（病原生物学专业论文）真核表达质粒pcdna3mdcifnγ的构建及其免疫佐剂效果研究.pdf

目录 中文摘要l 英文摘要4 研究论文真核表达质粒p c d n a 3 m d c i f n 丫的构建及其免疫佐剂 效果研究 前言8刖舌8 材料与方法9 结果1 9 附图2 l 附表2 6 讨论3 2 结论3 7 参考文献3 7 综述细胞因子作为d n a 疫苗基因佐剂研究进展4 1 致谢4 9 个人简历5 0 中文摘要 真核表达质粒p c d n a 3 m d c i f n 丫 的构建及其免疫佐剂效果研究 摘要 目的：柯萨奇病毒b 组( c o x s a c k i e v i m sg r o u pb ，c v b ) 属于小r n a 病毒科肠道病毒属，是非常严重的人类疾病的致病病原，它的感染可以造 成严重的心肌炎、心包炎，根据流行病学调查显示，5 0 左右的心肌炎与 近期或复发的柯萨奇病毒b 组3 型( c v b 3 ) 感染有关。近年来，d n a 疫苗的研究发展在c v b 3 感染的防治方面起到了至关重要的作用。v p l 是c v b 3 的主要衣壳蛋白，具有较强的免疫原性，可诱导机体产生保护 性中和抗体。我实验室曾利用d n a 疫苗的靶向策略，构建融合d n a 疫 苗p c d n a 3 m d c v p l ，免疫小鼠后显著提高了中和抗体滴度，对致死量 病毒攻击的保护作用有一定的提高，但仍达不到满意的效果。因此，寻找 合适的基因佐剂，提高c v b 3 d n a 疫苗的免疫效果成为目前的研究焦点。 巨噬细胞源趋化因子( m a c r o p h a g e d e r i v e dc h e m o k i n e ，m d c ) 属于 c c 趋化因子家族，具有趋化单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、t 细胞 等功能，其带有信号肽序列，可分泌到细胞外与t h 2 细胞、a p c s 等细胞 膜上表达的受体( c c r 4 等) 结合发挥趋化作用。m d c 主要增强t h 2 细 胞相关的免疫反应，是因为m d c 对t h 2 细胞( t h 2 细胞选择性高表达 c c r 4 ) 具有强烈的趋化作用。 i f n 吖是体内重要的免疫调节因子，可增强n k 细胞、单核巨噬细胞 对病毒的杀伤和吞噬作用，抑制病毒的复制。i f n 1 ，促进t h 0 细胞向t h l 型分化，增强机体的细胞免疫。增加抗原递呈细胞的m h c 1 1 分子表达，能 够产生c t l 应答和提高i g g 抗体。 本研究选用i f n 吖基因，与m d c 构建融合基因表达质粒 p c d n a 3 m d c i f n - 7 ，作为基因佐剂，和p c d n a 3 m d c v p l 共免疫，检 测免疫效果，探讨其用作基因佐剂，有无提高c v b 3v p ld n a 疫苗的免 疫效应。以寻找最有效辅佐d n a 疫苗的基因佐剂。 方法： 1 重组质粒p m d l8 t i f n 吖的构建根据i f n 吖基因序列及m d c 中文摘要 序列，设计带有b a m hi 和x h oi 酶切位点的特异性引物，用p c r 方法从 质粒p c d n a 3 i f n 吖中扩增i f n y 基因，将扩增产物与p m d l 8 tv e c t o r 连接，转化入e c o l i5 a 感受态菌，经转化、筛选和酶切鉴定，构建重组 质粒p m d l8 一t i f n 吖。 2 真核表达质粒p c d n a 3 m d c i f n 吖的构建取经b a m hi 和x h o i 双酶切的l i n k e r - i f n 吖与经过同样两种酶切的p c d n a 3 m d c - l i n k e r 片段 连接，经过转化、筛选和酶切鉴定后，构建真核表达重组质粒 p c d n a 3 m d c i f n - 丫。 3 用碱裂解法从转化的e c o l i5 a 中大量提取质粒 p c d n a 3 m d c i f n 吖，用聚乙二醇( p e g ) 沉淀法进行纯化。 4 动物实验：将6 8 周龄雄性b a l b c 小鼠随机分为5 组，每组2 0 只。5 组分别为生理盐水对照组、p c d n a 3 i f n 吖对照组、p c d n a 3 v p 1 对照组、p c d n a 3 m d c v p 1 对照组，p c d n a 3 m d c i f n 一丫+ p c d n a 3 m d c v p l 组。纯化后的质粒以生理盐水稀释后，股四头肌注射 免疫小鼠，每次每只接种1 0 0 9 9 ，每3 周接种1 次，共免疫3 次；每次免 疫接种后第1 4 天，内眦静脉取血，分离血清，用微量中和试验( 固定病 毒稀释血清法) 检测血清中c v b 3 特异性中和抗体。 5 末次免疫后3 周，用5 l d 5 0 的c v b 3 腹腔内攻击，观察并记录小 鼠死亡情况至感染后第2 l 天。 结果： 1 成功构建原核重组质粒p m d l 8 t i f n y ，限制酶切分析证明符合 预期设计。 2 成功构建真核表达重组质粒p c d n a 3 m d c i f n 吖，酶切鉴定可见 特异性条带。 3 大量抽提质粒p c d n a 3 i f n 丫、p c d n a 3 m d c i f n 丫、 p c d n a 3 m d c v p l 、p c d n a 3 v p l ，纯化后再次酶切鉴定，除可见预期的 特异性条带外，未见其他非特异性条带。 4接种小鼠后，各组血清中和抗体的平均效价分别为： p c d n a 3 m d c - v p l 组 l ：7 3 2 ，1 ：1 6 8 2 ，l ： 2 7 3 2 ； p c d n a 3 m d c - i f n 一7 + p c d n a 3 m d c v p1 组1 ：7 5 8 ，1 ：18 6 6 ，l ：3 0 3 1 ； 生理盐水对照组、p c d n a 3 i f n 丫组、p c d n a 3 v p l 组各次平均效价均低 中文摘要 于1 ：5 。可见第二次免疫后p c d n a 3 m d c v p l 组和p c d n a 3 m d c i f n p p c d n a 3 m d c v p l 组小鼠的中和抗体效价开始显著升高；对这两组第一、 二、三次免疫后中和抗体效价单因素方差分析后发现，两组第二、三次免 疫接种后的抗体效价和第一次相比均有显著性差异，表明抗体的效价随注 射次数的增加而提高。但两组间比较差异无统计学意义。 5 用5 l d 5 0 攻击小鼠，各组2 l 天生存率分别为：组( 生理盐水对 照组) 1 0 ，组( p c d n a 3 i f n y 组) 2 0 ，组( p c d n a 3 v p l 组) 1 5 ，组( p c d n a 3 m d c - 、俾1 组) 4 0 ，组( p c d n a 3 m d c i f n p p c d n a 3 m d c v p l 组) 3 5 。经过贮检验分析，尚不能确定后两组之间 有统计学差异。 结论： 1 成功构建重组质粒p m d l 8 t i f n 吖。 2 成功构建真核表达重组质粒p c d n a 3 m d c i f n - 1 , 。 3 小鼠免疫后血中中和抗体滴度随免疫次数的增加而提高，在 p c d n a 3 m d c i f n 。pp c d n a 3 m d c v p1 联合免疫组和p c d n a 3 m d c v p l 单独免疫组中比较，免疫无统计学意义。说明此次构建疫苗佐 剂对体液免疫水平虽有一定程度的提高，但效果不显著。 4对小鼠受到病毒感染后的生存状况进行分析，发现 p c d n a 3 m d c i f n - 7 作为疫苗佐剂，仍不能有效地保护小鼠对抗致死量 病毒感染。 关键词：干扰素丫；巨噬细胞源趋化因子( m d c ) ；柯萨奇病毒b 组 3 型；d n a 疫苗；佐剂；中和抗体 英文摘要 c o n s t r u c t i o no fp c d n a 3 m d c i f n 一丫a n d s t u d yo ni t si m m u n ea d j u e n te f f e c t a b s t r a c t o b j e c t i v e ：c o x s a c k i e v i r u sb ( c v b ) ，ap a t h o g e n o fh u m a ns e r i o u s d i s e a s e s ，b e l o n g st os m a l lr n a v i r u sa n de n t e r o v i r u sg e n u s i t si n f e c t i o nc a n c a u s e s m y o c a r d i t i s a n d p e r i c a r d i t i s a c c o r d i n g t ot h e e p i d e m i o l o g y i n v e s t i g a t i o n ，a b o u t50 o ft h em y o c a r d i t i sr e l a t e st or e c e n to rr e c u r r e n t c o x s a c k i e v i r u sb 3i n f e c t i o n i nr e c e n ty e a r s ，t h er e s e a r c hd e v e l o p m e n to f d n av a c c i n eh a sp l a y e dac r u c i a lr o l ei nt h ep r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to f c v b 3i n f e c t i o n c v b 3v p 1 ，t h em a j o r c a p s i dp r o t e i n ，h a ss t r o n g i m m u n o g e n i c i t y , w h i c hc a ni n d u c et h eb o d yt om a k ea n ds e c r e t ep r o t e c t i v e n e u t r a l i z i n ga n t i b o d i e s w eh a v em a d eu s eo fd n a v a c c i n et a r g e t i n gs t r a t e g y t oc o n s t r u c tf u s i o nd n av a c c i n ep c d n a 3 m d c - v p1 ，w h i c hs i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e dn e u t r a l i z i n ga n t i b o d yt i t e ri nm i c e ，a n di m p r o v e dp r o t e c t i v ee f f e c to f m i c ew i t hl e t h a ld o s et oac e r t a i ne x t e n t ，b u tt h ef u s i o nd n av a c c i n es t i l l c a n tr e a c hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h e r e f o r e ，t h ef o c u si s s u eo fc u r r e n tr e s e a r c h i st oe x p l o r et h es u i t a b l ea d j u v a n tt oe n h a n c ec v b 3d n av a c c i n ee f f e c t m a c r o p h a g e - d e r i v e dc h e m o k i n e ( m d c ) b e l o n g st ot h ec cc h e m o k i n e f a m i l yw i t ht h es i g n a lp e p t i d e ，a n dh a sa f u n c t i o nt oc a l lm o n o c y t e s ， m a c r o p h a g e s ，d e n d r i t i cc e l l s ，tc e l l s ，a n dp l a yar o l e i n c h e m o t a x i sb y s e c r e t i n gi n t ot h ee x t r a c e l l u l a ra n dc o m b i n i n gw i t hr e c e p t o r ( c c r 4 ，e t c ) o n t h 2c e l l s ，a p c sa n do t h e rc e l lm e m b r a n e b e c a u s em d ch a sas t r o n g c h e m o t a x i st o w a r d1 q a 2c e l l s ( t h 2c e l l ss e l e c t i v ee x p r e s sc c r 4 ) ，m d c m a i n l ye n h a n c e st h 2 c e l l si m m u n er e s p o n s e i f n 吖i sa ni m p o r t a n ti m m u n er e g u l a t o r yf a c t o ri nv i v o ，i tc a ni n c r e a s e s a c t i v i t yo fn k c e l l sa n dp h a g o c y t o s i so fm o n o c y t e sm a c r o p h a g e st ot h ev i r u s ， i ta l s oc a ni n h i b i t sv i r u s r e p l i c a t i o n i f n 吖c a np r o m o t e s t h 0c e l l s d i f f e r e n t i a t i o nt ot h l ，t h e ns t r e n g t h e n st h eb o d y sc e l l u l a ri m m u n i t ， a n d i n c r e a s e st h em h c i im o l e c u l e se x p r e s s i o no fa p c s ，a n da l s og e n e r a t e sc t l 4 英文摘要 r e s p o n s e sa n di m p r o v e st h ei g ga n t i b o d y i nt h i ss t u d y , w ec o n s t r u c t e df u s i o ng e n e sp c d n a 3 m d c i f n 一丫w i t h i f n 吖a n dm d cg e n e ，a sag e n i ca d j u v a n t ，w h i c hw a si n j e c t e dt o g e t h e rw i t h p c d n a 3 m d c v p 1t od e t e c tt h ei m m u n ee f f e c ti nt h em i c et o e x p l o r e w h e t h e rt h ef u s i o ng e n ec a ne n h a n c ei m m u n ef u n c t i o na sa na d j u v a n t b a s e o n t h i s ，f o l l o w i n gs t u d i e sa r ed o n et os e a r c ht h em o s te f f e c t i v ed n a v a c c i n e a d j u v a n t m e t h o d s ： 1c o n s t r u c t i o no ft h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp m d 18 一t i f n - 丫 a c c o r d i n gt oi f n 吖a n dm d cg e n es e q u e n c e ，w ed e s i g n e ds p e c i f i cp r i m e r s w i t hb a m h ia n dx h o ir e s t r i c t i o ns i t e s ，a m p l i f i e di f n - 7g e n eb yp c rf r o m p l a s m i dp c d n a 3 i f n 吖，a n dc o n n e c t e dt h ep r o d u c t sw i t ht h ep m d 18 - t v e c t o rt h e nt r a n s f o r m e di n t oe c o l i5 a c o m p e t e n c eb a c t e r i a ，a f t e r t r a n s f o r m a t i o n ，s c r e e n e da n dd i g e s t e dw i t hr e s t r i c t i o ne n z y m e s ot h ep l a s m i d p m d 18 一t i f n - 丫w a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y 2c o n s t r u c t i o no ft h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dp c d n a 3 m d c - i f n - q , t h e l i n k e r - i f n 吖，d i g e s t e db y b a m hia n dx h o i ，l i n k e d t o p c d n a 3 m d c - l i n k e r w h i c hc u t b y t h es a m e d i g e s t i v ee n z y m e p c d n a 3 m d c i f n 吖，t h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i d ，w a sc o n s t r u c t e d a f t e rt r a n s f o r m a t i o n ，s c r e e n i n ga n de n z y m e c u ti d e n t i f i c a t i o n ， 3a l a r g en u m b e ro fp l a s m i d sp c d n a 3 m d c i f n 一丫w e r ee x t r a c t e df r o m e c o l i5 at r a n s f o r m e d p l a s m i db ya l k a l i n el y s i sm e t h o d ，a n dt h e np u r i f i e db y p o l y e t h y l e n e g l y c o l ( p e g ) 4a n i m a le x p e r i m e n t s ：b a l b cm i c ea g e d6 - 8w e e k sw e r er a n d o m l y d i v i d e di n t o5g r o u p s ，n = 2 0 f i v eg r o u p sr e s p e c t i v e l yw e r en sc o n t r o lg r o u p ， p c d n a 3 i f n - 丫c o n t r o lg r o u p ，p c d n a 3 v p lc o n t r o lg r o u p ，p c d n a 3 m d c - v p l c o n t r o lg r o u p ，p c d n a 3 m d c - i f n - q , + p c d n a 3 m d c - v p lg r o u p t h ep u r i f i e d p l a s m i d s ，d i l u t e dw i t hs a l i n e ，w e r ei n j e c t e di nm i c eq u a d r i c e p s ，a n dw e r e i n o c u l a t e d10 0 u ge a c ht i m e ，o n c ee v e r y3w e e k s ，at o t a lo f3t i m e s e v e r y 14 t hd a y sa f t e ri m m u n i z a t i o n ，w ed r a w e db l o o d sf r o mt h ea n g u l a rv e i n b l o o d i nm i c ea n ds e p a r a t e ds e r u m ，t h e nt e s t e d c v b 3 一s p e c i f i cn e u t r a l i z i n g 5 英文摘要 一一_ 一 a n t i b o d i e sb ym i c r o n e u t r a l i z a t i o n ( f i x e dv i r u s s e r u md i l u t i o nm e t h o d ) 5t h r e ew e e k sa f t e rt h el a s ti m m u n i z a t i o n ，t h em i c ei ne a c hg r o u p r e c e i v e dv i r u sa t t a c k so f5 l d 5 0c v b 3 t h en u m b e r so fd e a da n ds u r v i v a l m i c ee v e r yd a yw e r eo b s e r v e da n dr e c o r d e df r o mt h eb e g i n n i n go fa t t a c kt o 21t hd a ya f t e ri n f e c t i o n r e s u l t s ： l p m d 18 m f n 吖w a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y 1 1 1 ea n a l y s i sa f t e rt h e p l a s m i dc u tb yr e s t r i c t i o ne n z y m e ss h o w e d t h a tt h ed e s i g nc o r r e s p o n d e dt o e x p e c t a t i o n s 2r e c o m b i n a n t p l a s m i dp c d n a 3 m d c i f n - 丫 w a s g e n e r a t e d s u c c e s s f u l l y e n z y m ec l e a v a g ea n a l y s i ss h o w e ds p e c i f i cb a n d s 3 l a r g en u m b e ro fp l a s m i dp c d n a 3 i f n 吖，p c d n a 3 m d c - i f n 。丫， p c d n a 3 m d c v p1 ，p c d n a 3 v p 1w e r ee x t r a c t e da n di d e n t i f i e dt h r o u g h d i g e s t e db yr e s t r i c t i o ne n z y m ea f t e rp u r i f i e d ，w h i c hi n d i c a t e dt h a t t h er e s u l t o n l yh a dt h ee x p e c t e ds p e c i f i cb a n d ，b u tn oo t h e ru n s p e c i f i cb a n d 4a f t e ri n o c u l a t e d ，t h ea v e r a g et i t e r so fs e r u mn e u t r a l i z i n ga n t i b o d yi n e a c h g r o u p m i c e r e s p e c t i v e l y w e r e ：1 ：7 3 2 ，1 ：16 8 2 ，1 ：2 7 3 2 i n p c d n a 3 m d c 。v p l g r o u p ； 1 ：7 5 8 ， 1 ： 1 8 6 6 ， 1 ：3 0 31 i n p c d n a 3 m d c i f n y + p c d n a 3 m d c - v p 1 g r o u p ；i nn o r m a ls a l i n ec o n t r o l g r o u p ，p c d n a 3 i f n - 7g r o u p ，p c d n a 3 v p 1g r o u pm e a nt i t e r so fe v e r yt i m e w e r e1 0 w e rt h a nl ：5 a f t e rt h es e c o n di m m u n i z a t i o na n t i b o d yt i t e r s w e r e h i g h e rt h a nb e g i n n i n gi np c d n a 3 m d c - i f n - 丫+ p c d n a 3 m d c - v p 1a n d p c d n a 3 m d c v p 1g r o u p a f t e rt h ea n t i b o d i e sa n o v ao ft h ef i r s t ，s e c o n d a n dt h i r di m m u n i z a t i o ni nt h el a t e rt w og r o u p s ，w ef o u n dt h a ta n t i b o d yt i t e r s h a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e dt h es e c o n da n dt h i r di m m u n i z a t i o nt ot h e f i r s t ，w h i c hs h o w e dt h a tt h et i t e r si n c r e a s e dw i t ht h en u m b e ro fi n je c t i o nt i m e s ， b u tt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w og r o u p sw a sn o ts i g n i f i c a n t 5t h em i c ew e r ea t t a c k e db y5 l d 5 0v i r u si ne a c hg r o u p ，t h e i r s2 1 d a y s s u r v i v a lr a t e sw e r e ：10 i nc o n t r o lg r o u p ，2 0 i np c d n a 3 i f n 一丫g r o u p ， 15 i np c d n a 3 v p lg r o u p ，4 0 i np c d n a 3 m d c v p lg r o u p ，3 5 i n p c d n a 3 m d c i f n - 7 + p c d n a 3 m d c v p 1g r o u p a f t e rz 2t e s t sa n da n a l y s i s ， 6 英文摘要 s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w og r o u p sc a nn o tb e d e t e r m i n e d c o n c l u s i o n ： 1r e c o m b i n a n tp l a s m i dp m d 18 - t i f n yw a sc o n s t r u c t e d 2t h e e u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dp c d n a 3 m d c i f n 吖w a s c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y 3t h ea n t i b o d yt i t e r si nm i c eb l o o di n c r e a s e df o l l o w i n gt h ei n o c u l a t i o n t i m e si n c r e a s ei n p c d n a 3 m d c 一、伊1 a n d p c d n a 3 m d c i f n p p c d n a 3 m d c v p 1i m m u n eg r o u p ，b u tn os i g n i f i c a n t i ti l l u s t r a t e st h a tt h e e f f e c tw a sn o ts i g n i f i c a n ta l t h o u g ht h eh u m o r a li m m u n el e v e li n c r e a s e dt o s o m ee x t e n t 4p c d n a 3 m d c - i f n - 丫，a sai m m u n ea d j u e n t ，c a ns t i l ln o tp r o t e c t m i c ea g a i n s t l e t h a lv i r a le f f e c t i v e l yo nt h eb a s i so ft h ea n a l y s i so fl i v i n g c o n d i t i o n so ft h ei n f e c t e dm ic e k e yw o r d ：i f n 一丫；m a c r o p h a g e d e r i v e dc h e m o k i n e ( m d c ) ；c o x s a c k i e v i r u sg r o u pb t y p e3 ；d n av a c c i n e s ；a d j u v a n t ；n e u t r a l i z i n ga n t i b o d y 7 研究论文 真核表达质粒p c d n a 3 m d c - i f n 丫 的构建及其免疫佐剂效果研究 _ - _ 一 刖吾 柯萨奇病毒b 3 ( c o x s a c k i e v i r u sb 3 ，c v m ) 属于小r n a 病毒科肠道病 毒属，主要引起人类病毒性心肌炎，有5 0 以上的心肌炎是由它引起的 n 】。c v b 3 的传统疫苗免疫效果较弱，上世纪9 0 年代发展起来的一种新型 疫苗d n a 疫苗目前拥有广大的应用前景，它一方面具有减毒活疫苗可 以诱发全面免疫应答的特点，另一方面拥有和亚单位疫苗一样的安全性。 v p l 是c v b 3 主要的衣壳蛋白【2 】，是产生免疫保护作用的主要抗原，它同 时含有b 细胞和t 细胞两种识别表位，可刺激机体产生特异性中和抗体； 但以编码v p l 蛋白的重组质粒d n a 疫苗免疫小鼠后发现血清特异性抗 体尤其是中和抗体水平均较低，不能有效保护小鼠对抗病毒感染。已有实 验证吲3 1 ，细胞因子作为佐剂与d n a 疫苗联合免疫或构建带有细胞因子 基因的融合疫苗，均可明显提高d n a 疫苗的免疫效应。我实验室曾尝试 在c v b 3 d n a 疫苗中加入细胞因子i f n - ? 、i l 1 8 、i l 一2 、g m c s f 等作为 基因佐剂，使疫苗的免疫作用有了不同程度的加强，但仍不能达到满意的 效果【4 - 7 】。 巨噬细胞源趋化因子( m d c ) 属于c c 型趋化因子，单核细胞、巨噬细 胞、b 细胞、t h 2 细胞等表面均带有m d c 受体( c c r 4 ) ，m d c 与受体 结合后发挥趋化作用。本室前期曾将带有信号肽的m d c 与v p l 基因融 合，构建成靶向抗原提呈细胞的重组质粒p c d n a 3 m d c v p l ，免疫小鼠后 发现免疫效果有了显著提高。实验证实【8 】靶向d n a 疫苗一方面有利于抗 原的摄取、加工和提呈，另一方面可以促进树突状细胞成熟，同时表达高 水平协同刺激分子，使病毒抗原免疫原性明显增强，能够诱导出更高的 特异性抗体水平。 本研究利用m i ) c 对a p c s 的趋化作用，更好的发挥干扰素的免疫增 强作用，拟构建p c d n a 3 m d c i f n - ? 融合基因，与p c d n a 3 m d c v p l 共同免疫小鼠后检测免疫效果，探讨其用作基因佐剂，有无提高c v b 3 v p ld n a 疫苗的免疫效应。以寻找最有效辅佐d n a 疫苗的基因佐剂。 研究论文 材料与方法 1 材料 1 1 细胞株、病毒株、菌株及实验动物 细胞株：人宫颈癌细胞系( h e l a ) 细胞本室保存 病毒株：柯萨奇病毒b 组3 型( c v b 3n a n c y 株)本室保存 菌株：大肠杆菌d h 5 a本室保存 实验动物：雄性b a l b c 近交系小鼠，6 8 周龄购自河北医科 大学实验动物中心 1 2 质粒、载体 p c d n a 3 m d c v p1 质粒 p c d n a 3 m l f n - 丫质粒 p m d l 8 t 载体 1 3 酶类 t 4d n a 连接酶 t a qd n a 聚合酶 b a m h i x h o i r n a s ea 1 4 试剂盒 本室构建保存 本室构建保存 t a k a r a 公司 p r o m e g a 公司 p r o m e g a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 天根生化科技有限公司 胶回收试剂盒天根生化科技有限公司 细胞计数试剂盒( c e l lc o u n t i n gk i t - 8 ，c c k - 8 )同仁化学研究所 1 5p c r 引物上海生工生物工程公司合成 1 6 细胞培养产品 胎牛血清( f b s )杭州四季青生物工程公司 r p m i1 6 4 0 培养基g i b c 0 公司 链霉素华北制药有限公司 青霉素华北制药有限公司 h a n k s 平衡盐 s i g m a 公司 胰蛋白酶 s i g m a 公司 1 7 其他试剂 研究论文 d n a 分子量m a r k e r i i i天根生化科技有限公司 d n t p s 大连宝生物工程公司 十二烷基硫酸钠( s d s )s i g m a 公司i i i 三羟甲基氨基甲烷( t r i s )s i g m a 公司 溴酚蓝( b p b ) s i g m a 公司 溴化乙啶( e b ) s i g m a 公司 琼脂糖( a g a r o s e )s i g m a 公司 乙二胺四乙酸二钠( e d t a )s i g m a 公司 b s a s i g m a 公司 t r i s s i g m a 公司 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ，a m p )华北制药集团 胰蛋白胨o x o i d 公司 酵母提取物o x o i d 公司 异硫氰酸胍e r v a 醋酸钠( s o d i u ma c e t a t e )北京化工厂 2 巯基乙醇( 2 m e ) s i g m a 公司 1 8 主要试剂的配制 1 8 1 质粒提取主要试剂 细胞裂解液( s o l u t i o ni i ) ：0 2 mn a o h 1 s d s 使用前新鲜配制 细胞悬浮液( s o l u t i o ni ) ：5 0 m m 葡萄糖 2 5 m mt r i s - c 1p h 8 0 10 r a me d t a n a 2 p h 8 0 t e 缓冲液：2 0 m mt r i s c 1 p h 8 0 l m me d t a n a 2 p h 8 0 中和液( s o l u t i o n i ) ：2 9 4 9 l 醋酸钾 1 1 5 冰乙酸 5 ml i c l 溶液：称取l i c l1 5 6 9 ，然后加水定容至5 0 m l ，过滤除 菌以后，分装用以保存。 t r i s 饱和酚( p h 8 0 ) - 将重蒸酚自2 0 c 温度条件取出，6 8 。c 水浴将 研究论文 其溶化，缓慢加入8 羟基喹啉调至终浓度为 1 9 l ，然后加入等体积1 mp h 8 0t r i s c l ，重 复抽提数次，直至测量上层水相p h 7 8 。 1 3 p e g ( 8 0 0 0 ) 溶液：称取n a c l9 3 6 9 ，溶于8 0 m l 水中，得1 6 m n a c l 溶液；再称取p e g ( 8 0 0 0 ) 1 3 9 ，加入 n a c l 溶液中，充分混匀，缓慢加水定容至 体积1 0 0 m l ，过滤除菌，分装用以保存。 1 8 2 琼脂糖凝胶电泳试剂 电泳缓冲液( 5 0 x t a e ) - 载样缓冲液： 1 2 1 9 ( 4 0 m m ) t r i s - 碱 18 6 9 ( 2 m m ) e d t a n a 2 2 8 5 5 m l 冰乙酸定容至5 0 0 m l 0 2 5 溴酚蓝 2 5 二甲苯青 8 0 甘油水溶液 1 8 3 细菌培养基及相关试剂 2 y t 液体培养基：胰蛋白胨1 6 9 酵母浸膏粉1 0g n a c l5 9 溶于9 5 0 m l 蒸馏水中，用1 mn a o h 调 p h 至7 2 ，加水定容至1 l ，高压灭菌。 2 y t 固体培养基：1 0 0 m l 液体2 y t 培养基中加入1 5 9 琼脂粉，高压灭菌。 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ，a m p ) ：称取质量为1 9 的氨苄青霉素，将其 溶于2 0 m l 生理盐水中，配制成浓 度为1 0 0 m g m l 的储存液，经过 0 2 2 u m 滤器过滤除菌后，于2 0 温度条件下保存。 1 8 4 细胞培养基及相关试剂 d h a n k s 液的配制：氯化钠( ( n a c l )2 9 氯化钾( k c l ) 0 1 9 磷酸氢二钠( n a h p 0 4 12 h 2 0 ) 0 38 9 碳酸氢钠( n a h c 0 3 ) 0 0 8 7 5 9 研究论文 磷酸二氢钾( r d - 1 2 p 0 4 ) o 0 15 9 三蒸水定容至2 5 0 m l