（分析化学专业论文）微流控高通量试样引入系统及其应用研究.pdf

1 r 浙江大学博士学位论文 摘要 摘要 微流控( m i e r o f l u i d i e s ) 是在微米级通道结构中操控微升至皮升体积流体的 技术与科学。其目标是通过对微通道网络中微流体的操纵和控制，在微芯片上 集成试样引入、预处理、反应、分离、检测等功能，实现生化反应和分析在宏 观系统中难以实现的的时间和空间精确控制，并实现分析系统的微型化、自动 化、集成化与便携化。目前，微流控发展的重要瓶颈之一是宏观体系与芯片微 通道的接口问题，开发高通量连续试样引入方法，对于微流控分析的发展和应 用至关重要。本文进行了微流控高通量试样引入技术的研究，并将其应用于微 流控流动注射分析、顺序注射分析和多相液滴生成与控制系统。 第一章首先综述了目前微流控高通量试样引入技术的研究现状。按照技术 路线，划分为储液池阵列式、流通池式和取样探针式试样引入系统三种类型进 行介绍。同时，对于高通量试样引入技术所应用的三类主要微流控分析系统的 最近研究进展，也进行了相应介绍，包括基于连续流动、区带注入和非均相间 隔模式的微流控分析系统。 第二章中，首次提出一种基于取样探针和缺口型试样管阵列的微流控高通 量试样引入技术。系统由加工有取样探针的微芯片和可按设定程序自动平移的 试样管阵列组成。在试样管上加工供取样探针进出的取样缺口，只需通过一维 移动试样管阵列扫过取样探针即可实现高通量的试样引入。在该技术基础上， 建立了高通量微流控芯片重力驱动流动注射分析系统。系统采用试样管和空白 管间隔配置的试样管阵列，在进行试样引入的同时，完成流动注射进样操作； 系统集成了液芯波导光度检测系统以实现高灵敏高通量检测。研究提供了一种 构建芯片流动注射系统的新思路，系统无需加工微进样阀或借助外部液流驱动 系统，整体结构和操作大大简化，对不同试样的分析通量大幅提高，最高达到 1 7 浙江大学博士学位论文 摘要 1 0 0 0 样，j 、时，而其最低试样消耗仅为0 6n l 样，分析精度达到0 6 ( r s d ，月= 1 1 1 。与国际上文献报道的同类芯片流动注射系统相比，新系统在分析通量、试 样消耗和分析精度等项性能上，均达到领先水平。 第三章在上述研究的基础上，采用毛细管直接与缺口型试样管阵列结合的 方法，首次建立了基于毛细管的微流控顺序注射系统。该系统无需任何微加工 设备和技术即可构建，在单通道毛细管内实现纳升级试样和多个试剂的顺序引 入、快速混合和反应，成功地解决了单通道毛细管系统不易实现多区带引入、 汇合和反应的问题。同时，还对单毛细管通道内串行多液体区带间的混合行为 进行了理论分析和实验验证，结果证明在纳升级区带体积范围内，在单通道内 串行液体区带间可实现有效的混合，其混合行为可用泰勒分散模型准确预测和 优化。该系统还被应用于基于卢半乳糖苷酶的高通量药物筛选实验，每次测定 试样和酶试剂以及底物溶液的消耗量均为4 2n l ，最高分析通量达到3 0 0 样i d , 时。除激光诱导荧光检测方法外，还将该顺序注射系统与化学发光和液芯波导 吸收光度检测方法联用，拓展了方法的适用范围。 第四章利用毛细管一缺口型试样管阵列顺序引入技术，首次建立可灵活和 精确控制每个液滴大小和组成的自动化微流控液滴生成系统。系统由缺1 ：3 型试 样管阵列、毛细管和微量注射泵组成。首次采用了进e l 端拉尖的毛细管，使产 生液滴体积可低至p l 级。实验结果显示，该系统具有通过程序设定自动连续 产生组成和大小不同的液滴的能力，这是目前文献报道的微流控连续液滴分析 系统所不具备的。该系统被初步应用于纳升级液滴中的蛋白质结晶实验。 关键词：微流控分析，高通量试样引入，微流控芯片，毛细管，流动注射分析 顺序注射分析，微流控多相液滴分析 v 浙江大学博士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t t h eo b j e c t i v eo fm i c r o f l u i d i ca n a l y s i si st oi n t e g r a t ea l lo ft h ef u n c t i o nu n i t s p e r f o r m e di l lal a b ，i n c l u d i n gs a m p l ei n l x o d u c t i o n , p r e t r e a t m e n t ，r e a c t i o n , s e p a r a t i o n a n dd e t e c t i o n , o nam i c r o c h i pt oa c h i e v et h em i n i a t u r i z a t i o n , a u t o m a t i z a t i o na n d i n t e g r a t i o no fw h o l ea n a l y t i c a ls y s t e m s o n eo ft h em a j o rb o r i c n e c ki nt h e d e v e l o p m e n to fm i c r o f i u i d i cc h i p sl i e s i n w o r l d - t o - c h i pi n t e r f a c e ，w h i c hh a s s i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo nt h ed e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no fm i c m f l u i d i cc h i p st h e t o p i c o ft h i sd i s s e r t a t i o ni sf o c u s e do nt h e d e v e l o p m e n to fm i c r o f i u i d i c h i g h t h r o u g h p u ts a m p l ei n t r o d u c t i o nt e c h n i q u e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o n si nf l o w 蜘e e t i o na n a l y s i s ( f t a ) ，s e q u e n t i a lm j e c t i o na n a l y s i s ( s i a ) a n dm u l t i p h a s ed r o p l e t g e n e r a t i o na n dm a n i p u l a t i o n i nc h a p t e r 1 ，t h ed e v e l o p m e n to fh i g ht h r o u g h p u ts a m p l ei n l r o d u c t i o n t e c h n i q u e sb a s e do nr e s e r v o i ra r r a y , f l o w - t h r o u g hi n t e r f a c ea n ds a m p l i n gp r o b ew a s r e v i e w e d t h er e c e n tp r o g r e s si nm i c r o f l u i d i cf l o w - m j e c t i o n , s e q u e n t i a lm j e c t i o n a n dm u l t i p h a s ed r o p l e ta n a l y s i ss y s t e m sw a sa l s oi n t r o d u c e d i nc h a p t e r2 ，an o v e ls a m p l ei n t r o d u c t i o na p p r o a c hu s i n gac a p i l l a r ys a m p l i n g p r o b ea n d a na r r a yo fh o r i z o n t a l l yp o s i t i o n e dm i c r o - s a m p l ev i a l sw j t l las l o t f a b r i c a t e do nt h eb o t t o m o fe a c hv i a lw a sd e v e l o p e dh i 曲t h r o u g h p u ts a m p l e i n t r o d u c t i o nw a sa c h i e v e db yl i n e a rm o v i n go ft h es l o t t e d - v i a la r r a y , a l l o w i n gt h e p r o b ei n l e tt 0s e q u e n t i a l l ye n t e rt h es o l u t i o n sf i l l e di nt h ev i a l st h r o u l g ht h es l o t s b a s e do nt h i st e c h n i q u e ，ar o b u s ta n da u t o m a t e dm i c r o f l u i d i cc h i p - b a s e df i as y s t e m w i t hg r a v i t yd r i v e nf l o w sw a sd e v e l o p e d s a m p l el o a d i n ga n di n j e c t i o nw e r e p e r f o r m e db ya l t e r n a t ei n t r o d u c t i o no fs a m p l e sa n dc a r r i e r , w i t h o u tr e s o r t i n gt o 3 1 丫浙江大学博士学位论文a b s t r c t v a l v e sa n dp u m p sa2 0 一m ml o n gt e f l o na f2 4 0 0c a p i l l a r yw a sc o n n e c t e dt ot h e c h i pt oa c h i e v el i q u i d c o r ew a v e g u i d ef l c w ) a b s o r b a n c ed e t e c t i o n t h es y s t e m p r o v i d e sh i g h e s ts a m p l i n gt h r o u g h p u to f1 0 0 0p e rh o u r , l o w e s ts a m p l ec o n s u m p t i o n o fo n l y0 6n l ，a n dg o o dr e p r o d u c i b i l i t yo f06 r s d 白= i s ) ，w h i c hw c l el o w e r t h a nt h o s ei nt h ep r e v i o u s l yr e p o r t e dc h i p - b a s e df i a s y s t e m i nc h a p t e r3 ，a na u t o m a t e dm i c r o f l u i d i cs e q u e n t i a li n j e c t i o na n a l y s i ss y s t e m ( i t s i a ) b a s e do nas h o r tf u s e d s i l i c ac a p i l l a r yi sd e s c r i b e dt h es y s t e mw a sb u i l t w i t h o u tn e e do fc o m p l i c a t e dm i c r o f a b r i c a t i o nt e c h n i q u e s s a m p l ea n dr e a g e n t s z o n e sw e r es e q u e n t i a l l yi n t r o d u c e dv i ag r a v i t yd r i v e nf l o wb ys c a n n i n gt h ec a p i l l a r y t i pt h r o u g ht h ev i a ls l o t s ，a n dr a p i d l ym i x e db yd i f f u s i o na n dc o n v e c t i o nw i t h i nt h e c a r r i e r f l o w , d e m o n s t r a t i n gab e h a v i o rt h a tc o n f o r m e dw e l lt ot h et a y l o rd i s p e r s i o n p h e n o m e n o np o t e n t i a l sf o ru s i n gt h es y s t e mm h i g ht h r o u g h p u ts c r e e n i n gw e r g d e m o n s t r a t e d b y t h e e n z y m e i n h i b i t i o n a s s a y o ff l - g a l a c t o s i d a s eal o w s a m p l e r e a g e n tc o m s u p t i o no f4 2n lw a sa c h i e v e dw i t hah i g ht h r o u g h p u to f3 0 0 a s s a y sp e rh o u r i no r d e rt of u l - t h e re n h a n c et h ev e r s a t i l i t y , c h e m i l u n i n e s e n c ea n d l c wa b s o r b a n c ed e t e c t i o ns y s t e m sw e r ed e v e l o p e dt oc o u p l ew i t ht h e 蝎i as y s t e m i nc h a p t e r4 ，an o v e la p p r o a c hf o rf l e x i b l ea n dp r e c i s eg e n e r a t i o no f d r o p l e t si n t h ep i c o l i t e rt on a n o l i t e rr a n g ew a sd e v e l o p e d t h es y s t e mc o m p r i s e da c a p i l l a r y w i t hat a p e r e dt i p ，as y r i n g ep u m pa n das l o t t o d v i a la r r a ys a m p l i n gs y s t e m h i g h s p e e dg e n e r a t i o no fd r o p l e t sw i t hd i f f e n e n ts i z ea n dc o m p o s i t i o nw a sa c h i e v e df o r t h ef i r s tt i m e ，w h i c hi sq u i t ei m p o r t a n tf o rt h ea p p l i c a t i o no fm i c r o f l u i d i cd r o p l e t s y s t e mi nh i 曲t h r o u g h p u ts c r e e n i n ga n dd r u gd i s c o v e r y p o t e n t i a la p p l i c a t i o no ft h e s y s t e m ms c r e e n i n go fp r o t e i n c r y s t a l l i z a t i o nc o n d i t i o n sw a sp r e l i m i n a r i l y d e m o n s t r a t e d 4 1 r 浙江大学博士学位论文 k e y w o r d ：m i c r o f l u i d i c s ，h i g h - t h r o u g h p u ts a m p l em u - o d u c t i o n , m i c r o f l u i d i cc h i p ， c a p i l l a r y , f l o wi n j e c t i o na n a l y s i s ，s e q u e n t i a li n j e c t i o na n a l y s i s ，m u l t i p h a s ed r o p l e t a n a l y s i s 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导入 完成的成果，该成果属于浙江大学理学院化学系，受国家知识产权 保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发表论文或申请专利，均 需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本人不得以任何 方式，以任何其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名 和父研弋 日期：2 0 0 7 年5 月2 1 日 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研咒成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘茔或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：亦士文，式签字日期： ：。年6 月f 。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘姿盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权迸江盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 粒丈域 签字目期：2 0 0 7 年月o 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 导师签名名2 芗 签字日期：一己一1 年月一日 电话： 邮编： v 祈江大学博士学位论文第1 章绪论 1 1 引言 第1 章绪论 微流控学( m i e r o f l u i d i c s ) 是利用尺度在数十至数百微米的微通道结构，处 理和操纵l l l 至凡级流体的科学和技术i l 一。微流控芯片( m i c r o f l u i d i ec h i p s ) 分 析是二十世纪9 0 年代初期主要在分析化学领域发展起来的前沿领域，它以分析 化学为基础，以微机电加工( m e m s ) 技术为依托，以微管道网络为结构特征， 以生命科学为目前主要应用对象，目标是把整个生化实验室的功能，包括采样、 稀释、加试剂、反应、分离和检测等集成在微芯片上，构建芯片实验室 ( l a b o n - a c “p ，l o c ) ，实现生化分析、细胞和生物大分子操控、反应合成和药 物筛选等系统的整体微型化、自动化、集成化与便携化。 目前，微流控分析系统发展和进一步实用化存在的主要瓶颈之一是宏观体 系与微观芯片微通道的接口问题【 】。微流控芯片系统内进行的是体积为p l 一 几的液体试样的操作。与其联系的外部宏观体系( 分析对象和试样储存系统) 则通常是在皿m l 级体积水平上。研制自动化的高通量微流控试样引入技术， 实现宏观体系与微观流体之间的衔接，对于提高微流控系统的分析性能和实用 性至关重要。也是一个具有挑战性的课题。本章将对当前微流控高通量试样引 入技术的发展现状进行详细综述。同时，对于高通量试样引入技术所应用的三 类主要微流控分析系统的最近研究进展也进行了相应介绍，包括基于连续流动、 区带注入和非均相间隔模式的微流控分析系统。 v 浙江大学博士学位论文 第1 章绪论 1 2 微流控试样引入技术 微流控试样引入是指将外部宏观体系的试样引入到微流控系统通道内的操 作。虽然不同的研究者对此有不同的表述，如宏观系统与微观系统的衔接 ( m a c r o - t o - m i c r oi n t e r f a c e ) 1 4 - 6 1 、交互连接( i n t e r e o r m e e t ) t - 1o 】或宏观世界与芯片的 衔接( w o r l d t o - c h i pi n t e r f a c e ) 等1 5 ，“5 1 ，但其实质是一致的，即实现宏观液体 到微观流体的转换。目前，文献报道的大多数微流控系统，均采用基于固定储 液池接口的手工间歇式试样引入方法，操作步骤繁琐、费时，效率低。只有发 展自动化的高通量试样引入技术，才能真正发挥微流控系统的高速分析的优势。 按接口结构的不同，微流控高通量试样引入系统主要分为以下三类：阵列储液 池式、流通池式和取样探针式试样引入系统。 1 2 1 基于储液池阵列的高通量微流控试样引入系统 在芯片上固定储液池中进行间歇试样引入的方法，是目前文献中采用较多 的技术。其方法是，在芯片储液池中的一个试样测定完成后，中断分析过程， 更换池中的试样，然后再开始新试样的分析试样更换一般依靠手工操作进行， 也有采用机械手实现自动化操作的报道【l6 】，但其分析通量依然较低。采用储液 池阵列提高试样引入通量的一个典型实例是安捷伦公司推出的2 1 0 0 芯片生化 分析仪( a g i l e n tb i o a n a l y z e r2 1 0 0 ) 1 7 】。其中，使用了1 2 通道毛细管电泳玻璃芯 片，在芯片上加工了1 2 个固定试样储液池，共用一个分离通道，测定前一次性 手工加入1 2 个试样，测定时通过各通道间液流的切换在芯片上实现换样，而不 需由外界再引入试样。1 2 个d n a 片段试样的毛细管电泳分离检测可在3 0m m 内完成。一次分析任务完成后，芯片即被废弃。 2 v 浙江大学博士学位论文 第1 章绪论 f i g u r e1 1a g i l e n tb i o a n a l y z e r2 10 0a n di t sc h i pf a m i l y 【切 f i g u r e1 2s c h e m 乱i cd i a g r a mo fac h i pl a y o u tc o n s i s t i n go f2 0 x2 0w e l l sa n dv a r i o u s i n p u t o u t p u t ，a n dc o n b o lp o r t s i n s e to nt h et o pl e f t ：as i n g l er e a c t o rc o d e dt oi n d i c a t e c o n t r o ll i n e s t e m p l a t es a m p l e ，d n ap o l y m e r a s e ，p r i m e r s 。a n dr o t a r yp u m p s c a l eb a r 6 4m m 1 1 目 3 v 浙江大学博士学位论文 第1 章绪论 q u a k e 研究组其提出的多层软光刻技术制作聚二甲基硅氧烷 ( p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) ，p d m s ) 气动微阀 1 s l 的基础上，通过高密度阵列化建立 了一种微流控芯片大规模集成化控制系统【1 5 ，。如图1 2 所示，在高密度矩阵 式的p d m s 微流控芯片上，集成了气动的微阀微泵控制系统和p c r 温控系统 【1 5 】。系统的试样和试剂微通道纵横排列( 2 0 行x 2 0 列) ，在垂直方向通道引入 2 0 种d n a 和p c r 反应聚合酶，水平通道引入引物。系统包含4 0 0 个可独立操 作的p c r 反应器。采用分支和的流水线式的试样引入系统【l ”，大大降低了移液 操作的复杂程度。系统仅需4 1 次移液加样操作；而采用常规方法，需要进行 1 2 0 0 次移液操作。该方法显示了微流控系统在大规模并行处理方面的巨大潜 力。 1 2 2 流通式微流控高通量试样引入系统 目前，文献报道的流通池式试样引入系统主要应用于芯片毛细管电泳中。 采用在芯片上加工与芯片微通道相连接的试样引入通道的方法，连续不间断的 向芯片内引入多种试样溶液，然后在芯片上进行进样分离操作。流通试样引入 系统通常采用蠕动泵、注射泵、真空泵，以及重力等作为试样更换的驱动。 1 9 9 9 年，方群等在流动注射毛细管电泳联用系统的基础上【2 0 1 ，首次报道 了一种基于短毛细管的h 通道包埋芯片微流控毛细管电泳分析系统【2 ”。将毛细 管进口端插入1 5 - m m 内径y y g o n 管，作为试样引入流通池接口，采用常规顺 序注射仪器装置，实现了毛细管电泳的连续试样引入和分离。电泳分析通量达 到6 0 样d , 时，试样之间的携出低于3 。系统具有成本低廉、无需特殊的加工 条件和技术、分离快速、重现性好等特点。在此基础上，h 一通道技术与流动注 射和顺序注射技术结合，配合多种检测手段，被成功用于氨基酸、塘、金属离 子、药物等试样的分离分析【2 2 删。 4 v 浙江大学博士学位论文 第1 章绪论 f i g u r e 1 3c o n s t r u c t i o no ft h em i c r o f l u i d i cc es y s t e mw i t hs p l i t - f l o ws a m p l ei n t t o d u c t i o n i n t e r f a c e ( n o tt os c a l e ) ( c t ) q u a r t zs e p a r a t i o nc a p i l l a r yt u b e 7 5m mi d ：( b ) p l a n a r g l a s sb a s e ；( g ) e p o x yg l u e ；( p ) t y g o nt u b e ；( m ) m i c r o u n et u b e ；p l a t i n u mt u b ea n o d e ； ( p dp l a t i n u mg r o u n d i n ge l e c t r o d e ；p ( ) g l a s sp l u g ；( c s ) c a r e e r s a m p l e ；( v v ) w a s t e 1 2 1 1 2 0 0 0 年，c a l i p e r 公司的s u n b e r g 等人【3 2 】申请了一个流通池式试样引入芯 片系统的专利，其原理如图1 4 所示。贯通芯片的流通池接口可以依靠弯曲液 面的表面张力存留试样溶液，换样时只需吹落前一个试样，用移液器等加入新 试样即可，也可以进行溶液的部分更换。引入的溶液依靠电渗流进入芯片微通 道进行电泳分析。 f i g u r e1 4ac f o s s s e c t i o n a lv i e wi l l u s t r a t i n gt h eu s eo fc a p i l l a r yf o r c e st or e t a i naf l u i d s a m p l ew i t h i nat h r o u g h h o l ep o r t a n da l s oi l l u s t r a t e st h eu s eo fe i e c t r o n e u cf o r c e st o t r a n s p o r tt h ef l u i dw i t h i nt h em i c r o f l u i d i cs u b s t r a t e ( 1 ) s u b s t r a t e ；( 2 ) e l e c t r i c a lp o w e r s o u r c e ；( 3 ) r e s e r v o i re l e c t r o d e ；( 4 ) m i c r o f l u i d i cc h a n n e l ；( 5 ) f l u i dt r a n s f e r r i n gp i n ；( 6 ) t h r o u g h - h o l ep o r t ；( 7 ) f l u i d ；( 8 ) e l e c t r o c a la c c e s sp o r t 丫浙江大学博士学位论文 第1 章绪论 2 0 0 1 年，方群等 3 3 , 3 4 】报道了一种用于毛细管电泳芯片上的高通量试样引入 接口溢流式接口，其重要特征是在芯片上设计了由滤纸圈导流的溢流式试 样引入流通池，以保证在长时间试样引入过程中流通池内液位的恒定。系统可 实现连续自动的高通量试样引入，芯片系统工作的稳定性和可靠性得到了显著 提高。系统分析通量达到4 0 8 0 样，j 、时，试样消耗量为8 0 2 4 0 皿。该系统 被应用于在线监测长达4 小时的氨基酸荧光标记反应，监测过程中内标峰高重 现性为49 ( r s d ，n = 1 6 6 ) 。 t u m p 培 f i g u r e1 5s t r u c t u r e o ft h em i c r o f l u i d i c c h i ps y s t e m w i t h f l o w - t h m u g hs a m p l e i n t r o d u c t i o ni n t e r f a c e i 卅 在此基础上，方群等又设计了一种滴液流通池接口用于芯片毛细管电泳系 6 1 r 浙江大学博士学位论文第1 章绪论 统陋3 6 1 ，以消除毛细管电泳系统高电压对试样引入系统的影响。 2 0 0 1 年，a t t i y a 等1 12 】提出了一种用于毛细管电泳芯片上的流通式自动试样 引入装置。其芯片试样引入端结构如图1 6 所示，试样被引入到刻蚀加宽的试 样引入通道( 深3 0 0 岬，宽1m m ) 内，引入操作对芯片电泳无明显干扰。采 用真空抽吸法的方法提供试样引入动力，试样引入流速可高至1m l m m ，可在 3s 内实现引入通道内试样的更换。 f i g u r e 1 6 e l e c t r o m i c r o g r a p h o fag l a s sd e v i c ec o n s i s t i n go fs a m p l ei n t r o d u c t i o n c h a n n e l ( s i c ) ，n e c k a n de t e c t r o k i n e t i ci n j e c t i o nc h a n n e l as a m p l ec a nb ei n t r o d u c e d i n t os i ca tas p e e du pt o1m l f m nw i t h o u td i s t u r b i n go t h e rm i c r o c h a n n e l su s e df o r m i x i n g r e a c t i o n a n dc es e p a r a t i o n i 同年，l i n 等p 1 设计了类似的用于芯片毛细管电泳的流通式试样引入装置， 采用了3 - m m 宽的试样引入通道，由注射泵实现不问断的试样引入( 流速5 7 止加i f l ) 。电泳进样采用门式进样法，在分离过程中依然可保持试样在试样引 入通道内的连续流动。2 0 0 2 年，c h e n 等优化了该系统，并用于进行连续蛋白 质试样的芯片毛细管电泳分离嗍。 2 0 0 2 年，l i n 等【3 9 1 又设计了一种连接毛细管实现自动化试样引入的电泳芯 片系统。采用图1 7 ( a ) 所示芯片构型，将一段3 4 - c m 长，2 0 - g m 内径的石英毛 细管一端直接连接于芯片分离通道上游的入口，毛细管另一端与配有自动采样 器的注射泵和多位选择阀相连。依次交替引入试样和缓冲液，进样量为0 2 10 止。接口处理论死体积为3 0 0n l ，在进样量为0 2 止时，引入的试样经过导管 ， 1 y 浙江大学博士学位论文 第1 章绪论 和接口处之后，浓度被稀释为原来的 2 。系统通过在两次试样引入间隔中 引入清洗溶液消除交叉污染，实现高通量的自动化连续试样引入。 a f i g u r e1 7 ( a ) t h ec o n f i g u r a t i o n so ft h em i c r o c h i pf o rc o n t i n u o u sa n a l y s i st h ee n l a r g e d t e f l o nf i t t i n g w h i c hw a sg l u e dt or e s e r v o i rai ss h o w no nt h ef i g h ts i d eo ft h ef i g u r e ；( b ) s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h em i c r o c h i ps y s t e m 【3 9 l 何巧红等4 ”报道了将固定试样储液池芯片改装为连续试样引入流通池的 方法，如图1 8 所示。将一段1 3 c m 长、7 5 一p m 内径的石英毛细管直接插入芯 片固定试样池中，另一端连接试样容器。为减少接口的死体积，毛细管的出口 端尽可能地贴近芯片充样通道口。试样池出口采用溢流式结构。毛细管电泳系 统采用夹流进样方法，建立了利用电渗泵驱动的芯片毛细管电泳流通式连续试 样引入系统。 s 1 r 浙江大学博士学位论文第1 章绪论 f i g u r e1 8s c h e m a t i cd i a g r a m o ft h ec em i c r o c h i pw i t haf l o w - t h r o u g hs a m p l e i n t r o d u c t i o ni n t e r f a c em o d i f i e df r o mas a m p l er e s e r v o i r 1 】 2 0 0 4 年，黄艳贞等川报道了一种采用套管式流通池进行连续试样引入的微 流控芯片连续流动分析系统。如图1 9 ( a ) 所示，芯片垂直放置，利用芯片上的 水平储渡池和高度可调的废液池( 通过延伸管与芯片出口通道相连) 之闻的渡 位差作为液流驱动力，使鲁米诺、铁氰化钾与过氧化氢试样在芯片上以稳定的 流速汇流混合反应，并进行芯片上的化学发光检测。过氧化氢试样通过一根伸 入流通池底部的毛细管，由蠕动泵驱动导入池内。新试样进入流通池的同时， 将旧试样冲出流通池实现试样更换，由置于出口的滤纸吸收溢出液，保持流通 池内液面的稳定。系统对0 1 0 0 n o l l 过氧化氢响应信号呈线性，r 2 = 0 9 9 9 5 ， 连续流动检测信号如图1 9 ( b ) 所示。在试样引入流速为2 4 0 止m i n 条件下， 系统分析通量达到8 0 一1 0 0 样d , 时，试样更换所需时间1 5s ，每次测定试样消 耗量为6 0 皿，。 9 1 r 浙江大学博士学位论文 第1 章绪论 f i g u r e1 9 s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h em i c r o f l u i d i cc h i p w i t hc o n t i n u o u ss a m p l e i n t r o d u c t i o na n dg r a v i t y - d r i v e nf l o w s ( b ) r e c o r d i n gf o rd e t e r m i n a t i o no fas e r i e so f 0 2 s t a n d a r ds o l u t i o n s a f ：o 2 0 ，4 0 6 0 8 0a n d1 0 0p m o l lh 2 0 2s o l u t i o n p 1 】 w a n g 等【4 2 】设计了一种类似的流通池式试样引入接口，用于芯片毛细管电 泳系统。系统采用十字通道构型的玻璃芯片和电化学检测系统。芯片结构如图 l1 0 所示。试样和缓冲液引入通道口加工成尖锥状，与两段2 - m m 内径的聚乙 烯泵管连接，依靠蠕动泵连续泵入试样溶液，多余的试样溶液从塑料导管( 距 离通道入口i 衄处) 排出电泳采用门式迸样方式，实现了酚类和爆炸物的电 泳分离检测，结果如图1 i o ( b ) 所示，系统分析通量约为2 0 样，j 、时。 a f i g u r e1 1 0 ( a ) s t r u c t u r eo ft h em i c r o f i u i d i cc h i ps y s t e mw i t h o n - l i n ec o n t i n u o u s m o n i t o r i n gc a p a b i l i t y ( b ) e l e c t r o p h e r o g r a m sd e t a i l i n gt h er e s p o n s et os a m p l em i x t u r e s c o n t a i n i n gi n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n so fe x p l o s i v e s h i o 丫浙江大学博士学位论文第1 章绪论 1 2 3 取样探针式微流控高通量试样引入系统 流通池式试样引入系统的局限性是试样消耗量较大，为了提高分析通量， 不得不加大进样的流速和体积，且大部分试样无法回收。为了在实现高通量试 样引入的同时降低试样消耗，出现了将芯片耦合毛细管作为取样探针，以探针 插入芯片外部的试样储存管进行采样的取样探针式试样引入模式。这种模式可 显著降低试样引入过程中试样的消耗，非常适合于珍贵试样的高通量筛选分析。 c a l i p e r 公司开发了一种基于毛细管取样探针的“吸样式”芯片 4 3 ，删，并将 其用于其开发的商品化仪器- i ，a b c h i p9 0 4 5 和l a b c h i p3 0 0 0 4 6 l 高通量药物筛 选系统m 。其“吸样式”芯片如图11 1 所示，在芯片上集成了垂直于芯片的石 英毛细管探针，通过三维移动多孔试样板，使取样探针插入板孔中吸取试样溶 液。取样动力来自于负压或电渗流驱动系统。采用这种芯片的l a b c h i p9 0 芯片 分析仪能完成d n a 片段分离p 7 】，蛋白质分析【4 8 】，细胞膜电势分析【4 9 5 0 等。在 d n a 片段凝胶电泳分离中【4 7 】，芯片采用双通道深度设计( 试样引入通道深而宽， 凝胶电泳通道浅而窄) ，试样引入通道耦合2 5 c m 长、5 0 一岬内径的石英毛细 管作为取样探针，由真空负压提供换样动力。通过计算机控制三维平移台，实 现取样探针在9 6 孔板的自动取样。在细胞膜电势分析中【5 ，由探针引入的试 样在芯片上与带有细胞的液流汇合，并用染料标记细胞，读取荧光信号。和常 规分析方法相比，分析的灵敏度较高，每每次测定仅消耗1 5 0 个细胞，试样消 耗量仅1 01 1 l ，分析通量达到5 0 0 样小时。 v 浙江大学博士学位论文 第j 章绪论 f i g u r e 1 1 1s i p p e rc h i pp r o d u c t so fc a l i p e rl i f es d e n c e su s e di nl a b c h i p 9 0 ( a ) a n d l a b c h i p 3 0 0 0 ( b ) d r u gd i s c o v e r ys y s t e m c h i ph a so n eo rt w e l v e5 0 l j ms i p p e r sd r a w s s a m p l e si n t oq u a r t zm i c r o f l u i d i cc h i p so nt h eu n d e r s i d eo fp l a s t i cc a d d y s 。w h i c hh a v e w e l l sf o rr e a g e n t so nt o p p 3 4 4 f i g u r e 1 1 2c a p i l l a r ya n ds i l i c o ng l a s si n t e r c o