（遗传学专业论文）核异常及微核对有丝分裂的影响.pdf

u n i v e r s i t yo fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g y o fc h i n a adi s s e r t a t i o nf o rm a s t e r sd e gr e e t h ee 仟e c t so fnu c l e a r ir r e g ula r i t ya ndmicr on u cleion m i t o s i s a u t h o r sn a m e ： s p e c i a l i t y ： 一 ， 3 u d e r v l s o r ： rl n l s b e dt i m e ： t 1 x i a o y u n s h i g e n e t i c s p r o f qi n g h u as h i d e c e m b e r1 0 t h ，2 0 1 0 中国科学技术大学学位论文原创性声明 i 吣删, t 9 0 8 9 7 4 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过 的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说 明。 作者签名：力瓤五 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有 学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文 的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入中国学位论文 全文数据库等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 口公开 口保密( 年) 作者签名： 签字日期：兰qf ! ：! 兰：2 旦 导师签 签字日 摘要 摘要 核异常与微核已被广泛使用为基因组不稳性的标志。而核异常及微核对细胞 有丝分裂的具体影响却并不清楚。为此，我们选取了表达h 2 b g f p 融合蛋白的 致瘤性细胞h e l a 和h o e c h s t 3 3 3 4 2 染色的非致瘤性细胞m c f i o a ，利用活细胞 实时摄影技术，长时间考察细胞有丝分裂，从而研究核异常和微核细胞对有丝分 裂的影响。我们发现在单核的h e l a 细胞中有5 0 细胞出现核异常和4 5 的细 胞具有微核。相对于正常单核h e l a 细胞，核异常的h e l a 细胞进入有丝分裂的 比例下降1 6 ，间期停滞的比例却升高了7 倍；进入有丝分裂后，核异常细胞中 期赤道板异常的比例由2 1 增长为2 8 。同时，核异常和微核细胞内的染色体 分离异常比例分别升高了1 6 和2 2 ，并且，核异常及微核细胞产生异常子细 胞的比例也分别上升了2 7 和2 6 。但是，h e l a 单核细胞有丝分裂的极数并不 受核异常和微核的影响。利用荧光原位杂交技术与活细胞摄影相结合，我们发现 核异常和微核细胞并不会导致更多有别于母细胞的非整倍体子细胞的产生。最 后，核异常细胞有丝分裂的整个细胞周期长度与正常细胞相比有显著性的升高。 与h e l a 细胞不同，虽然m c f 1 0 a 细胞有5 5 的单核细胞核异常，但是其有丝 分裂进程及结果的各个指标都没有受到影响。综上所述，核异常和微核对于细胞 有丝分裂的影响是有丝分裂阶段特异和细胞特异的。 关键词：核异常微核活细胞摄影落后染色体染色体桥分裂赤道板多极分裂 h e l a 细胞m c f 1 0 a 细胞 摘要 i i - _ i - _ _ _ - - _ - _ - - _ - - _ - _ - - - _ _ _ _ - _ _ - _ _ - _ l - _ _ _ _ _ _ - - _ - _ - _ _ _ - - _ _ _ _ _ - 一一一 一。 a b s t r a c t n u c l e a ri r r e g u l a r i t ya n dm i c r o n u c l e ih a v eb e e nw i d e l yu s e d a sm a r k e r so f g e n o m i ci n s t a b i l i t y h o w e v e gt h ee f f e c t so fn u c l e a ri r r e g u l a r i t ya n dm i c r o n u c l e i o n m i t o s i sa r en o tw e l lu n d e r s t o o d h e r ew ei n v e s t i g a t e d t h ee f f e c t so fn u c l e a r i r r e g u l a r i t y a n dm i c r o n u c l e io nm i t o t i cb e h a v i o r so fh e l ac e l l s ，e x p r e s s i n g h i s t o n e 2 bt a g g e db yg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，a n dm c f - 1 0 ac e l l ss t a i n e dw i t h h o e c h s t3 3 3 4 2 ，u s i n gl o n g t e r ml i v ec e l li m a g i n g w ef o u n dt h a t5 ：o a n d4 5 o f m o n o n u c l e a t e dh e l ac e l l ss h o w e dn u c l e a ri r r e g u l a r i t ya n dm i c r o n u c l e i ，r e s p e c t i v e l y c o m p a r i n gw i t hn o r m a lc e l l s ，t h ef r e q u e n c yo fi r r e g u l a r n u c l e a t e dc e l l st oe n t e r m i t o s i sw a sd e c r e a s e db y16 a n dt h ef r e q u e n c yo ft h e s ec e l l st ou n d e r g o a r r e s ta t i n t e r p h a s ew a si n c r e a s e db y7 - f o l d a f t e re n t e r i n g i n t om i t o s i s ，t h ef o r m a t i o no f a b n o r m a lm e t a p h a s ep l a t ei ni r r e g u l a rn u c l e a t e dc e l l sw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d f r o m21 t o2 8 m o r e o v e r ，w h e nc o m p a r e dw i t hn o r m a lc e l l s ，t h eo c c u r r e n c eo f c h r o m o s o m eb r i d g i n g l a g g i n gw a si n c r e a s e db y16 a n d2 2 ，r e s p e c t i v e l y , i n i r r e g u l a rn u c l e a t e da n dm i c r o n u c l e a t e dc e l l s m e a n w h i l e ，t h ep r o p o r t i o n so f m i t o s e s p r o d u c i n ga b n o r m a ld a u g h t e rc e l l sw e r ea l s oi n c r e a s e db y2 7 a n d2 6 ，r e s p e c t i v e l y h o w e v e r ，t h en u m b e ro fm i t o t i cs p i n d l ep o l e s ，o rt h ef r e q u e n c yo fa n e u p l o i dd a u g h t e r c e l l s a si d e n t i f i e db yf l u o r e s c e n c e ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，w e r en o ta f f e c t e db y n u c l e a r i r r e g u l a r i t yo rm i c r o n u c l e u s f i n a l l y , t h el e n g t ho fc e l lc y c l ei ni r r e g u l a rn u c l e a t e d c e l l sw a ss i g n i f i c a n t l ye x t e n d e dc o m p a r i n gw i t hn o r m a lc e l l s h o w e v e hi nm c f _ 1 0 a ， o fw h i c h5 5 m o n o n u c l e a t e dc e l l ss h o w e dn u c ! e a ri r r e g u l a r i t y , n u c l e a ri r r e g u l a r i t y w a sf o m l dt oh a v et r i v i a le f f e c t s o nm i t o t i cb e h a v i o r s t o g e t h e r ，t h e s er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tn u c l e a ri r r e g u l a r i t ya n dm i c r o n u c l e u s a f f e c t e dm i t o s i si nac e l l l i n e s p e c i f i ca n dm i t o t i cs t a g e - s p e c i f i cm a n n e l k e yw o r d s ：m i c r o n u c l e u s ，n u c l e a ri r r e g u l a r i t y ，l i v e c e l li m a g i n g ，l a g g i n gc h r o m o s o m e ， c h r o m o s o m eb r i d g e s ，m i t o s i sp l a t e ，m u l t i p o l a rm i t o s i s ，h e l ac e l l s ，m c f - 10 a c e l l s i i i a b s t r a c t i v 1 6 2 荧光原位杂交l3 1 7 本论文研究内容及其意义l4 第2 章材料方法1 7 2 1 细胞系1 7 2 2 活细胞摄影：1 7 2 2 1 细胞培养皿处理l7 2 2 2 m c f l 0 a 细胞活染1 8 2 2 3 活细胞摄影拍摄1 8 2 3 活细胞摄影分析标准1 8 2 3 1 微核分析标准l8 2 3 2 核异常分析标准l8 v 目 录 2 4 染色体特异性着丝粒d n a 探针标记：一19 2 4 1 探针d n a 质粒抽提19 2 4 2 缺口平移法探针标记l9 2 5 荧光原位杂交l9 2 5 1 活细胞摄影后细胞固定、制片1 9 2 5 2 荧光原位杂交19 2 6 荧光原位杂交标本分析2 0 2 6 1 滤色片选用2 0 2 6 2 图像获取2 0 2 6 3 荧光原位杂交标本分析标准2 0 2 7 统计分析2 l 第3 章实验结果2 3 3 1 细胞核异常、微核的分布和分类2 3 3 2 h e l a 细胞系中的n i c 、m n c 与n m c 的命运与分裂过程的区别2 5 3 2 1 h e l a 间期细胞命运2 5 3 2 2 h e l a 细胞中期赤道板异常。2 5 3 2 3 h e l a 细胞落后染色体和染色体桥2 7 3 2 4 有丝分裂极数2 8 3 2 5 分裂的结果2 9 3 2 6 细胞周期的长度3 0 3 2 7 荧光原位杂交检测非整倍体3l 3 2 8 不同类型核异常对h e l a 细胞分裂的影响。3l 3 3 核异常在非致瘤性m c f 1 0 a 细胞分裂中的影响3 2 3 4 核异常的诱因和起源方式3 3 第4 章结果讨论3 5 4 1 结果总结3 5 4 2 核异常对细胞分裂过程影响比微核更广泛3 5 4 2 1 核异常和微核的基因组不稳定性质不同3 5 4 2 2 核异常和微核的不同诱因影响到他们的功能缺陷3 6 4 3 核异常与微核更易导致分裂异常并产生异常子细胞3 6 4 4 核异常细胞及微核细胞不能促进非整倍体子细胞的产生3 6 v l 目录 4 5 核异常与微核不影响分裂极数：3 7 4 6 核异常在癌细胞和正常细胞中的作用不同3 7 4 7 核异常的诱因、起源与染色体结构畸变及分离异常密切相关3 8 参考文献3 9 致谢5 3 v i l 目 录 v i i i 绪论 1 1 引言 第1 章绪论 细胞核是真核细胞中最大的也是最重要的由膜包围形成的细胞器，是遗传物 质贮存、复制和转录的场所。细胞核是细胞生命活动控制中心，在细胞的生存、 生长和分化中起着重要作用。细胞核形态的正常、完整对细胞的安全至关重要。 在生物体发育的不同阶段，以及不同的组织、不同细胞中，细胞核都会呈现 出不同的形态。细胞核形态的变化在正常生理( a n n e m a d ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 和病理生 理过程中均具有其重要意义。恶性肿瘤组织中经常出现异常的细胞核形态，包括 核大小不一，异常的染色质结构，异常的核形状( h a n s e m a r me ta 1 ，1 8 9 1 ；k o s se ta 1 ， 1 9 9 2 ；e r l a n d s o ne ta 1 ，1 9 9 4 ；b i b b oe ta 1 ，1 9 9 7 ) ，称为核异常。1 8 6 0 年英国伦敦的 飚n g sc o l l e g eh o s p i t a l 的l i o n e ls b e a l e 首次在未经染色的咽癌病人的痰里观察 到了癌细胞核大小及形状的变化( b e a l e ，1 8 6 0 ) 。十九世纪三四十年代，细胞组织 染色法出现，使得同时观察细胞质和细胞核结构特征成为可能( d e m a y , 1 9 9 6 ) 。结 合子宫刮片技术，其在宫颈癌筛查中的应用，大大提高了宫颈癌早期诊断和治愈 的效率，使得居于女性癌症致死首位的宫颈癌发生率和致死率显著降低( f u ， 1 9 8 9 ) 。接下来的研究中，绝大部分肿瘤细胞中都发现了核异常，并且细胞核异 常的不同变化，往往对应着特定的癌症类型，提示了其重要的指标意义。现今核 异常已成为肿瘤临床诊断的经典传统标准。但是核异常与肿瘤的关系并不十分明 确。如核异常出现的恶性肿瘤如子宫癌、卵巢癌、乳腺癌，预后效果往往较差 ( e r h a r d te ta 1 ，1 9 8 9 ；v a c h e r - l a v e n ue ta 1 ，1 9 9 3 ；t a k e s h i m ae ta 1 ，1 9 9 8 ) ；而在另外 一些肿瘤中，如软组织肉瘤，核异常的出现似乎对预后效果并无影响( t r o j a n ie ta 1 ， 1 9 8 4 ；c o s t ae ta 1 ，1 9 9 0 ) 。研究表明细胞核的异常与染色体畸变相关( a t k i ne ta 1 ， 1 9 7 9 ) ，而关于核异常出现对细胞命运影响以及其机制尚不清楚，有待阐明。 微核作为另一种常见的核结构畸变，是间期细胞中与主核分开的，包含染色 质的圆形小体结构。最初是在猫和大鼠的外周血红细胞中发现，后来发现在人类 恶性贫血患者的外周血红细胞中也存在类似的小体。现在国际上普遍采用国际微 核协作小组为人的外周血淋巴细胞体系所定义的微核标准，即微核是指直径小于 主核直径的1 3 大于主核直径的1 1 6 的染色质结构( f e n e c he ta 1 。2 0 0 3 ) 。随着各 项研究的深入，多种疾病，如阿尔海默氏病( t h o m a se ta 1 ，2 0 0 7 ) ，心血管疾病 ( m u r g i ae ta 1 ，2 0 0 7 ) ，唐氏综合症( t h o m a se ta 1 ，2 0 0 8 ) 等都被发现与微核密切相 关。近来的深入研究数据显示，人的外周血淋巴细胞中微核频率的增加意味着癌 绪论 症风险的升高，特别是胃肠道系统和泌尿系统的癌症中效应尤为突出f b o n a s s ie t a 1 ，2 0 0 7 ) 。甚至，微核频率具有年龄，性别效应( t h i e r e n se ta 1 ，2 0 0 0 ) 。而一些不 良生活习惯，如抽烟，饮酒等，以及饮食营养状况和所处环境也会导致微核比率 的升高( i a r m a r e o v a ie ta 1 ，2 0 0 7 ) 。而且研究发现，微核的出现意味着染色体的受 损和基因组不稳定性。微核已经被广泛使用作为分子流行病学上的染色体受损和 基因组不稳定的生物标迹( f e n e c he ta 1 ，1 9 9 9 ；f e n e c he ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在癌症研究与 预防中，微核可以作为癌症细胞遗传研究系统中替代细胞里的遗传替代终点，来 反应与癌症相关联的特定染色体改变( c o l l i n s ，1 9 9 8 ；n o r p p a , 2 0 0 4 ) 。尽管应用十 分广泛，但由于传统细胞生物学和遗传学实验技术的限制，微核对细胞分裂的影 响至今仍未能得以阐明。 在本研究中，我们通过活细胞荧光实时摄影，清晰记录核形态异常细胞和微 核细胞的分裂过程，探索h e l a 和m c f 1 0 a 中核异常细胞和微核细胞对细胞分 裂的影响，深入研究核异常与微核与细胞分裂程中落后染色体、染色体桥的关系。 并结合荧光原位杂交来鉴定核异常细胞和微核细胞的染色体的非整倍体状态，分 析在间期或分裂过程中的异常与产生异常子细胞的关系。 1 2 细胞核的间期异常：核异常、微核 1 2 1 细胞核结构 细胞核主要包括核被膜、核基质、染色质和核仁四部分。细胞核内的染色体 以及其他核组分的空间排布构成了核的结构体系，为组织和调控核内的各种机能 提供骨架。核纤层被认为是核形状的最重要的决定因素。核纤层是核基质的一部 分，这是一个蛋白层，由l a m i n a c 和l a m i nb 基因表达的蛋白及相关蛋白组成。 它组成了染色质和核膜内膜的界面( g o l d m a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。核纤层的内表面存在染 色质附着点。核周异染色质附着在核纤层的内侧，不具有转录活性。大多数正常 细胞的核都具有规则的椭圆形状，但是在许多癌症中细胞核形态不规则 ( n i c k e r s o n ，2 0 0 1 ；z i n kd e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。癌细胞与正常细胞相比，在核骨架上存 在很多特征性的差异。而一些抗癌治疗方法就是使癌细胞恢复正常的结构和功能 达到治疗效果。对核结构异常的了解能够揭示细胞恶性转化的过程，并为新的诊 断和治疗方法的发明奠定一定基础。 2 绪论 图1 1 ( a ) 正常细胞和癌细胞( b ) 的核结构示意图( z i n ke ta 1 ，2 0 0 4 ) 图注：( a ) 正常细胞和癌细胞。细胞核由核纤层蛋白及其相关蛋白组成的核纤层( 紫色) 包 裹成圆形或椭圆形。核纤层与细胞质问的联系通过双层核膜。在核膜内面，核纤层与染 色质相结合，而且在大部分细胞类型中，核纤层结合染色质区域对应着异染色质( 绿色) 。 另外一个异染色质形成关键位点是在核仁( 黄色) 的表面。每个细胞核内会有1 3 个核 仁。它们被认定在核糖体牛物发牛时具有重要作用，也被认为在其他功能上也有关联， 如m r n a 运输，p 5 3 的代谢和控制细胞增殖。核基质( 黑色的内部网络，核基质蛋白 用蓝色小球表示) 。早幼粒细胞白血病蛋白体( p m l 小体，红色) 。p m l 的生长与肿瘤 抑制因子对这种面包圈状多蛋折复合体结构至关重要。( b ) 在肿瘤细胞中发现的一些核 结构改变的示例。细胞核变得异常开始有褶皱，经常呈现粗糙的异染色质凝集，在核仁 周围会出现一些核周结构( 粉色) ，一些特异的核基质蛋白可能会消失。 1 2 2 核异常与微核的产生 核骨架变化以及染色质含量变化均会导致核异常。l a m i na c 和l a m i nb 等 核形态的支撑骨架蛋白突变或缺失均会导致间期核形态的改变( m o u n k e se ta 1 ， 2 0 0 3 ；o s t l u n de ta 1 ，2 0 0 3 ) 。而核内染色质内容变化，如恶性肿瘤中d n a 的扩增 ( p e d e u t o u re ta 1 ，1 9 9 4 ) ，化学试剂处理或辐射致细胞内染色体结构畸变( n a s l u n de t a 1 ，1 9 8 7 ；g i s s e l s s o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) ，均伴随着核形态改变的现象发生。 在细胞分裂的前中期时，染色体着丝粒无法与微管结合，最终在分裂时导致 染色体不能被微管拉向两个子核而整条染色体落后( b e c k e re ta 1 ，1 9 9 0 ；c i m i n ie t a 1 ，2 0 0 1 ；n o r p p ae ta 1 ，1 9 9 3 ；f e n e c h ，2 0 0 7 ) ；或者，由于d n a 损伤或有丝分裂后 3 绪论 期染色体桥断裂产生的染色体片段在分裂末期的落后也可以形成微核 ( g i s s e l s s o ne ta 1 ，2 0 0 1 ；s a u n d e r se ta 1 ，2 0 0 0 ) 。依据着丝粒的有无，微核可以被区 分为三大类别，分别是含有完整染色体微核和不含有着丝粒的染色体片段的微核 以及既有完整染色体也有不含着丝粒染色体片段的微核。 1 3 有丝分裂中的染色体分离异常 有丝分裂是细胞周期进程中最为引人注目和具潜在危险性的步骤，因为染色 体将被不可逆地分配到两个子细胞中。为了完成正确的细胞分裂，细胞周期中心 控制系统( t h ec e n t r a lc e l lc y c l ec o n t r o ls y s t e m ) 需要对周围环境中对细胞周期进程 的刺激和干扰做出反应。达到这种目的的一种机制是通过检验点控锖l j ( c h e c k p o i n t c o n t r o l s ) ，它能在细胞周期中的关键点监控细胞周期进程，如果出现错误则停止 进程。细胞周期中存在很多检验点( l u k a se ta 1 ，2 0 0 4 ；s t a r ke ta 1 ，2 0 0 4 ) ，其中控制 后期开始的纺锤体装配检验点在染色体分离中起的作用尤为重要，不仅监控着丝 粒与微管间的附着从而控制后期的进入，还在退出有丝分裂时起作用( l e we ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。 很多类型的染色体错误分离都能够被d n a 损伤和纺锤体装配检验点检测 到。检验点控制的缺陷可能导致不能维持细胞分裂的精确程度，导致染色体不稳 定性( c h r o m o s o m ei n s t a b i l i t y , c l r 0 的出现。具有复杂基因组变化的肿瘤细胞常常 在检验点控制上存在缺陷并出现染色体分离故障( j a l l e p a l l ie ta 1 ，2 0 0 1 ；s a u n d e r se t a 1 ，2 0 0 0 ) 。 在各种癌细胞中发现的染色体分离异常有落后染色体( 1 a g g i n gc h r o m o s o m e ) ， 后期桥( a n a p h a s eb r i d g e ) ，多极纺锤体( m u l t i p o l a rs p i n d l e ) 等。 1 3 1 落后染色体 落后染色体( 1 a g g i n gc h r o m o s o m e ) 是指不能成功聚集到赤道板上的染色体或 染色体片断，或者是落后于后期分离的整条染色体或染色体片断。落后染色体可 能是由于着丝粒区域缺陷，而不能附着在纺锤体微管上而形成的( d u l o u te t a 1 ，1 9 8 4 ；c i m i n ie ta 1 ，2 0 0 4 ；k n o w l t o ne ta 1 ，2 0 0 6 ) ，或者是同一个着丝粒同时被两 极微管附着所引起的m e r o t e l i c 连接所致( c i m i n ie ta 1 ，2 0 0 1 ；c i m i n i e ta 1 ，2 0 0 2 ； c i m i n ie ta 1 ，2 0 0 3 ；c i m i n ia n dd e g r a s s i ，2 0 0 5 ) 。另外还观察到落后染色体起源于断 开的后期桥的碎片( l i ，2 0 0 4 ) 。而其中被认为最有可能导致染色体分离结果异常的 是m e r o t e l i c 连接。在中期染色体排列到赤道板后，正常情况下会由两极的纺缍 体发射出的微管分别联结姐妹染色单体上的着丝粒区域，而此时的姐妹染色单体 4 绪论 之间由于c o h e s i n 的粘结作用，会使纺缍体感受到张力。纺锤体检验点( s p i n d l e c h e c k p o i n t ) 正是通过检测这种张力来保护染色体的正常分离。由于m e r o t e l i c 连接 可以产生张力，所以纺缍体检验点不能纠正这种错误方式。事实上，在有丝分裂 前期有大量的m e r o t e l i c 连接产生，但大部分在后期开始前可以被纠正( m c e w e ne t a 1 ，2 0 0 1 ) 。在后期开始后，那些仍未被纠正的m e r o t e l i c 连接的染色单体会由两极 连着的微管数目来决定去哪一极，在研究中发现多数情况下，正确的一极上有着 更多的微管连接，使得染色体最终会移向正确的一极，再一步降低了分裂过程中 染色体错误分离率。当来染色体上连接的微管来自于两极的数目差相当时，后期 发生m e r o t e l i c 的姐妹染色单体就会持续停留在赤道板的位置不会移向任何一极 而形成一个落后染色体。有丝分裂末期，胞质分裂完成，该落后染色体会进入一 个子细胞，有可能形成一个与主核分离的微核( r a oe ta 1 ，2 0 0 8 ) ，也有可能融入主 核( c i m i n ie ta 1 。2 0 0 2 ) 。 1 3 2 后期染色体桥 后期染色体桥( a n a p h a s ec h r o m o s o m eb r i d g e ) ，是后期分离的染色体块之间的 一条或更多的染色质桥。后期桥最先是由b a r b a r am c c l i n t o c k 在玉米中观察到的 ( m c c l i n t o c k ，1 9 4 1 ；c l i n t o c k ，1 9 4 2 ) 。后期桥在癌细胞中大量存在并且与肿瘤发生 紧密联系( a r t a n d ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。近年来的研究显示后期染色体桥的出现会导致细 胞中染色体不稳定性的发生( g i s s e l s s o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。后期桥的出现符合一个经典 的模型，即b r e a k a g e f u s i o n b r i d g ec y c l e ( g i s s e l s s o n ，2 0 0 3 ) 。这一模型还被用来解 释了叶酸缺乏情况下微核、后期桥、芽( 图1 2 ) 的形成( f e n e c he ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 b f bc y c l e 的起始涉及一个d n a 双链断裂( d o u b l e s t r a n db r e a k ，d s b ) 的过程， 该过程暴露出一个没有端粒的染色体末端。这些裸露的末端能够与其他断链或 d n a 复制所形成的姐妹染色单体融合。依据融合发生的不同时期可以导致双着 丝粒染色体的形成，或者导致后期染色质型或染色体型的桥的形成。如果d n a 复制发生在两个d n a 断裂末端融合之前，那么将会在g 2 期形成一个双着丝粒 染色体。双着丝粒染色体将被向两极拉扯，最终断裂然后分别进入每个子细胞。 如果断裂是不对称的，那么可能会发生基因扩增或基因丢失，产生的断裂末端又 会进入这个流动库( c y c l i n gp 0 0 1 ) ( s a u n d e r se ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这被称为染色质型 ( c h r o m a t i d t y p e ) 的b f bc y c l e ；如果d n a 复制发生在末端融合和双着丝粒染色体 形成之后，一个双重的双着丝粒染色体将会形成，在后期它有可能被平行地分开， 也有可能是向两极被拉断。平行分离不会在后期导致桥的产生，但是子细胞将分 别遗传二个双着丝粒染色体。向两极被拉断则会在后期形成双桥，双桥断裂，每 个子细胞将会获得两个无端粒的末端。这两个末端可能会融合为一个双着丝粒染 绪论 图1 2 通过b f bc y c l e 的基因扩增( f e n e c hm ，c r o t tj w 2 0 0 2 ) 色体然后开始染色体型( c 1 1 r o m o s o m e - t y p e ) 的b f bc y c l e ( m c c l i n t o c k ，1 9 4 1 ； m c c l i n t o c k ，19 4 2 ) 。 细胞进入b f bc y c l e ，通过不断地丢失或获得基因发展为染色体不稳定。此 外，没有证据显示双着丝粒染色体能够被任何细胞周期检验点当作异常而识别。 在中期，双着丝粒染色体被纺锤体的两极牵扯，有可能提供了阻止纺锤体装配检 验点激活所需的张力。因而后期桥的形成能够导致增殖过程中不可逆的基因组变 化。 1 3 3 多极纺锤体 一个细胞要准确地分裂为两个同等的子细胞，不仅要求基因组d n a 复制且 只复制一次，同时还要求染色体均匀地分成两份。正常有丝分裂纺锤体是一个具 有两极的装置，它将染色体排列到赤道板上面，确保与每条染色体着丝粒的附着， 然后将它们拉到各个子细胞中。有丝分裂纺锤体是一个由微管围绕微管组织中心 ( m i c r o t u b u l eo r g a n i z i n gc e n t e r , m t o c ) 而形成的两极装置。在一个完整的纺锤体中 存在三种类型的微管：极性微管、动粒微管以及星状微管。极性微管延伸至纺锤 体的中心，与来自另一极的极性微管重叠，形成马达蛋白的轨道，产生表观方向 力( o u t w a r d l y d i r e c t e df o r c e s ) ，推动纺锤体分为两半。如果将末端附着在染色体的 着丝粒区域，那么极性微管可能成为动粒微管。动粒微管负责将微管动力学与染 色体运动耦合起来，将染色体拉向两极。其它的微管为星状微管，它们延伸到细 6 绪论 胞膜，与细胞膜及其相关蛋白相互作用，产生拉力，促成纺锤体的定位和伸长。 在多细胞生物中，中心体是其m t o c ，对许多细胞过程至关重要，中心体扩 增是癌细胞分裂错误的重要来源，一个世纪前b o v e r i 首先预言了中心体扩增在 肿瘤的形成中起到重要作用。中心体扩增最明显的影响就是多级纺锤体( m p s ) 的 形成。多极纺锤体和额外的中心体往往同时在肿瘤中被发现( g i s s e l s s o ne ta 1 ， 2 0 0 4 ) ，表明m p s 与中心体扩增密切相关。但是，含有扩增的中心体的细胞不一 定总是导致多极纺锤体的形成。细胞分裂时形成多极纺锤体就失去了染色体分离 的精确性。此外，对产生m p s 的细胞后期起始同步化的研究表明，细胞对于多 于两极的纺锤体并没有检验点来控带l j ( s l u d e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。多极分裂的轻微延迟是 由控制动粒与落后染色体附着的纺锤体装配检验点引起的。因此m p s 的形成是 另一种可能导致非整倍体的危险途径。 1 3 4 胞质分裂 胞质分裂( c y t o k i n e s i s ) 是将细胞一分为二的过程。它发生在有丝分裂末期染 色体已经分配到两个分离的核内之后。虽然看起来简单，但是胞质分裂是由纺锤 体微管、肌动蛋白细胞骨架以及膜融合事件之间复杂而又动态的相互影响所介导 的( g l o t z e r2 0 0 1 ；g u e r t i ne ta 1 ，2 0 0 2 ；g l o t z e r ，2 0 0 3 ) 。 胞质分裂的起始标志是分裂沟的出现，一般在后期之后的数分钟。新分开的 细胞能够维持躯体上的联系相当长的时间，培养的哺乳动物细胞最长可达4 小时 ( s a n g e re ta 1 ，1 9 8 5 ) 。分裂沟的形成依靠基于肌动蛋白的收缩环，它形成于细胞质 膜的下方。在后期，当动粒微管上的染色体向两极移动时，非动粒微管以反向平 行的构型形成束，中心纺锤体( c e n t r a ls p i n d l e ) 的装配开女f l ( m i s h i m ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 中心纺锤体对于胞质分裂的完成十分重要，在某些细胞中，中心纺锤体对分裂沟 的内移也是很关键的。分裂沟内移直到与中心纺锤体接触并挤压，与之相随的是 膜囊的融合。新膜必须调节表面区域扩大，以包裹住两个子细胞。在胞质分裂的 晚些阶段，一个被称为中间体( m i d b o d y ) 的狭窄的细胞质桥将两个子细胞连接起 来( b r e c k l e ra n db u r n s i d e ，1 9 9 4 ) 。中间体凸出的元件就是中心纺锤体。细胞质桥 最终断裂，这一过程称为切断( a b s c i s s i o n ) ，然后两个细胞分离，完成胞质分裂。 长时间摄影实验表明大多数双核细胞是由于双极分裂几小时后分裂沟退化而形 成的( s h ia n dk i n g ，2 0 0 5 ) 7 绪论 1 4 核形状异常、微核与染色体不稳定性 1 4 1 基因组不稳定性 基因组不稳定性，定义为与连续性的基因组变化相关的一种异常细胞状态， 包括突变、染色体重排、缺失、扩增及倒转，是肿瘤发生的标志之- - ( a l l e p a l l ie t a 1 ，2 0 0 1 ；d r a v i a me ta 1 ，2 0 0 4 ) 。基因组不稳定性至少有两个来源：1 、微卫星不稳 定( m r n ) 2 、染色体不稳定( c r n ) 。 m i n ( m i c r o s a t e l l i t e si n s t a b i l i t y ) 是指被称为微卫星( m i c r o s a t e l l i t e s ) 的简单重复 序列的稳定性丧失，发生于偶发性结肠癌或遗传性的非息肉型结肠癌( t h i b o d e a u ， b r e ne ta 1 19 9 3 ) 。有迹象表明m i n 是由于与后复制( p o s t r e p l i c a t i v e ) d n a 错配修 复有关的基因失活而造成的( i o n o ve ta 1 ，1 9 9 3 ) 。出现m i n 的直肠肿瘤具有正常 或者近乎正常的核型，而m i n 事实上在所有类型癌症中都不产生大幅度的基因 组变化( l ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 c i n ( c h r o m o s o m ei n s t a b i l i t y ) ，染色体不稳定，定义为染色体结构和数目的一 种连续性变化。非整倍体，即具有变化的染色体数目的状态，一个多世纪以来被 发现广泛存在于人类癌症细胞 ( h a n s e m a n n18 9 0 ) 。研究表明大多数肿瘤尤其是 实体瘤都是非整倍体( m i t e l m a n e ta 1 ，2 0 0 7 ；w e a v e ra n dc l e v e l a n d ，2 0 0 6 ) ，并且肿瘤 中非整倍体细胞的比例与肿瘤的恶化进程、转移风险、治疗效果以及预后效果等 密切相关( c a v a l l ie ta 1 1 9 8 9 ；m i t e l m a ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 。此外，非整倍体还是导致不育 不孕、自发流产以及先天性出生缺陷等危害人类生殖健康疾病的重要原因 ( s i m p s o n ，2 0 0 7 ) 。1 9 1 4 年，b o v e f i 提出假说，认为异常的染色体数目是癌性状态 的一种原因而并非结果( b o v e f i ，1 9 1 4 ) 。然而，非整倍体究竟出现在肿瘤发生的早 期或晚期，以及它究竟是一种原发性原因还是简单表现为细胞周期控制或分裂机 制的一般性故障，我们仍然不是很清楚。一些实验证明c i n 对于肿瘤发生并不 是那么重要。对于老鼠的研究表明腺瘤能够在没有核型变化或明显的基因组不稳 定的情况下发生( h a i g i se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。然而，在其他一些情况中，癌细胞经常有很 多的遗传变异。例如，存在多于1 1 ，0 0 0 种遗传变异的人直肠癌( s t o l e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 既然会出现如此大规模的变异，那么异常高比率的染色体丢失或增加是有可能 的。我们相信c i n 对于整个基因组范围内的变化是有责任的。突变子假说认为 c i n 出现在肿瘤发生的早期，使后来的能诱导肿瘤的突变，基因侵入及扩增的发 生增加( n o w e l l ，1 9 7 6 ) 。研究表明c i n 足以引发并推动肿瘤发生( n o w a ke ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。因此，c i n 被认为是推动与多级肿瘤发生相关的基因组变化的关键机制 ( s a u n d e r se ta 1 ，2 0 0 0 ；w ue ta 1 ，2 0 0 1 ；p i h a n ke ta 1 ，2 0 0 3 ；g i s s e l s s o ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 8 绪论 1 4 2 核形状异常、微核与基因组不稳定性 一些研究表明核异常是和染色体畸变密切相关的。在化学试剂诱导生瘤的实 验模型中，报导了非典型的细胞核形态增加了非整倍体的程度( n a s l u n de ta 1 ， 1 9 8 7 ) ，而且在