（植物学专业论文）auxins、ctks对aba诱导气孔关闭的效应及其作用机制研究.pdf

a u x i n s 、c t k s 对a b a 诱导气孔关闭的效应及其作用机制研究 盂赣妮 摘要植物生长物质a u x i n s 、c r k s 和a b a 对植物生长发育有重要调控作用。前人 的研究表明，a b a 通过提高保卫绷胞h 2 0 2 、n o 水平促进气孑l 关闭，a u x i n s 、c t k s 通过降低h 2 0 2 、n o 水平促进气孔开放。但时至今e 尚未见a u x i n s 、c t k s 和a b a 相互作用进而调控气孔运动的报道，更未见调控气孔运动巾前述生长物质相互作 蔫机截的研究。本文以蚕豆( f c a 扭b a ) 下表皮为材料，借助表皮条分析、蓊理 学实验及激光必聚焦显微镜技术，研究了a u x i n s ( i a a 、n a a ) 和c t k sf 6 b a 、 k t ) 对a b a 诱导气孔关闭的效应及其作用枫剖，旨在完善保卫缎胞信号转导翔络， 亦为丰富和发展气孔运动机制理论积累资料和奠定基础。 本文的主要结果如下： l 。a u x i n s ( i a a 、n a a ) 、c t k s ( 6 b a 、k t ) 均以剂量依赖方式阻止a b a 诱导 气孔关闭。 2 i a a 、n a a 和6 b a 、k t 遐止a b a 诱导气孑l 关阙的效应可被a s a ( 鹣0 2 清除剂) 、d p i ( h 2 0 2 合成酶n a d p h 氧化酶抑制剂) 、c p t i o ( n o 清除剂) 、l - n a m e ( n o 台成酶n o s 抑制剂) 所模拟，暗示i a a 、n a a 和6 - b a 、k t 阻止a b a 诱 导气孔关闭的效应可能与保卫细脆h 2 0 2 、n o 水平降低有关。 3 借助h ，0 2 、n o 的特异性荧光探针和l s c m 技术发现，与a s a 、d p i 的作 嗣相似，i a a 、n a a 稷6 - b a 、k t 确实阻正a b a 诱导蚕要保卫缅麓h 2 0 2 水平升 高；与c p t i o 、- n a m e 的作用相似，i a a 、n a a 和6 - b a 、k t 确实阻止a b a 诱 导豹蚕蔑保卫纲胞n o 水乎升高。这与a s a 、d p i 、c f t i o 、l - n a m e 隧止a b a 诱 导气孔关闭的结果一致。这些缩柴表明i a a 、n a a 和6 - b a 、k t 阻止a b a 诱导 气孔关闭的效应确实与保卫细胞h 2 0 2 、n o 水平降低有关。 4 与a s a 、c p t i o 相似，6 - b a 、曜j 数k b a 诱孕下已经关闭的气孔再次开放； 与d p i 、l - n a m e * 目似，i a a 、n a a 未能促进a b a 诱导下已经关闭的气孔再次开放。 由戴结果可见，6 - b a 、k t 与h 2 0 2 、n o 清滁铡豹效应一致，嚣i a a 、n a a 与糙0 2 、 n o 合成酶抑制剂的效应一致，这种一致暗示6 b a 、k t 可能通过清除已经由a b a 诱导生成的h 2 0 2 、n o 进颟促进酩经关闭的气孔再次开放，而l k a 、n a a 列 已经由 a b a 诱导生成的h 2 0 2 、n o 无清除效应，因而未使已经关闭的气孔再次开放。 5 借助h 2 0 2 、n o 的特异性荧光探针和l s c m 技术发现，a b a 处理3 h 末保卫细 飕h 2 0 2 、n o 永平较高，此时加入6 b a 、k t 、a s a ，h 2 0 2 水平在9 0 0 s 内靼馥照降 低，1 h 时明显低于对照；此时加入6 - b a 、k t 、c p t i o ，n o 水平在9 0 0 s 内亦明显 降低，l h 对亦明显低于对照。此结果表明，象a s a 、c p t i o 样，6 b a 、k t 确有 清除a b a 诱导生成的h 2 0 2 、n o 的效应，这与6 b a 、k t 促进a b a 诱导下已经关闭 的气孔再次开放的结果一致。 6 借助h 2 0 2 、n o 的特异性荧光探针和l s c m 技术发现，a b a 处理3 h 末保卫细 胞h 2 0 2 、n o 水平较高，此时加入i a a 、n a a 、d p i ，h 2 0 2 水平在9 0 0 s 内未见变化， 1 h 时亦与对照无差异；此时加入i a a 、n a a 、l - n a m e ，n o 水平在9 0 0 s 内亦无明 显降低，1 h 时亦与对照无差异。此结果表明，象d p i 、l - n a m e - - 样，i a a 、n a a 确无清除a b 婶导生成的h 2 0 2 、n o 的效应，这与i a a 、n a a 未能促进a b a 诱导下 已经关闭的气孔再次开放的结果一致。 综上所述，将6 - b a 、k t 降低a b a 诱导生成的h 2 0 2 、n o 进而促进气孔开放， i a a 、n a a 未降低a b a 诱导生成的h 2 0 2 、n o 亦未促进气孔开放的结果与6 - b a 、 k t 和i a a 、n a a 均阻止a b a 诱导h 2 0 2 、n o 水平提高和气孔关闭的结果联系起 来考虑，可以得出6 - b a 、k t 通过清除、而i a a 、n a a 通过抑制合成阻止a b a 诱导h 2 0 2 、n o 水平提高进而阻止气孔关闭的结论。 关键词：细胞分裂素：生长素；脱落酸：过氧化氢：氧化氮；蚕豆；气孔运动 t h ee f f e c t sa n dt h em e c h a n i s mo f a u x i n s ，c t k s o na l i a - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e a b s t r a c t ：t h ep l a n th o r m o n e sa u x i n s ，c y t o k i n i n s ( c t k s ) a n da b s c i s i ca c i d ( a b a ) a r e i m p o r t a n ti nt h er e g u l a t i o no fp l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t m a n yr e s e a r c h e ss h o w e d t h a ta b ai n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r eb yi n c r e a s i n gt h ei n t r a c e l l u l a r h 2 0 2 ( h y d r o g e n p e r o x i d e ) o rn o ( n i t r i co x i d e ) i ng u a r dc e l l s a u x i n sa n dc t k sp r o m o t e ds t o m a t a l o p e n i n gb yd e c r e a s i n gt h ei n t r a c e l l u l a rh 2 0 2o rn o i ng u a r dc e l l s b e s i d e s ，i th a db e e n f o u n dt h a ta u x i n sa n dc t k sc o u l dr e v e r s ea b a - i n d u c e ds t o m a t a ic l o s u r e h o w e v e r , u p t on o w , t h e r ew a sl i t t l ei n f o r m a t i o na b o u tt h em e c h a n i s mo ft h ei n t e r a c t i o no fa u x i n s ， c t k sa n da b ai nr e g u l a t i n gs t o m a t a lm o v e m e n t i no r d e rt oi n t e g r a t et h ei n t r i c a t e n e t w o r ko fs i g n a l i n gp a t h w a yi ng u a r dc e l l sa n dd e v e l o pt h em e c h a n i s m so fs t o m a t a l m o v e m e n t ，t h ee f f e c t sa n dt h em e c h a n i s mo fa u x i n s ，c t k so na b a - i n d u c e ds t o m a t a l c l o s u r ei nv a c i a a b aw e r es t u d i e dh e r eb ye p i d e r m a ls t r i pb i o a s s a ya n dl a s e r - s c a n n i n g c o n f o c a lm i c r o s c o p y t h em a i nr e s u l t sw e r ef o l l o w e d ： 1 a u x i n s ( i a n a a ) a n dc t k s ( 6 - b 氏k t ) r e v e r s e da b a - i n d u c e ds t o m a t a l c l o s u r ei nad o s e d e p e n d e n tm a n n e rr e s p e c t i v e l y 2 t h ee f f e c t so f 姒n a a , 6 - b aa n dk to nr e v e r s i n ga b a - i n d u c e ds t o m a t a l c l o s u r ec o u l db ei m i t a t e db ya s a ( h 2 0 2s c a v e n g e r ) ，d p ia ni n h i b i t o ro fs u p e r o x i d e g e n e r a t i n gn a d p ho x i d a s e ) ，c p t i of n os c a v e n g e r ) , a n dl - n a m e ( n os y n t h a s e i n h i b i t o r ) i tp r o b a b l ys u g g e s t e dt h a t 姒n a a ，6 - b aa n dk tr e v e r s e da b a - i n d u c e d s t o m a t a lc l o s u r eb yr e d u c i n gt h ee n d o g e n o u sh 2 0 2o rn oi ng u a r dc e i l s 3 u t i l i z i n gt h es p e c i f i cf l u o r e s c e n ti n d i c a t o ro fh 2 0 2o rn oa n dl s c mt e c h n i q u e ， i th a db e e nf o u n dt h a tt h ei n c r e a s eo ft h ee n d o g e n o u sh 2 0 2p r o m o t e db ya b ac o u l d b e e np r e v e n t e db yi a a ，n a a , 6 - b aa n dk t , l i k ea s ao rd p i a n da sc p t i oo r l n a m e ，l 钆钆n a a , 6 - b aa n dk tc o u l dp r e v e n tt h ei n c r e a s eo ft h ee n d o g e n o u sn o p r o m o t e db ya b a t h e s er e s u l t sw e r ei na c c o r d a n c ew i t ht h ee p i d e r m a ls t r i pb i o a s s a y t h u s ，t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o h i b i t i v ee f f e c t so fi a a ，n a a , 6 b aa n dk to n a b a - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r ew e r e d e f i n i t e l y r e l a t e dt ot h e d e c r e a s i n go f t h e e n d o g e n o u sh 2 0 2o rn o i ng u a r dc e l l s ； 4 6 - b aa n dk t ，l i k ea s ao rc p t i o ，c o u l dp r o m o t et h ec l o s e ds t o m ai n d u c e db y a b at oo p e n b u t ，i a aa n dn a 气l i k ed p io rl - n a m e ，c o u l dn o tp r o m o t et h ec l o s e d s t o m ai n d u c e db ya b at oo p e n i no t h e rw o r d s ，6 一b aa n dk tw e r es i m i l a rt ot h e s c a v e n g e ro fh 2 0 2o rn o b u ti a a a n dn a aw e r es i m i l a rt ot h es y n t h e s i si n h i b i t o r 皿l c a c c o r d a n c ep e r h a p si n d i c a t e dt h a t6 - b aa n dk tp r o m o t e dt h ec l o s e ds t o m at oo p e n t h r o u g hs c a v e n g i n gt h eh i g hl e v e lo fh 2 0 2 o rn oi n d u c e db ya b a d i r e c t l y , b u ti a aa n d n a ac o u l dn o tp r o m o t et h ec l o s e ds t o m at oo p e nf o rt h e i rn o ts c a v e n g i n gh 2 0 2o rn o i n d u c e db ya b a 5 u t i l i z i n gt h es p e c i f i cf l u o r e s c e n ti n d i c a t o ro fh 2 0 2 o rn oa n dl s c m t e c h n i q u e ， i th a db e e nf o u n dt h a t ，a l t h o t l g ht h ef l u o r e s c e n tl e v e lo fh 2 0 2o rn oi ng u a r dc e l l sw e r e h i g ha f t e rd e a l lw i t ha b a f o rt h r e eh o u r s ，t h el e v e lo fh 2 0 2w o u l dd e c r e a s ec l e a r l yi n 9 0 0 sa n dw o u l db ew e a k e rs i g n i f i c a n t l yt l i a nt h eb l a n kc o n t r a s ta to n eh o u ra f t e r6 一b 八 k ta n da s aw e r ea d d e d s i m i l a r l y , t h el e v e lo fn ow o u l dd e c r e a s ec l e a r l yi n9 0 0 sa n d w o u l db ew e a k e rt h a nt h eb l a n kc o n t r a s ta to d eh o u ra f t e r6 - b a , k ta n dc p l l ow e r e a d d e d t h e s er e s u l t ss u g g e s t e d6 - b aa n dk t , l i k ea s ao rc p t i o ，c o u l ds c a v e n g et h e i n t m c e l l u l a rh i 【g hl e v e lo fh 2 0 2o rn oi ng u a r dc e l l si n d u c e db ya b a a n dt h er e s u l t w a si na c c o r d a n c ew i t ht h ep r e v i o u so n e ，t h ee f f e c t so f6 - b 气k tp r o m o t i n gt h e a b a - i n d u c e dc l o s e ds t o m at oo p e n 6 u t i l i z i n gt h es p e c i f i cf l u o r e s c e n ti n d i c a t o ro fh 2 0 2o rn oa n dl s c mt e c h n i q u e ， i th a db e e nf o u n dt h a t ，i a 气n a aa n dd p ih a dn o tp r o m o t e da n yc h a n g e so nt h eh i g h l e v e lo fh 2 0 2i n d u c e db ya b af o rt h r e eh o u r si n9 0 0 sa n do n eh o u r s i m i l a r l y , i a a ， n a b , a n dl - n a m eh a dn o tp r o m o t e da n yc h a n g e so nt h eh i g hl e v e lo fn oi n d u c e db y a b af o rt h r e eh o u r si n9 0 0 sa n do n eh o u r t h u s ，i tc o u l db ei n d i c a t e dt h a ti a a 。n a a , l i k ed p io r l n a m e c o u l d n tr e d u c ea b a i n d u c c dh 2 0 2o rn ol e v e lo b v i o u s l y t h e s e r e s u l t sa c c o r d e dw i t ht h ee p i d e r m a ls t r i pb i o a s s a y i naw o r d ，6 - b a , k t , i a aa n dn a ac o u l dp r e v e n ta b a i n d u c e di n c r e a s i n go f e n d o g e n o u sh 2 0 2o rn oa n dr e v e r s e da b a - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e 6 - b a , k t d e c r e a s e dt h eh i g hl e v e lo fh 2 0 2o rn oi n d u c e db ya b a p r e v i o u s l ya n dt h e np r o m o t e d c l o s e ds t o m at oo p e n b u t ，眦n a ac o u l d n td e c r e a s et h eh i g hl e v e lo fh 2 0 2o rn o i n d u c e db ya b a p r e v i o u s l ya n dc o u l d n tp r o m o t es t o m at oo p e n s o ，i tc o u l db e c o n c l u d e ds y n t h e t i c a l l yt h a t6 - b aa n dk tr e v e r s e da b a - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e t h r o u g hs c a v e n g i n ga b a - i n d u c e dh 2 0 2o rn od i r e c t l y ；h o w e v e r , i a aa n dn a a r e v e r s e da b a i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r et h r o u g h i n h i b i t i n g t h e s y n t h e s i s o f a b a - i n d u c e dh 2 0 2o rn o k e y w o r d s ：c i t b ；a u x i n s ；a b s c i s i ca c i d ；h y d r o g e np e r o x i d e ；n i t r i co x i d e ；v a c i a ，口b a ； s t o m a t a lm o v e m e n t 主要缩略语词汇表 英文缩写英文名称 中文名称 h 2 0 2 h y d r o g e np e r o x i d e 过氧化氢 n on i t r i co x i d e 一氧化氮 r o sr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s活性氧 r n sr e a c t i v en i t r o g e ns p e c i e s活性氮 n o sn i t r i co x i d es y n t h a s e 一氧化氮合酶 a b aa b s c i s i ca c i d 脱落酸 6 - b a6 - b o n z v la m i n op u r i n e 6 - 苄氨基嘌呤 k t 6 - f u r f u r y la m i n op u r i n e 6 - 糠氨基嘌呤 i a ai n d o l e 3 a c e t i ca c i d 吲哚乙酸 n a a n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d n - 奈乙酸 d p i d i p h e n y l e n e i o d o n i u m c h l o r i d e 二苯基碘 触 a s c o r b i ca c i d抗坏血酸 l - n a m e n 6 - n i t r o - l a r g i n i n em e t h y le s t e r n ( 7 。氮屯一精氨酸甲酯 c p t i o c a r b o x y - 2 p h e n y l - 4 4 ，5 ，5 _ r a m h 登苎2 。兰。4 ，4 5 ，5 - 四甲基 h v l i m i d a z o l i n e 咪唑1 氧3 氧化物 m e s 2 一( n 。m 。r p h o l i n o ) 6 t h 8 n 。8 “l f 0 i 。2 ( n 吗啡啉) 乙烷磺酸 a c i d t r i st l i m e t h a n o la m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 h 2 d c f - d a2 ，7 - d i c h l o r o f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e乙酰乙酸盐- 2 ，7 - 二氯荧光素 乙酰乙酸盐4 ，5 二氨基荧光 d a f - 2d a 4 ，5 d i 锄i n o n u 。瑚。i l l d i 8 。诅忙黄 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 l s c ml 警 8 。a 1 1 1 1 m g c o m c a l 激光扫描共聚焦显微技术 、 。 激光扫描共聚焦显微技术 m i c r o s c o p y v 学位论文独创性声明 y 9 0 0 1 9 9 本人声明赝呈交豹学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得灼研 究成果。尽我所知，除文中恐经洼羽弓i 熙兹内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成聚，也不包含为获褥陕西师范大学或其它教育枫构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出熏要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 日期：翟i & 生瘟 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位勰闻论文工作豹知识产权单靛满陕题j 饕范大 学。本入保诞毕业离校后，发表率论文或使用本论文成果时著名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文弗向国家主管部门或其它指定机构送变论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行撩索； 有权将学位论文的标题颓摘要汇编出舨。 作者签名：童越 日期- 塑6 鞋圭直 i 文献综述 1 气孔保卫细胞a l i a 信号转导 自从上世纪6 0 年代发现和鉴定脱落酸( a b a ) 之后，其生理功能不断被揭示， 从最初认为它是一种生长抑制物质，到目前已经证实它对种子( 果实) 的发育和成 熟、逆境胁迫的适应、气孔运动以及基因表达的调控等均具有重要的调节功能 ( d a v i e s ，1 9 9 1 ；g i r a u d a t ，1 9 9 4 ) 。植物体内水分亏缺时脱落酸( a b 大量合成， 诱导气孔关闭，降低蒸腾失水，从而有效地调节植物的水分平衡。a b a 调节气孔 运动的显著效应使许多科学工作者对其作用机制产生了浓厚的兴趣，与其它刺激 因子( 如光、c 0 2 、湿度等) 相比，人们对于保卫细胞a b a 信号转导的认识更为深 入。近年来，有关a b a 调控气孑l 运动魄生理生化、分子遗传机制以及一些新突变 体的发现和研究，将保卫细胞a b a 信号转导的研究推向一个新的高潮，保卫细胞 也成为研究植物细胞接受刺激并作出反应的赵好模式系统。 1 1 a b a 受体 a b a 受体的研究是从a b a 结合蛋白入手的，早在1 9 8 4 年就有a b a 受体的报道 ( h o m b e r g ，1 9 8 4 ) ，之后又发现不同的能与a b a 结合的蛋白质( p e d r o n ，1 9 9 8 ；z h a n g ， 1 9 9 9 ) 。受体蛋白与其激素分子之间有很强的亲和力，激素受体的一个重要特征是 激素分子和受体结合后使受体激活，激活了的受体可引起特定的生理反应。与其 他激素受体相比，a b a 受体的研究比较落后。尽管近年来关于a b a 结合蛋白的研 究不少，也得到了纯化的结合蛋白，但真正符合受体特征并能表现生理功能的结 合蛋白尚未见报道。目前，a b a 受体的克隆已经成为研究植物细胞信号转导的重 要目标之一。值得欣慰的是，非洲爪蟾卵母细胞由于其细胞体积较大便于显微操 作而且该细胞本身具有大量的能表达所注射基因的各种组分( 如聚合酶i ，i i ， 等) ，过去常被作为良好的模式表达系统用于克隆与动物细胞相关的受体基因，现 在该模式系统已经被成功地应用于鉴定a b a 受体租相关的信号转导机制研究 ( l e y m a n , 1 9 9 9 ；s u r o n ，2 0 0 0 ) 。 a b a 与受体结合是其信号转导的第一步，在保卫细胞的质膜外侧和细胞内部 都存在a i 认识别与结合位点( a s s m a n n ，1 9 9 4 ) 。h o r n b c r g ( 1 9 8 4 ) 证明蚕豆保卫细胞原 生质体表面存在高亲和力的a b a 结合蛋白。a n d e r s o n ( 1 9 9 4 ) 将a b a 显微注射到鸭 跖草单个保卫细胞胞质，没有观察到气孔开度变化，但在胞夕b p h 6 5 时，外源a b a 处理诱导9 8 的气孔关闭，证明了胞# f a b a 受体在a b a 调控气孔运动中的重要作 用。然而，s c h w a r t z ( 1 9 9 4 ) 发现，在胞外p h 8 0 时，虽然a b a 浓度已经达到通常可 以引起气孔关闭的1 m m o l l ，气孔仍然处于开放状态，但如果将a b a 显微注射到保 卫细胞里，则可使气孔关闭，可见保卫细胞内部的a b a 受体也起重要作用。王恒 彬( 1 9 9 7 a ：1 9 9 7 b ) 的研究表明，蚕豆保卫细胞原生质体质膜上存在高亲和力的 a b a 结合蛋自，诱且这种蛋白与a b a 作用的最适p h 为6 5 。进一步研究发现，胞外 口h 的变化影响a b a 的存在形式。碱性条件促进a b a 解离为离子形式，不利于其跨 膜进入胞质，而酸性条件有利于a b 崂膜进入胞质。m a c r o b b i e ( 1 9 9 5 ) 报道，胞外 p h 由6 0 升至8 。o 与胞外a b a 浓度降低对气孔开度的影响类似。最近张骁( 张骁， 2 0 0 1 ：z h a n g ，2 0 0 1 a ) t l 勺研究表明，在胞# b p h 6 1 5 时，i m m o l l 的a b a c i 源处理或显 微注射均可诱导黉豆保卫细胞产雯h 2 0 2 ，警致气孔关闭，再次证明探卫细胞内、 外都可能存在a b a 受体。 1 2 保溅细胞a b a 信号转导 由于生物化学及分予生物学技术的弓| 入，膜片锚技术和激光共聚焦显徽技术 的应用蹲，对保卫细胞a b a 信号转导的研究已取得了重大进展。王学臣( 1 9 9 5 ) 报遭，环境耪逡条件下豹气孑l 运动与保卫缀胞a b a 区隔纯和再分配密切相关，僳 卫细胞背壁a b a 浓度的变化可能是启动气孔运动的重要因素。进一步的研究表明， a b a 与其保卫细胞内外侧受体结合后，产生肌醇三磷酸( i p 3 、和环腺萤酸二磷酸核 糖( c a d p r ) ，激活胞内钙库中c a 2 + 的释放，同时质膜上内向c a 2 + 通道f c a 2 + c h a n n e l s ) 也被激活，从而使胞内游离c a 2 + 浓度( 【c a 2 + 】嗣升高，并且诱鼯胞质p h 升高，进而 调节质簇上的离子通道。激活的蛋自激酶，装自磷酸酶也参与调节质貘上的离子通 道，促进阴离予和钾离予外流，抑制钾离予内流，降低保卫细胞膨压，导致气孔 关闭或抑制气孔开放。 1 2 ic a 2 + ，i p 3 和c a d p r a b a 通过c a 2 + 依赖和c a “不依赖两种信号途径调控气孔运动，其中钙依赖途 径更为常见和重要( a 眭a l l , 1 9 9 4 ) 。 在依赖c a 2 + 的a b a 信号转导途径中，c a 2 + 是a b a 信号途径中熏要的第二信 使，a b a 对气我豹诿节撵翔透过c a 2 + 来实现。在缺锈的条件- f ，a b a 尼乎不撺翻 气孔开放。胞外c a 2 + 螯会剂e g t a 与质膜或液泡膜上c a 2 + 通道的阻断剂均明鼹减 弱a b a 诱导的【c a 2 + k 增加以及a b a 对气孔运动的影响，揭示了增加的【c a 2 + k 可能来自于胞外钙内流或者胞内钙库释放。g r a b o v 等( 1 9 9 8 ) 利用钙的荧光指示 剂r a t a - 2 发现，a b a 能诱导鸭跖孳保卫细胞【c a 2 + h 迅速升高，而且这种升高现象 比气孔关闭现象出瑰的翼旱。应两膜片键技术发瑷，a b a 能激活保卫细腱内彝钙 离子通道和质膜上非选择性离子通道，使【c a lc v t 瞬间升高，引起气孔关闭( p e i ， 2 0 0 0 ) 。进一步磷究发现，保卫细胞l q “b 积累可以产生如下效应( m a n s f i e l d ， 1 9 9 0 ；c o u s s o n ，1 9 9 5 ) ：首先，通过质膜上c a 2 + 通道的c a 2 + 内流引起胞内贮钙体向 胞质中释放c a “( c a l c i u m - i n d u c e dc a l c i u mr e l e a s e ) ，使【c a “】q t 迅速升高，进面导 致质膜去极化和抑制k + 内流；其次， c a 2 q 。提高叮通过激活依赖c a 2 + c a m 复合 锯豹蛋如激酶，进丽激活授速阴离子逶遂( s 型) ，促进弱离子外流以及矮簇去极纯， 而去极化的质膜又可激活慢速阴离子通道( s 型) ，进一步使质膜去极化，接着去极 化豹质膜形成一个有利子k + 通过外向k + 遂道被动外流豹电化学梯度；再次， 【c a 2 + 】哪也可直接影响质膜上的内向k + 通邀，阻止k + 内流，从而降低保卫细胞的 膨压，引起气孔关闭或者抑制气孔开放。 另外，保卫缨胞肉韵自m c a 2 + 浓度并不是持续性缝增加，两是呈现忽高忽低豹 振荡现象( o s c i l l a t i o n ) ，而且这种变化可能是气孔关闭所必需的( s c h r o e d e r ，1 9 9 0 ： m c a i n s h ，1 9 9 5 ) 。导致气乳关闭豹4 种刺激因子泣巍a 、活性氧、j 嚣滏、外源q 2 + ) 均诱导野生型拟南芥保卫细胞【c a 2 + 】。振荡和气孔关闭，然而对拟南芥v a t p 鹪e 突 变体( d e t 3 ) 而言，尽管活性氧和外源c a 2 + 可持续地增加 c a 2 + k ( 非振荡彤式) ，但不 能诱导气孔关f i l ，只有熊够诱导【c a 2 + 】c y t 振荡的a b a 和低温刺激可以诱导气孔关闭， 因此【c a 2 + 1 c v t 振荡可能是气孔关闭信号途径中重要的上游信母。 g i l r o y ( 1 9 9 4 ) 发瑰，禚c a “逶遴阻断剂h ”存在的情况下，提衰鹤麟草保翌缀腿 胞内口3 水平，仍然能增加【c a 2 + 】哪，引起气孔关闭。动物细胞研究发现细胞质膜上的 4 , 5 二磷酸磷脂酰肌醇( p 口2 ) 在磷脂酶c ( p l c ) 催化下分解生成1 , 4 ，5 三磷酸肌醇 0 1 3 ) 和二酯酰甘油( d g ) ，i p 3 可以启动胞内钙库释放钙离予。植物中磷酸肌醇系 统的主要成分爵经鉴定出来，植物细胞液泡膜上也存在类似动物口3 受体的口。结合 蛋自。g i l r o y ( 1 9 8 6 ) 研究表明，鹋可遴避调节质膜上的k + 遥遂，降低保卫细觑内 k + 浓度，使气孔关闭。l e e ( 1 9 9 6 报道，蚕豆保卫细胞经脱落酸处理后，1 0 s 内 l p 3 浓度迅速壤加，弗呈现类似胞旗钙离子变佬的震荡现象。因此推测，i p 3 也是调 节气孔运动的第二信使，它与a b a 的关系可能是：a b a 与受体结合后激活p l c 、 催化婵3 产生、启动胞内钙库释放c a z + 、【c a 2 + 】。增加、抑制k 十内流、降低保卫细胞 膨压，最终诱譬气孔关闭。 除i p 3 外，环腺营酸二磷酸核糖( c y c l i ca d p r i l r o s e ，简称c a d p r ) 也能引起 【c a 2 + k 上升。w u ( 1 9 9 7 ) 报遴，a b a 处理豹拟南芥在基因表达镬i c a d p r 承乎增 加，c a d p r 的专一抑制剂8 - n h 2 c a d p r 能抑制报告基因的激活，而鼠c a d p r 能代 替a b a 激活擐嚣基因。因此c a d p r 也可能是a b a 倦号转导的第二信使。a b a c i 过 c a d p r 促进胞内钙库释放c a ：+ ，进而激活特定的爱自激酶，鬣白磷酸酶催亿特定蛋 白的磷酸化去磷酸化反应，从而将信息传递下去。最近也证实，c a d p r 介导a b a 诱导气孔关阈( l e c k i e ，1 9 9 8 ) 。另外，磷酯酶c ( p h o s p h o r l i p a s ec ) ( s t a x e n ，1 9 9 9 1 和磷酯酶d ( p h o s p h o l i p a s ed ) ( j a c o b ，1 9 9 9 ) 也可通过提高保卫细胞【c a 2 十】。v t 、抑制质 膜内肉k + 通道( k + 虹) 活性、激活质膜外向k + 通道( k + 。；) ，参与a b a 调控气孔运 动的信号过程。 1 - 2 0 h + 信使 c a 2 + 并不是引起气孔关闭的唯一途径，a b a 诱导气孔关闭可以没有【c a 2 + 】c y l 增加，保卫细胞中同时存在不依赖c a 2 + 而依赖h + 的a b a 信号通路。a b a 可激活 质膜h + - a t p a s e ，引起胞质p h ( p h j ) 升高，直接诱发不依赖c a ：+ 的下游事件，例 如k + 外向电流增加等，因此h + 也可能是保卫细胞反应信号途径中的第二信使 ( h a r m a g ，1 9 9 8 ；a l l a n ，1 9 9 4 ) 。与胞质自由c a 2 + 浓度变化的幅度不同，胞质p h 的变化即使不到一个单位，也可以产生显著的生理学效应。 i r v i n g ( 1 9 9 2 ) 发现，a b a 、i a a 和c t k s 均诱导保卫细胞【c a 2 + b 增加，但a b a 诱导p h i 升高、气孔关闭，l a a 和c t k s 诱导p h i 降低、气孔开放。由此推测，气 孔开关与保卫细胞p h i 水平直接相关，胞质碱化时气孔关闭，胞质酸化时气孔开放， 而与【c a 2 + k 升高没有直接关系，甚至【c a 2 + b 升高有时还伴随气孔开放。有关p h i 作为保卫细胞信使调控气孔运动的研究，大多集中在p h i 对离子通道的影响上。保 卫细胞p h l 既影响k ? 。，又影响k + 证。p h i 升高、胞质碱化可激活蚕豆保卫细胞的 k + 。t ，抑制l r k ；相反，p h j 降低则激活i p 矗( b l a t t ，1 9 9 3 ) 。 1 2 3 蛋白激酶，蛋白磷酸酶 大量研究表明，蛋白激酶蛋白磷酸酶( p k f p p ) 在保卫细胞a b a l 言号转导中起重 要作用( a r m s t r o n g ，1 9 9 5 ；l i ，2 0 0 0 ；s c h r o e d e r ，2 0 0 1 ) 。、p k p p 系统可通过调节质 膜h + - a t p a s e 活性，影响质膜极化状态从而影响保卫细胞的跨膜离子转运；也可通 过使离子通道蛋白磷酸化，脱磷酸化直接影响离子通道的转运活性，最终调控气孔 运动( a r m s t r o n g ，1 9 9 5 ) 。 目前已知参与气孔保卫细胞信号转导的蛋白磷酸酶主要有p p l 、p p 2 a 和p p 2 c 等。p p l 和p p 2 a 在不同的植物中表现出不同的甚至相反的调节效应，如在拟南芥 中，p p l p p 2 砧恿过提高阴离子外流参与a b a 诱导气孔关闭，是地信号的正调控 因子：而在蚕豆、鸭跖草中，p p l p p 2 a 抑制保卫细胞阴离子外流，是a b a 调控气 孔运动的负调控因子( g r a b o v ，1 9 9 7 ) 。 除蛋白磷酸酶外，某些蛋白激酶也作为正调控因子参与保卫细胞a b a 信号转 导，其中一类是不依赖c a “的蛋白激酶，另一类是依赖c a 2 十的蛋白激酶 ( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ，简称c d p k s ) ( k n e t s c h ，1 9 9 6 ：l i ，2 0 0 0 ) 。c d p k s 可使k + 内流通道剃刀基因编码的蛋白质磷酸化，从而钝化k + 内流通道( l i ，1 9 9 8 ) ； 此外，h + a t p a s e 也是c d p 的适宜底物，a b a 通过激活c d p k s 抑 | i l h + - a t p a s e 活 性( 王喜庆，1 9 9 9 ) 。另外，从保卫细胞中分离出了一种能被a b a 激活的s e r t h r 蛋白激酶( a b a a c t i v a t e ds e r i n e - t h r e o n i n ep r o t e i nk i n a