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中文摘要 通过比较基因组杂交研究肝癌中非随机的 染色体畸变 摘要 目的：肝癌是世界上普遍高发的癌肿之一，尽管采取综合性的治疗方案，肝癌的5 年生存率依然很低。现有研究虽然表明，包括肝炎病毒的感染、酗酒导致的肝硬化 以及类似黄曲霉素等化学致癌物质影响在内的多种因素可能和肝癌的发生密切相 关，但肝癌真正的发病机理及其相应机制并没有完全的明晰。本研究旨在通过对 2 5 例肝癌进行比较基因组杂交研究，鉴定该病非随机性的染色体d n a 扩增和缺失， 为阐明肝癌发生发展的分子基础提供实验依据，也为肝癌的预防、诊断、治疗提供 一些有益的线索。 方法：提取待测的肝癌标本及正常对照标本的基因组d n a ，用缺口平移法，以生物素 一1 6 一d u t p 标记肿瘤d n a ，以地高辛一1 1 一d u t p 标记作为对照的正常d n a ，使标记片段 大小为6 0 0 2 0 0 0 b p 。将肿瘤及对照d n a 探针混合，与c o t 一1d n a 一起沉淀，制备杂 交液。与正常人中期染色体在3 7 杂交6 0 7 2 小时。杂交完毕，肿瘤d n a 探针用亲 和素一异硫氰酸荧光素( f i t c ) 、生物素化的抗亲和素和第二层亲和素一f i t c 检测，对 照d n a 探针用鼠源抗地高辛抗体、兔抗鼠抗体一罗丹明( t r i t c ) 和羊抗兔抗体一t r i t c 检测。用4 ，6 一二氨基一2 一苯吲哚( d a p i ) 复染以鉴别染色体。用连在荧光显微镜上 的冷电荷藕合设备相机获取三种荧光的灰图，灰图经m e t a s y s t e m 染色体及荧光原 位杂交分析系统处理分别被赋予蓝、绿、红三色。用m e t a s y s t e m 染色体及荧光 原位杂交分析系统分析f i t c 和t r i t c 两种荧光的强度并计算两者的比值。按通用 的标准，比值低于o 8 表明d n a 拷贝数降低，大于1 2 则显示d n a 拷贝数增加。 结果：2 5 例肝癌均有d n a 拷贝数的变化。分析结果显示染色体8 p ，4 q ，1 6 q ，1 7 p ，1 3 q 和6 q 区域的d n a 缺失以及8 q ，1 q ，1 7 q ，2 0 q ，6 p 和2 l q 区域的d n a 扩增为肝癌的特征 性变化。 结论：肝癌细胞染色体上存在非随机性的d n a 拷贝数扩增和d n a 拷贝数减少的位点， 可能是肝癌特有的生物学特征，这些位点可能含有肝癌相关的候选癌基因和抑 癌基因。 关键词：比较基因组杂交；肝癌；细胞遗传学；癌基因：抑癌基因。 英文摘要 l ；沁s e a r c ht h en o n r a n d o mc h r o m o s o m ea b e r r a t i o no f h c c t h r o u g hc o m p a r a t i v eg e n o m i ch y b r i d 娩a t i o n a b s t r a c t a i m s ：h 印a t o c e l l u l a rc a r c i n o m ai so n eo fm o s t 上l i g h j yo c c u e dt u m o r si n t h ew o r l d a 蛐o u 曲t h e r ei ss y s t e m i ct h e r a p ys t r a t e g y ，t h ef i v e y e a rs u r v i v a lr a t eo fh e p a t o c 6 l l u l a r c a r c i n o m ac a s e si sv e r yl o we x i s t i n gr e s e a r c hs u g g e s tt h a ti n f e c t i o no fh b vo rh c v ， h e p a t o c i 玎h o s i sr e s u l t e df 而md r i n l ( i n 昌a 1 1 ds o m ec h e m i c a lc a r c i n o g e n ss u c ha sa n a t o x i n a r ea 1 1c l o s e l yc o r r e l a t e d 、i t l lt h eo c c u h c n c eo fh e p 砒o c e l l u l a rc a r c i n o m a ，h o w e v e r ，l e g e n e t i cb a s ea n dm o l e c u l a rm e c h a n i 锄o f h e p a t o c e l i u l a rc a r c i n o m ar e m a j nu n k n o w n t h j s s t u d yi s t oa n a l y z e2 5h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m as a m p l e sm m u 曲c o m p a r a t i v eg e n o m i c h y b r i d i z a t i o n ，i d e n t i f yt h en o n r a l l d o mc l l r o m o s o m a ld n ar e g i o n a la i l l p l m c a t i o n 锄d d e l e t i o n nm a yp m v i d es o m eh e l p m lc l u e sf o re l u c i d a t i n gt h em 0 1 e c u l a rm e c h a i l i s mo f h e p a t o c e l l l l l a rc a r c i n o m at i l m o 唱e n e s i sa 1 1 da l s of o rt h ep r e v e m i o n ，d i a g n o s i sa i l d 恤e r a p y o f h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a m a t e r i a la n dm e t h o d ：e x 打a c t e dt h eg e n o m i cd n ao ft m o rs 锄p l e sa n dc o r r e s p o n d i n g c o n t r o ls 锄p l e s l a b e l e dt 啪o rg e n o m i cd n aw i mb i 砸n 1 6 一d u t pa 1 1 dc o n t m lg e n o m i c d n aw i t hd i g o x i n _ 1 l - d u t pt h r o u 幽n i c k - t m s l a t i o n t h es i z eo fl a b e l e dd 咐a 丘a g m e m s i sb e t w e e n6 0 0a n d2 0 0 0 b p m i x e dt h et u m o ra i l dc o n 仃o ld n a p r o b e ，p r e c i p i t a t e dw i t h c o t 一1d n at op r e p a r em eh y b r i d i z a t i o n1 i q l l i d i y b r i d i z c dw i t l lm e t a p h a s ec l l r o m o s o m e s o fn o n l l a ih u m a nf o r6 0 7 2h o u r sa t3 7 c a n e rh y b r i d i z a t i o n ，t h et u m o rd n a p r o b ew a s d c t c c t 谢n la v i d i n f i t c ，b i o t i n a t e da 1 1 t i a v i d i n 柚ds e c o n d a r ya v i d i n f i t c ，c o n 仃o ld n a p m b ew i t hm o u s ea n t i d i g o x i na n t i b o d y ，r a b b i ta m i m o u s et r j t ca 1 1 dg o a ta n t i r a b b i t t r i t c c l l r o m o s o m e sw e r es t a i n e d 谢t hd a p i c a p t i l r et 1 1 eg r a yf i g u r eo ft l l r e et y p e so f n u o r e s c e n c ew i mo c dc o n n e c t e do nf l u o r e s c e n c em i c m s c o p e g r e yf i g l l r ew a se i l d o w e d b l u e ，g r e e na 1 1 dr 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sc h a r a c 硎s t i cf o rh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a c o c l u s i o n ： t h e r ea r en o n r a n d o mc l l r o m o s o m el o c io fd n ac o p i e sn u m b e r a m p l m c a t i o na n dd e l e t i o ni nh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a i nt l l e s el o c i ，“m a ye x i s ts o m e p u t a t i v eo n c o g e n e sa n dt u m 0 ts u p p r e s s 甜g e n e sr e l a t e dw i t hh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a k q w o r d s ：c o m p a r a t i v eg e n o m i ch y b r i d i z a t i o n ，h 印a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a ， c ”o g e n e t i c s ，o n c o g e n e ，a n dt i l i n o rs u p p r e s s o rg e n c i l i 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 麦：l 鸯 日 期：毡坠：呈： 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文 的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文 档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅 和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：j 牝导师签名：嗡r 翌7 前言 日吾 在我国，肝癌是威胁人们生命的第二大恶性肿瘤“杀手”，其死亡率仅次于肺 癌。目前，i 临床上对肝癌一般采取以手术为主的综合治疗，但由于肝癌细胞的转移， 手术后一半左右的病人5 年内会复发。根据国内外大量研究资料分析，认为肝癌发 生的原因可能有以下几种：( 1 ) 病毒性肝炎：主要是乙型与丙型肝炎病毒感染，尤 其是乙肝与乙肝病毒携带者，其原发性肝癌的发生率要比正常人高出2 1 0 0 倍；在 肝癌的高发地区，约2 0 的人可能是乙肝病毒携带者。( 2 ) 黄曲霉毒素( a f t ) ：以 黄曲霉素b 为最重要的致癌物质。适宜于高温、高湿的气候环境中生长繁殖，尤其 是夏季的霉变食物及谷物、饲料等，最易被黄曲霉菌污染而产生黄曲霉毒素，长期 食用含此毒素的食物可诱发肝癌。( 3 ) 水源污染：饮用水质的严重污染，是肝癌发 生的重要诱因之一，尤其是污染的沟水，其次为河水，井水最低。故在没有自来水 设施的乡村，应提倡饮用井水。( 4 ) 化学致癌物质：能引起肝癌的化学物质以n 一亚 硝基化合物为主，如亚硝胺和亚硝酰胺等。此外，农药、酒精、黄樟素等亦均能诱 发肝癌。( 5 ) 其他因素：营养过剩( 大量营养素) 或营养缺乏( 如维生素a 、b 1 缺 乏) 、血色病、寄生虫感染及遗传等，也是诱发肝癌的危险因素。( 6 ) 免疫状态：有 人认为肝癌患者血浆中含有一种封闭因子，能抑制细胞免疫并保护肝癌细胞不受免 疫细胞杀伤。现已证明，甲胎蛋白( a f p ) 就能抑制淋巴细胞和巨噬细胞的吞噬作用。 ( 7 ) 基因突变：环境中的突变原和病毒作用激发肝细胞分裂反应途径的活化，引起 细胞内基因的点突变和染色体易位诱发癌基因、抑癌基因的活化和失活，是加速癌 细胞增殖的可能因素。虽然近年来，围绕肝癌病症的研究多种多样，但是肝癌真正 的发病机理及其相应机制并没有完全的明晰。随着各项研究的深入，越来越多的证 据表明，肝癌的发生是多基因、多环节的连续发展过程，其中非随机性的染色体d n a 扩增和缺失是肝癌发生的主要因素，所以针对肝癌病症中非随机性的染色体d n a 扩 增和缺失的研究，为阐明肝癌发生发展的分子基础提供资料，为肝癌的预防、诊断、 治疗提供一些有益的线索。 用来分析这种非随机性的染色体d n a 扩增和缺失变化的传统的染色体显带方法， 因为制备实体瘤的中期染色体存在些技术难点，不易成功，而且不能对某些扩增 序列( 如均染区，双微体) 进行染色体定位，难以对高度异常的染色体变化做出准 确的判断。而1 9 9 2 年后发展起来的比较基因组杂交( c o m p a r a t i v eg e n o m i c 东南大学硕士论文 h y b r i d i z a t i o n ，c g h ) 技术不需进行肿瘤细胞的体外培养，只需少量肿瘤d n a 就能够迅速检测出在肿瘤基因组中哪些d n a 序列拷贝数增加和缺失，并对其定位， 使人们对某种实体瘤中d n a 拷贝数的变化能够有一个全面的了解，通过进一步研究 能够发现一些与肿瘤相关的扩增或缺失的基因。另一方面，c g h 所揭示的肿瘤染色体 非随机性的d n a 拷贝数变化的总体情况也可作为对传统细胞遗传学资料的补充，作 为肿瘤发生的发生发展因素来加以研究。 本研究应用c g h 技术检测2 5 例肝癌标本，对其d n a 拷贝数变化情况做一全面了 解，为进一步研究肝癌发生发展的分子基础提供资料。 2 文献综述 文献综述 比较基因组杂交技术及其在肝癌研究中的应用 比较基因组杂交技术( c o m p a r a t i v eg e n o m i ch y b r i d i z a t i o n ，c g h ) 是在荧光原 位杂交( f l u o r e s c e n c ei n s i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 基础上结合消减杂交技术于 9 0 年代发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术，它使间期基因组快捷可靠的检测 成为可能。和传统细胞遗传分析技术不同，它无需体外培养细胞，其待测细胞核型，亦 被称为c g h 拷贝数核型( c g h c o p yn u b e rk a r y o t y p e ) 产生于正常中期染色体：与f i s h 相比，它克服了需制备染色体特异区域的探针且仅能检测个别染色体或部分位点的 局限性，用c g h 方法，通过一次实验即可检测出待测标本整个基因组d n a 拷贝数的变 化并在染色体上定位。目前，c g h 技术主要应用于检测各种肿瘤的染色体不平衡， 包括乳腺癌。3 、肺癌。1 、淋巴瘤“1 、星形胶质细胞瘤。1 、肾癌嘲、头颈部癌“1 、膀胱癌 、卵巢癌跚、前列腺癌“”、肝癌1 、胃癌”1 、结直肠癌“3 3 等。 人类肿瘤的发生和发展往往伴有染色体的异常，这种非随机的异常包括有染色 体的丢失、获得、缺失、重排和异常的复制、扩增等等。充分发现这些肿瘤染色体 方面的异常，对了解肿瘤的起源、发生、发展和其生物学行为有重要意义。比较基因 组杂交( c o m p a r a t i v eg e n o m i ch y b r i d i z a t i o n ，c g h ) 由于具有精确、简便，提供的 信息量大等特点，而引起了人们的j “泛关注。本文拟就国内外的一些文献对c g h 的主 要原理、应用情况、相应改进和该方法目前在肝癌研究中的进展做简要综述。 一比较基因组杂交技术的原理、方法 1 原理 利用两组相互竞争的分别带有不同半抗原标记的基因组探针( 分别来自待测的 肿瘤标本及对照标本) 与正常人中期染色体杂交，之后用连有不同荧光的抗体进行 免疫组化染色，在荧光显微镜下观察，杂交到正常染色体上的两组探针在不同波长 的激发光下分别发出红色和绿色的荧光。每个位点上的红绿荧光信号之比代表了待 测基因组d n a 和对照基因组d n a 的拷贝数之比“1 。 2 方法 c g h 的应用虽然只有几年时间，但其主要技术方法已相当成熟，目前已有较多文 献报告了该技术应用的方法和步骤。k a l l i o n i e m io p 等在1 9 9 4 年讨论了c g h 的方法 东南大学硕士论文 学1 ，后人多参照他们的方法进行实验。 c g h 原理示意图 ( 1 ) 制各正常外周血淋巴细胞中期染色体片：抽取健康人外周血，在含植物血 凝素的培养基中培养，收获前加秋水仙素，经低渗、固定等步骤后滴片，要求染色 体分散良好，细胞质少。 ( 2 ) 提取肿瘤d n a ：可用各种方法从新鲜组织、细胞系或石蜡包埋组织中提取高 分子量的d n a 。 ( 3 ) d n a 探针标记：一般用缺口平移法或简并寡核苷酸引物p c r 法( d o p p c r ) 标记探针，以连接生物素的d u t p 标记待测d n a ，以连接地高辛的d u t p 标记参照d n a ， 用免疫学方法检测。也可用连有荧光素的脱氧核苷酸直接标记，其杂交信号细腻但 较弱。肿瘤和对照的标记d n a 的长度要一致并在6 0 0 2 0 0 0 b p 的范围内。 ( 4 ) 杂交：将标记好的肿瘤和对照d n a 探针与人c o t 一1 d n a 混合、沉淀，溶于含 5 0 甲酰胺和1 0 硫酸葡聚糖的杂交液中。c o t 一1 d n a 用来抑制基因组中的高度重复序 列。d n a 探针和中期染色体片分别变性后在3 7 杂交2 4 天，然后冲洗染色体片， 4 文献综述 间接标记d n a 探针的用荧光抗体检测，最后用4 ，6 一二氨基一2 一苯吲哚( d a p i ) 复 染使染色体显带以分辨各染色体。 ( 5 ) 图像的获得和分析：通过计算机控制的光栅，不同单一波长的激发光分别 激发不同的荧光素( d a p i ，f i t c ，t r i t c ) ，选取分散良好的中期染色体，用连在荧 光显微镜上的冷电荷藕合设备( c c d ) 像机摄取对应三种荧光染料的3 个黑白数字图 像，之后分别分配以蓝、红、绿色，合成彩图。应用分析软件，依d a p i 带型分辨 各染色体，沿各染色体纵轴计算f i t c 和t r i t c 之间的荧光比率，得到染色体上d n a 扩增和缺失的区带“。 二比较基因组杂交技术的近期进展及其尚存在的局限性 1 近期进展 c g h 技术仅能检测所有待测标本的d n a 平均拷贝数变化。多克隆的肿瘤彼此之 间某些区域的拷贝数变化可能会相互平衡而致c g h 检测不出：c g h 也不能区分二倍体、 三倍体等：c g h 也不能检测插入及易位。几年来，s o u t h e r n 印迹、f i s h 、c c 、流式细 胞仪等技术常与c g h 结合应用从而有助于克服这些缺点，复合f i s h ( m u 卜t i p l e x f i s h ) 及光谱核型分析( s p e c t r a l k a r y o t y p i n g ，s k y ) 更是大大改进了c g h 技术。中期染色 体的应用限制了基因组小片段( ( 2 0 m b ) 和紧密连锁的异常的检测。近年发展起来的定 位序列列阵技术代替中期染色体则可克服传统c g h 技术这一局限性。如p in k e l 等用 p 1 、b a c 微列阵提高了c g h 分辨率，p o l l a c k 则用c d n a 微列阵代替中期染色体，结合 高分辨率和基因组水平检测的高效率，且能比较d n a 拷贝数与基因表达的差异。 k i r c h o f f 等报道了用标准参考间隙法( s t a n d a r d r e f e r e n c e i n t e r v a l s ) 代替传统的固 定闽值法，检出了最低为3 m b 的缺失，大大提高了c g h 的敏感性。在探针方面，a l e r s 等报道了一种化学标记法，称为通用连接系统( u n i v e r s a l l i n k a g e s y s t e m ，u l s ) 。福 尔马林固定、石蜡包埋的档存标本d n a 常己降解，若再用切刻平移法标记，d n a 序列会 更短以至不适于进行c g h 分析( 2 m b 才可能被检出。 三比较基因组杂交技术在肝癌研究中的应用 肝癌是世界上普遍高发的癌肿之一，全世界每年约有2 5 1 ，o o o 名新病历予以报 道“。尽管采取综合性的治疗方案，肝癌的5 年生存率依然很低，现有研究虽然表 明，多种因素可能和肝癌的发生密切相关，例如：肝炎病毒的感染、酗酒导致的肝 硬化以及类似黄曲霉素等化学致癌物质的影响，但肝癌真正的发病机理以及相应机 制并没有完全的明晰。为了发现新的治疗策略和诊断方法，人们不断探索新的实验 手段和技术运用于这一领域，比较基因组杂交由于其独特的技术优势，迅速成为在 肝癌研究中不可忽视的力量。 几乎所有的肿瘤细胞都存在染色体片段的非随机异常，表现为染色体数目或结 构的改变，而这些改变又与原癌基因的扩增和抑癌基因的丢失密切相关，所以通过 6 文献综述 c g h 明确肿瘤染色体扩增或丢失的部位后，可进一步寻找与肝癌发生和发展相关的关 键基因。 目前通过c g h 对肝癌的工作研究已经初步表明，肝癌缺失区域常见于4 q ，8 p ， 1 6 q ，1 7 p ，1 3 qa n d6 q ”“。 4 q 2 1 ：这一区域曾在对于肝癌所进行的c g h 等相关研究中被重复报道，并且这 一区域的改变目前我们只在肝癌中能够看到，所以相关数据提示这一区域似乎具有 被看作是组织特异性改变的可能各选区域。 8 p 2 卜2 3 ：这一区域在不同的实验小组的结果中有着不同比例的缺失( 3 2 一6 5 不等) ，而且这一区域包括了通过早期r f l p 研究而得到大家公认的具有肿瘤抑制作 用的p r l t s 基因所在的区域。另外的数据显示，4 0 的8 p 缺失都和8 q 的扩增相联系， a g n e 。sm a r c h i o 等人在6 0 的肝癌病历中检测到8 q 2 2 2 4 区域的扩增，这一结果同时 是和t a b o r 等在大多数肝癌患者中的8 q 2 4 区域所检测到的c m y c 基因过表达相关联的 【2 2 o 1 p 3 6 ：a g n e sm a r c h i o 等人和y e h 等人在此区域都报道了约3 0 左右的缺失。而 且这个区域在其它不同的恶性肿瘤中都有相关报道，预示着这个区域含有相关的抑 癌基因。 1 6 ：1 6 号染色体上缺失的区域在约一半左右的肝癌患者中被检测到，这也同时 证实了s 1 a g l e 等人提出的在1 6 q 2 卜2 4 区域存在e c a d h e r i n 抑癌基因的结论。 1 7 p ：此区域的缺失通常被认为是1 7 p 1 3 1 这个区域中t p 5 3 基因所在的区域。 1 3 q 1 卜3 1 ，6 q 1 5 1 6 ：这两个区域也呈现了虽然较小但还是比较显著的缺失比例。 其中，k u r o k l d 等人曾经在1 3 号染色体长臂上两个被分隔的缺失区域中报道了r b l 和 b r c a 2 两个肿瘤抑制基因。“。 另外，对于肝癌c g h 的研究也同样表明，常见的扩增区域可能在8 q ，1 q ，a n d6 p a n d l 7 q 。虽然除了a g n e sm a r c h i o 等人的工作外，尚没有关于肝癌中6 p 和1 7 q 这两个区 域发生扩增的报道，但已有研究表明，在眼癌以及骨肉瘤等肿瘤存在着6 p 区域特异 性的扩增，c a n o 等人的研究也认为在6 p 2 1 这个区域与p i m l 等癌基因可能有潜在的关 联。；至于1 7 q 这个区域，不仅在肝癌患者中检测到了一定的扩增，而且早期的研究 就表明它和非小细胞肺癌等病症有关联。 通过这些研究，我们可以看到，虽然这些数据所表示的关于在肝癌的c g h 研究中 相关缺失和扩增的区域还较复杂，甚至在一些区域还只有一些零星的数据作为证据， 东南大学硕士论文 但可以肯定的是：这些变化中的绝大多数都不是随机出现和没有规律的。其中 有些区域的扩增和缺失与我们现在所知的癌基因和抑癌基因的位置相吻合，而有些 区域提示了新的未知基因的存在。 结束语：总之，作为一种新的分子细胞遗传学技术，c g h 的发展和运用正方兴未艾； c g h 应用于实体瘤的研究也只有近1 0 年时间，对肝癌的研究更是处于起步阶段，文献 报道都是小样本的研究，尽管如此，目前c g h 发现的一些扩增、缺失相关区域并未见 有与肝癌相关基因的报道，而在这些区域中极有可能存在与肝癌相关的重要基因，这 为今后的研究提供了极为有益的方向。 村料和方法 材料 材料和方法 1 肝癌标本 2 5 例原发性肝癌样本分别取自江苏启动地区医院、南京鼓楼医院、南京肿瘤医院， 所有患者术前均未接受过放、化疗治疗。 2 主要试剂及耗材 b i o t i n 1 6 一d u t p 、d i g o x i g e n i n 一1 l d u t p ( r o c h e ) ； n i c kt r a n s l a t i o nk i t ( i n v i t r o g e n ) ； d n ap 。l y m e r a s e d n a s ei ( i n v i t r o g e n ) ； 人c o t l 一d n a ( i n v i t r o g e n ) ； 去离子甲酰胺( a m r e s c o ) ； 硫酸葡聚糖( p h a r m a c i a ) ； a v i d i n f i t c ，b i o t i n y l a t e dg o a t a n t i a v i d i n ( v e c t o r ) a n t i d i g o x i g e n i n ，兔抗鼠抗体一t r i t c ，羊抗兔抗体一t r i t c ( s i g m a ) r n a s ea ( p r o m e g a ) ： 蛋白酶k ( m e c k ) ； 琼脂糖( i n v i t r o g e n ) ： 胃蛋白酶( s i g 眦) 。 3 溶液 部分溶液的配制方案： 2 0 s s c ： 1 7 5 3 9n a c l ， 8 8 2 9 柠檬酸钠， 用1 0 m o l ln a o h 调至p h 7 o ，加h 。0 定容至1 l 。 d n a 抽提缓冲液： l o i l l l n o l lt r i s c l ( p h 8 0 ) ， o 1 m o l le d t a ( p h 8 o ) ， 2 0 腿m l 胰r n a 酶， q 东南大学硕士论文 0 5 s d s 。 l p e p s i n ： 1 0 p e p s i n0 5 m ， o o l nh c l1 m l 。 p b s 缓冲液： 8 9n a c l ， o 2 9k c l ， 1 4 4 9n a ：h p o 。， o 2 4 9 k h ：p o a ， 用h c l 调至p h 7 4 ，加h ：o 定容至1 l 。 7 0 甲酰胺2 s s c ( p h7 o ，4 0m 1 ) ： 2 8 m ll o o 甲酰胺， 4 m l2 0 s s c ， 8 m ld d h 2 0 。 5 0 甲酰胺2 s s c ( p h7 0 ，4 0m 1 ) ： 2 0 m l1 0 0 甲酰胺， 4m l2 0 s s c ， 1 6 m ld d h 2 0 。 4 主要仪器和设备 荧光显微镜( 0 l y m p u s ) ； 冷电荷藕合设备( c c d ) 像机( z e i s si n c ) ； 普通显微镜( o l y m p u s ) ； 气裕恒温震荡器( 江苏金坛市医疗仪器厂) ； 台式低温离心机( e p p e n d o r f 公司) 隔水式恒温培养箱( 上海一恒科技有限公司) 凝胶成像系统( u v p 公司) 二氧化碳恒温培养箱( n a p c o ) ； 紫外分光光度计d u 7 0 ( b e c k m e n 公司) 0 材料和方法 电子天平( o h a u sc o r p o r a t i o n ) ； 恒压恒流小型电泳仪p a c 一3 0 0 ( b i o r a d ) ； 加样器( g 订s o n ) ； 一3 0 、一8 0 低温冰箱( h a i e r ) ； 微波炉( g a l a n z ) 。 计算机分析软件：德国m e t a s y s t e m 染色体及荧光原位杂交分析系统 二、实验方法与过程 ( 一) 制备正常外周血淋巴细胞中期染色体 1 抽取2 m l 健康成人外周血，分别注入含2 0 小牛血清及抗生素和植物血凝素( p h a ) 的r p m i1 6 4 0 培养基小瓶内，每瓶加o 5 m 1 外周血，混匀。 2 在3 7 。c 二氧化碳孵箱中培养7 2 小时，每日摇晃1 2 次。 3 在收获前2 小时每瓶加入2 0 p l 秋水仙素( 2 0 岭m 1 ) ，混匀。将每一瓶收获 的外周血分别移入一管1 0m l 离心管，1 0 0 0 转分离心1 0 分钟。 4 用细胞培养移液管移去上清，加入低渗液0 0 7 5 mk c l1 0m 1 ，轻轻吹打均匀， 3 7 。c 水浴1 小时。 5 加入1 m l 固定液( 甲醇：冰醋酸= 3 ：1 ) ，混匀。 6 1 4 0 0 转分离心1 0 分钟。 7 去上清，每管加固定液1 0 m l ，轻轻吹打均匀。置于4 。c ，3 0 分钟。 8 重复6 、7 步骤一次。 9 1 4 0 0 转分离心1 0 分钟，移去上清，每管加固定液1 0 m l 。置于4 。c 过夜。 1 0 1 4 0 0 转分离心1 0 分钟，移去上清，取其中一管加入适量1 ：1 固定液。 1 1 轻轻吹打使沉淀悬浮，滴片： a 事先将载玻片置于蒸馏水中，冷却到4 。c 备用。 b 将l o 斗l 悬浮液滴到载玻片上。 c 将载玻片置于空气中干燥。 1 2 在相差显微镜下观察中期染色体片，看染色体分散和细胞质残渣情况，调 整步骤l o 中加入的1 ：1 固定液体积，使细胞核和中期染色体的密度适中。 1 1 东南大学硕：l ：论文 1 3 如果条件合适，将余下的各管分别滴片，制成一批中期染色体片。 将中期染色体片做好标记，放入盒中，一2 0 。c 保存。 ( 二) 提取肝癌临床手术标本组织d n a 1 从一7 6 。c 冰箱中取出手术切除的肝癌标本，置于液氮中。将标本于研钵中碾碎 后，倒入5 0 m l 离心管，加入裂解缓冲液1 0 l 和1 0 m g m l 的r n a s ea2 0 肛l ( 终 浓度2 0 腿m 1 ) ，3 7 作用1 小时。 2 加入2 0 m g m 1 的蛋白酶k 约5 0 肛l ，至终浓度为1 0 0 u g m l ，5 0 水浴消化3 小时以上，裂解细胞，消化蛋白，水浴过程中应不时轻轻摇匀反应液。 3 反应液冷却至室温后，加等体积酚氯仿( 1 ：1 ) 1 0 m l ，缓慢来回颠倒离心管 l o 分钟以混合两相，室温1 0 ，0 0 0 转分离心l o 分钟，使两相分开，吸取上 清。 4 酚氯仿抽提两次后，将水相移至另一离心管中，再用氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提一次。1 0 ，0 0 0 转分离心1 0 分钟后，取上清。 5 上清液加入终体积0 1 倍的3 m 醋酸钠、2 倍体积的冷无水乙醇后，可见絮状d n a 。 挑取絮状d n a 至另一试管中，7 5 乙醇洗涤二次，待自然干燥后，加入适量t e 或 水溶解，o 8 琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察d n a 有无降解。经紫外分光光度仪 定量后置于一2 0 保存。 ( 三) 探针的制备 1 切口平移法标记探针 a 按以下方案冰上准备1 2 5 l 反应体系： 夺基因组d n a ( 来自肿瘤或正常，1 0 0n g 肛1 ) 夺b i o t i n 一1 6 一d u t p ( 或d i g o x i n 1 1 一d u t p ，1 i i l m ，r o c h ) 夺d n t p ( 其中d a t p 、d c t p 、d g t po 2 m m ，d t t p o 1 m m ) 夺m g c l 。( 2 5 l m ，t a k a r a ) 夺e i x ( d n a 聚合酶io 5 u 肛l ，d n a 酶i o 4 m u “) 夺d d h ：o 总反应体积 1 2 5m o 1 蛆 1m 2 5 眦 1 m 2 9 肚1 1 2 5m 材料和方法 b 上述反应体系在1 6 水浴1 小时，然后将e p p e n d o r f 管置于冰上，取1 儿 反应液，1 琼脂凝胶电泳，电压3 0 v ，以确定产物大小及产物量。产物电泳 结果在紫外灯下应该呈一片6 0 0 2 0 0 0 b p 的模糊区域。 c 如产物大小符合预期，则加入反应停止缓冲液( g i b c o ) 。产物可放于一2 0 保存备用。 2 探针的沉淀 a 按以下方案沉淀探针： 夺肿瘤d n a 探针 1 0 1 1 5 l 夺正常d n a 探针 1 0 1 1 5 肛l 夺h u m a nc o t 一1d n a ( g i b c o ) 2 0 l 夺n a a c ( 3 m )3 5 l 令无水乙醇 9 0 肛l b 混合后一7 0 沉淀1 小时。 3 配制杂交混和液 a 4 下1 2 ，o o o 转分离心1 5 分钟，小心吸去上清，用7 5 乙醇洗涤沉淀。 b 4 下1 2 ，0 0 0 转分离心5 分钟，小心吸去上清。 c 空气中干燥。 d 将沉淀溶解于2 5 去离子甲酰胺，1 2 5 斗l4 0 硫酸葡聚糖和1 2 5 儿双蒸 水。 e 混匀沉淀，室温放置2 0 分钟使其充分溶解。 ( 四) 中期染色体片杂交前的预处理 1 r n a 酶a 预处理，按以下方案进行 a 中期染色体片在1 p b s 中洗涤5 分钟。 b 梯度酒精脱水( 7 5 ，8 5 ，1 0 0 乙醇) 各5 分钟，干燥。 c 每片加稀释的r n a s ea1 0 0 1 ( 配制方案：1 p l 的1 0m g m lr n a 酶a 贮存 液加9 9 蛆2 x s s c ) 。 d 中期染色体片置湿盒内， 3 7 。c1 小时。 e 中期染色体片用2 s s c 在室温下洗涤3 次，每次5 分钟。 1 1 东南大学硕士论文 f 梯度酒精脱水( 7 5 ，8 5 ，1 0 0 乙醇) 。 g 空气中干燥。 2 胃蛋白酶预处理 a 每片加稀释的1 胃蛋白酶盐酸溶液1 0 0 肛l ( 配制方案：o 5 肛l 的1 0 p e p s i n 贮存液力口1m lo 0 1 nh c l ) 。 b 中期染色体片置湿盒内，在3 7 。c 孵育8 分钟。 c 在l p b s 中室温下洗涤5 分钟。 3 固定 a 在1 多聚甲醛中室温下浸泡1 0 分钟。 b 在1 p b s 中室温下洗涤5 分钟。 c 梯度酒精脱水( 7 5 ，8 5 ，1 0 0 乙醇) 。 d 空气中干燥。 ( 五) 杂交 1 探针变性 a 杂交混和液在7 5 。c 水浴8 分钟。 b 置3 7 。c 预复性2 0 2 5 分钟。 2 中期染色体片变性 a 选择中期染色体片上中期染色体分布最佳部位，用钻石笔标记。 b 将中期染色体片置于7 0 去离子甲酰胺2 s s c 中，7 3 。c 变性2 分钟。 c 在预先冷却的2 s s c ( 0 。c 4 。c ) 中洗涤2 次，每次5 分钟。 d 梯度酒精脱水( 7 5 ，8 5 ，1 0 0 乙醇) 。 e 空气中干燥。 3 杂交及封片： a 取出预复性的杂交混和液滴在中期染色体片标记好的部位。 b 用盖玻片盖在该部位上。 c 用封片胶封住盖玻片边缘。 d 封好的中期染色体片置湿盒内，在3 7 。c 孵育6 0 7 2 小时。 ( 六) 杂交信号检测 材料和方法 1 杂交后洗涤 a 中期染色体片去除盖片，在4 3 。c 的5 0 去离子甲酰胺2 s s c 中浸泡1 5 分钟。 b 2 s s c 中室温下摇洗2 次，每次5 分钟。 2 封闭 a 每张玻片加饱和脱脂奶粉溶液1 0 0 斗l ( 用4 s s c t w e e n2 0 配制) ，3 7 。c1 0 分钟。 b 4 s s c t w e e n2 0 中室温下摇洗3 次，每次5 分钟。 3 杂交信号检测 a a v i d i n f i t c5 垤m l ，3 7 。c 孵育5 0 分钟。 b 4 s s c t w e e n2 0 中室温下洗涤，摇洗3 次，每次5 分钟。 c b i o t i n y l a t e dg o a t a n t i a v i d i n5 m l 及a n t id i g o x i g e n i n ，3 7 。c 孵育 5 0 分钟。 d 4 s s c t w e e n2 0 中室温下洗涤，摇洗3 次，每次5 分