（果树学专业论文）银杏查尔酮合成酶基因和苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及表达.pdf

缩潞词表 缩写符号 英文全称 中文意义 尘堕竺迪竺一墅趔生曼堕! ! ! c h s c h a l c o n es y n t h a s e 查尔酮合成辩 p a l p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e苯丙氨酸解氨酶 t a l t y m s i n ea m m o n i a l y a s e酪氮黢解氨酶 c t a b c e t y l t r i m e t h y l a m m o n l u mb r o m i d十六烷基三甲基溴化胺 p c r p o t y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 r a c e r a p i d 锄p l i c a t i o nc d n a e n d快速扩增c d n a 末端 t a i l - p c rt h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r 燕不对称交镶p c r s t s s t i l b e n es y n t h a s e 芪合成酶 o r f o p e n n i n gr e a d i n gf r a m e舞敖读玛框絮 u t r u n t r a n s l a t e dr e g i o n 非编码区域 摘要 银杏( g i n k g ob i l o b a ) 叶黄酮具有重要的药用价值，近年来对银杏叶黄酮的研 究，特别是如何提高银杏叶黄酮含量已成为研究的热点与难点。对于提高银杏叶黄 酮的相对百分含量的研究，前人已有大量的报道，事实证明采用生理生化途径调控 银杏叶黄酮相对百分含量是一种有效的方法。同时，利用植物基因工程技术对银杏 进行遗传改良或在分子水平上调控银杏叶黄酮合成途径中关键酶的活性，从而提高 银杏叶黄酮含量也是一种行之有效的方法。银杏叶黄酮合成代谢中涉及到十几种酶， 而查尔酮合成酶( c h s ) 和苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 是银杏叶黄酮合成代谢途径中 的关键酶。因而，开展银杏查尔酮合成酶和苯丙氨酸解氨酶的研究具有重要的理论 意义与实践价值。 本研究以此为基础，以银杏品种家佛手叶为试材，采用c t a b 法提取d n a 和 r n a 。利用r a c e 技术从银杏中分离出查尔酮合成酶基因的c d n a 全长序列，利用 1 对简并引物分离出银杏苯丙氨酸解氨酶基因的部分序列，并利用半定量r t - p c r 法 对其不同时期m r n a 的表达与其活性变化以及黄酮积累的相互关系进行了初步的研 究，主要结果如下： 1 采用c 儆b 法分别提取银杏叶的d n a 和r n a ，提取的d n a 经电泳检测，有清 晰的主带，酶切效果较好，说明提取的d n a 质量较好。抽提的r n a 经电泳检测， 可见2 8 sr r n a 和1 8 sr r n a 两条主带；紫外吸收值测量，a 2 6 0 a 2 8 0 接近2 0 ； 反转录合成的c d n a 经r a p d 扩增，出现清晰的条带，这些说明提取的r n a 与 d n a 纯度高，质量好。该法简便易行，适合于富含多糖、多酚植物材料的核酸提 取。 2 采用1 对简并引物，以银杏叶d n a 为模板进行p c r 扩增，得到了长8 6 3 b p 的银 杏c h s 基因片段，g e n b a n k 登录号为a y 5 6 3 0 3 8 。利用t a i l - p c r 方法，扩增得 到了长为1 2 3 8 b p 的c h s 基因片段，包含c h s 基因y 末端基因组序列，g e n b a n k 登录号为a y 9 4 5 9 3 6 。 3 利用r a c e 技术从银杏中分离出类黄酮合成代谢的第一个关键酶基因c h s 基因， 并命名为g b c h s ，g e n b a n k 登录号为d q 0 5 4 8 4 1 。g b c h sc d n a 全长共1 6 0 8 b p ，该 序列包含p o l y ( a ) 尾结构和一个长1 1 7 3 b p 的最大开放阅读框架( o r f ) ，编码3 9 1 个氨基酸。通过核苷酸和蛋白质序列多重比较发现：g b c h s 与其它植物的c h s 基 因高度同源。g b c h s 蛋白质序列中包含与m s c h s 相一致的活性位点。g b c h s 蛋白质的三维空间结构模型表明：g b c h s 与m s c h s 蛋白质的晶体模型是非常相 似的，这说明g b c h s 蛋白质与m s c h s 蛋白质可能有相同的催化功能。c h s 的系 统进化树表明，g b c h s 与裸子植物的c h s 基因聚类关系最近。g b c h ss o u t h e r nb l o t 结果表明银杏c h s 是一个多基因家族。 4 利用简并引物，以银杏叶d n a 为模板进行扩增，得到长8 6 2 b p 的银杏b 气l 基因 片段，并命名为g b p a l ，g e n b a n k 登录号为a y 5 7 8 1 4 5 。g b p a l 编码2 8 7 个氨基酸。 通过核苷酸和蛋白质序列多重比较发现g b p a l 与其它植物的p a i l 基因高度同源。 g b p a l 蛋白质序列包含与水稻、玉米p a l 基因相类似的活性位点。p a l 的系统进 化树表明：g b p a l 与裸子植物的p a l 基因聚类关系最近。g b p f s o u t h e r nb l o t 结果 表明银杏p a l 是一个多基因家族。 5 采用半定量r t - p c r 方法定量分析了银杏叶生长过程中的c h sm r n a 与p a l m r n a 相对表达量的变化，并分别结合c h s 活性变化、p a l 活性变化以及黄酮含 量的变化曲线进行了线性回归分析。结果表明：c h sm r n a 相对表达量变化与 c h s 活性变化是同步的，可用c h sm r n a 相对表达量代替c h s 活性；p a l m r n a 相对表达量变化与p a l 活性变化是同步的，可用p a l m r n a 相对表达量代替p a l 活性。在整个银杏叶生长过程中，c h sm r n a 变化相对表达量与黄酮含量的变化 是几乎是完全同步的，c h sm r n a 表达水平高低决定了黄酮的积累；在银杏叶生 长后期，p a l m r n a 表达水平与黄酮含量的变化是同步的，银杏叶黄酮的积累与 p a l m r n a 表达水平密切相关。 关键词：银杏；查尔酮合成酶；苯丙氨酸解氨酶；黄酮；基因克隆：表达 a 黔s 下r a c t t h ef l a v o n o i d so fg i n k g ob i l o b ah a dm a n yp h a r m a c e u t i c a lp r o p e r t i e sf o rh u m a n h e a l t h t h es t u d i e so ni n c r e a s i n gf l a v o n o i d si ng i n k g ob i l o b ah a db e e nm o r ea n dm o r e p o p u l a ra n di m p o r t a n t u n t i ln o w , m a n ym e t h o d sh a db e e nc a r r i e do u to ni n c r e a s i n g f l a v o n o i d si ng i n k g ob i l o b a ，a n di tw a saa v a i l a b l em e t h o dv i ap h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lt or e g u l a t ef l a v o n o i d sc o n t e n t a tt h es a n l et i m e ，i tw i l lb eaaa v a i l a b l e m e t h o db yg e n ee n g i n e e r i n gt oi n c r e a s ef l a v o n o i d sc o n t e n ti nt h ef u t u r e t h e r ew e r e m a n ye n z y m e si nf l a v o n o i d sm e t a b o l i cs y n t h e s i sp a t h w a y , b u tc h a l c o n es y n t h a s e ( c h s ) a n dp h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e ( p a l ) w a st h ek e ye n z y m e s o ，c a r r y i n go u tt h es t u d i e s o nt h e s et w oe n z y m e sw a sv e r yi m p o r t a n tv a l u a b l ef o rt h e o r ya n da p p l i c a t i o n 。 d n aa n dr n aw e r ei s o l a t e dr e s p e c t i v e l yf r o mg i n k g ob i l o b al e a v e sb yc r a b m e t h o d ，a n dac h sf u l l - l e n g t he d n aa n dap a lg e n ef r a g r a e n tw a sc l o n e df r o mg i n k g o b i l o b a t e m p o r a le x p r e s s i o no fc h sa n dp a lg e n ew a sa n a l y s e d ，氇o r d e rt os t u d yt h e i n t e r r e l a t i o no fe x p r e s s i o nl e v e lo fc h sa n dp a lg e n e 、f l u c t u a t i o no fc h sa n d a c t i v i t ya n df l a v o n o i d sa c c u m u l a t i o n ，ad e t a i l e di n ：e s t i g a t i o na n da n a l y s i sw a sc a r r i e do u t 。 t h er e s u l t sa sf o l l o w i n g ： 1 ，t h ed n aa n dr n aw e r ei s o l a t e dr e s p e c t i v e l yf r o mg i n k g ob i l o b al e a v e sb yc r a b m e t h o d t h er e s u l ts h o w e dt h a td n aw a sh i 【g h q u a l i t y , a n dc o u l db ed i g e s t e d c o m p l e t e l yw i t he c o ri r n ao b t a i n e d f r o m g i n k g ol e a v e s ，w h i c h g e l e l e c t r o p h o r e t o g r a r nr e v e a l e dt h a tt h e r ew e r e2 8 sr r n a a n d1 8 sr r n a ，a n da 2 6 0 a 2 a p p r o x i m a t e dt o2 0 ，e d n ac o u l db e u s e dt or a p da m p l i f y i n g t h e s er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tr n aw a sh i g hp u r i t ya n dg o o dq u a l i t y t h ec r a bm e t h o dw a s e s p e c i a l l yu s e f u lf o rt h ed n a a n dr n ae x t r a c t i o no fp l a n tm a t e r i a l st h a tc o n t a i n e d p l e n t yo fp o l y s a c c h a r i d ea n dp o l y p h e n 0 1 2 t h eg e n o m i cd n a s e q u e n c eo fc h sg e n ef r a g m e n tw a s c l o n e df r o mg i n k g ob i l o b a b yu s i n gap a i rd e g e n e r a t ep r i m e r s + w h i c hw a s8 6 3 b pl o n g , a n do e n b a n k a c c e s s i o n n u m b e rw a sa y 5 6 3 0 3 8 。c h sg e n e3 e n dg e n o m i cd n as e q u e n c ew a sc l o n e db y t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp e r 翠a i l - p c r ) m e t h o d ，i t sl e n g t hw a s1 2 3 8 b p ，a n d g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e rw a sa y 9 4 5 9 3 6 3 ac h sg e 鞋3w a sc l o n e df r o mg i n k g ob i l o b ab yr a p i ：la m p l i f i c a t i o nc d n ae n d s ( r a c e ) m e t h o d ，a n di tw a st h ef i r s tg e n eo fk e ye n z y m e si n v o l v e di nf l a v o n o i d s m e t a b o l i cp a t h w a yi n 娃b i l o b a 。t h ef u l l l e n g t h ( n a m e da sg b c h s ) w a s1 6 0 8 b pw i t h p o l y ( a ) t a i l i n ga n di tc o n t a i n e da1 1 7 3 b po p e nr e a d i n gf l a m e ( o r f ) e n c o d i n ga 3 9 1 a m i n oa c i dp r o t e i n 。a n dg e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e rw a sd q 0 5 4 8 4 1 g b c h sw a s f o u n dt oh a v ee x t e n s i v eh o m o l o g yw i t ht h o s eo fo t h e rp l a n tc h sg e n e sv i am u l 咖i e 矗 a l i g n m e n t s t h ea c t i v es i t e si nc h sp r o t e i no fm e d i c a g os a t i v aw e r ea l s of o u n di n g b c h s m o l e c u l a rm o d e l i n go fg b c h si n d i c a t e dt h a tt h et h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r eo fg b c h s s t r o n g l yr e s e m b l e dt h a to f m s a t i v a ( m s c h s ) ，i m p l y i n gg b c h s m a yh a v es i m i l a rf u n c t i o n sw i t hm s c h s p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a t g b c h sh a dc l o s e s tr e l a t i o n s h i pw i t hc h s sf r o mg y m n o s p e r mp l a n t s t h eg e n o m i c s o u t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tg b c h sb e l o n g e dt oam u l t i g e n ef a m i l y 4 ap a lg e n ef r a g m e n t ( n a m e da sg b p a l ) w a sc l o n e df o r mg i n k g ob i l o b ab yu s i n ga p a i rd e g e n e r a t ep r i m e r s ，i t sl e n g t hw a s8 6 2 b pa n de n c o d e da2 8 7a m i n oa c i dp r o t e i n ， a n dg c n b a n ka c c e s s i o nn u m b e rw a sa y 5 7 8 1 4 5 g b p a lw a sf o u n dt oh a v ee x t e n s i v e h o m o l o g yw i t ht h o s eo fo t h e rp l a n tp a lg e n e sv i am u l t i p l ea l i g n m e n t s t h ea c t i v e s i t e si np a lp r o t e i no fo r y z as a f i v aa n dz e am a y sw e r ea l s of o u n di ng b p a l p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tg b p a lh a dc l o s e s tr e l a t i o n s h i pw i 穗p a 王s f r o mg y m n o s p e r mp l a n t s t h eg e n o m i cs o u t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tp a lo f g i n g ob i l o b ab e l o n g e dt oam u l t i g e n ef a m i l y 5i tw a sa n a l y s i s e df o rt h ec h a n g eo fc h sm r n ar e l a t i v ee x p r e s s i o na n d 呲m r n a d u r i n gt h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fg i n k g ob i l o b al e a v e sv i as e m i - q u a n t i t a t i v e r t - p c rm e t h o d ，a n dl i n e a r i t yr e g r e s s i o na n a l y s i sw a st o o ko ni tw i t hc u r v eo fc h s a c t i v i t y 、p a la c t i v i t y a n df l a v o n o i d sa c c u m u l a t i o n 。t h er e s u l t ss h o w e dt h a t f l u c t u a t i o no fc h sm r n ar e l a t i v ee x p r e s s i o na n dc h sa c t i v i t yw a si d e n t i c a l ，c h s a c t i v i t ym a yb er e p l a c e db yc h sm r n ar e l a t i v ee x p r e s s i o n d u r i n gt h e w h o l e p r o c e s so fg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fg i n k g ob i l o b al e a v e s ，t h ef l u c t u a t i o no fc h s m r n ar e l a t i v ee x p r e s s i o na n df l a v o n o i d sa c c u m u l a t i o nw a sa l m o s ts a m e ，t h e e x p r e s s i o nl e v e lo fc h sm r n ad i r e c t l yd e t e r m i n e df l a v o n o i d sa c c u m u l a t i o n ；t h e f l u c t u a t i o no fp a lm r n ar e l a t i v ee x p r e s s i o na n dp a la c t i v i t yw a si d e n t i c a l p a l a c t i v i t ym a yb er e p l a c e db yp a l m r n ar e l a t i v ee x p r e s s i o n + d u r i n gt h ee v e n i n go f g r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fg i n k g ob i l o b al e a v e s t h ef l u c t u a t i o no f 眦m r n a r e l a t i v ee x p r e s s i o na n df l a v o n o i d sa c c u m u l a t i o nw a si d e n t i c a l ，t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f p a l m r n a p l a y e dak e y r o l ei nf l a v o n o i d sb i o s y n t h e t i cp a t h w a y k e yw o r d s ：g i n k g ob i l o b a ；c h a l c o n es y n t h a s e ；p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a l y a s e ；f l a v o n o i d s g e n ec t o n g i n g ；e x p r e s s i o n 5 月l j 精 锻銮( g i n k g o b i t o b a l ) t 是褒寿辫子蓬戆孛最砉澎懿孑遮植秘之一，被秣为“活 化石”。银杏寿命长，又名“公孙树”。它原产中国，具有很高的经济、生态、观赏和 辩蹬馋篷，集核鼹、吁翅、耪臻、花粉罴及瓣赛嗣予一身，茏萁是铤杏俸遗纯学物 质的药用价值，已受到世界范围内研究者日螽广泛的茨注。锻杏叶中主要有效活性 成分是黉酝类铯舍物帮蕤悫琵，套效菊鼹残分黄酝类像合秘焱琴孛子、摄、茎、时中， 以叶中禽量为最高，殿药理实验毒性墩远小予种子。黄酮类化合物具有抗氧化、清 除自由罄、消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗心壶管疾瘫、捷衰老以及貉澄更年期综合瘥 等药理活性( 粱立兴，1 9 9 3 ；撩水源等，1 9 9 8 ) 。由于对其食用、药用价值的进一步 认识、开发和利用，锻杏的经济价值张国民经济中的缝位移馋用目趋麓要。飘此， 近年来对银杏叶黄酮的研究，特别是如何提离银杏叶黄酮含煮已成为研究的热点与 难点( 摆水源，2 0 0 1 ) 。 嚣前提高键杏时黄酮总鲞豹途径脊两条：提高单位面积叶产量和提高时赣酮的 相对百分含量。对于提高叶黄酮的相对百分含爨的研究，前人已有大蕨的报邀，事 实话瞻涎爵生联生纯途径调控镊杏甘黄酗相对百分含爨是一种有效的方法。潮此， 利用植物基因工程技术对银沓进行遗传改良或在分予水平上调控银杏叶黄酮合成途 径中关键酶鹳添性，莰嚣提蔫锻杏时黄繇含鐾蒸有重装懿莲论意义和实践价簸。在 银杏叶黄酮合成代谢途径中涉及到十几种酶，而查尔酮合成酶( c h a t c o n es y n t h a s e ， c h s ，e c2 。3 1 7 4 ) 秘苯嚣爨羧艇氨憨( p h e n y t a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e ，p a l ，e 。c 4 3 1 5 ) 是银杏叶黄酮合成代谢途径中的关键酶( 程水源，2 0 0 1 ) 。因而，开殿银杏 查尔酝会残簿秘苯嚣氨羧惩氨薅兹磷究其鸯重溪懿理谂与实践意义。瓣肉终关予查 尔酮合成酶和苯丙氨酸解氨酶的研究主要进展如下： 1 植物p a l 研究现状 苯丙氨酸解氨酶，它催化l 苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是苯丙氮酸代谢途径 中的关键酶。努革酸途径产生的l 苯雨氮酸经p a l 解氮作用生成反式啦桂酸，从恧 进入苯蹰烷代谢途径，生成香救酸、掰魏酸、芥子酸镣中间产物，这照酸可以进一 步转化为香豆索、绿原敝，也可以形成c o a 酶，再进一步转化为类黄嗣、木质素等 次生代澎产物偿l1 ) ( 欧阳光察等，1 9 8 8 ；程承源等，2 0 0 3 ) 。一切含笨丙烷骨架的 物质都由该代谢途径直接或间按生成。 1 1p a l 分布与定位 k o u k o l 和c o n n ( 1 9 6 1 ) 首次从绿色植物中发现了这种酶，并进行了分离纯化。 6 因它是初生代谢和苯丙氨酸代谢途径的纽带，对植物有非常重要的生理意义，所以 也是次生代谢途径中研究最多也最为深入的酶。经研究发现，该酶是一种存在于所 有绿色植物中，在真菌，细菌，藻类中也有发现( 欧阳光察等，1 9 8 8 ) 。p a l 活性在 不同植物中是有差异的，如水稻叶的p a l 活性远比小麦的高。即使在同一株植物中， 不同的组织部位p a l 活性也不同。一般来说，越嫩的部位p a l 活性越高，如萌发 5 d 的黄化水稻幼苗，其幼叶、根、胚轴、胚芽鞘中的山活性依次降低( 程水源等， 2 0 0 3 ) 。杨树的幼叶、顶芽、幼茎中p a l 活性最高，而老茎和成熟叶中p a l 则很 低( s u b r a m a n i a me ta 1 ，1 9 9 3 ) 。在茶叶中，p a l 活性也随叶片成熟度的增加而降低。 在细胞水平上，植物的p a l 主要分布在表皮下细胞和维管组织细胞中( 欧阳光察等， 1 9 8 8 ) 。在亚细胞水平上，p a l 定位于细胞质和一些细胞器如叶绿体、白色体、线 粒体、过氧化酶体、乙醛酸体( c a m me ta 1 ，1 9 7 3 ) 。n a k u s h i m a 等也进行了p a l 的亚 细胞定位研究，发现细胞间质部分p a l 活性最高，电镜技术显示，p a l 分散在细胞 的基质中，定位在高尔基体囊泡和次生壁加厚层中( 欧阳光察等，1 9 8 8 ；c a m me t a 1 1 9 7 3 ) 。p a l 已被固定化，用来工业化生产苯丙氨酸( 李清彪等，1 9 9 6 ) 。 生物碱a l k a l o i d ”n - - p h e 叫d a 耐耻卜一鼬i 蜮睇i d 恻艇螋! 叫h w a y 蛋白质p r 如h 苯丙氮酸莽草酸 莽草酸逢径 i 嚣1 墩 术质素 p 电她如蜒怂 对羹曼簖蛙 生物碱 如照b 蚴4 - - a e e t “e - m a l o m e p a t h w 町 乙酰- 缴 乙酸丙二酸酯途径 碴妇止嗽 厦三曼盹丛 l 、赢乙娜 f i m m o i d s 幽 戴酮粼缝扬 花青黄 图1 植物体内苯丙烷合成代谢的一般途径( 欧阳光察等，1 9 8 8 ；程水源等，2 0 0 0 ) f i g 1t h eg e n e r a lp a t h w a yo fp h e n y l p r o p a n es y n t h e s i sa n d m e t a b o l i s mi np l a n t 1 2p a l 生化性质 p a l 是一种胞内诱导酶，不同来源p a l 的结构、分子量、酶学性质等均不同。 7 州眦 瞧慧静来说，p a l 蛋幺分子量程2 2 0 k d a 一3 3 0 k d a 之间f 欧阳光察等，1 9 8 8 ：c a m me t a 1 ，1 9 7 3 ) ，但不同来源稍有差露。马铃藩p a l 分子量为3 3 0 k d a ，玉米为3 0 6 k d a ， 夺麦巍东籀豹分剩受2 8 0 k d a 黯2 3 0 k d a ( c a r o m e t a l ，1 9 7 3 ) ，革莓为2 6 6 k d a ( g i v e n e t a 1 ，1 9 8 8 ) ，火炬松为2 8 0 k d a ( w h e t t e ne ta 1 ，1 9 9 2 ) ，菜豆为3 3 4 k d a ( c u n h a , 1 9 8 8 ) 。p a l 蛋 鑫是一耱含有碡令程嚣淫蓦黪寡聚蕊，簿令耍蒺其一个作爱煮( 欧鼯澈察等，1 9 8 8 ； c a m me ta 1 ，1 9 7 3 1 。酶蛋白可能因不同的聚合状态而有不同的形式，并且在士豆、 链霉蓉审嚣秘影式不筑攘互转羧( c a r o me ta l 。，1 9 7 3 ) 。懿蛋鑫懿基馥缀藏睫不鬻来源 而异。水稻p a l 氨基酸组成中酸性氨基酸成分低于小麦、玉米和马铃藉，而中憾及碱 性氨基羧戒分煲l 楣对较麓( 欧鞭光察等，1 9 8 5 ) 。 。 鼢山维持活性的最适p h 为8 o 9 5 ，不同来源有所不同。菜豆p a l 最适p h 为 8 8 9 2 ( c u n h a ，1 9 8 8 ) ，嚣薯为8 5 9 5 ( c a m me ta l 。，1 9 7 3 ) ，水稷必9 。2 ，小麦为8 8 f 欧 阳光察辞，1 9 8 5 ) 。动力学曲线不符合米氏方程，不规则，具有别构酶的特征( c a r o m e ta 1 ，1 9 7 3 ) 。大多数p a l 的米氏常数( r a n ) 在0 。3 x l a “m m o l l 1 5 x l f f om l n o 班。范 围内( c a r o me ta l 。1 9 7 3 ) ，水稻中p a l 的k m 为5 9 4 1 0 m m o l u 欧阳光察等，1 9 8 5 ) ， 而小麦的k m 有2 个，分别为0 6 2 5 x 1 0 - 4 m m o l l 和3 i x - 4 m r n o l l ( s u b r a m a n i a me ta l ， 1 9 9 3 ) 。 酶的活性位点研究袋明，氰化物、n a b h 4 不可逆的抑制土豆、玉米、杜鹃、烟 萆和链簿蕾静p a l 活毪。用3 h 标记的n a b h 4 处疆，土豆，玉米产生3 h 丙氨酸( a l a n i n e ， a l a ) ，推测有一个脱氢a l a 在其活性位点，与缀氨酸( h i s t i d i n e ，h i s ) 功能类似，作为 奈奄孛，磐( 欧鬻必察等，1 9 8 8 ；c a l l l r l le la 1 ，1 9 7 3 ) 。勇辩，该酶也被巯蒸专一後修饰 剂- n 乙基鼍来酰亚胺( n e m ) 所抑制( 程水源等，2 0 0 3 ) 。 据投递p a l 有赘氨羧解氨瓣( t y r o s i n ea m m o n i a - l y a s e ，t a l l 活毪，疆纯赘氨酸 ( t y r o s i n e ，t y r ) 解氮生成对香豆酸( j e n s ，1 9 9 7 ) ，一般来讲t a i l 活性不总存在。有人认 为滚酶兹在强耱薅形式，其p a l 葶囊蚕蛾最逶萤辍不弱。p a i 矗a l 毙取次于硬魏形式 酶的比例。到底存在几种酶形式，有待对酶高度纯化才能确定( 程水源等，2 0 0 3 ) 。 1 3p a l 表达的调控方式 除了应用一般酶学方法和童理方法外，代谢抑制剂、放射标记、兔疫化学以及 密度标记等方法也被用磐进行酶基因表达调控研究。对苯丙烷类代谢途径的塌控包 锯酶的内部调节和乡卜界溺子对箕调控两个方面。它们的表达受发育和环境信号的调 节，具有严格的组织时间特异性( o z e k ia n dt a k e d a ，1 9 9 4 ) 。 1 3 1 植物体内p a l 的内部调节 俸内酶活渔豹羲态嶷讫是蠹部谣节静结巢，其橇慈瞧畜多耱，哥戆有酶懿潦释， 或者是存在着抑制因子殿调控因子，也可能受冀代谢途径的反馈调节。 8 ( 1 ) 发弯调警轻辽瀵蛙随揍糖生长发弯过羧提进嚣不甄建变化。热在水稻( 簿 应龙等，1 9 8 3 ) 、小麦、大焘、玉沭( w a l l a n c e ，1 9 7 7 ) 的种子萌发及幼菌生长过程 中p a l ，爨挂酸羟化酶( c i r m a m a t e d - 4 - h y d r o x y l a s e ，c a 4 h ) 和对香酰连接薅 ( 4 - c o u m a n a t ec o a l i g a s e ，4 c l ) 活饿均发生变化，并且三个酶的活住变化存在着伴随 性。一般酶活性最韧较低或没有，后上升剿一个离峰后下降，达到高峰的时间不同 植物有所不同：水稻9 d ，小麦7 d ，葬麦4 d ，胡萝p 仅6 0 h 。在欧芹悬浮缩胞培养物 中滤性峰与生长的j c 寸数期棚合，郁盎香花药中的酶活性水平与减数分裂阶段相符。 在缀织或离俸菌老纯过程中发现酶系的活憔也逐渐下降( c a m me ta 1 ，1 9 7 3 ) 。 ( 2 ) p a l 钝化因子和调节因予的调控植物体内有一种p a l 的内源蚀抑制物质 ( p a l - i n h i b i t o r , 鼢0 1 ) 参与了p a l 活毽豹调节，这已在东稻、秘铃薯、耀瘦，l 黄 瓜、萝p 、向日葵中得到证实。c r e a s y ( 1 9 7 6 ) 在向日葵叶子中提取的是种热不稳 定、刁；胃遴豹使酶失活懿貔质。b i l l e t t 等( 1 9 7 8 ) 敞印度枣黄最下憝辖获得戆选建 一个不能邂析、热不稳定但可逆的抑制p a l 的物质。从去胚乳的水稻黄化苗中也提 取并部分缝健tp a l - i ，稳宅是# 透辑熬鬣叁豢，大部分活性哥鼓蛋鑫懿( 获蛋囱 酶斧口链霉鬣自酶) 所破坏，具有热稳定性。动刀学实验表明p a l - i 对p a l 的抑制是 竞争性豹。承稻p a l - i 不仅毙籀制零援p a l ，虽熊掷毒l 跌差米、小麦、罨铃薯块蓬 切片中提取的p a l ，但不能抑制水稻中掇取的多酚氧化酶和a 淀粉酶( 应初衍， 1 9 8 7 ) 。硪究还发现，单予盱植物幼萤憝乳孛普遍缮在p a l 内源搀制物矮的调节粥 子( p a l - i n h i b i t o r ，r e g u l a t o r ，p 剐b i r ) 。在甚胚乳实验中还发现，p a l 失滔的程度还 与去除题乳敬多少有相关燃( 应初辑，1 9 8 7 ) ，因此，推想胚乳中可能有调节p a l - i 的菜种因予( p a l - m ) 存在。胚乳对苯丙烷代谢酶系的佟用也曾猩养麦、大麦、小 麦、玉米中观察至b f 欧阳光浆等，1 9 8 8 ) 。从而认为胚乳对幼苗础m 活性的调节作用 在朱本科中具有酱遍意义：双子叶植裙子叶对p a l 的调节作焉不兵普遮住( 欧阳光 察等，1 9 8 8 ) 。在双予叶植物西瓜、绿豆、油菜等予叶中，除了在西瓜中观察到子叶 对钫菌秘铖活怪麓调节，萁艳植秘中没磷察搿琵功能。献贮藏组缓来说联予时德黪 的子叶与单子叶植物的胚乳虽然都作为营养贮藏器官，但予叶尚舆光合作用功效， 西藏，双予盱植物子辞的调节作鬻要宽擎予时藿耪静薤羲复杂褥多( 获粥宠察等， 1 9 8 8 ：应初衍，1 9 8 7 ) 。 ( 3 ) 泰端产耱调节p a l 豫了耋然降解、羲纯邃子纛调节因子诿控努，还霉戆 受其末端产物的影响。p a l 的抑制剂有许多种类，包括肉棱酸、p 臀豆酸、l 2 一氨氧 墓o 苯嚣羧、a 羹襞基乙羧爨及慕些氨蓦羧蘩缓煞羧、色氮酸、攀嚣氨酸、酪氨黢、 氟举丙氨黻等( c a r o me ta 1 ，1 9 7 3 ) ，艇中肉棱酸和p 香豆酸楚很有效的抑制剂，且在p h 7 0 游比最逶蹲( 逶豢 8 ) 时对主豆、烟孳搀制爨青效。不同来源的p a l 对同一种 类抑制剂的敏感性不同。来源于大麦和红酵母的脚山对硫氢基类抑制剂敏感，丽来 源予马铃蘩、玉米、黑粉藏却链霉菌的则不敏感( c a m me ta l 。，1 9 7 3 ) ，遮弛对酶活 性的抑制间酶活健部位脱氯丙氨酰基的丧失和减少相伴随，其机理可能楚对脱氢雨 9 氨酰残基的修饰( c a r o me ta 1 ，1 9 7 3 ) 。栎树两种同工酶对肉桂酸、对香豆酸和苯丙氨 衍生物敏感性不同，这可能是控制其衍生途径的重要机制( c a r o me ta 1 。1 9 7 3 ) 。另黄 酮作为末端产物可抑制该酶。 表1 各种因子对不同植物p a l 表达的诱导 t a b l e1i n d u c e m e n to fs o m ef a c t o r st op a li nd i f f e r e n tp l a n t s 植物种类p l a n tv a r i e t y诱早因子i n d u c e m e n tf a c t o r s 马铃薯切片p o m t os l i c e 白光w h i t el i g h t 欧芹悬浮细胞p a r s l e yc e l l 紫外光u l t r a v i o l e t ，稀释d i l u t i o n s u s p e n s i o n 小黄瓜幼苗c u c u m b e r蓝光b l u el i g h t s e e d l i n g s 甘薯块根s w e e tp o t a t o切割i n c i s i o n ，生长素3 - i n d d e a c e t i ca c i d ( 1 a n ) 6 - 苄基氨基比 e a r t h n u t 林6 - b e n z y l a m i n o p r i n e ( b a p ) ，乙烯e t h y l e n e 豌豆荚p e a s e白光w h i t el i g h t ，乙烯e t h y l e n e 菜豆悬浮细胞b e a nc e l l 2 ，4 - 二氯苯氧乙酸2 , 4 d i c h l o r o p h e n o x ya c e t i ca c i d ( 2 ，4 - d ) ，激 s u s p e n s i o n 动素k i n e t i n ( k a 3 ，自光w h i t el i g h t ，稀释d l l u t i o n 、赤霉素 g i b b e r e i l i n ( g a ) 烟草悬浮细胞t o b a c c o6 - 苄基腺嘌呤6 - b e l l z y l a d e n i n e ( 6 - b a ) c e l ls u s p e n s i o n 玉米幼苗m a i z es e e d l i n g s红光r e dl i g h t 尾穗苋黄化苗 a m a r a n t h u sc a u d a t n s激动素k i n e t i n ( 1 ，蓝光b l u el i g h t e t i o l a t i o ns e e d l i n g s 菠菜和小白菜s p i n a c h 紫外光bu l t r a v i o l e t b a n dc a b b a g e 苹果a p p l e 紫外光u l t r a v i o l e t ，白光w h i t el i g h t 银杏叶g i n k g ol e a f 红光r e dl i g h t ，白光w h i t el i g h t ，乙烯利e t h y l e n e ，脱落酸 a b