（遗传学专业论文）产黄青霉谷胱甘肽转移酶基因的克隆、表达与功能研究.pdf

学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文产黄青霉谷胱甘肽转移酶基因的克隆、 表达与功能研究，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的 原创性成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中标明。 本声明的法律后果由本人承担。 论文作者( 签名) ：强堤 聊7 年争月2 日 学位论文原创性确认书 隆、表达与功能研究，是在本人的指导下，由其独立进行研究工作 所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内容外，该论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 指导教州签名，：罗茗参蠡够 专哆移， 矽1 年红伊 河北师范大学硕士学位论文 中文摘要 谷胱甘肽转移酶( g l u t a t h i o n ei z a n s f e r a s c ，g s t ，e c2 5 1 - 1 8 ) 是具有多种生理功能 的二聚体同功酶家族，催化细胞内的谷胱甘肽与各种内源或外源的亲电子有毒分子结合 以达到解毒的目的目前有关g s t 的研究大多集中在动物、植物、昆虫等生物体中，而 对于真菌尤其是丝状真菌中的产黄青霉( p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u mt h o r n ) g s t 的报道较 少。 。 本研究以产黄青霉e d n a 为模板，克隆得到了两个新的谷胱甘肽转移酶基因p e g s t b 和p c g s t c ，与g e n b a n k 中已知序列进行b l a s t p 比较显示，二者均具有保守的g s t 结 构域。将基因p e g s t b 和p c g s t c 分别与载体p t r e 9 9 a 和p e t - 3 9 b ( + ) 连接，构建了两种目 的基因的原核表达载体，转化大肠杆菌，经i p t g 诱导后获得了重组蛋白p c o s t b 和 p c g s t c 。 分别采用g l u t a t h i o n e ，a g a r o s e 亲和层析及包涵体溶解、复性的方法，对表达的重组蛋 白进行了纯化，并以1 - c l d o r o 2 , 4 d i n i t r o b e n z e n e ( c d n b ) 为底物检测纯化蛋白p e g s t b 和p c g s t c 的比活分别为0 4 0 1 t - 0 0 2 0 u r a g 和0 0 1 8 主0 0 0 1 7 u m g ，表明二者均具有g s t 活性。采用实时定量p c r 检测，结果表明在产黄青霉培养基中加入c d n b3 h 后，基因 p c g s t b 和p c g s t c 韵表达量分别增加了大约3 倍和l o 倍，而p a a 和h 2 0 2 对p c g s t b 和p c g s t c 基因的表达水平无显著影响。 对p c g s t c 蛋自的酶促反应动力学研究显示，以c d n b 为底物测得蛋白的k m ( c l m b ) 值为1 6 6 p m o l m l 、叫c d n b ) 为o 0 4 2 2 p , m o l m i n m g ，以g s h 为底物测得蛋白的j o s m 值为1 7 3 j - m a o l m l 、瓤( g 跚为0 0 4 3 2 弘m o l m i n m g 。底物特异性研究表明，除c d n b 外， p c g s t c 同样能够催化p - n i t r o b e n z y lc h l o r i d e ( n b c ) 、e t h a c r y n i ca c i d ( e a ) 和 4 - n i t r o p y r i d i n e - n - o x i d e ( n p n o ) 与g s h ( g l u t a t h i o n e ，谷胱甘肽) 结合，其比活分别为： 0 1 3 7 士- 0 0 0 5 u r a g 、0 0 2 5 士0 0 0 3 u r a g 、0 0 6 9 - j ：0 0 0 6 u m g ，而对i 2 - d i c h l o r o - 4 - n i t r o b e n z e n c ( d c n b ) 无活性。 本研究结果为深入研究产黄青霉中g s t 与g s h 、苯乙酸代谢的关系及其在青霉素生 物合成中的作用奠定了基础，并为利用基因工程手段进行青霉素生产菌种改良工作提供 了理论依据，同时也丰富了人们对g s t 基因家族进化的认识。 关键词：谷胱甘肽转移酶产黄青霉克隆表达纯化实时定量p c r 酶动力学 底物特异性 河北师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t g l u t a t h i o n et r a n s f e r a s e s ( g s t s ，e c2 5 1 1 8 ) a r eaf a m i l yo fm u l t i f u n c t i o n a lp r o t e i n st h a t m a i l yc a t a l y z et h ec o n j u g a t i o no fi n t r a c e l l u l a rg l u t a t h i o n e ( o s h ) t oaw i d ev a r i e t yo f e l e c t r o p h i l i c ，c y t o t o x i cm o l e c u l e so f e n d o g e n o u so re x o g e n o u so r i g i n t h es t u d i e sw e r em o s t l y c o n c e n t r a t e do na n i m a l s ，p l a n t sa n di n s e c t sa n dt h e r ew a sv i r t u a l l yl i t t l ei n f o r m a t i o no nt h e m o l e c u l a rc h a r a c t e r i s t i c so f g s t si nf u n g i ，e s p e c i a l l yi nf i l a r a e n t o mf i l i 试 i nt h i ss t u d y , t w on o v e lg s tg e n e s ，t e r m e dp c g s t ba n dp c g s t c ，w e r ec l o n e df r o mp e n i c i l l i n p r o d u c i n gf u n g u sp e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u mb yu s i n gr t - p c r a l i g n m e n to ft h e ma n do t h e r k n o w ng s t sb yb l a s t ps h o w e dt h a tt h e ya l lh a v et h ec o n s e r v a t i v eg s ts t r u c t u r a ld o m a i n s t h ee n t i r eo r fo fp c g s t sw e r ec l o n e di n t op r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c u 3 ra n dr e c o m b i n a n t p f o t e i n sw e r es u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l i p c g s t bw a sp u r i f i e db ya f f m i t y c h r o m a t o g r a p h yo ng l u t a t h i o n e - a g a r o s ea n dp c g s t cw a sp u r m e db yr e f o l d i n gf r o mt h e d i s l v e d i n c l u s i o nb o d i e s n 圮i ra c t i v i t i e st o w a r ds u b s t r a t e1 一c h i o r o 一2 ，4 - d i n i t r o b e n z e n e ( c d n b ) w e r ev a l i d a t e d r e a l t i m eq u a n t i t a t i v er t - p c rc o n f i r m e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fp c g s t ba n dp c g s t cw e r e m a r k e d l yu p - r e g u l a t e d ( a tl e a s t2 1 0 x 、i nt h ep r e s e n c eo fc d n ba f i e r3h o u r si n d u c t i o n n o c h a n g e so fp c g s t ba n dp c g a ce x p r e s s i o n sw e r eo b s e r v e dw h e nw ea d d e dp a ai n t ot h e f e r m e n t a b l em e d i u m i nt h ew o r kp r e 靶n t e dh e r e e x p o s u r eo f m y c e l i a t oh 2 0 2d i dn o tr e s l d ti n b o t ho f t h e mi n d u c t i o n t h ee n z y l t l e ss t e a d ys t a t ek i n e t i c so fp c g s t cw e r es t u d i e di n a s s a y s w i t hv a r i o u s c o n c e n t r a t i o n so f g s ha n dc i ) n b a tf i x e dg s hc o n c e n t r a t i o n s ，t h ek ma n dk mv a l u e sw e r e 1 6 6 t a n o l m la n d0 0 4 2 2 1 a n o l m i r d m gf o rc d n br e s p e c t i v e l y a tf i x e dc d n bo o f l c e n t r a t i o l l t h e a n d “v a l u e sw e r e1 7 3 t a n o l r a la n do 0 4 3 2 t t m o l m i n m gf o rg s hr e s p e c t i v e l y t h e p u r i f i e dr e c o m b i n a n tp c o s t ce x h i b i t s d i f f e r e n tc a t a l y t i ca c t i v i t i e st o w a r dt h es u b s t r a t e s e t h a c r y n i ca c i d ( e a ) ，p - n i t r o b e n z y lc h i o f i d e0 q b c ) a n d4 - n i t r o p y r i d i n e - n - o x i d e ( n p n o ) b e s i d ec d n b ，a n dn oa c t i v i t yw a sd e t e c t e dt o w a r d1 , 2 - d i c h l o r o - 4 n i t r o b e n z e n e ( d c n b ) 1 1 l e 豫幽b e n e f i t e dt os t u d y i n gt h er e l a t i o n s h i po fg s t - g s ha n dp a am e m b o l i s mi n p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m t h e s ew i l la l s og i v eu sac h a n c et oi m p r o v et h ei n d u s t r i a ls t r a i n sb y u s i n gg e n e t i cm e t h o d s a tt h es a m et i m e ，t h ek n o w l e d g e m e mo ft h ef u n g a lg s t sw e r e 2 河北师范大学硕士学位论文 d e v e l o p e d k e y w o r d s ：g l u t a t h i o n et r a n s f e r a s e ，p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m ，c l o n i n g ，e x p r e s s i o n , p u r i f i c a t i o n , r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep c r k i n e i d c ，s u b s t r a t as p e c i f i c i t y , 3 河北师范大学硕士学位论文 荚文缩写 a 3 4 0 a m p a p b p b s a m 们m c d n a c d n b c g s t c h l d c n b d e p c d h a r m 盯p e a e b e 】d t a g s h g s t 日呵g k a n k l n l b m a p e g m g s t m r 缩写词表 英文全称中文全称 a b s o r b a n c ea t3 4 0b i l l 3 4 0i r a 3 吸收值 a m p i c i l l i n氨苄青霉素 a m m o n i u m p e r s u l p h a t e 过硫酸铵 b a s ep a i r 碱基对 b o v i n es e r o n la l b u m i n 牛血清白蛋白 d e o x y r i b o n u c l e o s i d e 订i p h o s p h a t e脱氧核糖核苷三磷酸 c o m p l e m e n t a r yd n a互补d n a 1 - c h l o r o - 2 ，4 - d i n i t r o b e n z e n e卜氯- 2 ，4 - 二硝基苯 c y t o s o l i cg l u t a t h i o n et r a n s f e m s e胞浆谷胱甘肽转移酶 c h l o r a m p e n i c o l氯霉素 1 , 2 - d i c h l o r o - 4 - n i t r o b e n z e n e 1 ，2 - = 氯- 4 - 硝基苯 d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e焦碳酸二乙酯 d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c t a s e脱氢抗坏血酸还原酶 d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e 脱氧腺苷三磷酸 e c h a c r y n i ca c i d 利尿酸 e t h i d i u mb r o m i d e 澳化乙锭 e t h y l e n ed i a m i n e t et r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 g l u t a t h i o n e谷胱甘肽 g l u t a t h i o n et r a n s f e r a s e 谷胱甘肽转移酶 i s o p m p y l t h i o - 争d - g a l a c t o s i d e 异丙基硫代一b d - 半乳糖苷 k a n a m y c i n卡那霉素 m i c h e a l i sc o n s t a n t 米氏常数 l u r i a - b e r t a i nm e d i u m l b 培养基 m e m b r a n ea s s o c i a t e dp r o t e i n si ne i c o s a n o i da n d 谷胱甘肽与类二十烷酸代 g l u t a t h i o n em e t a b o l i s m 谢相关的膜结合蛋白 m i c m s o m a lg l u t a t h i o n et r a n s f e r a s e 微粒体谷胱甘肽转移酶 r e l a t i v em o l e c u l a rm a s s ( m o l e c u l a rw e i g h t ) 分子量 4 河北师范大学硕士学位论文 p - n i t r o b e m z y lc h l o r i d e 4 - n i t r o p y r i d i n e - n - o x i & o p t i c a ld 饥s i l y o - d i n i l r o b e n z e n e o p e ni e a d i n gf r a m e p h e n y l a c e t i ca c i d p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r v s b p o l y m v r a s ec h a i nr e a c t i o n p e n t a c h l o r on i t r o b e n z e n e r i b o n u c l e m ea r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r o 僦i o n a ls p e e di nr e v o l u f i o mp e rm i 埘l 怔 s o d i u md o d e c y ! s u l f a t e n ，n n ，n - t e t r am e t h y le t h y l e n ed i a m i n e t r i s ( h y d r o x y m e t h l y ) a m i n o m e t h a n e m a x i m u mv e l o c i t y w a v e l e n g t ho f m a x i m u ml i g h ta b s o r p t i o n 渊基苄氯 4 - 硝基嘧啶n 一氧化物 光密度 o - = 硝基苯 开放阅读框 苯乙酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳 链式聚合酶反应 五氯硝基苯 核糖核酸酶a 活性氧类物质 反转隶p c r 转，分钟 十二烷基硫酸钠 n n n n ，_ 四甲基乙二胺 三羟甲基氨基甲烷 最大速度 最大光吸收波长 眦一|眦一呱|；一三一佻舨 河北师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 1 青霉素及其生物合成概述 1 1 p 一内酰胺类抗生素概述 1 i 1 b 一内酰胺类抗生素的发现及应用 微生物的代谢产物名目繁多，从生源上考虑，可分为初级代谢产物、次级代谢产物 和转化产物。其中次级代谢产物主要包括抗生素、杀虫荆、杀菌剂、植物生长因子等， 在经济生活中十分重要，其中又以抗生素最为重要，包括b 一内酰胺类、大环内酯的红霉 素、四环素类、氨基糖苷类等。 抗生素的临床应用始于人们对b 一内酰胺类化合物功效的发现，被认为是人类在治疗 硅药物史上最重要的发现。在治疗传染性疾病中，应用抗生素所救活的生命远远多于用 其它药物【1 1 。 1 9 2 9 年，a l e x a n d e rf l c m i a g 发现在含有特异青霉( p e n i c i l l i u mn o t a t u m ) 的琼脂板上 葡萄球菌的生长受到了抑制 2 1 ，三年后，证实这种生长抑制是由于青霉素的作用。最早 对青霉素的临床试验是在1 9 4 1 年【3 】。h o d g k m 和l o w 于1 9 4 5 年通过x 射线结晶学分析证明 它的结构是b 一内酰胺结构【4 】。 十九世纪五十年代，从海洋中分离得到真菌c e p h a l o s p o r i u mc h r y s o g e n u m ( 现称为 a c r e m o n i u mc h r y s o g e n u m ) 的发酵液中发现头孢菌素【3 】，1 9 6 1 年，a b r a h a m 和n e w t o n 描述 了头孢菌素c 的结构，并通过x 射线结晶学分析证实【卯。头孢菌素c 的发现为临床应用增 添了重要的b 一内酰胺类抗生素新成员。 p 一内酰胺类药物治疗传染性疾病的成功之处在于它的高特异性和低毒性。目前，随 着科技的发展，以青霉素和头孢菌素为原料经化学或酶法生产6 - a p a 、7 - a d c a 、g c l e 、 7 - a c a 等母核，再经改造而得的半合成抗生素产品已不下1 2 0 种。在新的抗生素不断涌现 的今天，b 一内酰胺类药物仍然是应用最广泛的抗生素。 i i 2 p 一内酰胺类抗生素的作用机制 这类抗生素的作用机制是抑制细菌细胞壁中主要成分肽聚糖的生物合成，使生长和 分化中的细胞不能形成完整的细胞壁而失去生存能力，由于动物细胞没有细胞壁，故这 类抗生素总的来说对动物不产生毒性。但是，具有b 一内酰胺结构的化合物容易和血浆 蛋白结合，形成过敏原，从而发生过敏反应，而且b 一内酰胺抗生素长期应用后细菌容 6 河北师范大学硕士学位论文 易产生抗药性，都是这类抗生素在临床应用中的主要问题。 1 1 3 p 一内酰胺类抗生素的分类 b 一内酰胺抗生素是分子中含有四元p 一内酰胺环的一类天然合成抗生素的总称。目 前临床上应用的b 一内酰胺抗生素主要分五大类：青霉素类( 又称青霉烷类) ；青霉 烯类( 包括青霉烯类和碳青霉烯类) ；头孢菌素类( 包括头孢烯类、碳头孢烯类和氧头 孢烯类) ；单环b 一内酰胺类；p 一内酰胺酶抑制剂类( 包括氧青霉烷类和青霉亚砜类) 。 1 2 青霉素的种类 青霉素是一种抗革兰氏阳性细菌的b 一内酰胺类抗生素，是6 一氨基青霉烷酸( 6 - - a p a ) 的酰化衍生物。所有青霉素都有一个连接在杂环母核氨基上的酰基侧链，青霉素 环系( 青霉烷) 含有一个与五元噻唑烷环稠合的四元p 一内酰胺环嘲。 由青霉素产生菌培养所得的天然青霉素有多种成分。如青霉素g 、青霉素x 、青霉 素f 、青霉素k 、青霉素0 。深层发酵生产所得的青霉素主要为青霉素g 。发酵时加入 苯乙酸或苯乙酰胺作为前体，便可得到高纯度的青霉素g 。如果发酵时加入苯氧乙酸作 为前体，则可得到高纯度的青霉素v 。以6 一觚a 和多种化学合成的有机酸为中间体， 可以制得许多耐胃酸、抗耐药性和广谱的半合成青霉素。临床已使用的半合成青霉素有 苯氧乙基青霉素、甲氧苯青霉素、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、氯苯唑青霉素、氨苄青 霉素和羟氨苄青霉素等。 1 3 青霉素的生物合成及其相关基因 自然界有许多微生物能够生物合成b 一内酰胺类抗生素，包括真菌、放线菌和细菌， 其中疏水的青霉素类抗生素只由丝状真菌合成。研究表明，细菌、放线菌、真菌编码的 p 一内酰胺类抗生素生物合成酶的结构基因都是以基因簇形式存在的m ，产黄青霉 ( p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m ) 、特异青霉、构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 和纳地青霉 ( p e n i e i l l i u mn a l g i o v e n s e ) 的三个青霉素生物合成酶基因a c v a ( p c b a b ) 、i p n a ( p c b c ) 和a a t a ( p e n d e ) 都紧密成簇 青霉素的生物合成分三步( 图1 ) ，所有天然合成的青霉素都从三个氨基酸- i ，一 a 一氨基已二酸、l 一半胱氨酸和l 一缬氨酸开始，由一个多功能酶a c v 合成酶( a c v s ) 催化形成三肽化合物8 - - ( l a 一氨基已二酰) 一l 一半胱氨酰一d 一缬氨酸( a c v ) ， a c v s 由结构基因a e v a ( p c b a b ) 编码1 8 j 。 在第二步中，线性的三肽闭合环化生成具有特征性的b 一内酰胺环和五元噻唑烷环 河北师范大学硕士学位论文 骈联结构的异青霉素n ( 刀p n ) 。i p n 有弱 抗生素活性，是青霉素的第一个具有生物 活性的中间体。这个反应被异青霉素n 合 成酶( 玎p n s ) 催化完成。i p n s 活性最早在 ac h r y s o g e n u m 细胞提取物中被发现 9 1 ，这 是一种血红素铁依赖性的氧化酶，在环化 过程中，催化移走a c v 三肽上的四个氢， 同时还原分子氧生成水。该反应过程需要 亚铁离子、分子氧作为底物，需要抗坏血 酸盐作为电子供体 i o j 。研究显示只 c h r y s o g e n u m 中的i p n s 受到谷胱甘肽的强 烈抑制，而且对钴的抑制很敏感 i i 】。i p n s 由结构基因枷叫( p c b c ) 编码，是b 一内 酰胺抗生素生物合成基因中被克隆并在大 肠杆菌中表达成功的第一个基因。 圈l 青霉素生物合成途径 f 皓lb i o s y n t h e s i so f p e n i c i l l i n 青霉素合成的第三步也是最后一步， i p n 的亲水侧链l a 一氨基f , - - 酸被疏水的酰基置换下来，这个反应是由酰基一c o a ： 异青霉素n 酰基转移酶( i a t ) 催化完成的，i a t 由结构基因a a t a ( p e n d e ) 编码。在产 黄青霉中将i p n 转化为青霉素g 的过程包括两步酶促反应，首先i p n 脱酰基生成6 一 a p a ，之后6 一a p ：a 与苯乙酰- - c o a 反应生成青霉素g 。基因a a t a 的编码蛋白同时具有 异青霉素n 酰基水解酶、6 一耻a 酰基转移酶和青霉素酰胺酶的活性，催化上述酶促反 应的完成【1 2 1 。i a t 在生物合成过程中显示出了丰富的底物特异性，通过加入适当的前体 分予，可以直接发酵产生特殊的青霉索，由产黄青霉或构巢曲霉产生的i a t 在活化的侧 链前体苯乙酰- - c o a 或苯氧乙酰- - c o a 的存在下将i p n 转化为青霉素g 或青霉素v 。 1 4 青霉素生物合成的调控 1 4 1 碳源调控 产黄青霉生物合成青霉素在很大程度上受葡萄糖和蔗糖，极小程度上受麦芽糖、果 糖、甘露糖等其它糖的抑制，而不受乳糖调控。高浓度的葡萄糖显著阻遏产黄青霉的a v c s 和i p n s 生成但不抑制它们的活性，而较小程度阻遏i a t 的生成。葡萄糖还导致产黄青霉 河北师范大学硬士学位论文 的乙酰一c o a 合成酶失活，使侧链前体的活化受阻。而且由于葡萄糖与6 一灿! 九之间形成 复合物，导致可用于青霉素合成的中间产物的减少从而降低青霉素生物合成的速率和得 率。乳糖是早年青霉素生产中使用的碳源，在现代工业生产中则采用慢速流加葡萄糖的 方法，这样既能促进发酵前期的生产菌生长，又可避免葡萄糖阻遏，从而得到较高的青 霉素产量。 1 4 2 p h 调控 胞外碱性p h 可提高产黄青霉中p c b a b 、6 c 和妒厅魑因转录，从而有利于青霉素 的合成，但碱性p h 不能克服葡萄糖对青霉素生物合成酶的强劲阻遏。 1 4 3 氮调控 产黄青霉生物合成青霉素被较高浓度的铵离子抑制，这一调控水平和低水平的谷氨 酰胺合成酶相关。在低n i - 1 4 + 浓度下生长的菌丝中，有较高浓度的谷氨酰胺积累，但谷氨 酸的浓度较低，相反，随称r t - 1 4 + 浓度的增加，谷氨酰胺减少，谷氨酸浓度增加，抗生素 合成相应减少。n 地+ 还直接阻遏产黄青霉的青霉素生物合成基因表达，在用乳糖培养的 产黄青霉菌丝中加入过量的n i - l t c l 时，p c b a b 和p c b c 基因表达都受到抑制。 1 4 4 氨基酸调控 由于青霉素是由三个前体氨基酸生物合成的，因而某些氨基酸必然对这一生物合成 过程产生某种调控反应。其中l a 一氨基已二酸来自真菌特殊的氨基已二酸合成途径， 这个途径导致l 一赖氨酸的形成。在产黄青霉的发酵培养基中加入赖氨酸会减少可用于青 霉素生物合成的a 一氨基已二酸，从而降低青霉素的效价。缬氨酸能够反馈抑制本身生物 合成途径中的乙酰羟酸合成酶，由于产黄青霉的高产菌株的乙酰羟酸合成酶对缬氨酸的 反馈抑制表现出部分脱敏，才使这一前体氨基酸的供应得以增加。 1 4 5 硫调控 硫酸盐作为前体氨基酸半胱氨酸的合成原料，在青霉素生物合成中起作用，但在低 产产黄青霉菌株中高浓度的硫酸盐阻遏硫酸盐通透酶，从而影响了硫酸盐的摄取，在硫 酸盐饥饿条件下，硫酸盐通透酶活性和硫酸盐摄取率均会上升。在高产产黄青霉菌中， 呈现脱阻遏现象，即使在较高的硫酸盐浓度下，仍具有较高的通透活性。 1 5 青霉素生产菌株的改造 1 5 1 青霉素生产菌株的基本特征 所有产青霉型青霉素的微生物均是真核生物，主要属于青霉属类，其中产黄青霉被 9 河北师范大学硕士学位论文 用于青霉素的工业化生产。 产黄青霉普遍存在于空气、土壤及腐败的有机材料上。属于不对称青霉群，菌落生 长快，致密，绒状，有些略显絮状，有明显的放射状沟纹，边缘白色，孢子多，蓝绿色， 衰老的菌落有的呈现灰色或淡紫褐色，大多数菌系渗出液很多，聚成醒耳的淡黄色至柠 檬黄色液滴。反面亮黄至暗黄色，色素扩散于培养基中。分生孢子梗光滑，帚状枝不对 称，分生孢子链呈分散的柱状，分生孢子椭圆形，壁光滑。 一般来说，青霉素高产菌株的菌体形态及发酵状态较低产菌来说略有不同。通常， 高产突变株产生细弱的分生孢子梗，上面以短链排列着较少、较光滑的孢子；基生菌丝 体的颜色一般为浅黄白色或浅灰绿白色，不带可扩散的色素；菌落大多是致密的深放射 龟裂型，可能由于菌丝的快速分支，而放射性生长成丛，高产突变株的菌落直径比低产 突变株小。在沉没培养中，高产突变株通常可形成致密的菌丝球，而低产菌株大多以大 菌丝球或长菌丝体形式生长，且生长率较快，随着发酵的进行，菌丝球在中心开始溶解， 形成一个空壳或完全断裂形成短菌丝体，较高产突变株菌丝断裂得更快f 6 。 1 5 2 青霉素工业生产菌种改良 以青霉素和头孢菌素为代表的b 一内酰胺类抗生素是重要的抗感染药物，在临床上占 有非常重要的地位，占据了世界抗感染药物市场的6 5 ，因此，对微生物发酵产物青霉 素的生产菌种的改良具有重要的经济价值。 在过去的几十年中，对青霉素高产菌株的突变和选育进行了大量研究。基于物理化 学诱变和大规模筛选基础上的育种体系取得巨大的成就。菌种改良结合发酵技术的优化， 使得目前工业生产用青霉素菌种的产量与野生菌种相比提高了近1 0 0 0 倍，成为工业微生 物育种的典范。但随着产量的不断提高，菌种遗传负荷的不断增大，传统育种方法的局 限日趋明显。 分子生物学及d n a 重组技术的发展，使基因工程技术逐渐成为生物研究领域通用的 技术。基因组学研究取得的令人瞩目的研究成果，以及被称为第三代基因工程的代谢途 径工程技术的诞生，更为在工业生产菌种选育中改革传统的随机诱变、筛选技术，提高 育种工作的目的和效率提供了广阔的前景。通过对目的产物生物合成途径中“瓶颈”酶基 因进行扩增，增加其转录和表达，可有效提高发酵产品的产量、改善生产过程；而代谢 旁路及产生负调控作用基因的剔除，可提高原料转化效率，增加主产物产量。 l o 河北师范大学硕士学位论文 2 谷胱甘肽转移酶概述 谷胱甘肽转移酶( g l u m t h i o n ct r a n s f e 啦j s e ，g s t ) 是一个具有多种生理功能的同功酶 家族，是生物体在长期进化过程中保存下来的一种很重要的酶。自然界中的各种生物为 避免受到内源或外源化学物质，尤其是毒性物质的侵害，在长期进化过程中形成了一套 代谢此类物质的解毒酶系统，g s t 家族便是该酶系统的重要组成部分之一 二十世纪六十年代，在动物中第一次发现g s t ，这些酶在代谢解除药物毒性中起着 重要作用【1 3 】。1 9 7 0 年，在玉米中发现g s t ，该酶可以保护作物免受氯s 三嗪阿特拉津除 草剂的损割1 4 1 。此后，在动物、植物、微生物中不断发现新的具g s t 活性的相应酶或基 因序列1 1 3 , 1 5 。这类酶多为同型或异型二聚体，极少数为多聚体，随着亚基的不同组合而 形成多种同工酶，具有对各种各样异生物质( 如药物、致癌物、抗生素、杀虫剂、除草 剂等) 的解毒作用。g s t 多基因家族的研究有大量的文献报道。 2 1 谷胱甘肽转移酶的分类 g s t 同工酶是一个超基因家族，主要分为两种类型。一种是存在于胞浆中的可溶性 的g s t ，称为胞浆g s t ( c y t o s o l i cg l u t a t h i o n et r a n s f e r a s e ，c g s t ) ；另一种属于膜结合蛋 白，也称为微粒体g s t ( m g s t ，m i c r o s o m a lg l u t a t h i o n et r a n s f e r a s e ) 。因两者在一级结 构、空间构象、活性调控等方面存在很大差异，现多将m g s t 归为另一个超基因家族， 即谷胱甘肽与类二十烷酸代谢相关的膜结合蛋白( m e m b r a n ea s s o c i a t e dp r o t e i n s i n e i c o s a n o i da n dg l u t a t h i o n em e t a b o l i s m ，m a p e o ) 超家族【川。 人们根据等电点的不同、底物特异性、对抑制剂的敏感性、免疫学特性和氨基酸序 列相似性的不同，把g s t 分为许多亚型，哺乳动物中可溶性g s t 有8 种，分别为a 、瓠 o 、0 、l c 和【1 习；其中o 和是动物和植物中共有的亚型，还有植物中特有的9 、t 、九型 o s t 和脱氢抗坏血酸还原酶( d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c m s e sd h a r s ) ( 1 7 j ；昆虫中的g s t 被划 分为三类，分别为o 、6 和8 型【1 叼；而细菌中只确定了一种亚型即b 型g s t l l 9 1 。在真菌q 6 g s t 的研究相对还很少，且已经鉴定的真菌g s t 与已有的亚型都不相同1 2 0 1 ，目前还没有明确 的分类。 己知许多不同的外源性化合物是g s t 作用的底物，有些化合物与g s t 某个或某些同 功酶高度特异性结合，而与其它亚类中的同工酶几乎没有结合活性，这些g s t 作用底物 称为选择底物或模型底物。在实验中，底物的特异性有助于确定在某种酶制剂中存在哪 种g s t ，或用于比较不同种类g s t 的功能活性，如：口型g s t 对异丙基苯( c y m e n e ) 的过 河北师范大学硕士学位论文 氧化氢物具有很高的活性；兀型0 s t 对利尿酸( 甜删ca c i d ) 有很高的活性；o 型 s t 则 以4 一硝基苯溴化物( 4 - n i t r o p h e n e t h y lb r o m i d e ) 作为其标志性底物；而存在于几种哺乳动 物和秀丽新小杆线虫中的型g s t ，与哺乳动物其他g s t 不同，其n 一末端伸展与c - - 末 端邻按形成一个新的结构单位【2 ”，它们对经典的g s t 底物i 一氯一2 ，4 一二硝基苯( 1 - c h l o r o 2 , 4 - d i n i t r o b e n z e n e ) 的活性非常低，对谷胱甘肽一琼脂糖亲和介质( g l u t a t h i o n e - a g l o w ) 无亲合力，但能结合乙基谷胱甘肽亲和介质( e t h y l i cg l 咖h i o n e m a t r i x ) ，并显 示出显著的谷胱甘肽依赖的硫醇转移酶活性圈。 2 2 谷胱甘肽转移酶的进化 g s t 是一个古老而复杂的蛋白质家族，在动物、植物、细菌和真菌中以多基因家族 存在。它的多种类别是在进化过程中不同的时期分化而来的，各类o s t 并不依据通常真、 核生物和原核生物的进化路线，彼此之间较为独立】，h a n s s o n 等推测这些g s t 的进化是 由类似于d n as 蛐g 的机制所推动的刚在g s t 的众多种类中，8 类最古老，广泛存在 于脊椎动物、果蝇、植物及微生物中，这说明0 类代表了在真核生物和原核生物开始分化 时产生的g s t 的最初形式。a 、兀类g s t 可能给动物和真菌提供了新的解毒酶类以对抗 植物产生的某些化合物，和蛋白相结合的古g s t 基因的复制伴随着外显子的四处移动， 这种复制机制也许就是g s t 超家族中各个成员的催化机制各有特性的原因。 图2g s t 超家族可能的分化模式1 1 目 f i g 2p o s s i b l ep a t t e r no f d i v e r g e n c ei nt h eg s ts u p e r f a m i l y g s t 可能是为了克服氧化胁迫从硫氧还蛋白祖先进化而来。其它谷胱甘肽或半胱氨 1 2 河北师范大学硕士学位论文 酸结合蛋白也有类似硫氧还蛋白的折叠，而且现在越来越多的证据表明g s t 与各种生物 中的胁迫相关蛋白在序列和结构上存在相似性。许多研究者利用序列比较来构建系统树， 以便找到分化的模式，通过序列比较或免疫杂交方法。发现有一些非g s t 蛋白与g s t 近 缘。如细菌的强饥饿蛋白，植物的病源、胁迫抗性蛋白，酿酒酵母的u r e 2 蛋白，真核的 翻译延长因子h 等。这些近缘关系表明在硫氧还蛋白折叠进化之前可能有一个共同的祖 先【1 5 】。目前，人们对g s t 分类进化的了解还很有限，可能还会发现其它与解毒无关的新 的种类。图2 是g s t 超家族的一个可能的分化模式图。 2 3 谷胱甘肽转移酶的基本结构特征 至今报道的大部分可溶性g s t 都是一种同源或异源球状二聚体蛋白。亚基间界面残 基的不相容性导致不同类型g s t 亚基间不能二聚化，而在同类亚基中，即使氨基酸序列 差异很大，也能形成二聚体 2 s l ，从而大大增加了g s t 的多样性。微粒体g s t 与细胞质酶 在结构上没有相关性，一般为同型三聚体，亚基的分子量大约为1 7 k d a ，而且与细胞质 g s t 差别很大，有可能是由不同的祖先基因独立进化而来的【2 6 】。 研究不同类型胞质g s t 的结构研究表明：通常同类g s t 中会有大于6 0 的序列相似 性，而非同类的g s t 的序列相似性不会超过3 0 0 , 4 。尽管不同类型的g s t 序列差异很大，但 g s t 的二级结构及高级结构是非常相似的。每个亚基有一个独立的酶催化中心，分子量 介于2 3 2 9 k d a 。每个亚基的多肽链由两部分组成( 图3 ) ：一是n 一末端氨基酸结构域， 由大约8 0 个氨基酸排列形成6 一折叠和三股a 螺旋，是g s h 的结合位点( g 位点) ，该区域 较为保守，6 0 n 8 0 位的氨基酸残基尤其保守，是活性位点的重要组成部分。该区域含有 催化所必需的酪氨酸( 嘶妇类) ，丝氨酸( 0 类) 或半胱氨酸( c o o 类) 残基，这些残基 与g s h 的巯基作用，使g s h 的p k a 值从约9 0 降至6 o 7 0 ，这一步被认为是g s t 催化的关 键步骤【2 7 , 2 s l ；二是以5 到6 股a 螺旋构成的c 末端氨基酸结构域，该位点结构在不同类型的 g s t 间差别较大，是亲电子物质结合位点( h 位点) ，在碲“类中为5 个a 螺旋，在a 类中 为6 个旺螺旋( 该结构域的螺旋数目在类之间变化很大) ，它的主要功能是与第二个疏水 性底物相互作用，此外，它的第四个螺旋中含有一个保守的天冬氨酸残基，对g s h 结合 也有作用。从某种程度上说，g s t 对底物的选择性可能是由c 端结构域中的氨基酸不同决 定的。g 位点与h 位点是由5 1 0 个氨基酸残基组成的可变连接区连接的。亚单位接口的相 互作用对稳定所有g s t 亚单位的三级结构起重要作用，并且二聚体必须在每个亚单位的 活性中心和接口的非底物配体结合位点保持功能构象，有学者发现亚单位间的一个特异 河北师范大学硬士学位论文 性的疏水基序对二聚体的稳定性和蛋白质功能起作用【捌。 图3g s t 亚基的功能区三维结构i l ”。n - 末端结构域用蓝色袭示，c 一末端