，定量描述、分析这些信息在分 类、系统发育和进化上的意义，从而在分子水平上解释生物的多样性、系统发育及进化 规律的一门学科。它以分子生物学、系统学、遗传学、分类学和进化论为理论基础，以 分子生物学、生物化学和仪器分析技术的最新发展为研究手段，是一门交叉性很强的学 科。分子系统学使得系统发育和进化的研究进人到在分子水平上对演化机制的本质进行 探讨的阶段，其发展历史根据研究方法的发展大致可分为三个阶段。 2 0 世纪5 0 6 0 年代，分子系统学的研究主要在蛋白质的水平上进行。5 0 年代以免疫 2 第一部分文献综述 学方法为主，并在脊椎动物亲缘关系的研究上取得了一定成。1 9 5 5 年s m i t h i e s 发明了淀 粉凝胶电泳技术。6 0 年代中期h u b b y 等应用同功酶电泳证明了动物自然群体中存在着大 量的遗传变异，等位酶、同功酶电泳技术开始成为分子系统学的热点技术。 7 0 年代，分子系统学研究进入了核酸水平时期。7 0 年代末期，m t d n a 的限制性片段 长度多态技术开始在脊椎动物和无脊椎动物的种群结构研究中应用，到了8 0 年代末期 m t d n a 开始日益成为动物分子系统学研究的有力工具。 8 0 年代以来，以多聚酶链式反应( p c r ) 和s o u t h e r n 杂交为基础发展了一系列衍生技 术，如随机扩增多态性d n a 技术、d n a 指纹图谱技术和扩增片段长度多态性技术等，近几 年来又发展的微卫星d n a 指纹图谱技术及核酸序列测定技术，分子系统学在d n a 水平的研 究飞速发展并取得了大量的显著性成果。 2 2 分子系统学的研究方法及应用情况 2 2 1 蛋白质水平的标记与检测手段 2 2 1 1 同功酶和等位酶电泳 酶电泳始于5 0 年代，通过分析酶的电泳谱带可以间接达到在基因水平上研究遗传变 异的目的，同功酶和等位酶是应用最多的两类酶。由于等位酶谱带与等位基因之间关系 更加明确，因而以等位酶电泳的应用更为广泛。 可用于酶检测的电泳主要有淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素膜电 泳等，不同的电泳方法或同一方法中不同条件的组合，对同一样品的分离效果也是不同 的，多数研究表明，改变电泳条件能检测出更多的变异。 酶电泳方法可以在相对短的时间内检测出大量样本中许多座位上的遗传变异。在种 群水平上检测遗传变异快速有效，方便节省。但它的缺点是可利用的遗传位点数量较小， 只能检测编码酶蛋白的基圆位点，对非编码基因的变异则无能为力；同时，密码子同义 突变的广泛存在使之无法检测全部的d n a 变异。因而低估遗传变异水平，而且等位基因 位点易受选择压力的影响，进一步降低了它用于估汁遗传变异的精确性，因而用等位酶 数据实现系统发育重建说服力较弱。 在采用酶蛋白电泳方法时，检测尽可能多的位点和样本，提高数据的可信度。迄今 为止，酶电泳在分子系统学的应用已积累了丰富的资料，如在种内遗传多样性分析，系 统发育重建，遗传变异与地理分布关系研究等方面都取得了有意义的成果，由于酶极易 失活，不易运输，有活性的酶只能从活体动物获得。因此，酶电泳方法的应用有一定的 湖北大学硕十学位论文 限制。无法应用于濒危动物、古生物和生物标本。 2 2 1 2 蛋白质立体结构测定 近年来测定蛋白质的立体结构成为获得分子系统学信息的新技术。黄京飞等测定计 算了从低等到高等动物的血红蛋白和肌红蛋三维结构的分维数据的相似性，并以此建立 了分子系统进化树，其结果与来自一级结构的研究结果是一致的。由于蛋白质高级结构 的进化比一级结构要保守，因此根据高级结构建立的系统发育关系更加可靠，但高级结 构的研究必须在一级结构清楚的情况下进行，纯结晶蛋白样品获得的程序复杂，序列分 析仪器精密昂贵，非一般生化或分子生物学实验室所能完成。然而生物大分子序列和空 间立体结构最能准确反应系统演化关系。随着技术的不断进步，蛋白质立体结构分析在 分子系统学上必将得到广泛的应用。 2 2 2d n a 水平的标记与检测 2 2 2 1 分子标记技术( 间接方法) 限制性内切酶片段长度多态性技术( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 。r f l p 是8 0 年代中期发展起来的一种d n a 多态分析技术，它将目标 n n a 序列经一定数目和种类的限制性内切酶( r e ) 进行酶切，由于不同的目标d n a 的序列结 构( 遗传信息) 有差异，r e 在其上的识别位点的数目和距离就发生r 改变，因而产生相当 多的大小不等的d n a 片段。然后通过s o u t h e r n 杂交可以把与被标记d n a 相关的片段检测出 来，从而构建出多态性图谱( 较简单的靶序列，女i m t d n a 可以省却杂交直接用电泳方法检 测) ，进行系统进化和亲缘关系的分析。 r f l p 分析数据多态信息量大，结果稳定可靠，重复性好，不受环境及物种发育阶段 影响，呈孟德尔遗传，可有效区分纯合子和杂合子。而且非等位的r f l p 标记不存在上位 效应，只要有探针就可检测出不同物种或个体的同源d n a 分子的r f l p ，对于物种间亲缘 关系的研究特别有用。但r f l p 技术对样品纯度要求较高，当样品很少时要结合应用p c r 扩增。探针的制备很费功夫，标准方法必需先构建c d n a 文库并筛选出可用作探针d n a 序 列，技术路线复杂。而且杂交中存在放射性安全问题，不宜为一般的实验室所采用。另 外，它无法检测靶序列中的重复序列区，多态性检测水平过分依赖于所选用的r e 的种类 和数目，由于不同的r e 识别位点的进化速率不同，因而，对于不同的进化靶序列，如果 选样不当就会导致分析结果出现偏差。 目前在分子系统学中用于r f l p 分析的靶序列主要是基因组d n a 和线粒体 d n a ( m t d n a ) ，其中m t d n a 是系统进化研究的一个强有力的工具。尤其是动物线粒体。因 4 第一部分文献综述 为它的碱基替换速率相对较陕，而且高效的单倍体遗传和母系遗传方式减小了检测时的 有效种群大小( e f f e c t i v ep o p u l a t i o ns i z e ) ，提高了遗传漂变的敏感性，是目前分子 系统学上最佳的靶序列，主要用于研究种群的系统发生及群体间亲缘关系，并在许多物 种中得到广泛应用。但是，m t d n a 与核基因组无确定的关系，所以m t d n a 的r f l p 分析在系 统演化上只能确切地说明母系起源问题，而在父系起源上则无法提供有力的证据。有时 甚至与应用核d n a 得出的结论完全相反；另外，由于m t d n a 进化速率较快，所以不适合科 以上的系统发育研究。植物线粒体d n a 由于并不总是依照母系遗传。因而不常用于系统 发生研究，目前以叶绿体d n a 和核糖体的某些序列的应用为主。 基因组d n a 的r f l p 分析主要是通过与p c r 技术相结合对某一段具有进化意义的基因 进行系统学研究。 微卫星d n a 指纹图谱技术。微卫星d n a 也称简单串联重复序列( s i m p l es e q u e n c e r e p e a t ，s s r ) ，在所有真核生物基因组中随机分布，由于重复次数和程度的不同使所在 的基因座位呈现一定的多态性。微卫星d n a 的重复在基因组的进化中起着非常重要的作 用，因而，被认为是遗传信息含量最高的遗传标记，并日益成为基因组分析和分子进化 最普遍的工具。在分子系统学研究中。可以利用某个微卫星d n a 两端的保守序列设计一 对特异引物，通过p c r 扩增这个位点的微卫星序列，然后用探针( g a g a ) 。等寡核苷探针杂 交检测微卫星d n a 的变异。 微卫星d n a 在基因组中多态性高，并且等位基因数目多、呈等显性遗传，其指纹图 谱有极高的多态性，结果稳定可靠，重复性好，适用于任何真核生物的系统进化研究。 但是，微卫星座位突变几率高，列变异反应极其灵敏，所以易受到趋同变异引起的平行 演化( h o m o p l a s y ) 程度的影响，从而给物种间亲缘关系的评估带来误差；此外，这一技 术耗时较长，花费较大，并存在着放射性安全的问题，而且只能检测那些已知序列的微 卫星d n a 。 由于微卫星d n a 具有许多等价基因并且表现高度的杂合性，在用其对人类、兽类和 昆虫进行种群间遗传测量时，都表现了高度的有效性。李云海等用此技术成功地检测了 中国主要杂交水稻亲本闻的遗传差异。在用蛋白电泳检测大熊猫( a i l u r o p o d o m e l a n o l e u c a ) 的遗传多样性时，得出遗传多样性贫乏的结论。而用微卫星d n a 指纹技术 检测时，却发现极高的多态性。微卫星d n a 多态性在分析物种进化和系统发生、生物种 群内遗传变异以及种群间关系等方面均有重要意义。 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l i m o r p h i cd n a ，r a p d ) 。r a p d 技术是 5 湖北大学硕士学位论文 9 0 年代发展起来的建立在p c r 技术基础上的一种分子标记手段。它利用一系列不同的随 机排列的1 0 个碱基组成的寡核苷酸单链为引物，以生物的基因组d n a 为模板进行p c r ( 与 常规p c r 相比，退火温度较低一般为3 6 c ) 扩增。当模板上有引物的结合位点，并且一 定范围内有与引物互补的反向重复序列时，此范围内的d n a 片段就可以被扩增出。r a p d 带的多态性是由引物与模板的结合位点数及可扩增区域片段的长度决定的，基因组的遗 传变异通过琼脂糖凝胶电泳检测r a p d 产物的多态性获得。 r a p d 分析可在所有生物的基因组中进行，所需模板量少，并出于低温退火而在一定 程度上提高了检出分辨率。能够方便、快速地检出不同个体间大量的遗传差异，增加引 物种类数还可增加遗传变异检出率；它能检出r f l p 技术所不能检出的重复顺序，事先未 知研究对象的任何遗传背景，可以提供大量位点上的非细节信息。另外，实验程序简单 灵敏，安全快速，花费不高，具有良好的可操作性和实用性。但是，r a p d 标记为显性标 记，不能有效地鉴定出杂合子，结果分析中的序列同源假设( 长度相等的扩增片段视为 同源性片段) 可能会高估不同样本间的亲缘关系；此外r a p d 还极易受反应条件的影响， 不同实验室和不同实验条件下的结果难以统一，而且r a p d 的单带有可能是多个分子的混 合物，这是r a p d 技术目前在应用上存在争议的原因。 在分子系统学中，r a p d 方法已广泛应用于种群间系统亲缘关系、分类和系统发生等 方面的研究，并表现了一定的优越性。k r e m e r 用r a p d 对两种存在形态差别的栎树 ( q u e r c u sr o b 衙口np e t r a e a ) 进行了遗传变异分析，结果在4 5 个引物中有7 个在二者之 间表现出现明显的差异，这7 个引物所鉴别的3 6 条片段里，有1 4 个出现频率差异，而利 用叶绿体d n a 和等位酶分析则无法在基因水平上找出两种树有差异的证据。可见，r a p d 能检测出等位酶和细胞器d n a 所不能检测出的遗传变异。 由于r a p d 技术本身存在的一些弱点，有人认为r a p d 技术在应用于种间乃至近缘属之 间亲缘关系的研究时有一定的局限性。对于r a p d 结果统计中弱带的取舍问题，姚鸿等认 为当所分析的材料差异足够大，扩增产物数目足够多时，可以只分析主带；而汪小全等 则认为，产物条带重复性的好坏才是最重要的取舍标准。解决结果不稳性的方法之一是 采用序列特异性扩增区域( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ，s c a r ) 技术， 目前r a p d 技术还有待于进一步完善。 增片段长度多态性技术( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 。a f l p 是r f l p 与p c r 技术相结合产生的迄今最为有效的分子标记。靶d n a 经可产生黏性末端的r e 酶切，产生的片段被连接上通用接头( a d a p t e r ) ，连接产物作为p c r 扩增的模板，引物是 6 第一部分文献综述 在接头互补顺序和r e 识别位点的基础上增加l 3 个选择性核苷酸设计而成的，这样，只 有那些与引物的选择性碱基严格配对的酶切片段才被扩增出。通过调整引物3 端选择 碱基的数目可获得丰富的多态性。典型的a f l p 实验一次可获得5 0 - - 1 0 0 条谱带。v o s 等己 进行1 0 1 0 8 次的实验，充分证实这项技术的可靠性。 a f l p 技术既有r a p d 技术的多态性，又有r f l p 技术的稳定性和可靠性，灵敏度高，它 所检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段间d n a 序列的变异，本质上与r f l p 一致。 不过，它可以通过控制引物随机苷酸的种类和数目来控制选择不同的d n a 片段及扩增片 段的数目。a f l p 能检测到大量的基因位点，选用不同的引物组合能够检出亲缘关系很近 的品种的d n a 样品间极细微的差别。p a g e 的应用加强了它的灵敏性。对于较复杂的基因 组，还可以通过两步扩增法来提高指纹图谱的特异性和清晰度。但是，a f l p 技术是一项 专利技术，目前分析试剂盒价格昂贵，引物的同位素标记又涉及到放射性安全问题。此 外，基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以对内切酶的质量要求较高。这些都使它 目前的应用带有一定的局限性。 a f l p 技术用途广泛，已用于系统发育、分类和品种间亲缘关系的研究。陈洪等利用 它构建了8 种疾病性念珠菌的指纹图谱，多态性丰富，重复性好。a f l p l e r f l p 技术要灵 敏得多，在r f l p 多态性很差的大麦中进行a f l p 分析，只有1 6 个引物就定位出了1 1 8 个位 点，这显示了它极高的灵敏性和多态检出率。由于a f l p 技术的高效性和可靠性，尽管昂 贵，仍然被不少学者应用于系统学研究。 2 2 2 2 核酸序列测定( 直接方法) 通过测定核酸一级结构中核苷酸序列组成来比较同源分子之间相关性的方法即为 棱酸序列分析方法。以前常用的d n a 测序技术是双脱氧链( d d n t p ) 终止法，由于用到放射 自显影涉及到安全问题，现在多采用荧光标记的自动测序仪，而且有供序列比较的软件 的开发和应用。近年来，随着人类基因组计划的开展，在d n a 的序列测定上发生了一系 列重大的改进。国际上最新的如杂交法、质谱法和流动式单分子荧光检测法等。 直接测定d n a 序列可以测出所有的d n a 变异。从而获得最为准确的遗传信息，但是这 一技术耗资较大，目前d n a 样品制备技术矛h d n a 序列图象的获得及数据分析方法都不十分 理想，序列数据本身存在的多重替换问题、协同进化问题和序列进化速率的变异等问题 以及数据分析中的序列对准方法的不足都使得它目前的应用受到一定的影响。 在分子系统学研究中，用来进行序列测定的靶d n a 序列主要是一些进化上的高变区。 如m t d n a 的细胞色素b 区，李明等通过测定其序列对4 种鹿属动物的系统进化关系进行研 7 湖北大学硕+ 学位论文 究，王义权等对几种游蛇的演化关系进行了分析。另外，m t d n a 的其它一些序列区段以 及核d n a 的某些序列在系统进化研究上也得到了较广泛的应用。 目前植物c p d n a 的m a r k 基因和r b c l 基因序列及n r d n a 的i t s 区序列已作为重要的分子 形状被广泛用于不同分类阶元上的植物分子进化与系统发生研究，其核苷酸置换速率及 用于估计物种分歧时间对研究特定类群的起源与演化也具有重要的意义。选取研究序列 时应注意，变异太快的序列及在不同科中变异速率不一样的序列，一般不适于科以上水 平的系统发育研究如植物c h s ( 查尔酮合酶) 基因的外显子2 用于进行科以下分类等级的 系统学研究更为合适。 2 3 分子系统学研究中存在的主要问题 2 3 1 分子进化过程的模型 现阶段分子系统学研究中所应用的蛋白质和d n a 分子进化模型并不能真实地反应分 子进化的过程，它们只是一种理论上的假设，随之而来的取样方法的设计、数据的校正 和加权、系统发育分析方法便都有一定的局限性，使得研究和结果缺乏坚实的基础。 2 3 2 同源关系确定 序列对准和分析中的位点同源关系确定，对于编码蛋白质的序列，可借助密码子与 氮基酸对应关系来确定其位点同源性；而对结构d n a 基因和无功能d n a 序列，由于系统进 化过程中高频发生的碱基插入、缺失、不等交换、转位和复制错位等现象，它们的位点 同源性确定困难较大。 2 3 3 数据的价值 分子系统学研究中只有序列数据和二维结构数据才具有绝对价值，因为这类数据表 现了分子中的所有变异，而其它类型的数据只有相对价值，因此，分子标记数据要在不 同研究之间进行比较，就必须进行样本数量、实验条件、数据收集和变换的标准化，目 前的大多数方法缺少标准化，在一定程度上降低了这类研究的比较价值和通用意义。 2 3 4d n a 顺序的进化速率 不同物种的同源d n a j 顷序，无论是编码顺序还是无功能顺序，其进化速率是不同的。 那些快速进化的位点在长时间的进化中，同一位置上会出现多次置换，如果存在回复变 异，则所观察到的差异数会少于实际曾发生的置换数；与此不同，有些序列在很长时间 内是保守的，因此，现有的用恒定的进化速率估计出的分歧时间与实际情况往往有较大 误差。 第一部分文献综述 2 3 5 取样 检测样本大小是所有方法中都存在的问题。分子系统学研究取样数较少，一般在l 3 0 之间，x 本过小的结果是无法检出所有的变异，尤其是稀有变异。在应用不同地区的 同种个体对某物种进行系统进化的研究时，所取样本的遗传潜质或者说它的遗传代表 性有多大，能否代表所在地区所有或者大多数个体经历系统发育进程。对于序列分析来 说，存在选取序列长度的问题。如果分析序列的长度太短，结果易受随机因素的影响。 2 3 6 分子系统学的发展趋势 随着分子系统学的发展，一些有重大意义的问题的解决必将日益紧迫。首先，如何 用恒定进化速率和进化距离来更为准确地估计分歧时间和推断进化历史，是分子进化遗 传学中的一个重要的研究课题。其次，现阶段的分子系统学研究很少把基因组进化与表 型进化联系起来。在今后的研究中，为了追踪从d n a 进化到表型进化的途径，需要研究 结构基因和它们的调控基因间的关系及变化需要分子水平的比较解剖学和比较胚胎 学，分析蛋白质( 主要是酶) 在结构和功能上如何进化分析它们在生化调控途径中的组 织化如何出现，及分析它们在不同组织或不同发育阶段中的表达是如何被调控的，从而 将分子水平和形态水平的研究有机地结合起来。 随着分子生物学知识和技术的积累发展，系统学家已将生物信息大分子看作重要的 演化依据，人们在不断寻找新的、有良好检测功能的分子标记及检测手段，随着技术的 不断进步，来自分子方法的数据在不久的将来可能成为系统学研究最主要的数据来源， 并将引起分类、系统、发育和进化研究中的又一次革命性的变化，而且关于种群遗传结 构方面的研究必将为保护生物学提供遗传变异证据。在生物多样性的研究和保护中起到 重要指导作用。 9 湖北大学硕十学位论文 1 前言 第二部分拟果蝇细胞系的建立 目前的基因工程研究中，随着分子生物学研究方法的发展，对细胞系( 株) 的研究、 应用也逐步深入，各类细胞系( 株) 在细胞遗传学、分子遗传学、生物医学等方面的应用 研究均已广泛展开。果蝇作为生物学研究的模式材料，具有体形小、容易饲养、生活史 短、生活力强、突变性状明显等优点。果蝇细胞系的建立对于进行果蝇方面的分子生物 学等研究具有很重大的意义。目前国际果蝇基因组资源中心拥有的果蝇细胞系有c l o n e 8 ，s c h n e i d e rl i n e1 一( d l l ) ，s c h n e i d e rl i n e2 一( d l 2 ) ，k c ( k c1 6 7 ) ，m l d m b g 2 ， s c h n e i d e r sl i n es 2 一( s 2 ) ，s c h n e i d e r sl i n e $ 2 - ( s l 2 ) ，s c h n e i d e r sl i n es 3 ， s c h n e i d e r ss 2 一( s 2 爿c ) ，s c h n e i d e r ss 2 一( s 2 - r + ) ，s c h n e i d e r ss 2 一( s 2 c ) 等果 蝇细胞系，都是以黑腹果蝇为材料。其中c l o n e8 ，m l - d m b g 2 都是正常的二倍体核型， 其它的9 种细胞系都存在着异倍现象。这些细胞系除c l o n e8 ，y 几- d m b g 2 分别是利用三龄 幼虫的翅膀成虫盘和脑腹部神经中枢建系外，其它1 0 种都是利用果蝇的晚期胚胎建系。 本实验室在利用果蝇早期胚胎建立果蝇细胞系方面建立了一套自己的方法，曾成功建立 过黑腹果蝇细胞系，嗜风梨果蝇细胞系，以及黑条体突变型果蝇细胞系。在建系过程中 能非常方便的观察到多种细胞的分化。本文作者从2 0 0 7 年5 月开始建立拟果蝇细胞系， 历时5 0 0 d 左右建成能够稳定传代的细胞系。 2 材料和方法 2 1 实验材料 拟果蝇( d r o s o p h y l as i m u l a n 曲，隶属于黑腹种亚群( m e a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u p ) ， 与著名的黑腹果蝇( d r o s o p h y l am e l a n o g a s t e r ) 一样，具有繁殖好，产卵量大，生长稳 定等优点，由本实验室采集并保存 2 2 试剂及其配制 l 果蝇产卵板的配制：称取琼n 旨1 5 9 放入1 0 0 0 m l 烧杯中，加水2 2 0 m l 置火上煮溶琼脂 后，加入葡萄糖2 3 2 9 ，蔗糖7 1 9 ，酵母粉7 2 9 ，1 2 5 nn a o h8 8 m l ，待其全部溶化后 转入高压蒸气灭菌锅中，1 0 磅灭菌1 0 分钟，灭菌液冷到6 0 左右时加入4 4 m l 混合酸溶 l o 第二部分拟果蝇细胞系的建立 液，调p h 到4 2 - 4 4 ，立即倒产卵板。 2 混合酸溶液的配制：取1 0 0 丙酸4 8 m l ，8 5 磷酸8 3 m l ，加水至2 0 0 m l ，混匀后 放置4 备用。 3 酵母涂抹膏的配制：取干面包酵母粉7 0 9 ，加蒸馏水l o o m l 于2 5 0 m l 烧杯中，搅拌 均匀后，1 5 磅灭菌2 0 分钟，冷却后置于4 c 备用。 4 玉米一琼脂一糖培养基的配制：称取玉米粉l l o g 放入3 0 0 m l 水中搅拌均匀，在另一 烧杯中加水7 0 0 m l ，琼脂6 9 ，放在火上煮溶琼脂后，将玉米糊倒入，不断搅拌至煮实再 加入1 4 9 蔗糖，小火煮l o 分钟，当培养基冷到6 0 左右时加入3m l 丙酸，搅拌均匀后倒 入玻璃试管( 长l o a m ，直径3 a m ) 即成。 5 细胞培养液m 3 ( b f ) 的配制：按文献 6 进行。 6 其它试剂：1 0 来苏尔，2 5 次氯酸钠，0 3 新洁尔灭，双抗，胎牛血清( 杭 州四季青生物工程材料研究所，经5 6 ，3 0 分钟灭活) ，0 7 k c l 低渗溶液，卡洛氏固 定液，3 吉姆沙染色液( 用p h 6 8 磷酸缓冲液配制) ，0 5 秋水仙素溶液。 2 3 建系过程 2 3 1 原代培养 1 胚胎大量收集：将2 0 0 0 只左右( 约6 0 支试管量) 成果蝇放入群体产卵箱中，置2 5 黑暗中让果蝇产卵4 小时后，在湿润条件下让卵进行2 d 时胚胎发育，然后用水将卵洗 至l j l o o o m l 烧杯中，再用1 5 0 目尼龙布过滤收集胚胎。 2 灭菌：将胚胎投入l o 来苏尔液中灭菌5 - 1 0 m i n ，用过滤杯( 将液闪瓶割去瓶底和 瓶盖上部，在瓶口盖上1 5 0 目尼龙布，拧紧瓶盖即成) 过滤掉来苏尔收集卵，再用2 5 0 m l 三蒸水充分洗尽来苏尔溶液。 3 去卵壳：将灭过菌的胚胎放入2 5 次氯酸钠溶液中处理3 分钟，再用过滤杯收集 胚胎，再用三蒸水彻底洗尽次氯酸钠溶液。 4 匀浆：将去掉卵壳的胚胎放入玻璃匀浆器( 江苏海门制) 内，加入3 5 m l m 3 ( b f ) 培养 液，轻轻转动并抽动匀浆器三次，胚胎基本破碎成细胞团块，一般以每个细胞团块5 0 1 0 0 个左右细胞为好，这一过程要在冰浴中进行，以免破碎的细胞释放的酶破坏正常细胞。 5 收集细胞：将匀浆液用过滤杯过滤，除去卵壳和大的细胞团块，将过滤液移入l o m l 离心管中，5 0 0 r p m ，离心5 分钟，弃去上清液。 6 细胞培养：用含有1 0 胎牛血清培养液悬浮细胞，并将细胞悬浮液接种到3 3 咖 湖北大学硕十学位论文 塑料培养皿( n u n c 制) 或6 0 m m ( c a n a d a ，华美北京分公司售) 塑料培养皿中，放置2 5 生化 培养箱( l r h 一1 5 0 b ，广东省医疗器械厂) 中培养，在培养过滤中要保持一定的湿度。 7 结果观察：用倒置显微镜1 0 4 0 进行观察并拍照 2 3 2 传代培养 当原代培养到第2 8 天左右时，那些从细胞团块周围游离出来的圆形小细胞已经分裂 占据培养皿底部2 3 ，肌肉细胞和上皮细胞已经消灭，4 5 天左右，分裂的细胞基本占据 整个培养皿底部，此时用橡皮片( 用葡萄糖注射液瓶橡胶塞剪成) 或细胞刮刮起细胞，用 移液管轻轻吹散细胞后按1 2 量稀释，用含1 0 胎牛血清的地( b f ) 培养液将细胞传代到新 培养皿，最初几次传代，每隔1 5 天左右一次，一般在传代5 次以后，成纤维细胞和脂肪 细胞都已消失，只剩下生长较为一致的圆形小细胞，随着传代次数增多，细胞增殖越来 越迅速，可进行1 4 ，1 8 和1 1 0 量稀释传代，每周一次，直至成为能够无限生长的细胞 系。 2 3 3 细胞冻存 为了减轻工作量，防止污染和避免细胞发生遗传变异，可将细胞冻存，方法是： 1 当细胞长到一定密度时，用细胞刮刮起细胞后用吸管打散细胞移入离心管， 7 0 0 一1 0 0 0 r p m ，离心5 分钟。 2 弃去上清液，按细胞浓度5 倍的量加入新鲜培养液，再a n - 甲亚砜溶液( 最终浓 度1 0 ) 制成细胞悬浮液，用移液管将细胞悬浮液移到塑料指管中，置- 7 0 c 缓慢冻存细 胞，第二天迅速将指管移到一1 9 6 的液氮中冻存。 3 细胞苏复时，将指管从液氮中取出放在2 0 c 左右水浴中不断振动，急速使细胞 液溶解，这样可使细胞达到9 0 的存活率。 2 3 4 细胞系染色体制片 l 将传代增殖的细胞按1 5 的量稀释接种4 m l 至u 6 0 m m 塑料培养皿，使细胞增殖到皿底 2 3 - 3 4 。 2 吸去原培养液，加入含有最终浓度为0 5 - 5 u g m l 秋水仙素的新鲜培养液，在2 5 度 下培养1 5 - 1 8 、时。 3 用橡皮片将细胞刮起，用移液管将细胞悬液移到l o m l 离心管中，1 5 0 0 r p m 离心 l o m i n ( 以下条件同) 。 4 弃去上清液，打散细胞后加入5 m l 低渗液，轻轻摇动离心管，使细胞膨胀，然后 在室温下放置3 0 m i