毕业设计（论文）-物料预处理对酶法提取灵芝多糖的影响.doc

毕业设计(论文) 课 题 名 称 物料预处理对酶法提取灵芝多糖的影响 学 生 姓 名 学 号 系、年级专业 生物与化学工程系 2011 级生物工程 指 导 教 师 职 称 讲 师 2015 年 5 月 20 日 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） I 物料预处理对酶法提取灵芝多糖的影响 摘 要 目的目的:经过对灵芝中灵芝多糖的工艺提取的研究，找出最佳的物料预处理方法处理灵 芝，然后进行提取，让灵芝多糖的提取率尽可能的达到最大值。方法方法:本实验主要采 用酶法提取灵芝多糖的方法，以灵芝多糖的提取率为目的，进行各项单因素实验探 究，考察物料烘烤温度、物料粒度和紫外线的照射时间等物料预处理的条件对灵芝 多糖提取的影响。最后紫外分光光度计测定灵芝多糖的质量，并得出最佳的实验条 件。结果结果:经由实验结果整理分析可以得知，单因素的影响大小为 B（C） A（A烘烤温度，B物料粒度，C紫外线照射时间），其最佳组合为B2C2A1，粉 细度为80目，紫外线照射时间为35 min，烘烤温度为75，灵芝多糖提取率最高， 能够达到1.55%。结论：结论：通过对物料的预处理可以发现，较之未经物料预处理的提 取，灵芝多糖的提取率显著提高。 关键词: 预处理；灵芝多糖；酶法提取；紫外-可见分光光度法 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） II The material pretreatment effects on enzymatic extraction of GLP (2011 Biological Engineering , Department of Biology and Chemistry Engineering, Shaoyang Abstract Objective: To find out the best material pretreatment extraction technology makes the GLP extraction yield as high as possible by studying on the extraction and purification of Ganoderma lucidum polysaccharides(GLP) from Ganoderma lucidum.Methods: To investigate the baking temperature, material size and UV processing time of material pre-treatment conditions on extraction of GLP influence based on single factor experiment, using enzymatic extraction method and taking GLPs yield as the index. To optimize the optimum conditions of extracting GLP from Ganoderma lucidum powder by the orthogonal test, which apply ultraviolet and visible spectrophotometry (UV-vis) to determine the content of GLP. Results: The results of orthogonal test show that the main factors which influence GLPs yield in enzymatict extraction with the material pre processing are as follows: B or C A(A is the baking temperaturet, B is the material size, C is UV processing time), and the best parameter combination is B2C2A1.That is to say, The optimum conditions in ultrasonic enzymatict extraction with the material pre processing are that the material size is 80 mesh, baking temperature is 75, uv processing time is 35 min, and GLPs yield is up to 1.55%. Conclusion: based on the material pretreatment can be found that compared with the extraction of raw material pretreatment, ganoderma lucidum polysaccharides extraction yield was significantly improved. Key words: Pretreatment; Ganoderma lucidum polysaccharide(GLP); 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） III Enzymatic method；Uv-vis spectrophotometry 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 目 录 摘 要 Abstract 1 绪论1 1.1 课题研究的背景和意义 1 1.2 灵芝多糖研究的现状及水平1 1.3 本论文研究的主要内容 4 1.4 灵芝多糖的提取4 2 材料与方法6 2.1 实验试剂与材料6 2.2 主要仪器与设备6 2.3 研究方法7 2.4 检测方法8 3 结果与分析10 3.1 葡萄糖标准曲线的绘制10 3.2 单因素试验结果与分析10 3.3 正交试验结果与分析13 4 结论16 5 展望17 参考文献18 致谢20 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 1 1 绪论 1.1 课题研究的背景和意义 灵芝一般用于医学，是非常珍贵的中国传统医学药物，含有大量的药物的 有效成分，包括从灵芝中提取的灵芝多糖。灵芝多糖是一种具有抗衰老、抗肿 瘤以及清除自由基功能的一种非特异性免疫刺激剂1。由此对灵芝中有效成分的 提取即成为一项具有重大意义的工程，目前社会上新出行的高效降压茶其有效 成分即为灵芝中的灵芝多糖，目前实际生产中，溶剂提取法是提取灵芝多糖的 最普遍且常用的方法，此种方法主要是用水、稀碱、二甲基亚砜等有机溶剂进 行提取。但是此类法成本太高，并且工艺技术很繁复，工作量非常庞大，生产 过程不容易操控，不稳定因素很多，而且此类方法对有效成分的损耗很大，不 利于生产成本的降低2。尤其是工艺废料较难处理，会对环境造成严重污染，并 对人体健康有一定的损害，不利于当前社会倡导的可持续发展。 因为灵芝多糖的提取率非常之低，所以灵芝多糖的价格非常的昂贵，所以 为了加大高效降压茶的有效成分灵芝多糖的产量，满足社会群众的需要，最大 限度的对灵芝多糖的提取，要改善灵芝多糖的提取工艺，观察不同的单因素实 验对灵芝多糖提取率有何影响，并且能够最大限度的增加灵芝多糖提取率就成 为了一门尤为重要的工艺34。本实验研究主要是以灵芝子实体为原料，以灵芝 多糖提取率为参考目标，采用紫外-可见分光光度法测定OD值并计算得到多 糖的得率，然后针对酶法提取灵芝多糖的预处理因素进行试验研究，采用正交 实验得出单因素处理对酶法提取灵芝多糖的影响，为灵芝子实体更进一步的开 发研究提供了理论基础5。 1.2 灵芝多糖研究的现状和水平 1.2.1 灵芝多糖常规介绍 （1）灵芝多糖的简介 因为灵芝多糖有许多有利于健康的原因,经常用于人的身心发展,而且具有很 高的药用价值，高血压、高胆固醇、糖尿病患者需要的健康的灵芝类食品。灵 芝多糖可以用于加入固体食物中,如茶,咖啡,啤酒等饮料不改变原有的独特风味 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 2 而且具有药用价值,这些都是最具功能性发展前景的食品。根据美国中成药药 典与治疗概要对灵芝的记录的纲要，同样表明了国际医学界和药学界非常重 视灵芝多糖的研发及应用6。灵芝多糖具有许多特点,如明确的疗效,没有副作用, 作为辅助药物在肿瘤的临床治疗7。 （2）抗氧化作用 根据目前的研究成果表明，灵芝多糖具有一定的抗氧化功能，安全有效的 天然抗氧化剂的发展提供一定的理论依据。游育红等通过研究得出，灵芝多糖 可以保护细胞器免受氧自由基的损伤，可以提高细胞的存活率，证明了灵芝多 糖具有保护细胞和抗氧化的功能8。胡太平等最先证明灵芝多糖可以拮抗 NHDPH氧化酶酶系列的酶的活性，而此种酶系能够促进血管壁中O2-的产生 9。 （3）降血脂、血糖功效 随着人们的生活质量日渐提高，高血糖、高血脂的发病率在全球范围内都 呈现出逐年上升的趋势现象。解跃华等通过研究证明灵芝多糖能够降低血液中 脂质的分子含量10。实验先建立大鼠脂质代谢的紊乱模型和预防模型，并且以 血液样品中的TG、HDL-C、TC 的分子含量和大鼠体内脂肪的沉积情况为 参考目标。糖尿病在临床方面主要表现为血糖浓度非常高。黄智璇等通过注射 去甲肾上腺素导致小鼠产生高血糖症状，通过灵芝多糖对小鼠喂养实验,实验结 果表明,灵芝多糖具有降低血糖的作用 11。 （4）免疫调节功能 徐晋等将用于结合的灵芝多糖和 5 -氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡的实验结果 可以得出,该种组合可以加速并且提高肝癌细胞凋亡率1213。因此,生物体的主要 免疫调节机制可能是通过激活免疫反应,增强宿主免疫能力，从而实现免疫调节 功能。 （5）其它保健功能 吴京燕等研究表明复合灵芝多糖能非常显著的提高辐照的小鼠体液中的白 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 3 细胞及SOD活性，表明灵芝多糖具有拮抗辐射14的功能。此外还有研究表明， 灵芝多糖还能抵抗衰老、抵抗疲劳、改善微循环、有效抑制肿瘤、促进蛋白质 和核酸的合成等多种药理功效15。 1.2.2 灵芝多糖的提取的研究现状 传统的提取方法耗时较长、并且耗用溶剂量大、温度过高，容易使多糖发 生分解16。近年来,超声波、微波和酶技术,在生物活性成分的提取的应用逐渐增 加,超临界流体萃取、超滤等高新技术的发展也提供了高效、快速和更多的新技 术提取灵芝多糖。 酶法提取：酶法提取：沈爱英等通过提取姬松茸子实体多糖的提取实验，多糖的提取 率高达1.5167%，并且所需要的时间的只需要热水提取时间的一半,萃取率显著 高于水萃取,也较高于酸、碱提取17。用复杂酶方法可以保持产品的天然形态,不 会破坏它的原有的生物活性。也有一部分专家学者5研究了银耳多糖的多种提取 工艺，研究实验表明,酶的提取效果最好,碱法提取排到第二，酶法提取非常显著 的缩短了提取的时间,使用复合酶水解与热水提取法结合,提取香菇多糖，萃取时 间明显减少一半,而且萃取率增加 1819。 近年来，一些人提出的“仿生提取”。它基本上是建立模型，模拟胃和小肠 的身体内部工作环境，提出了人工胃液和人工肠液提取中药(TCM)在低温和酶 催化的引入人体，使药物进入人体易于综合利用活动的混合物。目前，主要实 验室研究采用的酶类有纤维素酶和果胶酶，除此之外也有中性蛋白酶等2021。 超声波提取超声波提取：可以促使溶剂渗透快速进入细胞,大大缩短提取时间,显著提高 提取率2223。超声提取是由超声波辅助溶剂萃取,其特点是超声波产生高速,强烈 的空化效应和混合功能损伤的细胞,能够缩短提取的时间。 超声波提取优点： 1、萃取效率高； 2、提取时间非常短；3、提取温度 非常低；4、适应性广；5、提取液中杂质很少，有效成分比较容易分离和提纯； 6、提取的过程中操作成本非常低，综合经济效益显著提高。 超滤法：超滤法：超滤是一种膜分离的技术，在多糖的提取过程中，使用超滤膜可 以孤立于水或其他液体分子量不同的胶体和高分子材料。动植物多糖的超滤技 术可以将多糖进行有效的分级，具有非常高的收率、重复性也比较好好、能源 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 4 消耗低、设备比较简单、没有污染、并且不会破坏多糖的生物活性等优点。和 超滤膜的情况下连续使用了很长一段时间也可以维持一个恒定的输出和分离效 果2425。 1.2.3 灵芝多糖的开发和利用现状 自1960年代以来,研究表明,某些真菌多糖的药用价值显著,没有细胞毒性,应 用前景非常广阔。测定多糖的多糖在药物质量控制有着非常重要的作用,但多糖 的研究开始得较晚，所以其测定方法以及提取过程中存在的影响因素目前还存 在着很大的不足。近年来郭利平26，陈超琴27，范晓良28等，这些学者在多糖的 研究方面都做出了很大的贡献，但是他们的研究主要关注多糖的提取工艺,故本 实验从老师所给的几点影响因素入手，参考近五年的有关多糖提取方面的文献， 结合不同学者多年来从不同方面对多糖测定方法的研究,预处理在几个对酶法提 取灵芝多糖的影响,并提出自己的看法不同的问题，以期为工业上预处理对酶法 提取灵芝多糖的影响因素的选择提供依据。 1.3 本论文研究的主要内容 这部分研究灵芝子实体为原料，通过不同因素的预处理，然后利用酶法提 取灵芝子实体的灵芝多糖，最后利用紫外分光光度法测定灵芝多糖的含量。本 次的实验目的主要是为了考查不同的单因素的物料预处理对酶法提取灵芝多糖 的影响，然后在单因素实验的基础上，用灵芝中灵芝多糖的提取率为参考目标， 对烘烤温度、紫外线的照射时间、物料粒度等因素进行正交设计试验研究。 1.4 研究方案和采取的措施 1.4.1 灵芝子实体的预处理 灵芝多糖存在于子实体细胞内壁，提取较为困难，因此采用粒度处理、烘 烤处理、紫外处理三种预处理方式，由于灵芝原材料不易加工， 所以实验前要 对原材料进行挑选、清洗、干燥、粉碎等几个预处理工艺。粉碎是为了增加在 萃取过程中反应的接触面积，用以获得到较高的提取率。 1.4.2 灵芝多糖的提取 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 5 近年来很多学者在灵芝多糖的提取上做了大量的研究，由曹泽虹16等做的 酶法提取灵芝多糖的工艺研究实验可知：纤维素酶的酶量为0.5%，纤维素酶的 降解温度为55 ，时间80 分钟， pH5.0；果胶酶的酶含量为0.5%，用果胶 酶酶解温度为40 ，果胶酶的降解时间为80分钟， pH4.5；植物蛋白水解酶 的酶量为1.0%，植物蛋白酶的降解时间为60 分钟，酶降解温度55 ， pH4.5。三种酶相比,纤维素酶提取灵芝多糖的效果最好,多糖提取容量高达 197.49毫克/ 100 mL.果胶酶,酒精、纤维素酶+酒精下沉的方法来比较三种方法 提取灵芝多糖含量、纤维素酶水解+酒精下沉方法提取效果是最好的,多糖含量 高达211.21毫克/ 100毫升,故本实验采取纤维素酶法+醇沉法提取，探究物料粒 度、烘烤温度以及紫外照射时间与（酶法提取）灵芝多糖提取率之间的相关关 系。 1.4.3 灵芝多糖的测定 灵芝多糖在浓硫酸的作用下能够水解成单糖,然后单糖之间能够快速脱水形 成醛衍生品,最后与酚结合，反应生成有色的化合物。最后可以用紫外可见分光 光度计测定其OD值，并且通过计算可以得到灵芝多糖的获得率。 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 6 2 材料与方法 2.1 实验试剂与材料 试剂与材料可以见表2.1。 表 2.1 试验所用试剂与材料 药品名称级别生产厂家浓度 无水酒精AR东莞市建润化工有限公100% C6H12O6AR北京化工厂 坏水AR淄博建龙化工有限公司95% 枸橼酸钠AR北京化工厂 石碳酸AR济南世纪通达化工厂100% 芝草市售戴家平老百姓大药房 2.2 主要仪器与设备 仪器与设备归纳表2.2。 表 2.2 试验用主要仪器 名字规格产地 紫外-可见光分光光度计GS-53上海天呈医流科技股份有限公司 标准筛JK-WQ61M/SZZ北京中科路达试验仪器有限公司 电子天平AR5120上海台之衡工贸有限公司 生物安全柜81M/AC2-4S1广州安邦生物科技有限公司 高速冷冻离心机Evolution RC美国 Thermo Scientific 公司 电热鼓风干燥箱DHG-91401北京中西远大科技有限公司 真空干燥箱DZF-6051上海垒固仪器有限公司 中药粉碎机TT30,FW177北京中西远大科技有限公司 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 7 2.3 研究方法 2.3.1 灵芝多糖提取工艺流程 （1）灵芝子实体的预处理 灵芝子实体挑选、清洗烘干至恒重粉碎过筛紫外线照射一定时 间预处理的灵芝粉 （2）灵芝多糖的提取工艺流程 准确称取2.0g灵芝粉单因素处理（烘烤温度，物料粒度，紫外线照射） 加入一定量的pH(pH=5.0)的缓冲液（料液比=1:15）加入0.5%的纤维 素酶(调pH，酶解8分钟)离心分离（3000r/min，15min）取上层离心 液酶解法除蛋白透析加热灭酶（10min）过滤除酶滤液经旋转蒸发 仪进行浓缩沉淀离心取沉淀丙酮洗涤烘干粗多糖 2.3.2 单因素的预处理对酶法提取灵芝多糖的影响的实验 (1)烘烤温度对(酶法提取)灵芝多糖的提取率之间的关系29 精确称取灵芝粉2.0 g，将其置于250 mL锥形瓶中，然后将盛有物料的锥 形瓶放入烘箱设备中烘烤温度（70、75、80、85、90）一定时 间，取出锥形瓶，处理后的灵芝粉降至室温时，将称取好的灵芝粉过80目筛， 紫外照射35min，按料液比1:15加入适量的缓冲液（pH=5.0） ，0.5%的纤维素 酶，纤维素酶降解80分钟，然后按照上述提取工艺流程得到灵芝粗多糖，计算 得率，考察烘烤温度与灵芝多糖提取率之间的关系。 (2)物料粒度对（酶法提取）灵芝多糖提取率之间的关系3031 精确称量干燥的灵芝粉2.0 g，将其置于250 mL锥形瓶中，然后将盛有物 料的锥形瓶放入烘箱设备中适当的温度烘烤一定时间，取出锥形瓶，处理后的 灵芝粉降至室温时，将称取好的灵芝粉分别通过（50目，60目，80目，100目， 150目）的目筛，紫外线下照射35 min，然后将通过不同大小目筛的灵芝粉分 别用标记好的锥形瓶装按料液比1:15加入适量的缓冲液（pH=5.0） ，0.5%的 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 8 纤维素酶，纤维素酶降解80分钟，然后按照上述提取工艺流程得到灵芝粗多糖， 计算得率，探究物料粒度对灵芝多糖的提取率的影响。 (3) 紫外线的照射时间与（酶法提取）灵芝多糖提取率之间的关系 精确称量干燥的灵芝粉2.0 g，将其置于250 mL锥形瓶中，然后将盛有物 料的锥形瓶放入烘箱设备中适当的温度烘烤一定时间，取出锥形瓶，将处理后 的盛有灵芝粉的锥形瓶降至室温，然后将处理后的并称取好的灵芝粉过最佳的 目筛，将锥形瓶放于紫外线下照射（25 min，30 min，35 min，40 min，45 min） ，然后将样品取出，按料液比1:15加入适量的缓冲液 （pH=5.0） ，0.5%的纤维素酶，纤维素酶降解80分钟，然后按照上述提取工 艺流程得到灵芝粗多糖，计算得率，探究紫外照射时间与灵芝多糖的提取率之 间的关系。 2.3.3 正交试验方案设计 以单因素试验结果为基础，以灵芝多糖提取率为主要考察目标, 以烘烤温 度、物料粒度、紫外线照射时间作为考察的3个因素，设计正交试验。 2.4 检测方法 2.4.1 绘制葡萄糖标准曲线的方法 （1）配制葡萄糖的标准溶液 精确数量的葡萄糖25毫克,添加一定量的水溶解,然后到250毫升容量瓶,如 果水在容量瓶没有达到容量大小规模滴水,摇匀配成标准储备溶液。与液体移动 移动0.5、1、3、5、7毫升葡萄糖标准储备溶液分别在10毫升容量瓶和扩 展能力,配水,葡萄糖含量为0.05、0.1、0.3、0.5、0.7毫克/毫升的标准使用 液。 配制5%的苯酚溶液 精确称量5 g苯酚，用容量刻度为100ml的移液管（或滴定管）量取95 mL的水加入苯酚中，均匀连续的搅拌，使苯酚完全溶解后，将配置好的溶液 转入棕色细口瓶中，放到冰箱备用。 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 9 （2）绘制标准曲线 准确测量2.00毫升蒸馏水和2.00毫升葡萄糖标准溶液,然后干把它插到试 管中,加入1.00毫升,5%的苯酚溶液,摇匀,然后把它放在冰水,然后立即加入 5.00毫升浓H2SO4,完全动摇,将其放置在室温下15分钟后在100沸水,让水 浴加热15分钟,然后拿出来放在冰水15分钟,为排除干扰，根据需要设置一个 空白试验。最后绘图计算可以得到线性方程。 2.4.2 灵芝多糖的含量的测定 （1）换算因数测定 准确称量灵芝多糖50毫克完全溶解于一定量的水,体积100毫升容量瓶定 容至100毫升,得到样液。用移液器移取1.0 mL灵芝多糖试液，然后遵循葡萄 糖标准曲线的绘制步骤进行显色反应，用紫外分光光度计测其在490 nm处的 OD值，并且从葡萄糖标准曲线的图中求出供试液的葡萄糖质量M2，换算因 素公式f=M1/M2(M1为供试液中多糖的实际质量50 mg，M2为测量出的供 试液的葡萄糖质量）25。据中华人民共和国药典f=2.0428。 （2）灵芝多糖含量的测定 首先提取粗多糖与纯净水反复溶解并定容至100毫升,然后稀释到一定浓度,取 稀释后的葡萄糖标准溶液1毫升,用于颜色反应、OD值在490nm。通过标准 曲线回归方程来计算样本液体葡萄糖,葡萄糖(ug),然后通过公式计算灵芝多糖的 含量。计算见公式2.1。 100 6 2.1%10100% MfA m 公式：灵芝多糖的得率（） M葡萄糖的质量； f换算因素（2.0428）； A稀释倍数； 100样液的体积(mL)； 106ug换算成g； 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 10 m灵芝粉的质量（g）。 3 结果与分析 3.1 葡萄糖标准曲线的绘制 图 3.1 葡萄糖标准曲线 用苯酚-硫酸法测定葡萄糖标准溶液的吸光度值（OD值），并用其在 490nm处测得的吸光度值（OD值）为纵坐标，用葡萄糖的质量数为横坐标， 利用 EXCEL 绘制葡萄糖的标准曲线图（图3.1）。从图中得出标准曲线的回归 方程是Y=0.0077X+0.0005(R2=1)。分析图可以得出结果，在20160ug 范围内，葡萄糖的质量与灵芝多糖的吸光度值具有一定的相关线性关系。 3.2 单因素试验结果 3.2.1 烘烤温度与灵芝多糖提取率之间的关系 表 3.1 烘烤温度与灵芝多糖提取率关系表 烘烤温度（） 7075808590 A1 0.1720.1980.2780.2520.241 A2 0.1730.1970.2750.2490.242 A3 0.1720.1080.2750.2520.242 OD 平均值 0.1720.1980.2760.2510.242 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 11 灵芝多糖得率 （%） 0.460.520.730.660.64 图 3.2 烘烤温度与灵芝多糖提取率关系图 根据测量的结果可以得到表3.1，以灵芝多糖的提取率为纵坐标，用预处 理因素烘烤温度为横坐标画出相应的曲线分析图（图3.2） 。 观察分析（图3.2）曲线图得知：多糖得率随烘烤温度的上升存在一个最 大值 80。烘烤温度的变化能够改变物料的细胞结构，让物料的内部有效成分 的扩散路径发生变化，变得更加畅通，有利于有效成分的提取。但是不断提高 的的烘烤温度没有利于灵芝多糖的溶出，反而具有一定的抑制作用，而且，烘 烤温度不断增大则对灵芝多糖的生理活性有非常不利的影响，可能还会溶出其 他与试验无关成分，增加后续分离操作的难度，因此，最佳烘烤温度应该选择 80较好。 3.2.2 物料粒度与灵芝多糖提取率之间的关系 表 3.2 物料粒度与灵芝多糖得率关系表 物料粒度（目）506080100150 A10.2630.3780.4340.3840.375 A20.2630.3790.4350.3850.374 A30.2620.3780.4350.3850.375 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 12 OD 平均值0.260.380.430.380.37 灵芝多糖得率 （%） 0.691.001.151.020.99 图 3.3 物料粒度与灵芝多糖提取率关系图 根据测定结果见表3.2，纵坐标为灵芝多糖提取率，以灵芝粉的物料粒度 为横坐标作出对应的曲线图（图3.3） 。通过分析曲线，选取3个较好的时间水 平。 从物料粒度-灵芝多糖得率曲线图（图3.3）中可以得知：灵芝粉物料粒度 在5080目时，灵芝粉中的灵芝多糖的提取率大体呈上升趋势，80目左右达 到最大，80目之后又出现下降的趋势，经分析讨论其原因可能是物料粉碎，细 胞的结构被破坏，使其有效成分流出；但如果粒子粒径不断增大，溶剂中的多 糖含量下降，可能是因为颗粒表面能会逐渐增加，将对一部分多糖产生吸附作 用，所以，灵芝粉的最佳物料粒度应该选择80 目较好。 3.2.3 紫外照射时间与灵芝多糖提取率的关系 表 3.3 紫外照射与灵芝多糖提取率关系表 紫外线照射时间 （min） 2530354045 A1 0.2350.3320.4420.4130.362 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 13 A2 0.2340.3310.4420.4120.361 A3 0.2340.3310.4450.4120.361 OD 平均值 0.230.330.440.410.36 灵芝多糖得率（%） 0.620.881.171.090.96 图 3.4 紫外照射时间与灵芝多糖提取率关系图 根据测定结果见表3.3，纵坐标为灵芝粉中的灵芝多糖提取率，以紫外线 照射时间为横坐标作出相应曲线（图3.4） 。 从紫外照射时间-灵芝多糖得率曲线（图3.4）中可以得到：灵芝粉中的灵 芝多糖的提取率随着紫外线照射的时间的增加而逐渐增大，当紫外线的照射时 间为 35min 时，提取率最高。分析讨论出现这种情况的可能原因是，紫外线能 够杀死灵芝粉表面附着的微生物，随着紫外线照射时间的不断增加，灵芝粉表 面的微生物被灭菌彻底，有利于多糖溶出的，多糖得率升高；当紫外线照射时 间继续增加时，多糖得率趋于平缓，原因可能在于灵芝粉表面的微生物已经全 部灭菌，已经趋于饱和亦或者灵芝子实体自身结构被破坏失活了，多糖得率变 化甚微。所以，最佳紫外线照射时间是 35min。 3.3 正交试验结果分析 3.3.1 正交试验结果直观分析正交试验结果直观分析 用烘烤温度、物料粒度、紫外线的照射时间作为本次实验的3个考查因素， 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 14 按L9(34)正交表进行正交试验设计，见表 3.4。 采用灵芝多糖优化提取工艺条件进行，将处理后的灵芝粉降至室温时，按 料液比 1:15加入PH=5.0的适量的缓冲液，0.5%的纤维素酶，纤维素酶降解 80分钟，对烘烤温度 A、物料粒度 B、紫外线照射时间 C 这三个影响因素 进行正交试验设计和分析，结果见下表3.5。 表3.4 因素水平表 因素水平与编码 试验因素 -101 烘烤温度A()758085 物料粒度B（目）6080100 紫外线照射时间 （min） 303540 表3.5 直观分析表 试验物料粒度 序列 烘烤温度 （）（目） 紫外照射 时间 （min）空列 多糖得 率(%) 11（75）1（60）1（30）11.26 21（75）2（80）2（35）21.55 31（75）3（100）3（40）31.22 42（80）1（60）2（35）31.32 52（80）2（80）3（40）11.27 62（80）3（100）1（30）21.21 73（85）1（60）3（40）21.18 83（85）2（80）1（30）31.31 93（85）3（100）2（35）11.25 均值 11.34 1.25 1.26 1.26 均值 21.27 1.38 1.37 1.31 均值 31.25 1.23 1.22 1.28 极差0.09 0.150.15 0.05 观察分析表3.5可知： 主 次 C(紫外线照射时间) B(物料粒度) A(烘烤温度) D(实验误差) 即C(紫外线照射时间) B(物料粒度) A(烘烤温度) D(实验误差)。 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 15 从表3.5中可以得出，A因素的均值中，均值1最大，说明其最优水平为 （烘烤温度是75），同理可得B因素最优水平为2（粉细度是80 目），C 因素最优水平为2（紫外线照射时间是 35min）。从正交实验结果可以得出： 最佳组合为 B2C2A1，即紫外线照射时间是35 分钟，物料粒度是80 目，烘烤 温度是75。 3.3.2 正交试验结果方差分析 根据需要制作方差分析表见表3.6。 表3.6方差分析表 因素偏差平方和自由度F 比F 临界值显著性 烘烤温度0.015623.6279 F(0.05)=5.14 0 物料粒度0.038428.9302 F(0.01)=10.9 0 紫外线照射 时间 0.036728.5349 误差0.00432 从表3.6中同样也可以得出：各因素影响的顺序是：C(紫外线照射时间) B(物料粒度) A(烘烤温度)D(实验误差) 3.3.3 优化工艺条件的确定 由表3.5和表 3.6 可知C2B2A1（B2C2A1）组合在直观分析表中能够得到证 明并且多糖得率最高，符合实验要求，不需要追加验证试验。为增加说服力。 取相同的1.0000g 灵芝粉，分成3份，按优化后的工艺组合条件进行热水提 取灵芝多糖，实验所得的数据结果见表3.7。 表 3.7 验证试验结果 试验样序号123平均值 灵芝多糖的得率 （%） 1.541.561.521.54 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 16 相对误差 %5%28 . 1 %100 54 . 1 54 . 1 56 . 1 (%) 由此实验可以得出，优化条件后的提取率与直观分析表3.5中的最高结果 1.55%最为接近，灵芝多糖的提取率相对较高，稳定性良好可行。 4 结论 经过实验，其结果表明，采用优化工艺条件后的酶法提取灵芝多糖方法提 取灵芝粉中的灵芝多糖，最佳实验条件为：紫外照射时间35分钟，烘烤温度 75，物料粒度80目，灵芝多糖的得率达到1.55%。 本实验从本质上讲由灵芝中的有效药物灵芝多糖出发从灵芝中提取，成本 较高，周期长。所以我们可以考虑用其他的有效提取法来代替原有的提取法， 近年来半仿生提取法逐渐活跃在药学界的视野，半仿生提取法是根据药物的有 效成分由未知到已知的实现，比较符合灵芝多糖提取的初衷,都是由结果出发， 逆向思维，将药物有整体和分子相结合,并且能够建立模拟口服药物和药物流经 肠胃的运转过程，具有很强的临床性。并且灵芝多糖的提取率高，不会改变药 物的原有功能和药效，生产周期短，成本低，是较为理想的提取方法并且具有 较大的优势和广泛的应用前景。 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 17 5 展望 近年来，国内外对于灵芝多糖的提取和分离也做了大量的研究，取得了骄 人的成绩，也出现了一些有关采用微波辅助提取法，酶法提取，超声波提取等 新方法的文献资料，但是新提取方法的生产设备昂贵，工艺技术复杂。一些提 取、分离手段仅仅只是存在于实验室中进行，不能大范围的进行实际的工业生 产。但是伴随着科学技术的发展，相信会有更多高新的技术用于灵芝多糖的提 取和分离，灵芝的应用价值也会越来越具有前景。 邵阳学院 2015 届毕业设计（论文） 18 参考文献 1 郭志烨,韩丽,杨明,等.中药多糖定量测定方法的探讨J.中成药,2014,10:2172-2176. 2 刘建华,张志军.灵芝多糖提取与应用现状J.保鲜与加工, 2009,3(3):9. 3 李阳,赵春玲,王晓晓,等.酶法提取枸杞多糖的工艺研究J.广州化工,2014,18. 4 李亚辉,马艳弘,黄开红,等.响应面法优化复合酶提取芦荟多糖工艺及其抗氧化活性分析J. 食品科学,2014,18. 5 于洪涛,吴茂玉,赵岩,等.灵芝多糖的提取及生理活性的研究进展J.食品研究与开发,2011, 32(5): 159-160. 6 林志彬.灵芝研究与开发的历史现状和未来C.灵芝专题研讨会,2004:2-3. 7 董汝晶.多糖提取方法的研究进展J.农产品加工(学刊),2014,08:46-48. 8 游育红,林志彬.灵芝多糖肽对ECV304细胞氧化损伤的保护作用J.中国药理学通报, 2007,23(11): 1510-1513. 9 胡太平,蔡尤彪.灵芝多糖对DOCA高血压大鼠主动脉NADPH氧化酶活性的影响J.社区 医学杂志,2007, 13(5):1-2. 10 解跃华,陈跃辉,刘义彬等.灵芝多糖对实验大鼠高血脂症的预防作用J.食品研究与开发, 2006,27(6):141-143. 11 黄智璇,欧阳蒲月.灵芝多糖降血糖作用的研究J.亚太传统医药,2008,4(8):24-25. 12 Jiang JH ,Slivova V,Harvey K,et al.Ganoderma lucidum suppress growth of breast cancer cells through the inhibition of A kt/N F kappa B signaling J.Nutr Cancer,2004, 49(2):209- 216. 13 徐晋,吴丽,徐巧芳.灵芝多糖诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的研究J.中国当代医药, 2009,16(23):7-9. 14 吴京燕,程光宇,江海涛.灵芝多糖合剂抗辐射保健功能的研究J.南京师范大学学报(自 然科学版),2003,26(3):79-81. 1