（物理化学专业论文）蛋白质与羟基磷灰石表面的相互作用机理研究.pdf

摘要 摘要 随着生物、医学、材料科学的发展，蛋白质与无机材料表面的相互作用成为 很多领域的研究热点。羟基磷灰石( h a p ) 是哺乳动物骨骼和牙齿的主要无机成 分，它具有很好的生物兼容性和特殊的表面性能，因此被认为是一种极具发展前 景的生物医用材料。本论文主要采用分子动力学模拟与量子化学计算相结合的方 法，从原子尺度系统地研究了蛋白质( 主要是骨形态发生蛋白b m p 一2 和b m p 7 ) 在h a p 表面的吸附一脱附行为，探讨了蛋白质在h a p 表面的吸附机理，并对不 同蛋白质的动力学行为进行了比较分析。研究结果表明，通过表面修饰等微观尺 度的调节，有可能达到有目的地调控蛋白质在生物医学材料表面的行为。 论文主要由以下六个部分组成： 第一章，论述了本论文的研究背景与意义，并对本论文研究工作的国内外研 究现状作了综述。 第二章，介绍了本论文所采用的研究方法，包括分子动力学模拟和量子化学 计算方法。 第三章，从原子尺度上揭示了蛋白质b m p 一2 在h a p 表面上的吸附脱附机 理。研究发现，b m p 一2 与h a p ( 0 0 1 ) 晶面的相互作用存在三种吸附基团，分别 为一o h ，- n h 2 和- c o o - 。作为活性基团，它们往往与强吸电子基团( 例如 - 4 2 = 0 ) 毗邻。根据蛋白质与h a p 晶体相互作用面的不同，可能有一种或几种吸 附基团同时起作用。至于其作用原理，库仑力是一c o o - 与h a p 相互作用的主 要作用力，但是对于不带净电荷的吸附基团( 例如一o h 和一n h 2 ) 而言，水桥 氢键更为重要。量子化学的计算结果证实这种水桥氢键是存在的。 第四章，研究了不同取向的b m p - 2 在h a p 表面的吸附一脱附行为。结果表 明，蛋白质的取向对其与h a p 表面的相互作用有着显著的影响。不同取向的 b m p - 2 在h a p 表面的吸附基团的种类、数量、相互作用强度以及吸附时间都各 不相同。并且，不同取向的吸附蛋白质构象变化显著，这很有可能导致蛋白质在 摘要 生物材料表面活性的变化。值得注意的是，在吸附最强的体系i 中，b m p 2 的 构象变化并不是最大的。 第五章，研究了h a p 不同的表面构造对蛋白质b m p 7 吸附脱附行为的影 响。结果表明，相互作用能曲线可以为研究b m p 7 动力学行为提供丰富的信息。 能量曲线不仅可以半定量的体现各个体系中相互作用强度的不同，而且可以定性 地说明不同体系中吸附基团的种类、数量以及吸附时间的差异。b m p 7 与h a p 之间强烈的相互作用可以引起蛋白质结构的变化。在本章所研究的六个体系中， 蛋白质在1 0 0 + a 体系中的构型变化最大。在所有的这六个体系中，只有两类基团 可以与h a p 表面形成有效的吸附，它们是- c o o - 和- n h 3 + 或者c ( n h 2 ) 2 + 。 进一步的量子化学计算表明，在蛋白质b m p 7 吸附到h a p 表面的过程中，发生 了电子转移现象。 第六章，对不同蛋白质在h a p 表面的吸附脱附行为进行了系统的比较。主 要选取了四种在生物体内参与调控h a p 矿化与生长的蛋白质( b m p 2 、b m p 7 、 l r a p 和f n i i i l o ) 。结果表明，尽管不同的蛋白质各有其与生物材料表面相互 作用的位点与基团，但是a s p 、g l u 、l y s 和a r g 这四种氨基酸残基在各种蛋白质 中普遍被吸附到h a p 表面，所以今后在讨论蛋白质与h a p 之间相互作用的时 候，这四种残基应该着重加以关注。当蛋白质以不同的取向与h a p 表面接触时， 其具体的动力学行为各不相同，但是每一种蛋白质都会有其特定的优势作用取 向。由于蛋白质与h a p 表面的相互作用，蛋白质的构象往往会发生变化。相互 作用越强，蛋白质构象的变化往往也越明显，从而有可能导致蛋白质生物活性的 变化，应该予以特别注意。 关键词：蛋白质、骨形态发生蛋白、羟基磷灰石、吸附脱附动力学、相互作用 机理、分子动力学模拟、量子化学计算 摘要 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm e d i c i n a ls c i e n c e ，m a t e r i a ls c i e n c ea n db i o t e c h n o l o g y , t h ea d s o r p t i o nb e h a v i o r so fp r o t e i n so n t oh y d r o x y a p a t i t e ( h a p ) s u r f a c e sh a v e r e c e i v e dm u c ha t t e n t i o nd u et oi t si m p o r t a n c eo nt h ec o n t r o lo fi n t e r f a c i a lb e h a v i o ro f b i o m a c r o m o l e c u l ea n dt h ed e s i g no fb i o m e d i c a lm a t e r i a l s i nt h i s p a p e r , t h e a d s o r p t i o n - d e s o r p t i o nd y n a m i c a lb e h a v i o r so fp r o t e i n so nh a ps u r f a c e sa n dt h e i n t e r a c t i o nm e c h a n i s mw e r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l yt h r o u g ht h em o l e c u l a rd y n a m i c s ( m d ) s i m u l a t i o na n dt h eq u a n t u mm e c h a n i c sc a l c u l a t i o n a n dt h e nt h ed i f f e r e n c e s b e t w e e nf o u rt y p e so fp r o t e i n sw e r ec o m p a r e di no r d e rt of i n ds o m eu n i v e r s a l p h e n o m e n a i ti ss h o w e dt h a tt h er e g u l a t i o no ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np r o t e i n sa n d t h eh a pv i at h ec o n t r o lo nt h ea t o m i cl e v e li sp o s s i b l ei nt h ef u t u r e t h i sp a p e ri sm a i n l yc o m p o s e do ft h ef o l l o w i n gs i xp a r t s ： c h a p t e rl ：t h eb a c k g r o u n da n dm e a n i n g so ft h i st h e s i sw e r ei n t r o d u c e d ，a sw e l l a sab r i e fr e v i e wo ft h i si s s u e c h a p t e r2 ：t h em e t h o d so fm o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o na n dt h eq u a n t u m m e c h a n i c sc a l c u l a t i o nw e r ei n t r o d u c e d c h a p t e r3 ：t h ea d s o r p t i o n d e s o r p t i o nd y n a m i c so fb m p - 2o nh a p ( 0 01 ) s u r f a c e w e r es t u d i e di nd e t a i l t h r e et y p e so fa d s o r p t i o nf u n c t i o n a lg r o u p s ，旬h ，n h 2 ，a n d c o o - ，a r ef o u n df o rp r o t e i nb m p - 2t oi n t e r a c t 诵t i lh a p ( 0 0 1 ) s u r f a c e a sa c t i v e g r o u p s ，t h e ya r eu s u a l l yn e i g h b o r i n gw i t hs t r o n g l ye l e c t r o n a t t r a c t i n gg r o u p sd i r e c t l y ， s u c ha s - c = 0 a c c o r d i n gt ot h ed i f f e r e n ti n t e r f a c e sp r o t e i n se n c o u n t e r e d 诵mh a p c r y s t a l l i t e ，t h e r em i g h tb eo n eo rs e v e r a lt y p e so fa d s o r p t i o ng r o u p sw o r k i n g s i m u l t a n e o u s l y t h ea d s o r p t i o nm e c h a n i s mw a se x p l o r e di nd e t a i l i na d d i t i o nt ot h e c o u l o m b i cf o r c e ，w h i c hh a sb e e nw i d e l ya c c e p t e d ，t h ew a t e r - b r i d g e dh b o n di sf o u n d t ob ev e r yi m p o r t a n ta sw e l l f o rg r o u p sw i t hn on e tc h a r g e ，s u c ha s 加ha n d n h 2 ，i t i st h ew a t e r b r i d g e dh b o n dt h a tr e s u l t si nt h ea d s o r p t i o n t h er e s u l t so ft h eq u a n t u m c h e m i s t r yc a l c u l a t i o n sc o n f i r mt h a tt h i st y p eo fw a t e r - b r i d g e dh - b o n dd o e se x i s t c h a p t e r4 ：t h ee f f e c to fd i f f e r e n to r i e n t a t i o no fb m p 2w a ss t u d i e d i ti sf o u n d i 摘要 t h a tt h eo r i e n t a t i o no fb m p 一2p l a y sa ni m p o r t a n tr o l eo nt h ei n t e r a c t i o nw i t hh a p s u r f a c e t h et y p e sa n dt h en u m b e ro fa d s o r p t i v er e s i d u e s ，t h ei n t e n s i t yo fi n t e r a c t i o n a n dt h ea d s o r p t i o nt i m ea r ev a r i o u sa m o n gt h es i xs y s t e m s s y s t e mie x h i b i t st h e s t r o n g e s ti n t e r a c t i o n ，a n d t h en u m b e ro fa d s o r p t i v er e s i d u e sa r et h em o s t c o r r e s p o n d i n g l y t h e r e f o r e ，t h i so r i e n t a t i o nm i g h tb et h em o s tp r e f e r e n t i a lo n ef o r b m p 2t oi n t e r a c tw i t ht h eh a p ( 0 0 1 ) s u r f a c e c h a p t e r5 ：t h ee f f e c to fd i f f e r e n tt e x t u r e so fh a ps u r f a c e so nt h ea d s o r p t i o n b e h a v i o ro fb m p 一7w a ss t u d i e d 。i ti so b s e r v e dt h a tt h ei n t e r a c t i o ne n e r g yc h iv ef r o m s m ds i m u l a t i o nc a np r o v i d et h ed y n a m i cb e h a v i o ro fb m p 一7i nd e t a i l i te x h i b i t sn o t o n l yt h er e l a t i v ei n t e r a c t i o ni n t e n s i t ys e m i q u a n t i t a t i v e l y ，b u ta l s ot h en u m b e ro f d e s o r b e dg r o u p s ，t h et y p eo fd e s o r b e dg r o u p s ，a n dt h et i m eo fd e s o r p t i o n d e t a i l e d s t u d i e ss h o wt h a tt h es t r o n gi n t e r a c t i o nm i g h ti n d u c ed r a m a t i c c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e si nb m p - 7 t h el a r g e s te o n f o r m a t i o n a lc h a n g eo c c u r s i ns y s t e m10 0 + a a c c o r d i n gt ot h ed i f f e r e n tt e x t u r e so fh a ps u r f a c e s ，t h e r ea r eo n l yt w oc a t e g o r i e so f f u n c t i o n a lg r o u p s ，t h a ti s ，- c o o - a n d - n h 3 + o r - c ( n h 2 ) 2 + t h eq u a n t u mm e c h a n i c s c a l c u l a t i o n ss u g g e s tt h a tt h e r ei sap h e n o m e n o no fe l e c t r o nt r a n s f e rf r o mh a pt ot h e g r o u p so fb m p 一7d u r i n gt h ea d s o r p t i o np r o c e s s c 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o n g e r t h ei n t e r a c t i o ni s ，t h eg r e a t e rt h ec o n f o r m a t i o n a lc h a n g e sw i l lb e ，w h i c hm i g h t t h e r e f o r ei n f l u e n c et h eb i o a c t i v i t yo ft h ep r o t e i n s k e y w o r d ：p r o t e i n ，b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s ( b m p s ) ，h y d r o x y a p a t i t e ( h a p ) ， a d s o r p t i o n - d e s o r p t i o nd y n a m i c s ，i n t e r a c t i o nm e c h a n i s m ，m o l e c u l a rd y n a m i c s ( m d ) s i m u l a t i o n ，q u a n t u mm e c h a n i c s ( q m ) c a l c u l a t i o n i v 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝堑太堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：董秀确 签字日期：绷矿年彳月占日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝堑太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝江太生可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 静硇 签字日期：伽p 年月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名 电话： 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临床诊断及生物传感器材料，齿科材料等。目前较活跃的研究内容有用于人工心 脏、人工血管和人工心脏瓣膜的高抗凝血材料；用于人工骨、人工关节、人工种 植牙的生物陶瓷和玻璃；用于骨科修补及矫形外科的钛及钛合金；用于局部控制 第一章研究背景与文献综述 释放的药物载体高分子材料；用于替代外科手术的缝合及活组织结合的生物粘合 剂，以及血液净化材料等。 1 1 1 2 生物医用材料的发展简史 生物医用材料的起步很早。早在公元前5 0 0 0 年就已经用人工牙植入口腔颌 骨来修复失牙。公元前2 5 0 0 年前，中国和埃及的墓葬中就发现有假牙、假鼻、 假耳1 6 】。1 7 7 5 年，就有用金属固定体内骨折的记载，1 8 0 0 年出现大量有关应用 金属板固定骨折的报道。1 8 5 1 有人报道使用硫化天然橡胶制成人工牙托和鄂骨 【6 】。由于当时工业不发达，直到进入二十世纪，高分子材料才开始用于制备人工 器官【5 1 。二十世纪五十年代以来，生物医用材料相继用于人工心脏瓣膜、人工心 肺、人工心脏( 短期) 等f 7 】；二十世纪六十年代初，c h a r n l e y 用聚甲基丙烯酸甲 酯骨水泥固定超高相对分子质量聚乙烯( u h m p e ) 、不锈钢配对人工全髋关节 成功。生物医用材料的发展给人类健康长寿带来了福音。尤其是二十世纪中后期， 高分子工业的迅猛发展推动了生物医用材料的发展。此后，生物医用材料的设计 与制备逐渐得到了重视。 2 0 世纪8 0 年代，人类开始将生物技术应用于研制生物材料，在材料结构及 功能设计中引入活性细胞，利用生物要素和功能去构建所希望的材料，从而提出 了组织工程的概念。这标志着医学将走出组织器官移植的范畴，步入到制造组织 和器官的新时代。用组织工程原理构建的人工器官将是新兴的、划时代的、具有 完善生理功能的器官，是替代损伤器官和修复组织的最先进、最理想的方法，这 也必将对相关的生物医用材料提出新的挑战。目前，在骨组织工程方面，已经可 以在降解生物材料三维支架上种植细胞，在体内或体外培养，然后植入缺损部位 进行骨组织的修复和再生。将细胞生长因子等如骨形态发生蛋白( b m p s ) 复合 到支架上诱导具有自然骨功能的新骨再生，是新一代骨组织工程的奋斗目标。 纳米技术的兴起更为材料的发展注入了新的活力。通常意义上的纳米材料指 的是颗粒尺寸为l 1 0 0n l n 的粒子组成的新型材料。其尺寸小、比表面大及量子 尺寸效应等性质使之具有常规粗晶材料所不具备的特殊性能，在光吸收、敏感、 催化及其它功能特性方面展现出引人注目的应用前景。纳米人工骨的出现，用一 种全新的骨置换材料来取代现在冰冷的金属和脆弱的塑料等材质，为病人送去福 2 第一章研究背景与文献综述 音，目前这一技术已通过我国8 6 3 项目验收。专家认为，这种纳米材料在生物活 性、柔韧性以及强度等方面都和人体组织接近，今后将在颅骨、脊椎骨、颌骨、 肋骨、髋骨、关节及喉管支架、穿皮器件与修复领域有着十分广阔的应用。 1 1 1 3 生物医用材料的发展前景 随着材料科学、生命科学和生物技术、纳米技术的发展，人类已经开始从分 子水平上去认识材料和机体间的相互作用，构建生物结构和功能，使传统的无生 命的材料通过参与生命组织的活动成为生命组织的一部分。目前生物医用材料研 究的重点是在保证安全性的前提下寻找组织相容性更好、可降解、耐腐蚀、持久、 多用途的生物医用材料，具体体现在以下几个方面： 一是提高生物医用材料的组织相容性。生物材料的相容性是指材料与人体之 间相互作用后产生的各种复杂的生物、物理、化学等反应。这是任何生物医用材 料必须满足的性质。其测试标准主要是1 9 9 2 年国际标准化组织( i s o ) 制定并 发布的医用装置的生物学评价标准( i s 0 1 0 9 9 3 1 9 9 2 ) ，现己被各国采用。我国医 疗器械生物学评价标准g b 、t 1 6 8 8 6 于1 9 9 7 采用了上述国际标准，保证我国生 物医用材料和医疗器械使用的安全性。 二是生物医用材料的可降解化。随着组织工程的发展，人们逐渐开始利用可 降解和吸收的材料来构建人体的组织或器官。生物降解材料就是适应这一新形势 的需要而发展起来的，主要是指那些在完成使命后会自动分解成无毒无害的物质 从体内排出的材料。例如，用可降解的聚乳酸及其共聚物制成支架，使成骨细胞 在其表面生长，骨细胞生长成熟后形成新的软骨或骨，聚乳酸的三维支架也就自 动降解排出体外。 三是生物医用材料的生物功能化和生物智能化。这主要是利用细胞学和分子 生物学方法将蛋白质、细胞生长因子、酶及多肽等固定在现有材料的表面，通过 表面修饰构建新一代的分子生物材料，来引发我们所需的特异生物反应，抑制非 特异性反应。例如生物体中细胞能分泌出特有的细胞外基质( e c m s ) 。细胞与 e c m s 组成一个物质、能量和信息传递的开放体系，构成要素间存在多重相互作 用。深入了解生物大分子间的协同相互作用，模仿其协同行为来构思生物医用材 3 第一章研究背景与文献综述 料，可使材料具有所期望的宿主响应，即实现智能化。 四是开发新型医用合金材料。在所有生物医用植入材料中，金属材料应用最 早，而且在临床中的应用也最为广泛【引。因此开发具有优异生物相容性和耐腐蚀 性的医用合金材料将具有重大的意义。近年来，西北有色金属研究院研制出了一 种性能优良的新型医用1 3 钛合金( t z n t 合金) 。该合金不含毒性元素，而且具 有良好的生物医学相容性、综合机械性能以及耐腐蚀性【9 1 。从金属植入材料的研 究现状来看，近些年发展起来的新型1 3 钛合金具有其它材料无可比拟的优越性。 因此，开发研究更适合临床应用的新型1 3 钛合金将成为金属植入材料的一个主要 发展方向。 五是作为研究热点的纳米生物材料。目前取得实质性进展的是纳米控释技术 和纳米颗粒基因转移技术。智能性药物释放是今后研究的重要方向，它可随外界 条件的要求和变化释放药物。如p h 敏感释放可在酸性介质中保持稳定而在碱性 环境中控制释放；温度敏感水凝胶可在不同温度下快速释放、慢速释放或不释放。 我国生物医用材料的研究虽然取得一些令人瞩目的成果，但整体水平不高， 跟踪研究多，源头创新少。结合我国国情和学科发展趋势，中国生物材料联合会 副主席、南开大学教授俞耀庭先生提出，我国应该在以下五个方面丌展重点研究： 一是生物结构和生物功能的设计和构建原理研究，二是表面界面过程材料与机 体之间的相互作用机制研究，三是生物导向性及生物活性物质的控释机理研究， 四是生物降解吸收的调控机制研究，五是材料的制备方法学和质量控制体系研 究。上述研究的开展，将使我国生物材料的研究水平有较大提高，为我国生物医 用材料科学及其产业的发展奠定坚实的基础。 1 1 2 蛋白质在生物材料表面的吸附 在生物体系中，大量的现象与应用都与蛋白质在生物材料表面的吸附有关。 例如血浆蛋白在医用材料表面的沉积以及随后产生的生物学响应、船体外壳的细 菌污垢以及生物分离过程中过滤膜的阻塞等，这些都是蛋白质在材料表面吸附所 产生的负面影响；而食物稳定剂中所使用的大量蛋白质以及蛋白质在生物传感器 中的应用等则是充分利用了蛋白质的吸附作用。 4 第一章研究背景与文献综述 蛋白质与生物材料表面的相互作用不仅仅是一种很重要的普遍现象，而且也 是生物材料以及生物仪器设备设计的关键。在生物材料领域，蛋白质的吸附是植 入设备以及植入材料与组织相互作用的第一步【1 0 】。例如纤维蛋白原等可以影响 到白细胞、巨噬细胞以及血小板的粘附，从而最终导致它们的表面纤维化( f i b r o u s e n c a p s u l a t i o n ) 1 2 0 , 2 。在纳米技术中，蛋白质表面的相互作用是界面蛋白质仪器 组装的关键，这些仪器包括生物传感器、触媒剂以及其它一些生物电子连接处 的组分。对蛋白质与生物材料表面相互作用的机理研究对这些领域意义深远，对 特定的蛋白质一表面相互作用的驾驭能力将直接影响到纳米尺度生物材料以及生 物纳米装备技术的发剧】。为了达到这个目的，我们首先就要对蛋白质的基本知 识有所了解。 1 1 2 1 蛋白质概述 蛋白质是由氨基酸组成的、具有复杂结构的生物大分子。它是构成生物体的 基本物质之一。从简单的病毒到高等动物乃至人类，无不含有蛋白质。人体含蛋 白质多达十万种以上，按总量计占人体干重的4 5 ，各组织中的含量约为1 7 2 0 ，它们在人体生长、发育、繁殖、遗传等生命活动中起着极为重要的作用。 几乎所有的生命现象和生理功能都是通过蛋白质来实现的，所以蛋白质又是生命 活动的主要物质基础。凡是有蛋白质的地方，就一定会有生命存在。整个生物界 可能存在一百亿种不同的蛋白质，致使生物体表现出千差万别的生命现象。 结构决定功能。因此不仅要了解蛋白质分子的氨基酸组成和排列顺序，还必 须了解蛋白质分子中多肽链是如何卷曲折叠而形成空间构象的。蛋白质分子中氨 基酸的组成和排列顺序就是其一级结构。一级结构是蛋白质的基础结构，它决定 了蛋白质的三维结构，对它的研究是对蛋白质结构与功能的研究基础。除了上述 的一级结构之外，蛋白质还有二级结构( a 螺旋、p 一折叠、d 转角和无规则卷曲) 、 三级结构( 在二级结构基础上形成的很不规则的构象) 和四级结构( 由两条或两 条以上的具有三级结构的多肽链聚合而成的特定的构象) ，这三种结构统称为蛋 白质的三维结构，也叫做构象，它决定着蛋白质分子的形状、理化性质和生物活 性。图1 1 中给出了蛋白质的基本结构【1 2 】。一旦三维结构遭到破坏，蛋白质的功 能将随之丧失。维持蛋白质分子构象的化学键主要是一些次级键，如氢键、疏水 5 第章研究背景与文献综述 键、二硫键、盐键、配位键和范德华力等。这些键中的一种或者几种将影响到蛋 白质在生物材料表面的吸附过程。尽管不是每种蛋白质都包含上述所有键，但是 对于任何一种蛋白质由于其固有的氧基酸结构，在15 4 lc m “( a m i d ei i ) 和1 6 4 2 c m 1 ( a m i d ei ) 跗近都有较强的吸收峰。蛋白质的这些不同级别的构蒙是可以互 相转变的，但是一旦蛋白质的构象发牛了变化，往往就会伴随着生理机能的改变。 能导致蛋白质构琢发生变化的因素很多，例如温度、溶液d h 或组成以及蛋白质 在材料表面的吸附等等。 氟基酸 螺旋 多肚链 日l 台哑组 黔譬二嗡 一锰结梅二墟嫱掏三锺结丰每 固缀结秘 例蚩自质的基本结构 1 i 2 2 蛋白质在生物材料表面的吸附及其模型 一般而苦，蛋白质在材料表面的吸附主要分为三大步，一是蛋白质分子扩散 到材料表面，二是蛋白质分子吸附到材料表而的活性位点，三是蛋白质分r 在吸 附之后发生结构重整。蛋白质吸附到材料表面之后，其活性和溶液状态时不同。 首先，吸附可以导致蛋白质溶液局部浓度较高，而蛋门质的功能又往往与浓度相 关。其次，由于吸附位点可能正好位于蛋白质的活性中心，所以，吸附之后蛋白 质的反应活性有可能发生变化。最厉，蛋一质总是通过与材科表面发生相互作用 才产生吸附现缘的，此作用 往会导致蛋白质的变性，从而使蛋白质增强或失去 原有功能或者产生额外的功能。蛋白质与材料表面的相互作用一般包括静屯力、 第一章研究背景与文献综述 氢键以及范德华力，其能量从前往后依次减小。不同的蛋白质具体以何种方式与 材料表面相互作用，这取决于蛋白质和材料自身的性质。由于蛋白质的吸附是一 切生物材料生理反应的开始，所以，在分子生物学领域，微观尺度下的蛋白质吸 附问题已经日益成为研究热点之一。其重要性主要体现为：l 。调节细胞吸附； 2 激发生物体系列反应，产生排异反应；3 诊断分析传感装置的设计和使用的 关键；4 诱发其它的生物吸附，比如：血液中的沉积现象、蛋白污染、细菌粘 附等。目前对吸附蛋白的测量主要分为量化技术和动力学技术。量化技术包括标 记方法、表面h p l c 、x p s 信号强度和椭圆光度法等。其中标记方法最为常用， 例如采用放射性同位素与特殊的氨基酸残基结合的放射性同位素标记法、荧光标 记、染色等。常见的动力学技术包括原位椭圆光度法、表面细胞质基因共振法等， 因为都需要进行“模型”处理而限制了其实际应用。 在蛋白质所有的吸附模型中，最简单的一种是朗缪尔吸附模型( 图1 2 a ) ， 它可以应用于众多可逆吸附过程，例如二元混合物稀释组分的表面层析、气体的 表面物理吸附以及可逆生物分子作用( 例如受体一配体键合) 等。蛋白质等生物 分子与材料表面的朗缪尔吸附模型与化学反应动力学类似，我们假设：一个蛋白 质分子只占据一个表面位点( 可包含多重次价键) ，若以p 代表吸附的蛋白质， s 代表材料表面的空白位点，p s 代表材料表面被蛋白质占据的位点。那么蛋白 质在材料表面的吸附可以表示为： p + shp s 假设反应遵循级反应动力学： 则： 吸附率= 【p 】【s 】，脱附率= k d 【p s 】 上面式子中【p 】为蛋白质浓度，【s 】为空白表面位点的密度，【p s 】为被蛋白 占据的位点密度。 平衡时：吸附率= 脱附率， 【p 【s 】= 坝p s 】 假设过程可逆，则可以定义一个关系常数k = 如幻= 【p 】【s 】【p s 】，此常数也 7 第一章研究背景与文献综述 可称为“键合或“缔合 常数，是吸附程度的一个指标；常用单位为l t o o l 。 定义常数y = 占据的位点数总位点数，则 v ：【竺! ：旦 s 】- 4 - 【p s 】k “p 】 当，= 1 时，为单分子层覆盖。 在吸附实验中，通常测量的是表面浓度例如n g c m 2 或者l l g c m 2 ，常表示成 厂或口。假设在厶甜时是单层覆盖，就能计算出每个蛋白质分子在材料表面的有 效面积。 锄= 瓦m p e r o t e j n 需要注意的是，朗缪尔模型只适用于可逆过程，在很多方面不能应用于蛋白 吸附，所以还存在其它一些蛋白质吸附模型，例如竞争吸附、不可逆吸附、重建 和多层的形成【i3 1 。竞争吸附是指当存在许多不同种类的蛋白质时，各种蛋白质 吸附量的多少，取决于各蛋白质与材料表面作用力的强弱，强者的吸附量大，如 图1 2 b 所示( 其中不同的颜色代表不同种类的蛋白质) 。不可逆吸附是指吸附 的蛋白质虽然长时间暴露在蛋白质溶液中，但是并不脱附的现象。发生不可逆吸 附时，吸附分子常与吸附剂表面形成化学键，吸附分子的性质往往会发生变化。 图1 2c 给出了发生不可逆吸附时，吸附量与吸附时间关系的示意图。重建是指 达到单层饱和吸附的蛋白质分子层能够在材料表面重组( 例如：结晶) ，产生阶 梯等温线，如图1 2 d 所示。所谓多层的形成是指材料表面在吸附一层蛋白质分 子之后，还能够再吸附溶液中的蛋白质分子，从而形成蛋白亚分子层，得到复杂 的吸附结构( 图1 2e ) 。 8 第一章研究背景与文献综述 ， - ， !硷 筐憋隧凌物隧隧 a 朗缨尔吸附模玳b 竞争吸附 吸附时间 d 重建 吸附时间 c 不可逆吸附 吸附时间 e 多层的形成 图i2蚩f l 质柏，生物材村嵌面的箨种吸附模 o 示意h 1 1 3 羟基磷灰石( h a p ) 二十世纪生物材料学取得了飞速发展，无机生物医用材料的研究及其应用 十分活跃，其中备受关注的是羟基磷版石( h y d r o x y a p a t i t e 简称h a p ) 活性陶 瓷材料的研究和临床应用。 1 1 3 1 羟基磷灰石简介 羟基磷扶石理论组成为c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 ，c a p 比为1 6 7 。h a p 晶体为六方品 系，属l 6 p c 对称型，p 6 3 m 空间群，其结构为六角柱体，与c 轴垂直的面是一 个六边形，a 、b 轴夹角1 2 0 。，品胞参数a 0 = 0 9 4 3 0 9 3 8n m ，c o = o6 8 8 0 6 8 6 t a m ， 单位品胞含有l o 个c a 2 - 、6 个p 0 4 和2 个o h 。其中o w 位于晶胞的4 个角 上，l o 个c a 2 + 分刖占据两种位冒；4 个c a 2 + 占掘c a ( j ) 位置，即z = 0 和z = 1 2 卜 取= | ，谊 凰等盎一。一 一 一 量 ， 一沙答 第一章研究背景与文献综述 位置各2 个，该位置处于6 个o 组成的c a o 八面体的中心；6 个c a 2 + 处于c a ( ii ) 位置，即z = 1 4 和z = 3 4 位置各有3 个，处于3 个o 组成的三配位体中心。6 个p 0 4 3 。四配位体分别位于z = 1 4 和z = 3 4 的平面上，这些p 0 4 3 四面体的网络 使得h a p 结构具有较好的稳定性【1 4 1 。 h a p 的表面性能取决于其结构，表面主要存在两种吸附位置。当o 盯位于 晶体表面时，该位置联结着2 个c a 2 + ，在水溶液中，表面的o w 至少在某一瞬 间空缺，由于2 个c a 2 + 带正电，形成一个吸附位置。同理，当表面的c a 2 + 在某 一瞬间空缺时，表面形成另外一个吸附位置，而该位置带负电荷，能吸附s p 等 阳离子和蛋白质分子上的基团。h a p 表面水化层通过氢键与水有较好的相容 性，在水中的表面能较低，能长时间保持细小的分散状态。 h a p 是人体骨骼中的主要无机成分，其理论密度为3 1 5 6g c m 3 ，折射率为 1 6 4 1 6 5 ，莫氏硬度为5 ，微溶于水，呈弱碱性( p h = 7 9 ) ，易溶于酸而难 溶于碱。h a p 是强离子交换剂，分子中的c a 容易被c d 2 + 、h 9 2 + 等有害金属离 子和s p 、b a 2 + 、p d 2 + 等重金属离子交换，还可与含有羧基的氨基酸、蛋白质及 有机酸等发生交换反应。h a p 在人骨中的质量分数约6 5 ，在人的牙釉质中的 质量分数则在9 5 以上。近年来的研究表明，h a p 的许多特性与其粒径大小密 切相关。当粒径为l 1 0 0n i l l 时，其纳米粒子与普通的h a p 相比具有不同的理 化性能，如溶解度较高、表面能较大、吸附性更强、生物活性更好等。 1 1 3 2 羟基磷灰石的应用 植入材料羟基磷灰石具有良好的生物活性和生物相容性1 1 4 , 1 5 ，常规的高温、高 压灭菌操作后不改变其物理性质；植入人体后对组织无刺激和排斥作用，不引起 炎症反应，不会改变正常组织的矿化过程，能与骨形成很强的化学结合。另外， h a p 在体内降解缓慢，是常用的生物活性骨替代物。植入体内后，在体液的作 用下，它自身所含有的钙和磷会游离出材料表面，被机体组织所吸收，并能与人 体骨骼组织形成化学键，生长出新的组织