（遗传学专业论文）人elongator复合物elp3亚基调控人hsp702基因的转录.pdf

摘要 反义寡聚核甘酸( a o d n ) 是一段与m r n a 或d n a 特异性结合并阻断其基因表达的人工 合成的d n a 分子。根据碱基互补原理，反义寡聚核甘酸可以把d n a 双螺旋分子的专一性序 列作为靶目标。形成三螺旋d n a 从转录水平或转录延伸水平完全抑制特定基因的表达。目 前反义寡聚核甘酸技术在肿瘤治疗的研究中已成为热点之一，并且已取得了一些成绩。 人的e l o n g a t o r 复合物在组成及其与r n a pi i 的作用方式上与酵母的e l o n g a t o r 复合 物十分相似，在以前的研究中，我们利用酵母的功能补偿系统研究了人e l o n g a t o r 复合 物中的h e l p 3 亚基的功能，但在人细胞中对其功能研究极少。为了研究人细胞中h e l p 3 在调控基因转录中的作用，我们利用h e l p 3 反义寡核苷酸下调入2 9 3 t 细胞中h e l p 3 的 表达。实验结果表明h e l p 3 蛋白质水平的下降明显抑制了h s p 7 0 - 2 基因的表达，同时这 一现象伴随着h s p 7 0 - 2 基因上组蛋白船的乙酰化不足和r n a 聚合酶密度降低。而且 我们通过c h i p 实验检测h e l p 3 被招募到h s p 7 0 - 2 基因上，这一结果进一步证明h e l p 3 对于h s p 7 0 - 2 的调控作用是直接的。本文提供了h e l p 3 在人细胞中调控h s p 7 0 - 2 基因转 录延伸的直接证据，为进一步揭示人e l o n g a t o r 复合物的功能及作用机制提供实验证据。 关键词：反义寡核甘酸；h e l p 3 ：乙酰化；h s p 7 0 - 2 基因 a b s t r a c t t h ea n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e s ( a o d n ) a r es y n t h e s i z e dd n a st h a tc a l ls p e c i f i c a l l yb i n d i ot h em r n ao rt h ed n at ob l o c kt h eg e n ee x p r e s s i o n t h ea n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e sc a l l t a r g e tt h es p e c i f i cs e q u e n c e so fd n a d o u b l eh e l i xo nt h eb a s i so fb 嬲ec o m p l e m e n tt of o r m t r i p l eh e l i xd n ar e s u l t i n gi nt h ei n h i b i t i o no ft h es p e c i f i cg e n ee x p r e s s i o nb o t ha tt h e t r a n s c r i p t i o n a li n i t i a t i o na n dt r a n s c r i p t i o n a le l o n g a t i o nl e v e l s t h ea n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e h a sb e c o m eah o ts p o ti nt h et r e a t m e n t so f c a n c e ri nr e c e n ty e a r s t h eh u m a ne l o n g a t o rc o m p l e xi sr e m a r k a b l ys i m i l a rt oi t sy e a s tc o u n t e r p a r ti ns e v e r a l a s p e c t s i nap r e v i o u ss t u d y , w ea n a l y z e dt h ef u n c t i o n so ft h eh e l p 3s u b u n i to ft h eh u m a n e l o n g a t o rb yn s i n ga ni nv i v oy e a s tc o m p l e m e n t a t i o ns y s t e m h o w e v e r d i r e c te v i d e n c ef o r h e l p 3f u n c t i o n si nr e g u l a t i n gg e n ee x p r e s s i o ni nh u m a nc e l l sh a dn o tb e e no b t a i n e d i nt h i s s t u d y , w e u s e dt h eh e l p 3a n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d ei n h i b i t o r st ok n o c kd o w nt h eh e l p 3g e n e e x p r e s s i o nt oi n v e s t i g a t ei t sf u n c t i o n si nh u m a n2 9 3 tc e l l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tr e d u c t i o n o fh e l p 3p r o t e i nc a u s e das i g n i f i c a n ts u p p r e s s i o no fh s p 7 0 - 2g e n ee x p r e s s i o n , a n dt h i sw a s a c c o m p a n i e db yh i s t o n eh 3h y p o a c e t y l a t i o na n da d e c r e a s e dr n a p i id e n s i t ya th s p 7 0 - 2g e n e m o r e o v e r , t h ed a t aa l s od e m o n s t r a t e dt h a th e l p 3e x e r t e dt h et r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r y f u n c t i o nd i r e c t l yt h r o u g hi t sp r e s e n c ea tt h eh s p 7 0 - 2g e n e d a t ap r e s e n t e di nt h i st h e s i s p r o v i d ef l l r t h e ri n s i g h ti n t oa n dd k e c te v i d e n c eo ft h ef u n c t i o n so fh e l p 3i nh s p 7 0 - 2g e n e t r a n s c r i p t i o n a le l o n g a t i o ni nh u m a n c e l l s k e y w o r d s ：a n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e ；h e l p 3 ；a c e t y l a t i o n ；h s p 7 0 - 2g e n e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 丞女叠日期：丛1 ：。2 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：箧垒塞鱼指导教师签名： 1 3期：坦2 ，! f 日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 引言 一、本论文的研究背景和立题依据 人的e l o n g a t o r 复合物也是一个不稳定的六亚基复合物，容易分解成两个亚复合物， 具有组蛋白乙酰转移酶活性，可直接与r n a p i i 相结合。从h e l a 细胞中分离纯化的人 的e l o n g a t o r 复合物以两种形式存在；一种是6 亚基的全e l o n g a t o r 复合物形式，该复合 物具有h a t 活性，在体外可直接乙酰化组蛋白h 3 、h 4 。体外转录实验表明，人的 e l o n g a t o r 复合物可以一种乙酰辅酶a 依赖的方式促进转录；从h e l a 细胞抽提物中去除 e l o n g a t o r 复合物可降低抽提物转录染色质模板的能力，该结果为e l o n g a t o r 在以染色质 为模板的转录中具有重要功能的推测提供了生化证据。e l o n g a t o r 复合物的e l p 3 亚基具 有h a t 活性，这也是它在发现之初就受人们关注的原因。e l p 3 属于g n a t ( g c n 5 - r e l a t e d n - a c e t y l t r a n s f e r a s e ) 家族，可与d n a 和核小体结合，主要的乙酰化位点是组蛋白h 3 的 1 4 位赖氨酸和组蛋白h 4 的第8 位赖氨酸；其h a t 活性对体内染色质的组蛋白h 3 和 h 4 维持正常的乙酰化水平极为重要。 h s p 是一组可溶的胞内蛋白质家族，具有“分子伴侣”活性。i z 印基因与其所编码的 蛋白质存在于所有细胞的整个生命活动中，在胞内有不同的定位。“等人发现在爪蟾卵 中组蛋白乙酰化修饰是h s p t o 基因表达的主要调控方式。我们实验室以前的研究结果也 表明使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂喂食果蝇三龄幼虫，增强t h s p 7 0 的基础表达和诱导 表达。并且，最近的研究表明组蛋白乙酰基转移酶c b p 作为染色质修饰复合物t a c l 的 主要成员参与了果蝇热休克基因的表达调控，它通过乙酰化热休克基因5 转录非翻译 区的组蛋白h 3 促进r n ap o li i 逃逸休止状态，c b p 缺失的果蝇突变体其热休克基因5 转录非翻译区的组蛋白h 3 的乙酰化水平明显降低，表达受到抑制。另外，t h o m s o n 等 人将鼠细胞热激不同时间后，检测发现其h s p z 0 启动子处组蛋白h 3 、h 4 的乙酰化水平发 生了改变。由此可见，组蛋白乙酰化修饰与热休克基因表达的关系逐渐明确，但组蛋白 乙酰化修饰在热休克基因表达调控中的作用以及乙酰化修饰与其他组蛋白修饰的关系 还不清楚，有待于进步探讨。 二、本论文的研究内容和意义 本论文拟在已有的工作基础上，利用染色质免疫沉淀，免疫共沉淀，r t - p c r 等实 验技术进行分析，首先确定r n a 干涉或者反义寡核甘酸是否能抑制e 1 p 3 的表达，e l p 3 是否直接参与h s p 7 0 - 2 基因的转录延伸，从而在分子水平上了解组蛋白乙酰转移酶、染 色质修饰和各种转录相关因子与h s p 7 0 - 2 基因表达的关系，阐明组蛋白乙酰转移酶参与 h s p 7 0 - 2 基因表达调控的机制。 第一章文献综述 一、r n a 干涉研究进展 ( - - ) p j n a 干涉的发现 r n a 干涉( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 指体外人工合成的或体内的双链r n a ( d s r n a ) 在细胞内特异性的将与之同源的m r n a 降解成2 i n t 2 3 n t 的小片段，使相应的基因沉 默f 1 ，2 捌。 1 9 9 5 年，康奈尔大学的s ug o u 博士h 利用反义r n a 技术试图阻断秀丽新小杆线虫 中控制胚胎对称性的p a r - 1 基因表达，在与之对照的注射相应的正义链实验中发现p a r 一1 基因表达同样被特异性地抑制。1 9 9 8 年2 月华盛顿卡耐基研究院的fi r e 将双链r n a ( d o u b l e s tr a n d e dr n a ，d s r n a ) 注射) k - - 种线虫( c a e n or h a b d i t i se l e g a n s ) 体内可以诱导 专一性的靶向基因沉默( g e n es i l e n c i n g ) 。这种d s r n a 比单独的正义r n a 或反义r n a 具有更高效的特异性基因沉默效应i l 】。随后，a n d r e wf i r e 和c r a i gm e l l o 对这一现象做 了解释：正义链对基因表达的抑制是由于体外转录制备的单链r n a ( s c n c eo ra n t i s e n s e r n a ) 中混有少量的双链r n a ，若将制得的单链r n a 电泳纯化去除d s r n a ，再将正 义或反义r n a 单链注射入线虫体内，则不产生r n a j ，如果将正义，反义r n a 链混合， 退火，复性得到双链r n a ，再注射到线虫体内，则可产生明显的r n a i ，由此可见，r n a i 是由双链r n a 引起的【1 t 5 】。随后，在真菌( 粗糙脉孢霉) ，植物( 拟南芥) ，无脊椎动物 ( 线虫，锥虫，涡虫，水螅等) 及小鼠胚胎干细胞，卵母细胞及早期胚胎中也均发现存 在r n a i 现象【6 ，”。目前已知r n a i 广泛存在于从真菌到植物，从无脊椎动物到哺乳动物 的各种生物中。由于这种r n a i 作用于r n a 水平，是在m r n a 水平上对基因的调控， 故又称转录后基因沉默( p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g 。p t g s l 【l 】口 ( - - ) r n a 干涉的机制 目前根据对线虫、果蝇和拟南芥的研究结果，提出了一种模型【8 9 ，州( 图1 1 ) ：由 r n a 病毒入侵，转座子转录，基因组中反向重复序列转录等所产生的d s r n a 分子在细 胞内被特定的的蛋白复合物识别，启动相关蛋白结合到d s r n a 分子上，其中r d r p ( r n a d e p e n d e n tr n a p o l y m e r a s e ) 对d s r n a 进行复制，产生足够数量的d s r n a ，随后或同时， d i c e r ”】核酸酶( r n a s ei i i 核糖核酸酶家族成员) 或d i c e r 核酸酶同源物将d s r n a 剪切 成2 1 2 3 n ts i r n a ，3 端带有2 个碱基突出的粘性末端，5 伪磷酸基团，这一结构对于 s i r n a 行使其功能是至关重要的。剪切位点是特异性，一般在u 处。然后，r n a i 特异 性的核酸外切酶，核酸内切酶( r n a s e l l l 同源物) ，解旋酶，辅助识别同源序列蛋白和 其它一些蛋白与s i r n a 结合成r n a 诱导沉默复合体r i s c ( r n a - i n d u c i n gs i l e n c e c o m p l e x ) 识别目标m r n a ，其中的反义链与目标m r n a 结合，正义链则被置换出来。 继而，r i s c 复合物中的r n a s e i i i ( 可能是d i c e r ) 在目标m r n a 与s i r n a 结合区域的 2 中间将之切断。这样的过程多次发生后，一个完整的m r n a 就被降解成多个2 1 2 3 n t 的小片段，从而导致相应的基因表达沉默。在这一过程中的多个步骤都需要a t p ：r i s c 复合体的形成，s i r n a 与目标m r n a 的配对，目标m r n a 的切割。另外在d s r n a 复 制过程中，两条链的分离可能也需要一个依赖a t p 的r n a 解旋酶。 人工合成的s i r n a 在果蝇、线虫和哺乳动物细胞中也可诱导特异的基因沉默。这表 明d s r n a 的加工过程和随后目的m r n a 降解过程是可以分离的。s i r n a3 端各有两 个2 n t 碱基突出的黏性末端( 这一结构特征也证明了s i m q a 是由r n a s ei i i 产生的) ，这 种结构对于s i r n a 的引发是必需的。体外、体内实验均表明平端的s i r n a 使r n a i 作 用大为减弱。这可能是由于黏性末端存在时，单链结合蛋白与之结合，避免了加工d s r n a 的因子与之结合。 图1 1r n a 干涉机制l l ” ( 三) r n a 干涉的特点 1 特异性抑制目的基因。只有相对于某一基因的外显子的d s r n a 才能诱导该基因 的沉默，而相对于启动子或内含子序列的d s r n a 则无干涉效应。r n a i 只特异性降解同 源m r n a ，无关m r n a 的表达不受影响，染色体d n a 序列也未发现有异常。 2 高效性。少量d s r n a 就可诱导大量的同源m r n a 降解，而且表型可达到缺失 突变体的程度。表明存在信号放大机制【1 2 】。 3 目标m r n a 切割位点的确定性。在r i s c 作用下，同源m r n a 被切割，切割位 点相差2 1 2 3 n t ，并且均分布在m r n a 5 端与s i r n a 互补序列的第1 0 1 1 位之间。 4 具传播性。一个细胞发生r n a i ，其效应可穿过细胞界线，引起临近细胞或整 个生物体特异性r n a i 的发生。在线虫中，这种效应甚至可传递到子代中1 1 】。目前研究 表明，序列特异性信号很可能是s i r n a ，因为2 1 2 3 n t 这样的长度足够产生序列特异 3 性，又小到非常容易在细胞间传递。 5 需要a t p 的参与。r n a i 效应是一个a t p 依赖的过程，d i c e r 将d s r n a 剪切成 2 1 2 3 n ts i r n a 过程和s i r n a 依赖的r i s c 复合物形成的过程都需要a t p 的参与。 ( 四) r n a 干涉的生物学意义 r n a i 是生物普遍存在的r n a 水平上调控基因表达的机制，其最核心的生物学意义 在于监控异常的或者外源的遗传物质在机体内的水平，是一种原始的基因组对抗外来基 因表达的保护机制1o ”，1 4 1 ，同时r n a i 也具有调控基因的表达的作用。r n a i 的生物学 意义具体体现在以下方面： 1 防御病毒感染：d s r n a 是很多病毒的遗传物，即使是以单链r n a 作为遗传物 质，在其生命周期中也会出现特异性的d s r n a 。当病毒入侵后，诱发r n a i 效应，封闭 病毒复制和繁殖的必需基因。 2 维持基因组中转座子的稳定：多种模式生物研究表明，剔除了r n a i 相关基因 则导致异常的转座子活动，说明r n a i 具有防止转座子在基因组中异常转位的功能。 3 清除异常的r n a ：r n a i 可以清除来自细胞核和细胞质中异常的或者无功能的 r n a ，从而发挥监视m r n a 的功能。 。 参与基因表达调控：拟南芥中，敲除d i c e r 相关基因可抑制胚胎的发育，推迟开花 时间，造成花的分生组织细胞分裂的无序调节。线虫中的e g o 一1 既参与d s r n a 介导 的r n a i 作用，又为线虫生殖细胞发育所必需。这些都表明r n a i 在生物发育中起基因 调控的作用。 二、反义寡聚核甘酸的研究进展 ( 一) 反义寡聚核甘酸的发现 反义寡聚核甘酸是反义核酸中的一种。反义核酸是指能与特定m r n a 精确互补、 特异阻断其翻译的r n a 或d n a 分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低 表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。它包括反义r n a 、反义d n a 和核酶 ( r i b o z y m e s ) 三大技术。反义r n a ：是指能和m r n a 完全互补的一段小分子r n a 或寡聚 核苷酸片段。反义寡聚核甘酸( 反义d n a ) ：( a n t i s c r t s eo l i g o d e o x y n u c l e c o t i d e ，a o d n ) 是一段与m r n a 或d n a 特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的d n a 分子。反义 核酶作为一种基因下向调节作用因子，在抑制一些有害基因的表达和失控基因的过度表 达上发挥着重要作用。自1 9 7 8 年s t e p h e n s o n 和z a m e c n i k 首次进行了有关反义技术的 实验研究以来，大量实验证明，与m r n a 特定序列互补的o d n s ( a s 2 0 d n s ) 不论在培 养细胞中还是在体内都能抑制由该m r n a 编码的蛋白质的表达【1 5 1 。a o d n s 以 w a t s o n 2 c r i c k 碱基互补配对方式与靶m r n a 在可接近位点形成双链，然后通过r n a s e h 水解m r n a 等机制抑制相关基因表达【1 6 】。 ( 二) 反义寡聚核甘酸的来源 反义寡聚核甘酸目前有三种来源；一是利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡 4 聚核苷酸( a n t i s e n s eo l i g o d e o x y n c l e o t i d e s ，a o n ) ，这是反义寡聚核甘酸最普遍的应用方 式，包括未修饰a o n 和硫代磷酸酯化( p s ) 、磷酸二酯化( p o ) 和甲基化等修饰a o n 。因 为反义寡聚核苷酸在生理条件下易被核酸酶( 主要是3 核酸外切酶) 降解，目前最常用 的是硫化磷酸型的反义核酸，即用硫原子代替磷酸基团的氧原子。该方法易于合成，毒性 较小，血浆清除较慢，而且具有更强的抗核糖核酸酶的活性和稳定性。同时反义核苷酸的 磷酸骨架带有负电荷，这给其穿越细胞膜带来了困难，故常对其进行修饰。为增加细胞穿 透能力很多研究采用增加针对细胞特异性的配基，增加翻译物的疏水性或根据d n a 带有 负电荷而使用阳离子脂质体等方法。a o n 设计合成简单，只要其顺序与靶m r n a 部分 顺序互补即可，而对基因的读码框无要求；二是更具有实用价值的人工表达载体，包括 单个基因和多个基因的联合反义表达载体，它是利用基因重组技术将靶基因序列反向插 入到载体的启动子和终止子之间，通过转录可源源不断产生反义r n a 分子；三是天然 存在的反义核酸分子，但目前分离纯化尚存在困难。 ( 三) 反义寡聚核甘酸的作用机理 反义寡聚核甘酸主要是通过m r n a 的翻译和基因d n a 的转录而发挥作用： 1 抑制翻译：反义寡聚核甘酸一方面通过与靶m r n a 结合形成空间位阻效应，阻 止核糖体与m r n a 结合，另一方面其与m r n a 结合后激活内源性r n a s e 或r i b o z y m e ， 降解m r n a 【”。 2 抑制转录：反义d n a 与基因d n a 双螺旋的调控区特异结合形成d n a 三聚体 ( t r i p l e x ) ，或与d n a 编码区结合，终止正在转录的m r n a 链延长【l 8 】。 3 反义寡聚核甘酸还可抑制转录后m r n a 的加工修饰，如5 端加帽、3 端加尾( p o l y 曲、中间剪接和内部碱基甲基化等。并阻止成熟m r n a 由细胞核向细胞浆内运输。 此外，通过a o d n 进行化学改性，如在a o d n 的37 末端连接上化学切割试剂、 乙二胺四乙酸、二价铁离子或邻菲罗琳的衍生物，在改性过程中需要铜离子和还原剂的 存在，可实现对靶基因进行诱导切割等不可逆的反应，从而导致靶基因的失活。 ( 四) 反义寡聚核甘酸的应用 科学工作者通过以上原理已设想以下三种途径来治疗和控制肿瘤，( 1 ) a o d n 与靶 d n a 双螺旋形成三链状结构，从而导致肿瘤基因失活【1 9 】。( 2 ) a o d n 的化学改性作用， 克服了细胞内限制性内切酶对未改性a o d n 的快速水解作用，延长了a o d n 在细胞内 的半衰期；( 3 ) a o d n 的3 末端和5 末端可以采用许多封端基因来改性。 细胞对天然a o d n 的摄取往往效率很低，其原因一方面是a o d n 通过胞饮作用进 入细胞内，主要分布于细胞器中，如溶酶体、高尔基体和内质网中，但a o d n 真正的 作用位点在胞浆和胞核内，所以起不到真正的作用：另一方面a o d n 易受到核酶等物 质的分解，而造成稳定性差。可通过以下四种方式输送a o d n 从而提高其摄取率： 1 以聚合物微球为载体输送系统：可降解的聚合体为核苷酸药物提供保护并依赖 其本身的结构特性控制所包裹药物的释放，研究最为广泛的聚合物微球是聚丙交酯及乳 酸一羟乙酸( l a g a ) 。 2 树枝状高聚物：树枝状高聚物( d e n d r i m e r s ，d e n ) 是一种新的超分子转运系统。 可以转运带负电荷的a o d n ，并形成稳定的复合物。这些复合物可提高细胞对a o d n 的摄取及细胞内的利用率，同时促进a o d n 向细胞核转运。 3 脂质体、脂质复合物和两性阳离子：反义基因包裹在脂质双层中，阳离子脂质体 和a o d n 形成阳离子脂质复合物与带有负电荷的细胞膜亲和，通过胞饮进入细胞内。 目前，脂质体转移系统主要是疏水性胆酸与精胺共价结合，通过精胺或亚精胺与核苷酸 结合构建的转运分子。 4 受体介导：受体介导的胞饮作用可提高a o d n 和核酶对特异组织和细胞的靶向 作用，肿瘤细胞因对营养物质要求较高而对这种转运系统更为敏感。将核酶与转铁蛋白 受体抗体( t e a ) 结合，可使其细胞摄取效率提高3 倍。 三、e i o n g a t o r 的研究进展 在真核细胞中通过r n a 聚合酶i i 的转录可在多个水平上进行调控，包括染色质模 板的识别、转录的起始( i n i t i a t i o n ) 、延伸( e l o n g a t i o n ) 和终止( t e r m i n a t i o n ) 等。染色 质模板的识别在很在程度上是受组蛋白修饰的影响；这些修饰的包括乙酰化、去乙酰化、 磷酸化和甲基化等。在很长一段时间里，组蛋白的乙酰化一直被认为是与转录的激活 有关，而且绝大多数已知的组蛋白乙酰转移酶也被认为是在转录起始之前起作用，然而 近几年来的研究发现一种具有h a t 活性的复合物可与延伸形式的r n a p i i 相结合，人们 对该复合物组成及功能进行了研究并将其命名为延伸体( e l o n g a t o r ) 复合物。 ( 一) 酵母e l o n g a t o r 复合物 1 e l o n g a t o r 复合物的发现 早在1 9 9 2 年，t r a v e r s 就推测在r n a p i i 控制的以染色质为模板的转录延伸过程中 可能有h a t 的参掣2 0 1 ，因为已有研究证实模板上核小体的存在会抑制转录的延伸【2 1 2 2 】。 1 9 9 8 年t s e 等人发现乙酰化修饰可以削弱这种抑制作用【2 3 】，但是这期间一直没能鉴定出 具有h a t 活性的蛋白因子以证明该作用的存在。 1 9 9 9 年，o t e r o 等人在研究延伸中的r n a p i i 复合物各成分的性质时，发现从酵母 染色质的r n a p i i d n a ，i l n a 三元复合物中分离得到的r n a p h 与一种蛋白质复合物紧 密结合，该复合物由1 5 0 ，9 0 和6 0 k d a 三个亚基组成，在酵母细胞中的含量和r n a p i i 一样丰富，它与r n a p i i 的稳定结合需要r n a p i i 的c 末端结构域的高度磷酸化，同时 也可以不与r n a p h 结合的自由形式存在，他们将这种蛋白因子命名为e l o n g a t o r 复合物 【刎，进一步实验证实e l o n g a t o r 的第三个亚基即6 0 k d a 的e l p 3 是一种组蛋白乙酰转移 酶，其氨基酸序列在真核生物中高度保守【2 5 】。 2 e i o n g a t o r 复合物的组成 根据最初用m o n o q 柱纯化的结果，研究者认为酵母e l o n g a t o r 复合物由三条多肽 组成，分别为e l p l 、e l p 2 和e l p 3 2 4 。随后为了研究e l o n g a t o r 的功能，该实验室又用亲 和层析法纯化分离酵母e l o n g a t o r 复合物，发现除了上述三个亚基外，e l o n g a t o r 还包含 另外三个亚基，将除e l p l 、e l p 2 和e l p 3 的三条新的多肽命名为e l p 4 、e l p 5 和e l p 6 2 6 1 。 6 他们将亲和层析得到的六亚基复合物过m o n o q 柱，用逐渐增高的盐浓度洗脱时，可以 得到三种不同形式的复合物。当盐浓度小于1 1 m 时最先被洗脱下来的是六亚基全 e l o n g a o t r 复合物，接下来检测到的是三亚基的核心复合物，最后得到的是富含e l p 4 、 e l p 5 和e l p 6 的部分。发现2 mn a c l 存在时，e l o n g a t o r 被破坏。认为先前在用m o n o q 柱纯化过程中，复合物被阳离子交换层析或高盐浓度所破坏，因而没有得到三个较小的 亚基【2 6 】。而几乎与此同时另外两个实验室也分别纯化出包括三个较小亚基在内的六亚 基e l o n g a t o r 复合物。因而目前普遍认为全e l o n g a t o r 复合物是由六个亚基组成的不稳定 复合物，容易分解为两个亚复合物，其中由e 1 p 1 、e l p 2 和e l p 3 组成的亚复合物为核心 复合物，而较小的亚复合物则由e l p 4 、e l p 5 和e l p 6 组成，并认为较小的亚复合物与核 心复合物之间的结合较弱，因此在纯化时只有采用接近生理条件的离子浓度才有更多的 机会得到结合状态的全e l o n g a t o r 复合物【2 7 捌。 3 酵母e l o n g a t o r 复合物的功能 3 1 e l o n g a t o r 复合物是一个功能整体 o t e r o 等人最早克隆出编码e l o n g a t o r 复合物1 5 0 k d a 的最大亚基e l p l 的基因e l p l ， 为了研究该亚基的功能，将其编码基因从酵母基因组敲除，得到的突变菌株e i p l a 呈现 出不同的表型：对生长条件的改变适应缓慢、对高盐敏感掣2 4 】。随后不同的研究者分别 敲除e l o n g a t o r 复合物的其它亚基得到的e l p 2 a 、e l p 3 a 、e l p 4 a 、d p 5 和 e l p 6 a 2 0 2 1 ，9 2 9 3 ，9 7 均与e l p l 有相似的表型，研究者将其称为e l p 表型：主要有对高 温、高盐和咖啡因、6 - a u 和霉酚酸等敏感 2 1 ，9 6 】及一些基因的缓慢激活等 2 4 】，而且同 时敲除任意两个( 如e l p l a e l p 4 a ) i l f 基的编码基因得到的菌株其生长速率、对高温、高盐 敏感等表型均与敲除单个基因的表型相同【2 6 , 2 9 1 。运用e l o n g a t o r 各亚基基因缺失的品系 进行的基因芯片的分析表明，它们的基因表达图谱非常相似，尤其是当对e l p l 和d p 2 与d p 4 和e l p 6 的基因表达图谱进行比较时，发现它们几乎相同【2 剐。 综合这些研究结果研究者普遍认为e l o n g a t o r 复合物在体内以一个功能整体的形式 行使功能 2 6 2 5 2 9 | ：完整的e l o n g a t o r 复合物可能是其h a t 活性的载体，其中任何一个亚 基缺失都会导致复合物整体结构的丧失，使h a t 活性低于某一临界值，从而导致一系 列的生长缺斛”。但关于e l p 5 是否是酵母的必需基因目前还存在争议。由于w i n k e l , 等人所在的实验室敲除e l o n g a t o r 复合物六个编码亚基基因得到了相应的六个菌株，虽然 突变株呈现出一系列典型的e l p 表型，但对酵母是非致死的，因而认为六个亚基的基因 都是酵母的非必需基斟2 6 】；但是k r o g a n 等人则认为六个编码基因中e l p 5 应为酵母的 必需基因，因为他们敲除e l p 5 基因得到菌株是致死的【埘。 3 2 e i p 3 的h a t 活性是e l o n g a t o r 复合物行使功能所必需 与延伸中的r n a p i i 紧密结合的e l o n g a t o r 复合物的显著特点就是它的e l p 3 亚基具 有h a t 活性，这也是它在发现之初就受人们关注的原因。因为组蛋白尾部的修饰作用是 一种染色质结构调控蛋白结合的“识别信号”，结合r n a p i i 的h a t 引起的不同核心 组蛋白尾部l y s 的乙酰化作用提供了一系列的位点，这些位点可以被辅助延伸进程的染 色质修饰复合物( 如f a c t 、h m g 1 4 及h a t 复合物) 所识别。e l o n g a t o r 复合物正是新 7 发现的可识别并结合于已被磷酸化的延伸中的r a n p i i 的染色质修饰复合物。 e l p 3 属于g n a t ( g c n 5 r e l a t e dn a e e t y l t r a n s f e r a s e ) 家族，重组的e l p 3 亚基在体外具 有h a t 活性【2 5 】，可与d n a 和核小体结合，主要的乙酰化位点是组蛋白h 3 的1 4 位赖 氨酸和组蛋白h 4 的第8 位赖氨酸；其h a t 活性对体内染色质的组蛋白h 3 和h 4 维持 正常的乙酰化水平极为重要【驯。 将e l p 3 的h a t 区催化结构域b 基元的两个保守的酪氨酸变为丙氨酸，得到两个突 变的e l p 3y 5 4 0 a 和y 5 4 1 a ，其酶活分别只有野生e l p 3h a t 活性大约2 5 和3 5 ，这 种使e l p 3h a t 活性严重丧失的点突变可导致所有的e l p 表型”】；充分说明e l o n g a t o r 复 合物的最重要的功能是建立在其拥有h a t 活性的基础上。e l p 3 的h a t 活性对缺少g c n 5 h a t 活性的细胞的生长极为关键，表明在体内与转录相关的h a t 复合物有功能上的重 叠。而同时对两个去乙酰化酶( h d a c ) h d a i 和h o s 2 突变，可以抑制e l p 3 a g c n 5 a 菌株的非正常表型，表明e l p 3 作为一个h a t 对于维持体内组蛋白乙酰化与去乙酰化之 间的平衡极为重要【3 1 】。去除e l p 3 并伴随组蛋白h 3 和h 4 的尾部突变可导致酵母菌株病 态或生存能力的严重下降，又证明e l o n g a t o r 在体内染色质的修饰和改构中具有重要功 能【3 ”。 另外，研究表明e l o n g a t o r 复合物的六个亚基也是t o t 复合物( p u t a t i v e k l u y v e r o m y c e sl a c t i sz y m o c i nt a r g e tc o m p l e x ) 的组成部分【3 2 】，t o t 基因的产物对细胞周 期的正常进行非常重要，t o t 基因缺失的突变菌株产生典型的t o t 表型：对咖啡因和一 种白色荧光剂卡尔科弗卢尔敏感、生长缓慢和细胞周期g 1 期的延迟等 3 2 , 3 3 。研究表明 t o t 3 e i p 3 的h a t 活性是z y m o e i n 复合物( 一种酵母菌株分泌的毒素) 作用所必需的， 而敲除非e l o n g a t o rh a t s ( g c n 5 a ，h a t l a ，h p a 3 a 和s a s 3 a ) 及非e l o n g a t o r 转录延伸因子t f i is ( d s t l a ) 和s p t 4 p ( s p t 4 a ) 的菌株则对z y m o c i n 没有抗性，表明e l o n g a t o r 在k h e f t s z 3 q n o c i n 毒素的信号传导中发挥重要的作用【3 2 1 。另外e l p 3 除了c 末端的h a t 结构域外， 在n 一末端还有一个与s a mr a d i c a le n z y l n e 相似的结构域，研究者认为e l p 3 相关蛋白可 能与组蛋白或d n a 的去甲基化作用有判3 0 】，这些证据表明e l o n g a t o r 复合物可能在细胞 的多种活动中行使功能。 3 3 较小的亚复合物可能对核心复合物的h a t 活性起调控作用 在研究e l o n g a t o r 复合物各亚基之间及其与r n a p i i 的相互作用时，研究者发现 e l p 4 、e l p 5 和e l p 6 只与由e l p l 、e l p 2 和e l p 3 组成的核心复合物相互作用，而不与延伸 复合物中的r n a pi i 相互作用。研究还表明核心复合物没有h a t 活性，而只有与e l p 4 、 e l p 5 和e l p 6 组成的较小的亚复合物结合形成6 亚基的全e l o n g a t o r 复合物才具有h a t 活性，因而认为三个较小的亚基组成的复合物对核心复合物的h a t 活性具有调控作用 【删，而具有8 个重复w d 4 0 结构的e l p 2 在复合物的装配中可能具有重要功甜2 9 】。 3 4e l o n g a t o r 复合物的作用模式 由于e l o n g a t o r 复合物作为r n a p i i 延伸复合物中的一个重要组分，可与延伸中的 r n a pi i 全酶从d n a r n a r n a pi i 复合物中共纯化，e l o n g a t o r 复合物可直接与r n a p i i 相互作用，它们之间结合的稳定性则靠r n a pi i 最大亚基c 末端结域的磷酸化状态来 b 维持1 2 4 】。而另一个与r n a p i i 结合的复合物是中间因子( m e d i a t o r ) ，它专门与非磷酸化的 r n a p i i 结合并在转录起始中循环，据此有人提出了一个模型：e l o n g a t o r 在起始延伸转 换点对t f i i h 介导的c 末端区域的磷酸化发生应答，置换中间因子并在此后的延伸过 程中协助r n a p l i 发挥作用 2 4 1 。 e l o n g a t o r 复合物中e l p 3 亚基h a t 活性的特定功能虽仍需确定，但它在包括哺乳动 物在内的真核生物中的进化保守性表明它在体内一定具有非常重要功能，也许与g c n 5 的h a t 活性对启动子d n a 进行修饰以协助转录起始的功能相类似，e l p 3 可能是对一个 基因的染色质进行修饰从而促进转录的延伸，为r n a pi i 全酶的延伸扫清道路p ”。 ( 二) 人的e l o n g a t o r 复合物 针对人e l o n g a t o r 复合物的研究与酵母相比要少得多。人的e l o n g a t o r 复合物也是一 个不稳定的六亚基复合物，容易分解成两个亚复合物，可直接与r n a p l i 相结合。从 h e l a 细胞中分离纯化的人的e l o n g a t o r 复合物以两种形式存在：一种是6 亚基的全 e l o n g a t o r 复合物形式，该复合物具有h a t 活性，在体外可直接乙酰化组蛋白h 3 、h 4 ： 另一种是三亚基的核心复合物形式，虽含有e l p 3 催化亚基，但却没有h a t 活性【3 5 】。体 外转录实验表明，人的e l o n g a t o r 复合物可以一种乙酰辅酶a 依赖的方式促进转录口6 】， 从h e l a 细胞抽提物中去除e l o n g a t o r 复合物可降低抽提物转录染色质模板的能力【3 6 】， 该结果为e l o n g a t o r 在以染色质为模板的转录中具有重要功能的推测提供了生化证据。 根据目前的研究结果，e l o n g a t o r 复合物在人和酵母之间高度保守，人e l o n g a t o r 复合物的各亚基分别是酵母e l o n g a t o r 复合物的同源物，人和酵母的e l p 3 在蛋白质水平 有7 7 的相同性，有8 1 的相似性。研究表明人的e l o n g a t o r 复合物最大亚基的编码基 因i k a p ( 酵母e l p l 的同源物) 突变可导致一种严重的神经性疾病：家族性自主神经异常