（细胞生物学专业论文）苎麻ccoaomt基因cdna转化模式烟草ws38的研究.pdf

苎麻c c o a o m t 基因c d n a 转化模式烟草w s 3 8 的研究 摘要 木质素是影响苎麻纤维品质的主要成份，常规育种或栽培措施来控制木质 素含量总难达到理想的效果。通过基因工程技术降低木质素的含量或改变其组 分，进行低木质素育种，是苎麻遗传改良非常有前景的领域。 本研究分别构建了苎麻咖啡酰辅酶a 氧甲基转移酶( c c o a o m t ) 基因正义 和反义表达载体，通过农杆菌介导转化木质素研究的模式植物烟草w s 3 8 ，以了 解苎麻c c o a o m t 基因对木质素合成的作用和降低木质素含量的可行性。本文的 主要研究结果如下： ( 1 ) 以p b l l 2 1 为载体，构建了苎麻c c o a o m t 基因3 5 s 启动子控制的反义 c d n a 基因质粒( p b l l 2 1 一a n t i b n c c o a o m t ) ，转化模式植物烟草w 3 8 ，获得了转 基因植株。 ( 2 ) 以p w m l 0 1 为载体，构建了苎麻c c o a o m t 基因3 5 s 启动子控制的其a d n a 全长表达质粒( p w m l 0 1 一b n c c o a o m t ) ，并对模式烟草进行了遗传转化。 ( 3 ) 对转基因植株进行了分子分析和初步的组织学研究。苎麻基因在烟 草中组成型表达，对烟草生长产生了一定影响，无论正义基因还是反义表达基 因，转基因植株比对照植株生长较缓慢。组织学研究表明，反义转基因烟草细 胞壁木质素含量降低，而正义转基因细胞壁变化不明显。 上述研究结果为深入研究苎麻c c o a o m t 基因及其在木质素代谢中的功能 提供了一定的参考。为低木质素或木质素组分改良的苎麻基因工程积累了经 验。 关键词：苎麻；木质素；c c o a o m t ；模式烟草w s 3 8 ；遗传转化 i v s t u d yo nt r a n s f o r m a t io no fc c o a o m te d n ao f b o e h m e r aniv e ainm o d eit o b a c c ov arie t y w s 3 8 a b s tr a c t t oc o n t r o lt h ec o n t e n to fl i g n i n ，w h i c hc o n s t i t u t e sp r i n c i p a l l yt oi n f l u e n c et h eq u a l i t y o fr a m i ef i b e r , t or e a c ht ot h ei d e a le f f e c tb yc o n v e n t i o n a lb r e e d i n go rp l a n t a t i o nm e a s u r e s a l w a y sg o e si nv a i n i tp r o v e st h a td e c r e a s i n gt h ec o n t e n to ra l t e r i n gt h ec o m p o n e n t so f l i g n i n ，c a r r y i n go u tl o wl i g n i nb r e e d i n gv i ag e n ee n g i n e e r i n gt e c h n o l o g ys e e mt ob ea p r o s p e c tf i e l do ft h eg e n e t i ci m p r o v e m e n to fr a m i e i nt h i s s t u d y , w ec o n s t r u c t e dt h e f u l l l e n g t he x p r e s s i o nv e c t o ro fc c o a o m t ( c a f f e o y l c o a3 - 0 一m e t h y l t r a n s f e r a s e ) ，a n dt h e nt r a n s f o r m e di ti n t om o d e lt o b a c c ov a r i e t y w s 38v i aa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n i no r d e rt of m do u t w h e t h e rc c o a o m to fr a m i eh a se f f e c t si nt h es y n t h e s i so fl i g n i na n dc a nd e c r e a s et h e c o n t e n to fl i g n i no rn o t t h em a i nr e s u l t so ft h i ss t u d ya r ea sf o l l o w s ， ( 1 ) t h e3 5 sp r o m o t e rc o n t r o l l i n gf u l ll e n g t he d n ao fc c o a o m to fr a m i e e x p r e s s i o nr e c o m b i n a n t ( p w m l 0 1 - b n c c o a o m t ) h a sb e e nc o n s t r u c t e di n t ov e c t o r p w m 101a n dt r a n s f o r m e di n t om o d e lt o b a c c ov a r i e t yb yc o c u l t i v a t i v em e t h o d s ( 2 ) t h e3 5 sp r o m o t e rc o n t r o l l i n ga n t i - s e n s ec d n ao f r a m i ec c o a o m tr e c o m b i n a n t ( p b il21 - a n t i b n c c o a o m t ) i sc o n s t r u c t e di n t ov e c t o rp b i121a n dt r a n s f o r m e di n t om o d e l t o b a c c ov a r i e t yw s 38 ( 3 ) m o l e c u l a ra n a l y s i sa n dap r i m a r yh i s t o l o g ys t u d yr e v e a lt h a tt h er a m i eg e n e a f f e c t st h eg r o w t ho ft o b a c c ow h e ni ti se x p r e s s i n gc o n s t a n t l yi nt h et r a n s f o r m e dp l a n t l e t s w h e n e v e ri ti se x p r e s s e di nas e n s eo ra n t i s e n s ew a y t h et r a n s f o r m sa r eu s u a l l yg r o w t ha l i t t l eb i ts l o w e rt h a nt h ec o n t r o l s t h et i g n i nc o n t a n ti nv a s c u l a rb u n d l eo fl e a f s t a l ks e e m s r e d u c e di na n t i s e n s et r a n s f o r m sb ys t a i l lw i t hs a f r a n i nb u tt h e r ei sn oa p p e r a n t l yd i f f e r e n t i ns e n s et r a n s f o r m s 、航t 1 1n o n - t m n s f o r m e dw s 38a sc o n t r 0 1 t h er e s u l t sa b o v ep r o v i d es o m er e f e r e n c e so ft h ef - u l t h e rs t u d yo fc c o a o m to f r a m i ea n di t sf u n c t i o ni nt h em e t a b o l i s mo f t i g n i n i na d d i t i o n ，t h es t u d ya c c u m u l a t e st h e e x p e r i e n c e so nt h eg e n ee n g i n e e r i n go fr a m i et or e d u c el i g n i nc o n t e n t so rt oi m p r o v e d c o m p o n e n t so fl i g n i nt of a v o rf i b e ru n g l u e i n g k e y w o r d s ：r a m i e ；l i g n i n ；c c o a o m t ；m o d e lt o b a c c ov a r i e t yw s 3 8 ；g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 附、缝时间：2 0 0 6 年0 4 月2 0 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 橡忿时间：2 0 0 6 年0 4 月2 0 日 时间：2 0 0 6 年0 4 月2 0 日 第二章绪论 苎麻 b o e h m e r i an i v e a ( l i m a ：) g a u d 】属荨麻科苎麻属，是多年生宿根性草本植物。 作为中国特产的纺织原料作物，很早便开始作为经济作物栽种。苎麻收获物是麻皮， 麻皮通过脱胶获得其纤维，苎麻纤维吸湿散热快，其织物挺括凉爽，是我国重要的创 汇产品。苎麻产业在我国加入世贸组织后得到了前所未有的发展机遇。 提高苎麻纤维产量和品质是苎麻育种的主要方向。经过杂交育种、系统选育等传 统育种方法改良纤维品质取得了一定成功。一些优良的品种得以推广和应用，如湘苎 3 号等。 苎麻麻皮含3 - 7 的木质素，是比较顽固的杂质，严重影响苎麻纤维的品质，即 使少量的木质素存在对苎麻纺织性能仍有较大影响。含木质素残留的纤维织物接触皮 肤后引起皮肤红肿痒痛。在纺织工业中为脱除苎麻纤维中混在的木质素，需要采用碱 处理，化学药品投入及废液的处理需要大量耗能并增加成本，对环境的污染也较大。 从理论上讲，木质素一般在老化的韧皮部和茎基部含量较高，传统上用适时收获 的方法在茎老化之前收获可降低原麻的木质素含量。而在农业生产实际中，引起木质 j l 素含量增加的因素还很多，如土壤中水分不足，或者排水不良都会促进木质素沉淀。 苎麻在生长期常遇风害，风斑多的原麻，其风斑处产生木栓组织含木质素较高。因此 通过栽培或生产措施来控制木质素含量可操作性不强。 由于栽培措施与常规遗传育种对苎麻的产量和品质的改良有一定的限度，要实现 更高水平的定向改良目标，必须在基因水平上对韧皮纤维细胞的分化、代谢进行直接 的调控。如通过基因工程方法降低木质素合成的水平，改良苎麻品质，将有望培育出 更高纤维素质量的苎麻新品种。 木质素是植物体中仅次于纤维素的一种重要大分子有机物质，填充于纤维素构架 中增强植物体的机械强度，利于疏导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。陆 生植物的木质素合成是适应陆地环境的重要进化特征之一。然而，制浆造纸的中心环 节是用大量化学品将原料中的木质素与纤维素分离，纤维素用于造纸，分离的木质素 等成为造纸工业的主要废弃物，也是自然水体的主要污染物。脱木质素的化学品投入 及废液的碱回收处理需大量耗能并增加造纸成本。饲草的木质素还影响牲畜的消化与 营养吸收，木质素含量的高低是饲草优劣的指标之一。降低木质素含量或改变其组分， 将有利于更好地利用资源植物，同时，环境保护是2 l 世纪面临的严峻挑战，其中源 头治理污染、实现清洁生产在国际上已成为重要研究方向。造纸原料降低木质素含量， 减少环境污染的尝试走在了前沿。通过转基因技术调控植物木质素含量与组分，可以 从源头- j 告纸原料入手，治理造纸废水污染并降低造纸成本。该项研究在国际上已 成为热点，且木质素生物合成途径的基础研究也日新月异。本章先对木质素生物合成 途径及其调控的研究与进展进行一个概述。 1 木质素生物合成的研究进展 木质素是所有维管植物细胞壁必需的要素，是最丰富的生物高分子聚合物之一，光 合作用固定的碳相当部分被木质素合成所消耗i l j 。木质素是苯基丙氨酸衍生的芳香族 亚基聚合体【2 j ，具有重要的生物功能：木质素在细胞壁中填充于纤维素骨架内，加大 了细胞壁的硬度，增强了细胞的机械支持力和抗压强度；由于木质素是不溶性的酚类 聚合物，使木质部细胞壁疏水，因此维管植物能有效的进行水分运输；木质化的组织 非常紧凑以致于蛋白质分子都不能渗透组织，所以木质素是微生物侵袭障碍，增强了 植物的抗病能力【1 ，2 1 。 1 1 木质素的组成 木质素单体有三种：香豆醇p c o u m a r y la l c o h 0 1 ) 、松柏醇( c o n i f e r y la l c o h 0 1 ) 和芥子 醇( s i n a p y la l c o h 0 1 ) 。在树木中木质素由芥子醇、松柏醇、香豆醇聚合而成。在硬木( 双 子叶植物) 中木质素主要含芥子醇和松柏醇；而软木材木质素( 松类和银杏) 主要由松柏 醇组成；松类紧密的木材多含香豆醇。作为生物大分子的木质素是由几种单体组成的 不寻常的复杂无序的网状结构【1 1 ( 见图l 。1 ) 。根据木质素的单体组成，可将木质素分为 3 种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素( s 木质素) ；由愈创木 基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素( g 木质素) ；和由对羟基苯基丙烷结构单 体聚合而成的对羟基苯基木质素( h 木质素) 。裸子植物主要为愈创木基木质素( g ) ； 双子叶植物主要含愈创木基紫丁香基木质素( g s ) ；单子叶植物则为愈创木基紫丁香 基对羟基苯基木质素( g s i - i ) t 3 1 。裸子植物木质素主要是g 结构单元，具一个甲氧基 基团，c 5 位置可以与其他单体以比较稳定的c c 键连接；双子叶植物含有s 结构单 元，具两个甲氧基集团，无游离的c 5 ，比裸子植物缺少c c 连接，木质素比较疏松， 造纸中相对容易去除 4 1 。植物体存在多种类型的木质素以及多种木质素单体的组成， 是植物在长期进化和发育过程为适应不同的环境条件或实现不同功能特性的结果。 2 图1 1 推定的木质素结构和木质素单体【1 】 f i g 1 1h y p o t h e t i c a ll i g n i ns t r u c t u l r ea n di t sm o n o l i g n o l s 1 2 木质素的生物合成 木质素的生物合成十分复杂，表现为复杂的网络状合成途径。以苯丙氨酸或酪氨 酸为前提，在细胞质中的一系列酶催化下，经过脱氨基、羟基化、甲基化和氧化还原 等过程，使苯丙氨酸或酪氨酸逐步转化为木质素单体，然后转运到细胞壁再最终聚合 成木质素，木质素生物合成途径见图1 2 【5 i 。 木质素单体的含量、组成及总木质素含量随植物种类不同而不同。所涉及酶的种 类、活性及比例的差异决定了不同单体产生和合成的速率及在木质素中不同木质素单 体的比例，从而决定了特定木质素的产生。 木质素单体生物合成途径的苯丙烷( p h e n y p r o p a n o i d ) 途径是植物体次生代谢中的 一个通用途径【6 ，7 ，引，与植物多种次生代谢关联起来。如咖啡酸、芥子酸、阿魏酸、香 豆醇、芥子醇等。 1 3 木质素合成的分子调控 1 3 1 木质素生物合成过程中的关键酶 木质素可使维管组织如木质部导管分子和韧皮部纤维次生壁加厚，它的形成受发 育、胁迫和病原物侵染的诱导。它不仅增加维管组织的机械强度和防水性，还可防止 分化过程中细胞自体溶解时细胞壁降解，在植物维管组织分化和防御体系中发挥重要 作用。木质素的合成途径中有几个关键酶如p a l 、4 c l 、c o m t 、c c o a o m t 和c a d 等，是木质素分子生物学研究中热点。 ， y ，。o h 、_ 饺 b | l 奈 h 商 o h 6 h ch 嚏番豆奠 嘲i阿囊嚏纠1基目t 1 4 c l 4 c l 4 c l4 c l l o v 8 c 0 a 一， ， 3 h ， 萝罄 番豆囊 ，s c o ao ：r s c o ao v s c o ao 6 r j j 竺紫l 鲫_ i 瑚吖 d h - t 【 i 量。古声谳 0 j h o c 吨c 阿酰辄i a5 - 羟基网奠赡辅一a j 匕台钧 o 丫hi 霹 ，hl 黑 ，h l) v h j 令a c 咖 1 旦lr曼唑 ：ijli c 垂木黯 s 曼术髓 图 木质素生物合成途径【9 】 ( 1 ) 苯丙氨酸解氨酶p a l3 5 ) 催化苯丙氨酸形成肉桂酸。在百日草植株中转入反义基因后，内源基因活性 4 受到抑制、木质部发育异科1 0 1 。在烟草中转入反义p a l 基因，当p a l 活性降到野生 型的2 0 2 5 时，木质素含量受到显著影响【l 。 ( 2 ) 4 一香豆酸c o a 连接酶4 c l ( e c6 2 1 1 2 ) 依赖a t p 主要将香豆酸与辅酶a 连接，包括一系列同工酶，可通过利用不同的 底物来调节木质素合成。v o o 等【1 2 】从火炬松木质部中克隆出一个4 c lc d n a ，编码6 4 k d 多肽。此多肽可利用香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸，但不能利用芥子酸。从 荷兰芹中分离出的4 c l 1 基因，主要在维管组织中表达，其启动子含有受发育调控的 一个正调控元件和一个负调控元件，负调控元件抑制基因在韧皮部表达【b 】。 ( 3 ) 咖啡酸3 一o 一甲基转移酶c o m t 或c a o m t ( e c2 1 1 6 ) 它以s 腺苷甲硫氨酸为甲基供体，在正发生木质化作用的细胞中表达【1 4 1 。 在烟草中转入杨树反义c o m t 基因，烟草c o m t 酶的活性降低，木质素成分发 生改变，而含量未受影响【1 5 】。若将烟草反义c o m t 基因转入烟草，当c o m t 酶的活 性减少8 0 9 0 时，木质素成分显著改变，而含量不受影响，当转入正义c o m t 基 因，c o m t 过量表达时，木质素合成不受影响【l6 1 。但在烟草中转入紫苜蓿反义c o m t 基因时，木质素含量受到影响，而木质素成分不发生改变【l7 1 。 ( 4 ) 咖啡酰c o a 一3 一o 一甲基转移酶c c o a o m t ( e c2 1 1 1 0 4 ) c c o a o m t 是1 9 8 9 年才被发现的。在木质化中的作用是y e 等于1 9 9 4 年发现的。 他们克隆了百日草c c o a o m t 基因并发现它在t e 分化过程中表达，参与木质部和韧 皮部纤维的木质化作用，是木质素生物合成过程中参与甲基化作用的关键酶 1 8 , 1 9 】。目 前已经从荷兰芹c c o a o m t 基因启动子中鉴定出几个顺式作用元件【2 0 】。与这些顺式 作用元件结合的反式作用因子有待进一步研究。 ( 5 ) 肉桂酰乙醇脱氢酶c a d ( e c1 1 1 1 9 5 ) 在木质素合成的最后阶段起作用，催化香豆醛、松柏醛、芥子醛分别形成香豆醇、 松柏醇和芥子醇。，已从菜豆、烟草和火炬松等多种植物中克隆出其基因。基因表达受 发育和环境因子调节。与4 c l 类似，被子植物c a d 和裸子植物c a d 对底物亲和性 。 不同，可通过利用不同的底物来控制形成不同类型的木质素。c a d 突变体【2 1 】或转反 义c a d 基因【2 2 1 的植株，木质素单体的组成都发生改变。 ( 6 ) 过氧化物酶 在木质素形成、细胞壁多糖间的连结及一些蛋白质分子的交联反应中起作用。s a t o 、 等 2 3 1 从百日草叶肉细胞体外分化形成t e 过程中分离出5 个过氧化物酶同工酶p 1 - p 5 。 它们以阳离子状态靠离子键结合在细胞壁内。其中p 5 是t e 分化过程中特异地参与木 质素合成的同工酶。 对木质素单体的糖基化、贮藏和运输及聚合形成木质素的研究，目前也取得了较 大进展 2 4 1 ，但还不清楚如何人为控制木质素中不同单体的比例。此外，虽然在p a l 、 4 c l 和c a d 基因启动子中发现了一些保守序列，并已鉴定出一些与这些保守序列相 结合的蛋白质，如m y b 类转录调节因子【2 ”，但基因表达及木质素沉积到细胞壁的调 节仍有待进一步研究。 1 3 2 木质素合成的分子调控 在拟南芥 2 6 , 2 7 , 2 8 】、玉米 2 9 , 3 0 , 3 1 】、松树等几种植物中发现了木质素含量与组分改 变的突变体，研究表明这是由于木质素合成代谢中的某个酶失活造成的。突变体的发 现为利用现代生物技术降低植物木质素含量提供了思路，人们用分子生物学的手段通 过抑制植物木质素单体合成酶的内源基因，达到降低转基因植物木质素含量的目的。 木质素生物合成途径中几乎所有酶的基因都已经被克隆，为利用基因工程调控植物木 质素的研究奠定了基础。目前，对苜蓿、桉树与杨树等一些重要植物进行了遗传操作， 对木质素进行改造，希望能够从源头改变木质素的组成与含量，对牧草进行操作以降 低木质素对消化产生的不利影响。因此，在不影响植物生长发育的前提下，降低木质 素含量或改变其组成已成为国际上研究的热点。研究结果表明c o m t 、c c o a o m t 、 f 5 h 、c c r 和c a d 等在木质素合成中发挥着重要的调控作用，因此也是基因工程调 控木质素代谢的主要对象。近年来，利用4 c l 与c c o a o m t 基因调节植物木质素合 成的研究获得了令人满意的结果。 p a l 对苯丙烷类代谢起一个总开关作用，参与包括木质素、香豆酸酯类和类黄酮 等多个次生代谢物质的合成。抑制p a l 活性往往伴随着非正常生长或者出现与次生代 谢物质有关的环境适应性和抗逆性下降。只有p a l 抑制到一定程度时才影响木质素的 合成，而且抑制p a l 的转基因植物木质素含量下降的同时还伴随着植物体非正常生长 u 】。利用反义r n a 技术转化烟草，p a l 活性下降5 3 0 时，木质素没有明显的降 低1 3 引。p a l 活性降低超过3 0 后，s e w a l t 等得到了木质素含量降低的转基因烟草，而 且木质素单体组成g s 比值明显上升，转基因烟草的表型严重变形【3 4 1 。b a t e 、e l k i n d 等得到抑制烟草p a l 的转基因植株，木质素含量下降伴随非正常生长。这些尝试尽管 6 有效地降低了植物木质素含量，但由于植株的非正常生长，而没有生产上的意义【3 5 ”。 f r a n k e 等的研究表明，p a l 或c 4 h 受到抑制后，转基因烟草的k l a s o n 木质素含 量都不同程度地降低，s g 值发生改变。但c 4 h 导致了木质素分子中s 单元的减少， 类似于c o m t 和f 5 h 被抑制后结果。因此，g 型木质素可能存在另外的通路，或者 c 4 h 可能与其他的酶形成多酶复合体来控制s 型木质素的形成。f 5 h 的过量表达导致 拟南芥的木质素几乎都是由s 型单元组成，抑制它的表达导致木质素的s 单元明显降 低，进一步证实了f 5 h 是s 型木质素合成的控制点。c 3 h 的作用是将木质醇合成过 程中苯环的c 3 的羟基化，但它的催化底物一直被认为是对香豆酸。得到的拟南芥r e j 8 突变体的表型表明，缺失了c 3 h 基因，植株的木质素下降了2 0 4 0 ，木质素的组 成发生了明显变化，在野生型拟南芥含量很少的h 型单元却成了突变体木质素的主要 成分，而野生型中的主要组成成份g 和s 单元在r e j s 中含量非常少。s e w a t t 等得到抑 制c 4 h 的转基因烟草，但转基因烟草生长不正常。 木质素合成中研究较多的是c o m t ，研究结果并不一致，产生差异的原因尚无明 确解释。在转基因烟草、杨树中，c o m t 的下调使木质素组分发生改变，对s 型木质 素的影响比较大，g 型木质素受它的影响较小，s g 比值下降，木质素分子中有5 羟 基松柏醇残基的积累，这与c o m t 在木质素合成途径中重新定位是一致的【3 6 , 3 7 , 3 8 , 3 9 】。 用插入突变获得的玉米b r o w nm i d r i b 3 突变体中c o m t 活性仅有野生型的2 0 ，木质 素的s g 比明显下降，但k l a s o n 木质素含量不变。用维管组织特异表达启动子来调 节c o m t 的转录【4 0 1 。n i 等【4 1 】在转基因烟草中使木质素含量明显降低，无组分改变， 亦无5 羟基愈创木基木质素出现。a t a n a s s o v a 等【l6 】认为c o m t 活性被抑制达 8 0 9 0 ，才能对木质素的组分产生影响。j o u a n i n 等【4 2 】以c o m t 共抑制的转基因杨 树在c o m t 活性几乎被全部抑制( 活性残留不足3 ) 的转基因杨树中才发现木质素含 量降低，c o m t 活性被抑制的程度影响木质素的含量与组分。制浆时出浆率增加约 1 0 ；但伴随s g 下降导致木质素结构致密，不易去除，纸浆k a p p a 值升高，影响质 量和后续漂白，二者效应相互抵消。因此，降低木质素含量需同时重视木质素的组分 改变。 c c o a o m t 是木质醇合成中另外一个催化甲基化作用的酶。烟草、苜蓿的 c c o a o m t 被抑制后，其k l a s o n 木质素含量有相应的降低，当c c o a o m t 的活性几 乎完全被抑制时，苜蓿g 木质素下降5 0 ，但对s 木质素没有影响，推测c c o a o m t 7 可能也参与了苜蓿g 型木质素的甲基化作用。因此不同木质素的甲基化作用存在着一 定差异，c c o a o m t 和c o m t 共同作用合成g 型木质素，c c o a c ! m t 可能不参与s 型木质素的甲基化过程。z h o n g 等1 4 3 】获得反义c c o a o m t 表达的转基因烟草，k l a s o n 木质素含量下降3 6 一4 7 。g 木质素比s 一木质素减少的幅度大，s g 比值增加。 m e y e r m a n s 掣删在抑制c c o a o m t 表达的转基因杨树中发现木质素含量降低1 2 ， s g 比值增加1 1 。z h o n g 等l 4 5 】将c c o a o m t 转入杨树，也发现木质素含量明显下降， 且结构疏松利于脱木质素。s g 比值增加，木质素结构更为疏松，易于去除m ，4 5 1 。刘 惠荣等通过农杆菌介导法将毛白杨c c o a o m tc d n a 反向导入烟草，大部分转基因株 系木质素含量均有不同程度的下降，其中下降最多达3 7 ，表明抑制植物内源 c c o a o m t 的表达可有效地降低木质素含量【4 引。 不同植物的4 c l 活性受到抑制后对木质素含量与组成的影响不尽相同。在4 c l 活性降低的转基因拟南芥中发现s 一木质素含量明显下降，g 一木质素无明显改变【4 7 】。在 转基因烟草中的结果却与此不同，两种木质素含量都降低 4 8 1 。烟草4 c l 活性变化导 致木质素含量、木质素分子中肉桂醛和s 残基含量的变化，s g 也在0 4 5 2 0 之间波 动。k a j i t a l 4 9 j 获得的抑制4 c l 表达的转基因烟草，其木质素含量下降1 9 。3 5 ，且肉 桂醛与s 木质素含量减少，转基因烟草与野生型在形态上没有差别。拟南芥4 c l 活 性抑制后g 型木质素降低，不影响s 型木质素的变化【5 0 1 。h u 掣5 1 1 用反义r n a 技术 抑制黑杨4 c l 基因表达，活性下降9 0 以上的转基因株系中木质素含量下降达4 5 ， 且根、茎及叶生长增强，伴随纤维素含量增加1 5 。转基因黑杨纤维素与木质素的总 含量与野生型相比保持不变，表明植物中木质素与纤维素的合成可相互补偿。杨雪萍 等将反义4 c l l 基因转化植株的纤维素含量比对照提高了1 1 4 ，而木质素含量比对 照降低了1 9 1 【5 2 j 。 利用反义核酸技术能够抑制7 0 的c c r 活性，木质素及其分子中g 残基含量都 下降，导致了木质素s g 比率增加，有些株系木质素s 残基含量也有明显下降。缺失 了c c r 基因的拟南芥突变体i r x 4 的木质素含量下降5 0 ，g 和s 残基也明显下降。 一 植株呈现出生长缓慢，株型明显矮化，其育性受到明显影响。c c r 的降低调节能使烟 草的k l a s o n 木质素降低5 0 ，同时出现矮生长、顶端优势降低、不正常的叶形和枯 黄病【5 3 1 。将反义小麦c c r 基因转化烟草，转基因烟草木质素下降了1 1 7 ，成熟植 株的株高约为野生型的2 3 5 4 1 。可见抑制c c r 的活性导致木质素含量降低，并影响植 8 株的生长发育。 b a u c h e r 等研究表明，在c a d 活性被抑制的转基因杨树中，产生了特殊的红色木 质素且容易分离提取出来，这说明抑制c a d 活性虽然木质素总量没有明显降低，但 抑制c a d 活性能够使木质素结构发生了改变1 5 5 】。b a u c h e r 等深入研究表明，当抑制 c a d 活性时，木质素中出现了肉桂醛这种新的组分。因为木质素分子中s 残基含量 降低，苜蓿木质素的s g 比率下降 5 6 1 。h a l p i n 等在转基因烟草中使c a d 活性降为野 生型的7 ，但木质素含量仍末降低【57 1 。c a d 被抑制的转基因杨树中，特殊的红色木 质素容易被分离出来，制浆实验表明k a p p a 值降低，说明抑制c a d 虽然没有降低木 质素的含量，但改变了木质素的组成结构，有利于脱木质素的制浆化学工艺【5 8 】。因此， 许多学者认为在木质素生物合成中，c a d 并非限速步骤，可能极低的内源c a d 活性 就能满足植物体木质素合成的需要。 利用有性杂交同时抑制c c r 和c a d 活性导致烟草木质素下降5 0 ，s 型和g 型 木质素均有不同程度的降低，g 型木质素下降明显，转基因烟草的发育正常【4 ，使 c c r 单基因的转基因烟草株形变矮的性状得以恢复。c c r 或c a d 对木质素分子中 s g 比率的影响要小于f 5 h 或c o m t 的作用。合理的解释是c c r 和c a d 是g 型和 s 型木质素合成都必需的，而f 5 h 和c o m t 主要负责s 型木质素的生物合成。 抑制或增强f 5 h 表达仅影响木质素的组分【5 鲥。i p e l c l 等通过抑制杨树的一种过氧 化物酶的表达，使木质素含量下降1 0 2 0 【6 0 1 ，是唯一抑制木质素单体聚合而降低 木质素含量的报道。 综上所述，运用传统的反义或正义核酸技术调节木质素合成中某个单一基因的表 达来调控木质素的含量、结构和组成，尽管已经获得了一些理想转基因株系，但对于 复杂的木质素合成过程而言，在转基因植物中抑制某单一外源基因表达往往受到外源 基因的整合位点与拷贝数等多种因素的影响【6 l 】，经常会造成顾此失彼的结果。 利用有性杂交技术将已经纯合的c o m t 、c c r 或c a d 转基因株系杂交或同时抑 制相关基因表达的后代，可能因为在不同的转基因株系重复使用3 5 s c a m v 启动子， 导致所有后代都不同程度地出现目的基因沉默现象。c o m t 、c c r 或c a d 的基因表 达受到一些抑制，但抑制效果不稳定，木质素组成的变化不理想【6 2 】 连续两次转化同一植株，已获得了同时抑制c o m t 和c a d 的转基因杨树和同时 抑制c o m t 和c c o a o m t 转基因烟草。二次转化优点在于可以克服有性杂交的障碍， 9 缩短研究周期。但是也因每个基因整合位点的距离，后代可能出现基因分离，而且二 次转化也容易诱导基因沉默【6 3 1 。 a b b o t t 用c o m t 、c c r 和c a d 部分序列两两组合和3 个基因片段构建的一个嵌 合基因，置于同一表达框架内，在转基因植物体内可以同时抑制每一个片段同源基因 的表达。同时成功地抑制了烟草c o m t 、c c r 和c a d 的表达。不同株系c o m t 、c c r 和c a d 的酶活性都有明显下降，c a d c o m t 的转基因株系k l a s o n 木质素含量降低 了2 9 ，c a d c o m t - c c r 的转基因植株木质素下降了1 7 。木质素组成与结构都有 明显变化，分子中s 残基显著降低，木质部导管扭曲变形，植株生长发育受到严重影 响。转基因株系特别是c a d c o m t - c c r 的株系生长缓慢，植株矮化【6 4 1 。 利用正义核酸技术获得的转基因植株，并没有表现出木质素含量升高的结果。木 质素含量、结构和组成上的变化反而与反义核酸的结果基本相同，这可能是基因之间 同源抑制所致。由于缺乏合适的表达载体，通过基因工程方法过量表达木质素合成中 重要基因的研究工作并不多。2 a 多蛋白体系为同时过表达复杂代谢途径中的多个基 因提供了可能。2 a 是一段来自口蹄疫病毒( f m d v ) 的d n a 片断，编码由 q l l n f d l l k l a g d v e s n p g 组成的1 9 肽【6 5 j 。2 a 能够在翻译水平介导通过它相连的 两个或多个蛋白之间的分离，产生具有一定生物学功g j - - , 匕匕如催化作用的蛋白质。最初， 2 a 多蛋白体系应用在哺乳动物、人、昆虫与真菌的研究中，最近在植物特别是木质 素等复杂的代谢过程开始了一些研究工作。f r a n k e 等【5 9 】首先用2 a 多蛋白体系在烟草 中表达了拟南芥的f 5 h ，导致了烟草茎木质素中s 单元显著增加。他们还构建表达了 g u s 一2 a f 5 h 和g u s 2 a c o m t - 2 a f 5 h 等多蛋白体系，这些多蛋白结构都能够正确 翻译、剪切并分离为g u s 2 a 、c o m t - 2 a 、f 5 h 等单独的蛋白，而且f 5 h 能够正确 的定位。这种方法能够简单快速地在植物体内引进多个目的基因，实现同时用多个目 的基因来调控木质素的合成。 赵艳玲等将融合基因g r p l 8 a n t i - 4 c l l 的定位于形成层表达明显地改变了转基因烟 草植株的木质素和纤维素的含量和比例。转基因烟草的木质素含量较对照平均降低 了13 7 ，而转基因植株的纤维素含量较对照升高了15 6 6 6 1 。 赵华燕等对表达单个及两个甲基化反义基因的成熟转基因烟草植株的木质素含 量测定结果表明，反义抑制c o m t 与c c o a o m t 的表达均使转基因植株的木质素含 量下降， 1 0 表1 1 木质素生物合成的基因工程概况 t a b l e1 1g e n e r a lc o n d i t i o no f t h eg e n ee n g i n e e r i n go f l i g n i nb i o s y n t h e s i s 但单独抑制c c o a o m t 表达引起的下降幅度明显大于c o m t ，并且两个基因同时被 抑制时降低幅度更大1 7 引。 上il 等通过共改造过程组合改造白杨，在反义4 c l 表达的白杨植株中木质素含量 减少4 0 ，纤维素含量增加1 4 。在正义c a l d 5 h 表达植株中s g 比率增加3 倍，木 质素含量没有变化。这些影响是独立的又是累积的，转化2 个基因的植株达到木质素 含量减少5 2 ，s g 比率增加6 4 ，纤维素含量增加3 0 。s g 比率增加加速茎的次 生木质部细胞成熟【7 1 1 。 木质素生物合成的研究经历了4 个阶段：木质素结构的了解、脱氢理论的提出、 脱氢理论的证实，现在进入了第四个阶段的边缘，即木质素生物合成的控制。随着研 究的深入，不久的将来，科学家能“随意塑造”植物，培育新的树木品种，这些树木 能产生优良的木材，为制浆造纸工业提供“量体裁衣”式的植物纤维，提取纤维的过 程无需消耗大量化学药品和能源，并且不会造成对环境的任何污染，使制浆造纸工业 真正成为一种与环境友好的可持续发展的无害化工业。 2 反义r n a 技术在植物基因工程中的应用 反义r n a 技术是基于在细胞内引入一种能和靶m r n a 序7 0 ( 或部分序列) 互补的 r n a 链，从而阻断由d n a 经过r n a 到蛋白质的信息流：m r n a 和反义r n a 之间 能形成复合物，然后这种复合物或者被迅速降解，或者在核内加工过程中被破坏，或 使m r n a 的翻译受到阻遏，从而发挥调节基因表达的作用【7 川。 反义r n a 最早发现于原核生物，1 9 8 6 年w i l l i a m s 发现真核生物中也存在天然的 反义r n a ，它们控制噬菌体溶原和溶菌状态的转换，转座子t n l 0 的转座，质粒的复 制以及某些蛋白质的合成。由于从自然界获得有价值的反义r n a 的可能性很小，因 此通常是采用基因工程的方法在体外或体内人工合成反义r n a ，然后转入植物的细 胞内。e c k e r 和d a v i s ( 1 9 8 6 ) 最初报道了在植物中应用反义r n a 的研究。他们将氯霉 素乙酰转移酶( c a t ) 基因的反义r n a 基因，转入到转该基因的胡萝卜组织原生质 体内，其c a t 酶活性可以抑制达9 5 t 。7 8 】。v a nd e rk r 0 1 等( 1 9 8 8 ) 将花色素合成过 程的关键酶苯基苯乙烯合成酶基因构建成反义r n a 基因，并转入矮牵牛和烟草， 使矮牵牛和烟草花冠花色素模式发生了改变。花色素模式出现三种类型，一种为花冠 基本无色素，一种为花色素明显减弱，还有一种与野生型一致，三种类型的出现是由 于花色素合成的抑制程度不同而产生的，而这种抑制程度与反义r n a 基因的表达程 1 2 度相关【7 9 1 。 目前，反义r n a 技术成为遗传改良的一个重要工具，已经广泛的应用于病毒病、 癌症、遗传性疾病等疑难疾病的基因治疗，动植物品种的改良以及生物研究方法的改 进方面，取得了令人瞩目的成就【8 0 , 8 1 , 8 2 , 8 3 】。 2 1 反义r n a 技术的操作原理 反义r n a ( a n t i s e n s er n a ) 是与某一m r n a 互补的r n a 分子。m r n a 作为信 使分子指导多肽的合成，所以被称为有义( s e n s e ) 分子，而与之互补的分子则为反义 ( a n t i s e n s e ) 分子。反义r n a 能削弱相应基因的表达，即所谓“下降性调节” ( d o w n r e g u l a t i o n ) 现象。 反义r n a 的核苷酸序列与m r n a 互补。当两者互补结合时，可阻止r n r n a 翻 译产生蛋白质。这样即使基因有活性也不会有蛋白质产物，从而抑制基因的表达，实 现删除基因的目的【7 7 】。由于反义r n a 可以特异地抑制基因的表达，因此在基因功能 的研究中有重要的意义。采用反义r n a 基因技术进行基因的“敲除”是当今基因功 能研究，基因治疗的常用方法之一。目前关于反义r n a 作用的详细分子机制尚不全 然清楚，但该方法的可行性已为很多实验所证实。 2 1 1 反义r n a 的分类 根据阻抑基因表达机理的不同，反义r _ n a 可以分为三类：第一类是能和包括 m r n a 的s d 序7 u ( 核糖体结合位点序y u ) 或编码区的靶m r n a 互补序列，并直接导致 翻译水平的抑制或靶m r n a 失去稳定性；第二类是能和m r n a 的非编码区，如s d 序列上游形成复合物，从而导致= l r i , i a 失活，属间接效应。目前只知道这类反义r _ n a 与核糖体的结合有关，但仍不了解其作为负因子的具体细节：第三类是在转录上起作 用，因此将它