（植物学专业论文）龙胆八氢番茄红素合成酶（psy）基因的克隆与功能分析.pdf

摘要 类胡萝卜素是一系列呈现黄色、橙色和红色的萜类色素物质，存在于所有的光合器 官中并具有抗氧化的特性，但动物体内不能直接合成类胡萝卜素，必须从食物中摄取。 近年研究表明，除了含有b 紫罗酮环的类胡萝卜素是维生素a 的前体外，许多其他类胡 萝卜素在增加动物营养、增强人体免疫力等方面起到重要作用，另外由于它能清除细胞 内的活性氧自由基，所以类胡萝卜素在防癌抗癌方面的功效也越来越受到重视。八氢番 茄红素合成酶是催化类胡萝卜素生物合成的一个特异性酶，它将2 分子的栊牛儿栊牛儿 焦磷酸( g g p p ) 催化合成第一个类胡萝卜素八氢番茄红素。研究表明八氢番茄红素合 成酶基因是类胡萝卜素生物合成途径中的限速酶。在番茄、油菜、拟南芥和马铃薯中过 量表达八氢番茄红素合成酶，相应组织中积累类胡萝卜素的水平显著提高，在番茄果实 中提高了1 9 倍，拟南芥种子中b 胡萝卜素平均提高4 3 倍，油菜种子中提高5 0 倍，马铃 薯块茎中提高了8 倍。 本研究应用分子生物学技术从龙胆( g p ，z f 砌，2 口z “纪口) 花瓣c d n a 文库中克隆到八氢番 茄红素合成酶2 和3 ( g l p s y 2 和g 1 p s y 3 ) 基因( c d n a ) ，经序列比对分析发现其与g l p s y l 基因有高度同源性但又不完全相同。g l p s y 2c d n a 核苷酸序列总长度为1 9 2 3b p ，含有 一段1 2 7 5b p 的不间断开放阅读框( 0 i 讧) ，4 9 7b p 的57 末端和1 5 1b p 的37 末端非编码区，在 位于1 7 7 0b p 的终止密码子( t a a ) 与多聚腺苷酸之间有p o l y ( a ) 添加信号( a a t a a ) ，位于 1 8 3 3 1 8 3 7b p 。编码区起始于4 9 8b p 处起始密码子( a t g ) ，0 砌? 编码一个含4 2 4 个氨基酸 残基的蛋白质，分子量为4 8 2 9 8 6 5d ，等电点为8 7 9 。g 1 p s y 3c d n a 核苷酸序列总长度 为1 7 6 5b p ，含有一段1 2 7 8b p 的不间断开放阅读框( o i u ) ，3 9 9b p 的57 末端和8 8b p 的3 末 端非编码区，在位于1 6 7 5b p 的终止密码子( t g a ) 与多聚腺苷酸之间有p o l y ( a ) 添加信号 ( g a t a a a ) ，位于1 7 4 5 1 7 5 0b p 。编码区起始于3 9 9b p 处起始密码子( a t g ) ，0 i 强编码一 个含4 2 5 个氨基酸残基的蛋白质，分子量为4 8 3 9 9 7 5d ，等电点为8 7 9 。 构建p u c g l p s y 2 和p u c g l p s y 3 表达载体，将p u c p s y 质粒与缺失八氢番茄红素合 成酶( c 佃) 基因的工程大肠杆菌p a c c 啦5 c n b 共转化进行互补实验，得到呈现出明 显黄色的单克隆菌株，通过高效液相色谱分析，鉴定转化菌株的代谢产物为玉米黄质等 类胡萝卜素。另外，我们将p u c p s y 质粒转入工程大肠杆菌p a c c n e ( 在大肠杆菌中可 合成栊牛儿栊牛儿焦磷酸，g g p p ) 中。通过高效液相色谱分析，鉴定转化菌株经过量 表达得到的代谢产物为八氢番茄红素，证明g l p s y 2 和g l p s y 3c d n a 编码的蛋白都具 有八氢番茄红素合成酶活性。 关键词：龙胆；类胡萝卜素；八氢番茄红素合成酶；玉米黄质 i i a b s t r a c t c a r o t e n o i d sa r eo n eo fm o s ta b u n d a n tc l a s s e so fn a ：t u r a lc o m p o u i l d s ，o r e nm 曲l yc o l o r e d 谢t 置1 y e l l o w ， o r a n g e o r r e d ， d 甜v e d舶mi s o p r e n o i d s t h e ya r e s y n t h e s i z e di n a 1 1 p h o t o s y n t l l e t i co r g 砌s m s ，a sw e l la u ss o m eb a c t e r i 岛如n g i 趾da l g a e t h e ya c c u m u l a t ei nt h e c 1 1 l o r o p l a s t so fl e a v e sa i l di i ln l ec 1 1 r o m o p l a s t so fm 锄l yn o w e r sa 1 1 df r 血t s c a r o t e n o i d sh a v e 劬d 锄e n t 出r o l e si i lh 啪锄n 嘶t i o na sa n t i o x i d a n t sa r l dv i t 锄i 1 1a p r e c u r s o r s nh a sb e e n d e m o l l s 仃a t e dt l l e i rc o n s 啪m i o ni si n c r e a s i l l ga l s s o c i a t e d 丽t hp m t e c t i o n 仔o mad i v e r s eo f d i s e a l s e s a i l i m a l sa n dl m m a r 塔a r eu na _ b l et os y r l t l l e s i z ec a r o t e n o i d s 如，2 d v da i l dm u s td e p e n d o nd i e t a d rc a r o t e n o i d s t h u st l l e ym u s ta c q u i r - e 廿l e m 丘- o mm e i rd i e t t h ef i r s tc o m m i t t e d s t 印 i i lm ep l 刎d - l o c a l i z e dc a r o t e n o i db i o s y n t h e t i cp a t h w a yi sm e d i a t e db yt h en u c l e 册e n c o d e d p h y t o e n es y m h a s e ( p s y ) nh a sb e e nd e m o n s t r a t e dp s yi s 也ek e ye n z ) r i n e1 i m i t i i l gi n c a r o t e n o i db i o s y n t l l e s i si 1 1t o m a t o 仔u i t ，c a n o l as e e d s ，p o t a ：t ot u b e r s ，4 ，口6 蚴话f 施，f 口船口 s e e d s ，g 册蹴嬲胁胞口n o w e rp e t a l sa l l dm a i z ee n d o s p e n n t h es o l eo v e r e x p r e s s i o no f p h ”o e n es y n t h a u s eh a sap o t e n te 晚c to nc a r o t e n o i dl e v e l s 访s t o r a g eo 玛a i l sg e n e r a l l y ，e g r e s u l t 血gi i la1 9 一f o l di n c r e a s ei nt o m a t of m i t s ，a5 0 - f o l dm c r e a s ei nc a i l o l as e e d s ，a4 3 f o l d i 1 1 c r e a s ei i l 彳阳6 蛳西s e e d sa n da8 - f o l di n c r e a s ei 1 1p o t a t ot u b e r s 1 1 1t h ep r e s e n ts t u d y ，t l l ep h y t o e n es y n t h a s e ( p s y ) 2a i l d3c d n a sw e r ec l o n e d 矗o m n o w e rp e t a lc d n al i b r a d ，o fg p 玎f 切，2 口，”纪口t h eg ，甜纪口p s y 2 ( g l p s y 2 ) a n dp s y 3 ( g 1 p s y 3 ) c d n ah 面n i l a t i o nw e r ed e p o s i t e di 1 1n c b i ( n a t i o 蹦c e n t e rf o rb i o t e c h n 0 1 0 9 y i i l f o m a t i o n ) g e n b a n k ( a c c e s s i o nn u m b e r s ：e f 2 0 3 2 5 9 锄de f 2 0 3 2 6 0 ，r e s p e c t i v e l y ) t h e 伽l - l e n g t l lo fn u c l e o t i d es e q u e n c eo fg l p s y 2c d n ac o n s i s t e do f19 2 3b p 、) r i ma12 7 5b p o p e nr e a d i n g 脑n e ( o r f ) ，a4 9 7b p5 t i 铘i 血l a la i l da151b p3 t e n l l i n a ln o n c o d i l l gr e g n s ， r e s p e c t i v e l y 。n l ed e d u c e d 锄i i l oa c i ds e q u e n c eo fg l p s y 2c d n aw a sap 0 1 y p e p t i d eo f4 2 4 a m m oa c i dr e s i d u e sw i mm o l e c u l a rw e i g h to f4 8 2 9 8 6 5d t h ef u l l - l e n g t ho fn u c l e o t i d e s e q u e n c eo fg l p s y 3c d n a 、瑚17 6 5b p 谢t 1 1a12 7 8b po p e nr e a d i n g 行锄e ( o r f ) ，3 9 9b p5 t e 删锄d8 8b p3 t e m i n a ln o n - c o d i n gr e g i o n s ，r e s p e c t i v e l y ，n l ed e d u c e da m i n oa c i d s e q u e n c eo fg l p s y 3c d n aw 2 l sap o l y p 印t i d eo f4 2 4a i l l i n oa c i dr e s i d u e sw i t l lm o l e c u l a r w e i g h to f4 8 3 9 9 7 5d 1 1 1 ei s o e l e 嘶cp o no f b o 也o fg l p s y 2a i l dg l p s y 3w a s8 7 9 t h e 1 1 1 g l p s y 2a 1 1 dg l p s y 3a 血oa c i ds e q u e n c e sh a v e1 1 i 曲e ri d e m i t i e s 埘t l ll 【i l o w n 缸1 c t i o n a l p s ys e q u e n c e s 行0 mh i g h e rp l a n t s t h ei n d i c a t e d 劬c t i o no fg ，“f p 口p s y 2a n dp s y 3 c d n a sw a se s t a b i l i s h e db yh e t e r o l o g o u sc o m p l e m e i 慨i o ni i le n g i l l e e r i n ge f c 忍p ，七办砌，f k e yw o r d s ：g p 玎砌阳胁p 口；c a r o t e n o i d s ；p h y t o e n es ”m 粥e ；z e a x a d t h i l l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：日期：矽堡161 乡 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文储躲越 日期：也望垒：乡 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名： 日 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 引言 一、类胡萝l 、素简介 1 类胡萝卜素的结构与功能 类胡萝卜素是一类广泛存在于自然界的脂溶性色素，具有7 5 0 多种不同的结构【l 】。 除八氢番茄红素、六氢番茄红素等几种类胡萝卜素无色外，绝大多数类胡萝卜素呈黄色、 橙色或红色，从而赋予植物花、果实等器官以绚丽的色彩【2 】。所有进行光合作用的有机 体都能够合成类胡萝卜素，尤其在由黄色向红色转变的水果、蔬菜和花卉中。一些具有 特殊颜色的鸟类、昆虫和海洋无脊椎动物体内也含有这类色素【3 】。类胡萝卜素是四萜的 衍生物，镶嵌于叶绿体和有色体膜中，一般是由8 个异戊二烯单位集合在一起构成的类 异戊二烯，含有多烯的长链是其最显著的分子特点，能够延伸出3 至1 5 个共轭双键【4 】。 发色团的长度决定了类胡萝卜素分子的吸收光谱，从而显示出肉眼可以分辨的颜色。所 有类胡萝卜素的差异都是由于含有不同末端基团，环上不同位置的氢原子可被氧基、羟 基、环氧基等代替，从而形成了各种类胡萝卜素衍生物由黄至红的颜色和各异的功能。 如p 胡萝卜素中含有两个b 紫罗酮环，能够在动物体内转变成维生素a 【5 1 。 在植物中，类胡萝卜素在叶绿体中参与光合作用，他们担当叶绿体光合天线的辅助 色素，帮助叶绿素接收光能：另一方面，它们在高温、强光下能通过叶黄素循环，以非 辐射的方式耗散光系统i i 口si i ) 的过剩能量保护叶绿素免受破坏【4 】。植物激素脱落酸 ( a b a ) 能促进脱落、休眠等作用，在逆境中还能促进气孔关闭、提高抗逆性，是植物体 中重要的激素，脱落酸的前体就是类胡萝卜素。 近年来，类胡萝卜素在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌 等保护人类健康方面所起的作用越来越受到人们的重视。如玉米黄质具有较强的抗氧化 能力，能够淬灭单线态氧，清除自由基，保护机体组织细胞，降低某些疾病的发病率， 尤其在抑制衰老引起的视黄斑退化和白内障等眼疾方面起重要作用【6 】。类胡萝卜素在人 体中的重要作用早有认识，b o n e 等研究发现玉米黄质和叶黄素的混合物不但构成了人 类视网膜黄斑，这些色素还分布于眼球晶状体中，猝灭单线态氧，间接地减少晶状体蛋 白的分解，从而防止白内障的形成【6 l 。不断有人关注这一领域的研究，l a l l d m m 等人发 东北师范大学硕士学位论文 现人类眼底中存在高浓度的玉米黄质，在光线到达视杆细胞和视锥细胞之前必须先通过 高浓度的玉米黄质层，玉米黄质作为光吸收剂保护黄斑免受氧化损伤，保护着人类的健 康【刀。 一 对比食用蔬菜和水果中类胡萝卜素的含量，发现番茄红素和玉米黄质的分布最为局 限，而它们在增强免疫力、预防疾病等方面却有着不可替代的作用【8 1 。由于胡萝卜素主 要存在于新鲜蔬菜和水果中，人体及动物自身不能合成，因此从自然界中寻找富含类胡 萝卜素的植物资源，并研究其形成与代谢的调控机制正日益受到人们的重视。相关的大 量研究一般集中在克隆类胡萝卜素合成相关基因，也有研究者关注调节类胡萝卜素形成 及其在植物中的积累过程。 2 类胡萝卜素生物合成途径及其关键酶基因 类胡萝卜素是由类异戊二烯聚合而成的萜类化合物，生物合成的前体是含有5 个碳 的异戊二烯焦磷酸( i p p ) ，它还参与合成植物激素如赤霉素、细胞分裂素等，又被称为“活 跃异戊二烯”。绝大多数类胡萝卜素是由8 个i p p 单位聚合而成的，含有4 0 个碳的碳氢四 萜类( 胡萝卜素) 及其含氧的衍生物。i p p 在i p p 异构酶( i p p i ) 作用下，异构化生成二甲 基丙烯焦磷酸( d m a p p ) ，两者水平处于动态平衡。在栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合酶 ( g g p s ) 催化下，d m a p p 与3 个i p p 分子缩合而生成含有2 0 个碳的栊牛儿基栊牛儿基焦磷 酸( g g p p ) 驯。两分子栊牛儿栊牛儿焦磷酸在八氢番茄红素合成酶( p h y t o e n es y n t h 2 l s e ， p s y ) 的作用下首首相接，释放焦磷酸后生成八氢番茄红素【4 】。它先以1 5 顺式异构体的形 式出现，随后转变为全反式异构体【3 】。这是植物类胡萝卜素生成途径中第一个4 0 碳的类 胡萝卜素，在这一基础上经脱氢、环化等作用能够形成各种其它类胡萝卜素。 八氢番茄红素在八氢番茄红素脱氢酶( p h ”o e n ed e s a t u r a l s e ，p d s ) 作用下生成胡萝 卜素，然后在一胡萝卜素脱氢酶( c a r o t e n ed e s a ：t l l r a s e ，z d s ) 的作用下生成番茄红素 ( 1 y c o p e n e ) 【9 l0 1 。p d s 与z d s 是两个植物脱氢酶，它们催化形成四个双键，使生成的八氢 番茄红素形成番茄红素，而c r t i s o 催化番茄红素的顺反异构体，最终全部形成反式番 茄红素【1 1 - 14 1 。 植物类胡萝卜素生物合成途径由此出现重要的分支：一支在番茄红素e 环化酶 ( l y c o p e n e c y c l a u s e ，l y c e ) 和番茄红素b 一环化酶( l y c o p e n eb - c y c l a s e ，l y c b ) 的共 同作用下形成c 【胡萝卜素，迸一步形成0 【隐黄质、辛黄质、叶黄素等；另一支在l y c b 基 因单独作用下把番茄红素进行b 环化，形成b 一胡萝卜素即维生素a 前体，在胡萝卜素 2 东北师范大学硕士学位论文 b - 羟化酶( b c a r o t e n eh y d r o x y l a s e ，b c h ) 作用下形成b - 隐黄质、玉米黄质、堇菜黄质等 类胡萝卜素( 图1 ) 【l 】- 1 4 1 。 c h ：乏竺a 。：一譬。：一。一 一。一 c h 22 c a 1 2 一c l l ：一0 一t 眇一。一心j 异戊烯焦磷敞 上g g p s a - k 、姒o p p 栊牛儿健牛几焦磷酸 p s y 八鬟是人 人黑1 1 b 。 l 一一一 人，“人人、a 、 i c k lj s u - 胡萝卜素 z d s 叶黄素 图1 植物中类胡萝卜素的生物合成途径 缩写词：g g p s ：栊牛儿栊牛儿焦磷酸合成酶；p s y ：八氢番茄红素合成酶；p d s ：八氢 番茄红素脱氢酶；z d s ：- 胡萝卜素脱氢酶；c i 玎i s o ：类胡萝卜素异构酶：l y c b ：番 茄红素p 环化酶；l y c e ：番茄红素- 环化酶；b c h ：p - 胡萝卜素羟化酶；e c h ：一胡萝 卜素羟化酶。红色示意化学键发生变化的位置。 3 类胡萝卜素生物合成相关基因的研究与应用 类胡萝卜素合成酶是由细胞核基因编码的，翻译成蛋白后转运至质体中，从而参与 类胡萝卜素的生物合成【1 5 】。早在1 9 5 0 年，p o r c e r 和l i n c o l n 就提出了高等植物类胡萝卜 素合成途径。由于类胡萝卜素生物合成酶主要位于膜上、量少，且在体外不稳定，所以 类胡萝卜素生物合成酶的纯化比较困难。加m s t r o n g 等用功能互补实验从一种光合细菌 红荚膜细菌( r 办d 如6 口c 据，- c 卿“肠f 螂) 中分离出类胡萝卜素生物合成基因【1 6 1 。日本的 m i s a 、v a 等从噬夏孢欧文氏菌( 西w 砌记 ，p 如v d 阳) 中克隆得到一系列基因，它们在类胡萝 卜素生物合成途径中起作用【1 7 】。在噬夏孢欧文氏菌中以州基因簇表示在工程大肠杆菌 3 东北师范大学硕士学位论文 ec d ，f 中合成类胡萝卜素的酶基因( 图2 ) 。 = ：补嘏 = 素一例， 懈黄腼6 0 竺，州 血黻餍。焱麓渺 与高等植物类胡萝卜素生物合成途径显著不同的是，植物中有p d s 、z d s 、c i 盯i s 0 三个酶参与番茄红素的合成，而在菌类中八氢番茄红素的整个脱氢化的过程只有c r 一 个酶参与催化反应，形成四个双键，直接生成全反式番茄红素【18 1 。另外，细菌中含有植 物中没有的玉米黄质葡糖基转移酶( 仃啪，催化玉米黄质迸一步糖基化生成玉米黄质 p d 半乳糖苷【1 9 】。 a t g a t gg t g 13 9 8 4 61 3 4 9 骘睦 a t g 2 5 0 6 图3p a k 3 2 菌株 a t g 4 0 0 8 i p a k 3 2 东北师范大学硕士学位论文 m i s a w a 等通过产黄农杆菌似即概绾r f 姗z 口姗册砌c 聊z ) 的实验，发现在生成类胡萝卜 素的基因簇中包括5 个功能基因，按仃f 形c 呢c 玎e 仃以c 加的顺序排列( 图3 ) 。由 此构建出一系列生产类胡萝卜素的工程大肠杆菌，除两端各有一个召口聊h i 酶切位点外， 中间还含有多个其他酶切位剧1 9 1 。把这些片断分别插入p b l u e s c r i p ti ik s ( + ) 载体，并在 质粒上游构建乳糖启动子( p 肠c ) 。研究者把这些质粒转入工程大肠杆菌中进行功能分析， 积累色素后用色谱分析和分光光度法分别验证了这些洲基因的功能。由此衍生出携带 单个类胡萝卜素合成基因的一系列菌株，如p u 0 2 ，p 址3 2 5 ，p a k 3 2 4 ，p a k 3 2 3 等菌 株【l9 1 。 近年来类胡萝卜素生物合成基因的分离与功能鉴定，为应用基因工程技术改变植物 体内类胡萝卜素成分和提高类胡萝卜素含量提供了新的基因资源，有关类胡萝卜素合成 的生物化学及其在体内调控研究的新进展，使通过遗传操作调控植物体内类胡萝卜素生 物合成途径成为可能。研究者们做了大量的工作，以提高类胡萝卜素在农作物及食品中 含量。 二、p s y 基因的研究进展 p s y 是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键调节酶，其编码基因成为应用植物基 因工程技术改善转基因植物中类胡萝卜素含量首选的目的基因。在一些模式植物中， p s y 基因已经有了较为具体和详细的研究基础，如在番茄、马铃薯、油菜、玉米、水稻、 烟草等植物中的研究【2 3 】。 1 番茄 八氢番茄红素合成酶是质体中特有的类胡萝卜素生物合成途径的第一酶【2 0 1 。p s y 是 类胡萝卜素生物合成中的限速酶，这在番茄果实中被证实【2 1 】。b r 锄l e y 等将番茄八氢番 茄红素合成酶( p s 基因反义导入番茄中，结果得到的转基因植株中类胡萝卜素含量 显著降低。在番茄中有2 个p s y 基因，其中p s y l 基因在果实和花中特异性表达，而p s y 2 基因则主要在叶片中表达【2 6 ，蛔。 2 马铃薯 r o m e r 等在前人的“金色水稻”之后成功培育出含有大量玉米黄质的“金色马铃 薯”。他们应用反义技术以及共抑制的方法，使用颗粒结合淀粉合成酶( g b s s ) 特异性 5 东北师范大学硕士学位论文 启动子，通过农杆菌介导的方法转化马铃薯，对马铃薯块茎中玉米黄质环氧化酶( z e p ) 进行负调节，阻断玉米黄质的进一步氧化和环化。成功得到转基因马铃薯植株，块茎中 玉米黄质的含量从0 3 g 上升到4 0p g 干重，达到野生型的1 3 0 倍以上，总的类胡 萝卜素含量也提高到野生型的5 7 倍，从1 0 6p g 干重上升到6 0 8p g 干重f 3 0 1 。 噬夏孢欧文氏菌仃馏基因编码八氢番茄红素合成酶基因。d u c r e u ) ( 等用农杆菌介导 的方法把连接马铃薯块茎特异性启动子的c 厂培基因转入马铃薯。得到的转基因马铃薯块 茎中类胡萝卜素含量达到3 5u g 干重。其含量也发生了变化，野生型马铃薯块茎中几 乎不含b - 胡萝卜素，而在转基因块茎中提高到1 1 “g 干重，并且叶黄素积累量比转入 空载体的对照组高1 9 倍，( 空载体：o 4 8 “g 干重；野生型：0 7 3 “g 干重) ，转基 因马铃薯块茎中叶黄素达到1 1 o l g 干重。在另一组试验中，c 加基因被转入二倍体 马铃薯( 勋砌姗p 办“咖) 中，总的类胡萝卜素含量最高达到了7 8p g 干重，其中包括 堇菜黄质、叶黄素、花药黄质和b 胡萝卜素等【3 1 】。 d i r e 讹等用农杆菌介导法用3 个来自噬夏孢欧文氏菌的基因转化马铃薯，即编码 八氢番茄红素合成酶基因c ，培、八氢番茄红素脱氢酶基因c 川和番茄红素b 环化酶基因 c 刀】，在马铃薯块茎特异性启动子b 3 3 的作用下转化马铃薯。在转基因马铃薯块茎中， 类胡萝卜素含量增加了近2 0 倍，达到1 1 4 4 肛g 儋干重，而野生型中只有5 8 “g g 干重； 其中b - 胡萝卜素含量是野生型的3 6 0 0 倍达到4 7 4p 眺干重( 野生型0 0 1 3p g 干重) 【3 2 3 3 1 。 3 油莱 s h e w m a l 【e r 等用来自油菜( 8 阳s ，f c 口玎印淞) 的种子特异性启动子( n 印i n ) 驱动噬夏孢欧 文氏菌的c ，馏基因，对油菜进行农杆菌介导的转化。在油菜种子中过量表达c ，培基因， 积累的类胡萝卜素提高了5 0 倍，从3 3 g 鲜重增长为1 6 1 7 g 鲜重。其中占主要成分 的为q 胡萝卜素3 9 4p g 鲜重和b - 胡萝卜素9 4 9 g 鲜重，而野生型中不含a 胡萝卜 素，b 胡萝卜素仅为3 “g 鲜重【3 4 】。 i m a n e l l o 等也应用了油菜特异性启动子( n 印血) ，驱动来自噬夏孢欧文氏菌3 个基 因：即八氢番茄红素合成酶基因馏、八氢番茄红素脱氢酶基因c 厂和番茄红素b 环化 酶基因仃f 】，。这三个基因在得到的转基因油菜种子中过量表达，总的类胡萝卜素含量达 到1 2 9 9 儋鲜重，a - 胡萝卜素和b - 胡萝卜素含量之比为3 ：1 ( q - 胡萝卜素2 8 1p g 鲜重， b 胡萝卜素8 4 6p g 鲜重) 【3 5 】。 6 东北师范大学硕士学位论文 4 水稻 p o 仃y k u s 等培育出金色水稻( g o l d e n 硒c e ) ，将黄水仙p s y 和l y c b 基因构建到一个质 粒上，由胚乳特异性表达谷蛋白启动子( g l u t 0 1 ) 驱动，将此质粒与花椰菜花叶病毒3 5 s 启 动子驱动的细菌c ，玎( 具有植物p d s ，z d s ，c i 玎i s 0 三个酶的功能) 一起转入一个日本 水稻品种。转基因水稻的胚乳能生产b 胡萝卜素、玉米黄质和叶黄素等，总类胡萝卜 素含量约为1 6 g 干重【2 8 1 。 p 2 l i n e 等人用p s y n l 2 4 2 4 载体连接来自玉米的p s y 基因和来自噬夏孢欧文氏菌的 盯玎基因，结合胚乳特异性表达谷蛋白启动子( g l u t 0 1 ) 转化水稻。得到第二代转基因水 稻，积累类胡萝卜素达到3 7p g 干重，其中b 胡萝卜素含量达到3 1 g 儋干重【2 9 】。 5 玉米 在玉米中有3 个p s y 基因，狮，是玉米胚乳中类胡萝卜素合成途径中的关键酶 基因【2 4 1 。l i 等人最新发现z i n p s y 3 基因能够在根中参与类胡萝卜素的合成，并且有可 能对9 顺式环氧类胡萝卜素二氧合酶( n c e d ) 形成正调控，从而影响脱落酸( a b a ) 的合 成【2 4 2 5 1 。更多关于禾本科p s y 基因的研究现状和意义将在讨论部分进行展开。 三、本论文研究的目的和意义 植物中类胡萝卜素有多种功能，包括光合作用、光保护作用、生成a b a 前体、作为 发育过程中的信号，参与植物与生物环境的交流【4 1 ，4 羽。八氢番茄红素合成酶在质体中特 有，是类胡萝卜素生物合成途径的第一个酶f 4 1 1 。目前已经证实，在番茄果实、油菜种子、 马铃薯块茎、拟南芥种子、龙胆花瓣和玉米胚乳中，p s y 是类胡萝卜素生物合成中的限 速酶【2 2 4 ，3 4 ，4 3 ，4 6 ，4 9 1 。在有些物种如拟南芥中，p s y 是由核编码的单拷贝基因【4 9 】；而番茄、 玉米和水稻中的p s y 则是由一个小基因家族编码的多拷贝基因，龙胆( g 胁f p 口) 的p s y 基 因是以多拷贝的形式存在于龙胆基因组中【2 2 翻，4 3 4 6 1 。 龙胆( g p 玎砌mz “f p 口) 为多年生草本植物。茎略具四棱，粗糙，绿色或稍带紫色。叶 对生，下部叶鳞片状；中、上部叶卵状披针形，边缘及下面主脉粗糙，基部抱茎。花簇 生于茎顶和上部叶腋：花萼钟形，膜质，花冠呈黄色，其花瓣中含有大量的类胡萝卜素 【4 。在龙胆花发育过程中，花瓣中的叶绿体转化为有色体，叶绿体含量迅速降低，类胡 萝卜素总量逐渐增加，其中由a 胡萝卜素代谢生成的叶黄体素等占类胡萝卜素总量的比 例逐渐降低，而由b 胡萝卜素代谢生成的玉米黄质和新黄质等占类胡萝卜素总量的比 7 东北师范大学硕士学位论文 例逐渐增加【3 6 】。 朱长甫博士应用龙胆g l p s y lc d n a 做探针，从龙胆花瓣c d n a 文库中得到2 个克 隆。经酶切检验发现它们与g l p s y lc e n a 不同，并命名为龙胆g l p s y 2 和g 1 p s y 3 基 因。本论文对龙胆( g ，“纪口) 八氢番茄红素合成酶2 和3 的基因( c d n a ) 进行了序列分析， 通过与g l p s y lc d n a 序列( g e n b a n k 登录号：a b 0 1 1 0 1 2 ) 比对，发现它们具有明显 差异，有必要对该基因进行功能分析和鉴定。构建p u c g l p s y 2 和p u c g l p s y 3 表达 质粒，应用工程大肠杆菌( ec d ，f ) 鉴定了龙胆八氢番茄红素合成酶2 和3 基因( c d n a ) 编 码的酶的功能。鉴定的龙胆八氢番茄红素合成酶2 和3 的基因可应用于改良植物品质( 类 胡萝卜素) 以及改变园艺植物花的颜色的分子育种。 8 东北师范大学硕士学位论文 材料与方法 一、实验材料 1 菌种和质粒： 大肠杆菌西c 乃p ，f c 乃砌z f 菌株x l l b l u e ，本实验室保存； p a c c 剐r 2 5 ，p a c c 削毪5 c r t b ，p a c c a r c r t e 和p a c c r c b 质粒d n a s ，本实验室 保存； p b l u e s 嘶p t - g l p s y 2 和p b l u e s c r i p t g l p s y 3 质粒d n a s 由朱长甫博士提供。 2 常用抗生素及试剂( 储存浓度) ： 氨苄青霉素( a n l p i c i l l i n ) ：1 0 0m g 枷； 氯霉素( c m o r 锄1 p h e i l i c 0 1 ) ：1o om g i i d ； 异丙基一b d 硫代半乳糖苷( i p t g ) ：1 m ； 高效液相分析：乙腈、甲醇、异丙醇，分析纯试剂。 3 分子生物学实验材料： 3 1 试剂 克隆载体p b l u e s c r i p t i is k ( + ) 和p u c 8 ，本实验室保存； p m d l 8 t 载体为t 水加公司产品； 各种d n a 限制性内切酶，d n a 连接酶，m a r k e r 等为t o y o b o 公司产品； 回收凝胶中d n a ：g e n e c l e a n ；b 1 0 1 0 1 ，l aj o l l a ，c a 。 3 2 引物及测序 人工寡聚核苷酸引物合成：上海生工公司； 质粒d n a 测序：上海生工公司； 序列分析软件：c h m o r s ，d n a s t a i 质粒构建图谱软件：v e c t o rn t i9 。 9 东北师范大学硕士学位论文 3 3 序列比对分析 序列比对分析：b l a s t ( g e i 也a n k 在线基因数据库) ； 基因同源进化树：c l a s t l w ( e b i 在线基因数据库) 。 4 缓冲溶液配方 4 1h s ( 1 m ) 溶液( s 三羟基氨基甲烷，c 4 h 1 l n 0 3 ) 1 2 1 0 9g 而s 加蒸馏水定容至1 l ，用盐酸调p h7 5 ，8 o ，8 5 ，室温保存。 4 25 0 倍t a e 缓冲液( 1 l ) 啊s2 4 2g ，冰醋酸5 7 1m l ，0 5me d t a ( p h8 0 ) 1 0 0 血，加蒸馏水定容到1l ，用 氢氧化钠调p h8 5 ，室温保存。电泳时稀释成1 倍t a eb u 虢r 。 4 3t e 缓冲液( p h8 0 ) 啊s h c l ( p h8 0 ) 1 0m m ，e d t a ( p h8 o ) 0 5m ，高压灭菌，室温保存。 4 4t f b l 缓冲液 醋酸钾3 0m m ，氯化锰5 0m m ，氯化钾4 0 0n 州，氯化钙1 0r 1 1 m ，甘油1 5 ( v v ) ， 用0 2m 醋酸调p h5 8 ，抽滤除菌，4 保存。 4 5t f b 2 缓冲液 n a - m o p s ( 3 吗琳丙磺酸钠) 1 0i l 州，氯化钙7 5m m ，氯化钾1 0m m ，甘油1 5 ( v v ) ， 用1m 氢氧化钠调p h7 0 ，抽滤灭菌，4 保存。 5 培养基配方 5 1l b 液体培养基( 1 l ，p h7 o ) 蛋白胨1 0g ，n a c l5g ，酵母浸粉5g ，n a o h ( 1 m ) 1m l ，1 2 0 灭菌2 0 分钟，室 温保存。 5 2l b 固体培养基( 1 l ，p h7 o ) ； l b 液体培养基1l 中，加入1 5g 琼脂粉。1 2 0 灭菌2 0 分钟，冷却至5 0 时加入 适量抗生素，约4 0m l 倒入无菌的玻璃平皿中，4 保存。 5 3s o b 液体培养基( 1 l ，p h 7 0 ) 蛋白胨2 0g ，n a c l0 5g ，酵母浸粉5g ，氯化钾( 2 5 0m m ) 1 0 n l l ，n a o h ( 1 m ) 1m l ， 1 2 0 灭菌2 0 分钟，室温保存。 1 0 东北师范大学硕士学位论文 6 主要仪器及设备 艋t e c h 超净工作台，苏州净化仪器厂； s i 舯a1 1 3 台式高速离心机； b i o r a d 电泳仪及电转移装置； i b a s2 0 0 0 凝胶图像处理仪； 日本岛津s h i i t l a d z u 高效液相色谱仪( l c - 1 0 m p ) ； 迪马( 钻石) d i 锄o n s i l 色谱柱，9 9 9 0 3 ，c 1 85 啪，2 5 0 4 6m m 。 二、实验方法 1 质粒的构建 1 1 碱法提取少量质粒d n a 的方法 ( 1 ) 挑取单克隆菌落，接种到5i n l 含相应抗生素的l b 液体培养基中，3 7 2 0 0 印m 振摇培养1 2 1 6 小时； ( 2 ) 取1 5 “茵液于微量离心管中，1 2 0 0 0 印m 离心1 分钟，弃上清，将离心管倒 置于吸水纸上，尽可能地吸去残留的培养基； ( 3 ) 用1 0 0 “l 冰预冷的溶液i ( 5 0m m 葡萄糖，2 5r i 州h s c lp h8 o ，1 0m m e d t a p h8 0 ) 重悬细菌沉淀，加入2 0 0p l 新配制的溶液i i ( 0 2mn a o h ，1 s d s ) ，颠倒数 次混匀。 ( 4 ) 加入1 5 0p l 用冰预冷的溶液( 3m 醋酸钾，5m 冰醋酸p h4 8 ) ，颠倒数次混 匀，有絮状沉淀产生，1 2 0 0 0 印m 离心5 分钟，取上清，加入2 倍体积冷无水乙醇，混 合均匀，置2 0 3 0m i n 。 ( 5 ) 4 1 2 0 0 0 印m 离心1 0 分钟，弃上清。 ( 6 ) 再加1m l7 0 乙醇洗涤沉淀，1 2 0 0 0 叩m 离心1 - 2 分钟后，弃去上清。 ( 7 ) 倒置干燥1 5m i i l ，使酒精彻底挥发。 ( 8 ) 以2 0 p l 含i 矾a 酶( 终浓度2 0 “l 幽m ) 的t eb u 舵r ( 1 0m m 嘶sp h8 0 ，h c l1m m e d t ap h8 o ) 溶解沉淀。 ( 9 ) 2 0 冰箱中保存。 1 2d n a 纯度和浓度测定 ( 1 ) 以l ：2 0 或更高的比例将样品d n a 溶液在t e 或双蒸水中稀释。 1 1 东北师范大学硕士学位论文 ( 2 ) 用t e 或双蒸水在紫外分光光度计波长2 3 0 、2 6 0 、2 8 0n m 处做空白对照。 ( 3 ) 将d n a 稀释液装入比色皿进行比色，读取质粒d n a 在紫外分光光度计波长2 3 0 、 2 6 0 、2 8 0m n 处的光密度值，即o d 值。 h ) 记录光密度数据，进行计算。 公式：d s d n a 浓度5 0 o d 2 6 0 稀释倍数( 单位腭m 1 ) 1 3 保存菌株： 取过夜培养的菌液9 5 0 “l 至1 5m l 离心管，加入5 0 ld m s o ( 二甲基亚砜) 混匀， 8 0 保存。 1 4 聚合酶链式反应( p c r ) 1 0 p c rb u f r e r ( m g z 十) d n t p ( 5 m m ) 弓i 物1 ( 2 0 n g p 1 ) 弓l 物2 ( 2 0 n h 1 ) 模板c d n a ( 5 0 n 山) h 2 0 1 砷酶( 5 u “1 ) 2 0u l 0 4 1 o “l 1 o l 2 4 “l 1 3 1 “l 0 1 “l 总体积2 0 “1 在p c r 仪上进行扩增，程序如下：9 5 变性3 分钟；9 5 4 5 秒，6 0 4 5 秒，7 2 2 分钟；共进行3 5 个循环；最后于7 2 延伸1 0 分钟，4 保存。 1 5 单酶切反应： 1 0 b u 虢r d n a ( 5 0 0n p 1 ) d d h 2 0 酶( 1 0u “1 ) 0 “1 om 5 1 5 山 3 7 酶切，3 小时后电泳。 总体积 1 0u l 1 2 东北师范大学硕士学位论文 1 6 双酶切反应： 1 0 b u f f e r d n a ( 5 0 0n 山) d d h 2 0 酶i ( 1 0u 1 ) 酶i i ( 1 0u 叫) 1 0p l 2 0 “l 6 0 “1 o 5 “l o 5 山 总体积 1 0 “1 3 7 酶切，3 小时后电泳。 1 7 大肠杆菌x l l b l u e 感受态细胞的制备： ( 1 ) 挑取大肠杆菌x l l 一b l u e 单克隆至含有1 0p m l 四环素( t e 缸a c y c l i i l e ) 的5m ll b 培 养基中，3 7 2 0 0 卿振荡培养1 2 1 6 小时； ( 2 ) 取l 血菌液加入含1 0 g m l 四环素的1 0 0 咖s o b 培养基中，3 7 振荡培养4 6 小时( 至o d 枷= o 4 一o 5 ) ； ( 3 ) 将菌液分装至2 个5 0r n l 离心管中，冰上放置3 0 分钟后，4 5 0 0 0 删离心1 5 分钟，弃上清； ( 4 ) 向离心管中加入1 01 1 1 lt f b l 缓冲液，并轻轻悬浮沉淀，冰上放置3 小时后，4 5 0 0 0 印m 离心1 5 分钟，弃上清； ( 5 ) 向每个离心管中加入2m lt f b 2 缓冲液重悬菌体，2 0 0 l 管分装至1 5m l 离心管； ( 6 ) 用液氮预冷，8 0 保存。 1 8