（有机化学专业论文）新型传感界面构建及其在农药分子检测和生物活性研究中的应用.pdf

摘要 农药在为农业生产提供保障的同时其残留物也对环境和人类健康造成危害，这就对当前农 药研究提出了两方面的研究课题：一方面，发展快速、可靠的农药分析检测方法保障食品安全 和品质；另一方面，开发高效、低毒、低残留的农药新品种，从源头上降低农药残留带来的副 作用。将靶标蛋白与底物结合的高选择性和分子识别能力与电化学检测的灵敏、快速等特点结 合，成为研究高效、便捷的农药分析检测新方法的发展趋势。利用靶标蛋白与底物的分子识别 能力建立抑制剂离体生物活性分析方法，同样对实现新型农药候选化合物的初期筛选和先导结 构化合物验证具有重要意义。无论是农残检测还是药物筛选，界面构建和生物大分子的固定是 影响传感分析信号灵敏度和稳定性的关键因素。本文利用电化学和表面等离子体共振技术，以 乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 希i d l 蛋白酶( c t p a ) 为靶标蛋白构建了几种生物兼容的界面，围绕发展基 于靶标蛋白分子识别的农药分子检测和生物活性研究新方法这一中心，开展了以下几个方面的 工作： 1 多壁碳纳米管壳聚糖乙酰胆碱酯酶复合界面的构建及其与底物的分子识别 利用戊二醛作为交联剂将a c h e 固定在壳聚糖与多壁碳纳米管组成的复合界面上。壳聚糖 作为载体固定酶，为a c h e 提供一个理想的微观环境以保持酶的活性，碳纳米管的引入能有效 降低酶催化产物硫代胆碱在电极上的氧化电位。固载的a c h e 能快速灵敏的催化溶液中的底物 氯化乙酰硫代胆碱( a t c i ) ，定量检测a t c i 在2 0 2 0 0i i m 和2 0 0 - 4 0 0 0 州两个浓度区间内 与电流响应有良好线性关系，a c h e 的表观米氏常数为1 3 2 1 t m 。该方法重现性好、灵敏度高、 响应迅速、稳定可靠，有望为酶抑制剂的检测提供一个经济、便利的检测方法。 2 构建多壁碳纳米管交联壳聚糖乙酰_ l | 1 日碱酯酶复合界面用于杀虫剂检测及生物活性分析 以多壁碳纳米管交联壳聚糖复合膜固定a c h e ，采用竞争结合方法，分析溶液中的杀虫剂 与a t c i 竞争结合表面固定的酶。电化学信号的降低与杀虫剂三唑磷的浓度在0 0 3 7 8p m 和 7 8 3 2 0g m 浓度范围内呈现良好线性，并定性分析比较了西维因、马拉硫磷、乐果对a c h e 的 抑制效果，建立了基于a c h e 抑制的农药药效快速分析电化学方法。改变表面| 司载的靶标酶蛋 白，可用于其它酶底物或模拟底物水解产物具有电化学活性的酶抑制剂的活性比较。 3 银纳米粒子生物素复合界面固定乙酰胆碱酯酶检测有机磷农药 将自主合成的b i o t i n 聚醚链- 硫辛酸与1 1 巯基一1 十一醇混合组装于金电极表面，以a v i d i n 作 为桥接将b i o t i n 衍生化的乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 固定于表面，银纳米通过与a v i d i n 之间的静电引 力结合，进而形成银纳米粒子- a v i d i n - a c h e 复合界面。以a t c i 为底物，根据氧化峰电流的减少， 检测剑乐果在0 0 5 1 0 0 州浓度范围内与酶抑制率呈线性关系，线性拟合的相关系数分别 0 9 9 8 3 ，检测限为0 0 1 p m 。 博士学位论支 d o c t o r a i 。d i s s e 影脒r l o n 4 金纳米粒子标记的氨基甲酸酯与乙酰胆碱酯酶相互作用的表面等离子体共振研究 a c h e 通过共价键固定在1 1 巯基1 十一酸的自组装膜上，将本课题组设计合成的两种抑 制剂先导化合物( h y l 和h y 2 ) 通过硫金键固定于金纳米粒子表面实现标记( 记作a l c l 和 a l c 2 ) 。a c h e 与抑制剂之间的相互作用会引起表面等离子体( s p r ) 信号的变化，金纳米特 殊的光学性质放大s p r 检测信号，提高检测灵敏度，得到a c h e 与h y l 、h y 2 的结合动力学 数据：结合速率常数( k d 分别为1 4 6 x 1 0 5 ( m s ) - 1 和7 7 3 x 1 0 4 ( m s ) 一，解离速率常数( 1 ( d ) 分 别为4 6 6 x 1 0 五s - 1 和1 2 1 x 1 0 以s 1 ，计算得到亲合常数( k a ) 分别为3 1 3 x 1 0 6 和6 3 9 x 1 0 5m i 。 此体系结合竞争模式可以实现其它小分子农药类似物的免标记活性比较分析。 5 芯片表面原位形成金纳米粒子放大表面等离子体共振信号检测酶抑制剂 固定反应时间，s p r 信号与a c h e 的活性有对应关系，根据酶活性的抑制程度建立了有机 磷农药三唑磷的高灵敏检测方法，在0 5 1 4 0 “m 浓度范围内，三唑磷浓度与s p r 信号呈线性 关系，检测限为0 0 5 肛m 。在这个体系中，无论是酶、底物还是分析物都无需标记和固定，反 应在溶液中进行，为农药检测提供了一种简单、无标记、实时、灵敏的检测方法。 6 d 1 蛋白酶与二茂铁标记2 4 肽相互作用的电化学检测及抑制剂活性分析 利用一步沉积法将氯金酸还原成金纳米原位沉积于电极表面构成金纳米壳聚糖的复合界 面固定c t p a 。二茂铁( f c ) 标记的2 4 肽作为底物，通过与界面同定的c t p a 相互作用结合到电极 表面。结果表明，溶液中的f c 2 4 p 在2 0 - 6 5 0 州的浓度范围内与电流响应呈现良好线性，通过 测量小分子抑制剂与f c - 2 4 p 对d 1 蛋白酶的竞争反应，对三种c t p a 抑制剂先导化合物h y l 、h y 2 和n a l 进行了生物活性分析。 7 d 1 蛋白酶与金纳米粒子标记2 4 肽相互作用动力学的表面等离子体共振研究及其应用 金片表面修饰生成羧基化葡聚糖界面后将羧基活化，利用酰胺键将c t p a 固定在芯片上。利 用s p r 技术研究金纳米标记的2 4 肽与表面固定的c t p a 相互作用，得到动力学数据k a = 3 0 8 x 1 0 2 ( m s ) - 1 ，k d = 6 2 4 x 1 0 - 3s - 1 。当溶液中有酶的抑制剂存在时，抑制剂与底物竞争性结合界面固定的 c t p a 。选取竞争性拟合模型拟合了抑制剂存在条件下的s p r 数据，获得了抑制剂与酶的结合速 率常数、解离速率常数及亲合常数等动力学数据，为实现d 1 蛋白酶抑制剂的生物活性筛选提供 了新方法。 关键词：碳纳米管；金纳米粒子；乙酰胆碱酯酶；d 1 蛋白酶；有机磷杀虫剂；界面分子识别； 电化学；表面等离子体共振；信号放大；动力学 i i 博士擎位论之 d o c l d r 人ld 瞧s e l 订k n0 _ n a b s t r a c t u s eo fp e s t i c i d e sc o n t r i b u t e sp o s i t i v e l yt oa g r i c u l t u r a ld e v e l o p m e n t h o w e v e r , e x c e s s i v eu s ei s a s s o c i a t e d 州ms e r i o u sr i s k st oe n v i r o n m e n ta n dh u m a nh e a l t h h e n c e ，s c i e n t i f i cr e s e a r c h e r sa r e f a c i n gb yt h e s et w oc h a l l e n g e s ：f i r s t l y ，d e v e l o p m e n to fr a p i d , e f f e c t i v ea n dc r e d i b l ep e s t i c i d e r e s i d u a l a n a l y t i c a lm e t h o d st om o n i t o rf 0 0 dq u a l i t yp r o c e s s s e c o n d l y , t od i s c o v e rh i 曲p o t e n tp e s t i c i d e so f l o wt o x i c i t ya n dr e s i d u et oc o n t r o lt h ee n v i r o n m e n t a la n dh e a l t hr i s k s c o m b i n i n gh i g hs e l e c t i v i t ya n dm o l e c u l a rr e c o g n i z a t i o na b i l i t yo fi n t e r a c t i o nb e t w e e nt a r g e tp r o t e i n a n di t ss u b s t r a t ew i t hs e n s i t i v i t ya n dc o n v e n i e n c eo fe l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nt e c h n i q u e s ，b i o s e n s o r i sc o n s i d e r e dt ob eh o tt o p i c so fc u r r e n tr e s e a r c hi np e s t i c i d er e s i d u ed e t e c t i o n i ti ss i g n i f i c a n tt o d e v e l o p e n v i t r os e n s i t i v ea n a l y i c a lm e t h o d sf o rp e s t i c i d e ss c r e e n i n ga n dd i s c o v e r y f o rb o t h p e s t i c i d e - r e s i d u a ld e t e c t i o na n dd r u gs c r e e n i n g ，ac o n s t r u c t i o no fi n t e r f a c ef o ri m m o b i l i z a t i o no f b i o m o l e c u l e si sak e yf a c t o rt oi n f l u e n c es e n s i t i v i t ya n ds t a b i l i t yo fs e n s i n gs i g n a l s e v e r a lb i o n i c i n t e r f a c e sw e r ec o n s t r u c t e di nt h i sp a p e r , u s i n ga c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) a n dd ip r o t e a s e ( c t p a ) a st a r g e tp r o t e i n s f o c u s i n go nd e v e l o p m e n to fn e wm e t h o d sf o rp e s t i c i d er e s i d u ed e t e c t i o na n dd r u g s e n s i t i v i t yc o m p a r i s o nb a s e do nt a r g e tp r o t e i nm o l e c u l a rr e c o g n i z a t i o nb yt h et e c h n o l o g yo fs u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) a n de l e c t r o c h e m i s t r y ，w ec a r r i e do u ts o m er e s e a r c h e s 舔f o l l o w 1 m o l e c u l a rr e c o g n i z a t i o no fa c e t y l t h i o c h o l i n et oi m m o b i l i z e da c h eo nm u l t i w a l lc a r b o n n a n o t u b e - c r o s sl i n k e rc h i t o s a nc o m p o s i t e c h i t o s a np r o v i d e das a t i s f i e dm i c r o e n v i r o n m e n tt or e t a i nt h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo fa c h ew i t h g l u t a r a l d e h y d e a sc r o s s l i n k e r b e c a u s eo ft h ei n t r o d u c t i o no fm u i t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e ，t h e o x i d a t i o np o t e n t i a lo ft h i o c h o l i n ew a sm u c hr e d u c e d t h ei m m o b i l i z e da c h eh a dg r e a t e ra f f i n i t yf o r a c e t y l t h i o c h o l i n e ( a t c i ) a n de x c e l l e n tc a t a l y t i ce f f e c ti nt h eh y d r o l y s i so fa t c i ，w i t ha 1 狮v a l u e o f13 2 州u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n st h ea m p e r o m e t r i cc u r r e n ti n c r e a s e dl i n e a r l yw i t hi n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o no fa t c ii nt h er a n g e2 0 - 4 0 0 0p , m t h i sm e t h o ds h o w e dv e r yg o o dr e p r o d u c i b i l i t y ， s e n s i t i v i t ya n da c c e p t a b l es t a b i l i t y i ti s ap r o m i s i n gn e wt o o lf o rc h a r a c t e r i z a t i o no fe n z y m e i n h i b i t o r sa n df o rp e s t i c i d ea n a l y s i s 2 a nc o m p o s i t ei n t e r f a c eb a s e do ni m m o b i l i z a t i o no fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s eo nam u i t i w a l lc a r b o n n a n o t u b o - c r o s s - l i n k e dc h i t o s a nf o rp e s t i c i d ed e t e c t i o na n ds e n s i t i v i t yc o m p a r i s o n p r e s e n c eo fp e s t i c i d e si ns o l u t i o nw i l lr e d u c et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na t c ia n di m m o b i l i z e d a c h eo n am u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e _ 屯r o s s - l i n k e dc h i t o s a nc o m p o s i t e ，w h i c hr e s u l t e di n 锄 e l e c t r o c h e m i c a ls i g n a lr e d u c t i o nc a u s e db yt h i o c h o l i n e b a s e do nc o m p e t i t i o ns t r a t e g y ，t h ei n h i b i t i o n o ft r i a z o p h o sw a sp r o p o r t i o n a lt oi t sc o n c e n t r a t i o ni nt w or a n g e s f r o m0 0 3t o7 8p , ma n d7 8t o3 2 l ： 博士擎位论史 d o c t o r a l d i s s e r l 嬲o n 肛m p e s t i c i d e so fc a r b a r y l ，m a l a t h i o na n dd i m e t h o a t ew e r es e l e c t e dt os t u d y t h e i ri n h i b i t i o n e f f i c i e n c i e st oa c h e ，w h i c hi si l l u m i n a t e dt h ee s t a b l i s h m e n to fas p e e d yc o m p a r i s o nf o rp e s t i c i d e s e n s i t i v i t yb y e l e c t r o c h e m i c a l t e c h n i q u e t h e c o n s t r u c t e db i o s e n s o r p r o c e s s i n gp r o m i n e n t c h a r a c t e r i s t i c sa n dp e r f o r m a n c es u c ha ss i m p l ef a b r i c a t i o n ，f a s tr e s p o n s e ，a c c e p t a b l es t a b i l i t ya n d a c c u r a c yh a sp o t e n t i a la p p l i c a t i o ni nt h ec h a r a c t e r i z a t i o no fe n z y m ei n h i b i t o r sa n dd e t e c t i o no ft o x i c c o m p o u n d s t oe n z y m e 3 c o m p o s i t ea s s e m b l yo fs i l v e rn a n o p a r t i c l e sw i t hb i o t i n y l a t e da c h ef o rp e s t i c i d a ls e n s i n g u s i n ga v i d i na sal i n k e r ，ab i o s e n s o rh a sb e e nd e v i s e db yi m m o b i l i z a t i o no fb i o t i n y l a t e da c h eo n ab i o t i n t e r m i n a t e da n dl1 - m e r c a p t o - l - u n d e c a n o l m i x e ds e l f - s s e m b l ym o n o l a y e r s i l v e rn a n o p a r t i c l e s w a si n t r o d u c e db yt h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb e t w e e ns i l v e rn a n o p a r t i c l e sa n da v i d i n u n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o n saq u a n t i t a t i v em e a s u r e m e n to fo r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d ed i m e t h o a t ew a s a c h i e v e dw i t ht h el i n e a rr a n g eo f0 0 5 州t o l 0 0r t ma n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t so f0 9 9 8 3 t h e d e t e c t i o nl i m i tw a so 01 m ，w h i c hc o r r e s p o n d st oa10 d e c r e a s ei ns i g n a l 4 i n t e r a c t i o nr e s e a r c hb e t w e e ng o l dn a n o p a r t i c l e sl a b e l e dc a r b a m a t ea n da c h eb ys p r t w oc a r b a m a t ei n h i b i t o r sw i t hd i f f e r e n te t h e rl i n k a g e sa n dt h et e r m i n a ll i p o a t ew e r es y n t h e s i z e d a n dl a b e l e dw i t hg o l dn a n o p a r t i c l e s w i t ht h es i g n a la m p l i f i c a t i o no fa u n p s ，t h es p e c i f i ci n t e r a c t i o n s b e t w e e nt h ea u n p sl a b e l e dc a r b a m a t ei n h i b i t o r sa n dt h ei m m o b i l i z e da c h eo ns e n s o rc h i ps u r f a c e w e r er e a d i l ye x a m i n e db ys p r u s i n g1 ：1f i t t i n gm o d e l ，t h ea s s o c i a t i o n d i s s o c i a t i o nr a t ec o n s t a n t s w e r ef i r s to b t a i n e df o rt h eb i n d i n gi n t e r a c t i o nb e t w e e nc a r b a m a t ei n h i b i t o r sa n da c h e t h i sa u n p s l a b e l i n gs t r a t e g yi sv e r s a t i l ea n dm a yb ea p p l i c a b l ef o rt h ec o m p e t i t i v es p rk i n e t i ca s s a yo ft h e i n t e r a c t i o nb e t w e e ns m a l lm o l e c u l ei n h i b i t o r sa n dt h e i rt a r g e tp r o t e i n sw i t hah i g hs e n s i t i v i t y 5 s i g n a le n h a n c e m e n tb ya c h es t i m u l a t e d i ns i t ug r o w t ho fg o l dn a n o p a r t i c l e sf o rs p r t e c h n o l o g y b a s e ds e n s i n go fi n h i b i t o r t h eh y d r o l y s i so fa c e t y i t h i o c h o l i n ec h l o r i d e ( a t c l ) c a t a l y z e db ya c h ec a ny e i l dar e d u c i n ga g e n t t h i o c h o l i n et h a ts t i m u l a t e st h ef o r m a t i o no fa u n p si nt h ep r e s e n c eo fh a u c h ，w h i c hc a u s e das p r s i g n a l t h ef o r m a t i o no ft h ea u n p sw a si n h i b i t e db yt d a z o p h o s ，t h u se n a b l i n gas e n s i t i v e d e t e r m i n a t i o nf o ra c h ei n h i b i t o rb ys p rt e c h n o l o g y t h ei n h i b i t i o no fm e t h o m y lo na c h ew a s p r o p o r t i o n a lt oi t sc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo f0 。5 1 4 0l x m ，w i t hd e t e c t i o nl i m i to f0 0 5 | l m i n h i b i t o rd e t e r m i n a t i o nw a sa c h i e v e dw i t h o u tl a b e l l i n go rm o d i f i c a t i o nf o rt a r g e tp r o t e i na c h e ，w h i c hi s a p p r o p r i a t ef o re n z y m e - b a s e dd e t e c t i o n s u c has i m p l ea n dc o n v e n i e n ts t r a t e g ym a yf i n dw i d ep o t e n t i a l a p p l i c a t i o n si nb i o s e n s o r s ，b i o c a t a l y s i sa n dd u r gs c r e e n 6 i n t e r a c t i o nr e s e a r c hb e t w e e nd 1p r o t e a s ea n df e r r o c e n el a b e l e d2 4p e p t i d ea n da p p l i c a t i o ni n i n h i b i t o rs e n s i t i v i t yc o m p a r i s o nb ye l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e i v an o v e li n t e r f a c ee m b e d d e di n s i t ug o l dn a n o p a r t i c l e si nc h i t o s a nh y d r o g e lw a sc o n s t r u c t e df o r c t p ai m m o b i l i z a t i o nb yo n e s t e pe l e c t r o c h e m i c a ld e p o s i t i o n f e r r o c e n el a b e l e d2 4p e p t i d ew a s a c t e d a se l e c t r o c h e m i c a lp r o b eb e c a u s eo fi t sr e d o xa c t i v i t y t h ec u r r e n tr e s p o n s et h a ta r o s eb yf e r r o c e n d i s p l a y e di n t e r a c t i o n b e t w e e ni m m o b i l i z e dc t p aa n d2 4p e p t i d e t h ec u r r e n tr e s p o n s ew a s p r o p o r t i o n a lt oc o n c e n t r a t i o no ff e r r o c e n el a b e l e d2 4p e p t i d ei nt h er a n g eo f2 o _ 6 5 0 州i n h i b i t o r s e n s i t i v i t yc o m p a r i s o nw a sa c h i e v e db yc o m p a r i n gi n h i b i t i o nr a t eo f t h r e ek i n d so f c t p ai n h i b i t o r sa tt h e s a l n ec o n c e n t r a t i o n 7 i n t e r a c t i o nr e s e a r c hb e t w e e nd 1p r o t e a s ea n dg o l dn a n o p a r t i v c l el a b e l e d2 4p e p t i d eb ys p r ： k i n e t i ca n a l y s i s c t p aw a si m m o b i l i z e do nac a r b o x y lm e t h y ld e x t r a ni n t e r f a c eb ya c y l a m i d eb o n dt os t u d yt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nc t p aa n dg o l dn a n o p a r t i c l el a b e l e d2 4p e p t i d eb ys p r t h ek i n e t i cd a t aw a s o b t a i n e dw i t hk a = 3 0 8 x 1 0 2 ( m s ) - 1 ，i q = 6 2 4 x 1 0 。3s p r e s e n c eo fi n h i b i t o ri ns o l u t i o nw i l lr e d u c e t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc t p aa n d2 4p e p t i d eo nam u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e - - e r o s s - l i n k e dc h i t o s a n c o m p o s i t e ，r e s u l t i n gi ns p rs i g n a lr e d u c t i o n b a s e do nc o m p e t i t i o nf i t t i n gm o d e l ，t h ek i n e t i cd a t a i n c l u d i n ga s s o c i a t i o nr a t ec o n s t a n t , d i s s o c i a t i o nr a t ec o n s t a n tw e r eo b t a i n e d , w h i c hp r o v i d e dan e w m e t h o df o ri n h i b i t o rs e n s i t i v i t yc o m p a r i s o na n ds c r e e n i n g , k e y w o r d s ： c a r b o n n a n o t u b e ； g o l dn a n o p a r t i c l e ； a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ；d 1p r o t e a s e ； o r g a n o p h o s p h a t e sp e s t i c i d e ；i n t e r f a c i a lm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ；e l e c t r o c h e m i s t r y ；s u r f a c ep l a s m o n r e s o n a n c e ；s i g n a le n h a n c e m e n t ；k i n e t i ce v a l u a t i o n v 博士擎位论丈 i ) ( ) c t o r a ld i s s l ：耽们o n 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 日期研年易月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：廊 呐：川年占月j 日 言荔一日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的规 定享受相关权益。回童诠塞握窒厦澄蜃! 旦主生；旦二生；旦三生筮查! 作者签名： 嘲：叼年多月j 抑始旅群 日 日期：砷年占月j 日 博士擎位论支 d o c l r a ld i s s e r l ( ) n 本论文的主要创新点 1 结合材料科学新成果，构建了掺杂碳纳米管、银纳米粒子、金纳米粒子的各种仿生界面。 这些界面具有良好的生物兼容性和化学稳定性，有效的保持酶蛋白的生物活性，掺杂的纳 米粒子对检测信号都有良好的放大效应，为提高分析检测的灵敏度提供了新途径。 2 采用电活性物质二茂铁标记的策略首次实现了d l 蛋白酶与底物识别过程的电化学检测，并 在此基础上发展了酶抑制剂的药效快速比较分析法。为实现抑制剂活性的体外快速比较提 供新方法。 3 利用金纳米标记2 4 肽，实现了d l 蛋白酶与底物2 4 肽的直接结合动力学研究，采用l ：1 的结合模式拟合数据得到两者的结合常数、解离常数以及亲和力常数等动力学数据。结合 竞争性结合策略，采用两种物质竞争模型拟合数据，得到了抑制剂与酶的动力学数据。为 定量评价抑制剂的抑制效率提供有价值的数据。 v i ： 博士学位论文 d 0 釉r ld i s s e r l 人订o n 第一章绪论 农药在当今农业生产中占有重要地位。一方面，农药对于保证作物免受病、虫、草害，实 现农业的稳产增收，确保人类对食品的需求具有重要意义。据统计，如果不使用农药，农作物 会平均减产7 0 。在我国，农药的使用使每年挽同的粮食损失就高达5 4 0 0 万吨。另一方面， 农药的使用也极大地减轻了劳动强度，直接或间接地提高了农业生产水平。大火节省的劳动力可 以间接产生其他财富。然而农药是把“双刃剑”，它为人类带来益处的同时，农药残留及其有毒 代谢物的存在也对环境造成严重污染，给人类健康带来负面影响。目前，国际上对农药最高残留量 要求越米越严格，这些都给农药残留检测技术提出了更高的要求。因此，发展具有高灵敏度、高稳 定性且对农药及其代谢物有特异性响应的检测技术对国民健康和经济发展无疑具有重要意义。 此外，由于植物抗药性的增加以及社会和环境对农药安全性要求的提高，开发高效、低毒、环 境友好型的新型农药也显得尤为迫切。农药生物活性的发挥是一个十分复杂的过程，包括吸收、 传导、代谢以及与作用靶标的相互识别等多个环节，但其中农药分子与作用靶标之间的选择性 识别是影响其生物活性最关键的因素【l 】。由于酶是多数农药作用的靶标分子，农药的作片j 机制 主要是破坏酶系统的某个环节，使酶的活性降低或失活，以抑制正常生理功能。因此无论是农 药检测还是生物活性分析，其本质都是研究靶标蛋白和抑制剂之间的分子识别作用。 1 1 分子识别 分子识别是指主体和客体( 或者说受体和底物分子) 彼此间发生专一的选择性相互作用并 形成具有特定结构的分子有序组合体。分子识别广泛存在于化学及生物体系中，因为由于每一 种分子生物功能发挥都是从它与其他分子直接的物理接触开始的。例如，细胞对外界物质的吸 收是从物质与细胞表面受体的识别开始，而细胞内物质的合成和代谢也处处涉及到它与酶的结 合和识别。由于生物体内的分子识别绝大部分都是发生在界面环境中，如酶的活性位点、膜的 表面或d n a 双链螺旋内部【2 】，因此，研究界面分子识别过程是从分子水平研究和探索生物现象 的重要途径。 1 1 1 分子识别中主要的相互作用力 分子识别过程既包括键合过程义包括主体对客体的选择过程，只有相互作用不是识别，因 为识别是一种有选择、有目的的作用，因此选择性是分子识别的重要特征。分子识别中的相互 作用主要有离子键、氢键、范德华力和疏水作用力。离子键是由电子转移形成正、负离子之间 的静电引力所形成的化学键，无饱和性和方向性。离子键是分子识别过程中强度最大的作用力 之一。另一个强作用力就是氢键，它在生物系统中具有非常重要的作用，是目前研究最多的非 键相互作用。由于氢键具有方向性和饱和性，因此，它是分子识别中专一性最强的作用力，也 就是说分子识别的选择性大部分来自于氢键作用。天然分子结合反应的表疆驱动力丈部分起源 于非静电相互作用如疏水相互作用。对疏水相互作用有利于分子结合的解释之一是：水分子 之问存在的相互作用比水分子与大多数溶质分子之问的相互作用更强，体系更稳定。生物分子 问的结台能减少溶质与辖荆之间的净分界面积包围溶质所需要的溶剂分子更少，因而溶液的 自由能降低，使生物分子趋向于结台疏水相互作用没有提供结台特异性的机制，它与色散力 一起成为分子识别中最不具有专一性的作用力。此外一个分子与形貌互补的另一个分子结合， 如果搭配得当，它们之间的范德华相互作用大由此也可以获得一些结台的特异性。 1 1 2 界面分子识嗣 对于生物体内的分子识别绝大部分发生在界面环境这一现象，o , d a 等给出了部分解释。在 众多非共价相互作用力中，氢键作用力在分子识别过程中起重要作用但是由于受本体水分子 强烈的氢键影响，主体与客体在水溶液中的特异性相互作用被大大削弱，表现井不明显d 】为 此，他们还比较了三种不同环境中胍盐与一磷酸腺营的相互识别效果( 图1 - 1 ) 。研究发现，胍 盐与一磷酸腺苷在胶柬或双层膜表面的结台常数( 1 0 2 1 0 4 f ) 远远大于它们在水中的绪台常 数( 1 4 r 1 ) 【4 】，当两者的结合处于水表层臣口液气界面时，其结台常数最大 5 】。由此可知， 分子的识别在特定的界面比在均相水溶液中更有教。 b j 0 n # 1 1 i ”0 s o n c e k = t4 m - 1 k 1 妒1 矿1 扫 i n 忡o t m s 嚏m n鱼f f a o f m b 岫删日瞄y * 【c ) m 舶4 晰l n _ 触 t n g , t - i 聊i c m b i n d i n g c o m t a n t s b e t w e e n p h o s p h s t c a n d o m n i d l n l u m f o r v a r i o u s a q u e o u s m e d i