（内科学专业论文）辣椒素对乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤的保护作用.pdf

r 嬲 辣椒素对乙醇诱导大鼠胄粘膜损伤的保护作用 摘要 目的：通过观察辣椒素( c a p s a i c i n ，c a p ) 对乙醇诱导胃粘膜损伤的大鼠胃酸分 泌，胃窦区组织内辣椒素受体( v a n i l l o i dr e c e p t o rs u b t y p e1 ，v r l ) 、降钙素 基因相关肽( c a l c i t o n i ng e n e r e l a t e dp e p t i d e ，c g r p ) 和p 物质( s u b s t a n c ep ， s p ) ，及胃粘膜屏障的影响，探讨c a p 对乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤的影响 及其机制。方法：( 1 ) 实验动物分组：4 8 只s d 雄性大鼠，体重1 8 0 9 - 2 4 0 9 之间，随机分为四组：a 组( 正常对照组) 、b 组( 乙醇模型组) 、c 组( c a p 组) 、d 组( 乙醇+ c a p 组) ，每组大鼠1 2 只。( 2 ) 实验方法：所有s d 大 鼠饲养2 周以适应环境，然后按照以下方法进行实验：a 组：大鼠自由进食 进水，生理盐水1 0 m l k g 日分2 次灌胃，连续1 4 天。b 组：大鼠自由进食 进水，5 0 乙醇1 0 m l k g 日分2 次灌胃，连续1 4 天。c 组：大鼠自由进食进 水，c a p5 m g k g l j 分2 次灌胃，连续1 4 天。d 组：大鼠自由进食进水，c a p 5 m g k g 日+ 无水乙醇两者体积之比为1 ：1 混合后( 即乙醇浓度为5 0 ) 分2 次灌胃，连续1 4 天。所有大鼠于实验结束前2 4 h 开始禁食( 不禁水) ，然后 进行标本采集。( 3 ) 检测指标及方法：造模及给药过程中观察大鼠的一般 情况。胃酸的测定：所有大鼠经麻醉后打开腹腔，将整个胃取出，剪开胃 并用2 m l 生理盐水清洗胃内容物，收集清洗液，用酸碱滴定法测定胃酸。 胃窦组织内v r l 和c g r p 、s p 的表达情况：取各组大鼠胃窦组织( 约0 5 c m 0 5 c m ) 全层一块，立刻置于4 的多聚甲醛中充分固定2 h ，石蜡包埋， 连续5 1 x m 切片，用免疫组化方法分别进行v r l 、c g r p 、s p 测定。胃壁 凝胶层厚度测定：垂直切取胃窦部1 6 m m 厚度胃壁厚片，将切取的厚片置 于倒置相差显微镜暗视野下用目镜测微尺测定凝胶层厚度。胃粘膜屏障改 变：把清洗过胃内容物之后的胃置于4 的多聚甲醛中充分固定后，肉眼观 察胃粘膜形态，采用g u t h 标准改良评分评定胃粘膜损伤情况，并取胃粘膜 组织送病理组织学检查，光镜下对h e 染色后的胃粘膜进行观察。结果：( 1 ) 动物一般情况：实验过程中，a 组大鼠精神状态好，行动灵活，食欲佳，皮 毛光泽，大小便正常，体重增加；b 组大鼠出现好斗，易激惹，互相撕咬等 情况，毛色光泽，体重减轻，但无死亡。c 组大鼠精神状态好，行动灵活， 食欲佳，皮毛光泽，大小便正常，体重增加。d 组大鼠精神状态，活动，皮 毛光泽，大小便，体重增加。在灌胃过程中b 组有4 只大鼠、c 组有1 只大 鼠、d 组有2 只大鼠曾出现呛咳，但均无窒息和死亡。( 2 ) 胃液总酸度的变 化：各组大鼠的胃液总酸度分别为：a 组4 8 2 7 2 1 4 m m o l l ，b 组4 9 2 3 3 1 4 m m o l l ，c 组3 4 1 2 + 2 0 9m m o l l ，d 组3 5 1 9 3 0 8m m o l l 。其中a 组胃 液总酸度显著大于c 组和d 组( p o 0 5 ) 。( 3 ) 胃窦组织内v r l 的表达情况： 大鼠胃窦区组织内v r l 表达水平分别为：+ a 组o 6 2 o 4 9 分，b 组o 5 9 o 4 8 分，c 组2 6 1 0 3 4 分，d 组2 5 6 + 0 4 8 分。其中c 组及d 组v r l 表 达水平均显著大于a 组及b 组( p o 0 5 ) ，c 组v r l 表达水平与d 组表达水平没有统 计学意义( p 0 0 5 ) 。( 4 ) 胃窦组织内c g r p 情况：大鼠胃窦组织内c g r p 表达水平分别为：a 组1 0 6 0 4 3 分，b 组o 7 2 0 3 2 分，c 组2 1 9 0 5 7 2 分，d 组1 8 7 0 4 8 分。其中b 组c g r p 表达水平显著低于a 组( p o 0 5 ) 、 c 组( p o 0 5 ) 、d 组( p o 0 5 ) ，a 组c g r p 表达水平显著低于c 组( p o 0 5 ) 、 d 组( p o 0 5 ) ，d 组c g r p 表达水平显著低于c 组( p o 0 5 ) ；其余各组 间s p 表达水平均没有统计学意义。( 6 ) 胃壁凝胶层厚度：大鼠胃壁凝胶层 厚度分别为：a 组7 2 2 2 6 2 1l am ，b 组4 1 7 6 5 2 8l am ，c 组7 1 3 4 4 8 7 l am ，d 组6 0 2 8 5 2 7l am 。其中b 组凝胶层厚度显著低于a 组( p o 0 5 ) 、 c 组( p o 0 5 ) 、d 组( p o 0 5 ) ，d 组凝胶层厚度显著低于a 组( p o 0 5 ) 、 c 组( p o 0 5 ) 。( 7 ) 胃粘膜屏障：肉眼下大鼠胃粘膜损伤情况：a 组及c 组胃 粘膜光滑，b 组胃粘膜可见充血水肿、点状糜烂。d 组胃粘膜可见充血水肿， 未见糜烂。胃窦粘膜损伤评分( g u t h 标准改良评分) 分别为：a 组0 分，b 组2 7 4 2 3 6 1 分，c 组o 分，d 组9 2 1 2 3 2 分。其中b 组粘膜损伤评分 显著大于a 组( p o 0 5 ) 、c 组( p o 0 5 ) 、d 组( p o 0 5 ) ，d 组粘膜损伤评 分显著大于a 组( p o 0 5 ) 、c 组( p o 0 5 ) 。大鼠胃窦粘膜病理组织学改变：a 组、c 组大鼠胃窦粘膜上皮细胞形态正常，t 4 y u 整齐，未见粘膜脱落、充血、 水肿、炎性细胞浸润及腺体结构紊乱和坏死。b 组大鼠胃窦粘膜镜下见表层 上皮损伤、脱落，粘膜充血水肿，中性粒细胞浸润，偶可见溃疡病灶。d 组 大鼠胃窦粘膜上皮细胞轻度脱落、充血、水肿，未见腺体结构紊乱和坏死上 皮细胞、炎性细胞浸润。大鼠胃窦粘膜病理组织损伤积分( m a s u d a 标准方 法) 分别为：a 组o 1 2 o 3 8 分，b 组3 9 1 1 1 0 分，c 组o 1 l o 2 5 分， d 组1 2 1 o 2 8 分。其中b 组病理组织损伤积分显著大于a 组( p o 0 5 ) 、 c 组( p o 0 5 ) 、d 组( p o 0 5 ) ，d 组病理组织损伤积分显著大于a 组( p 0 0 5 ) ( 4 ) t h e e x p r e s s i o no f c g r pi ng a s t r i ct i s s u e ：t h ee x p r e s s i o nl e v eo fc g r pi nr a t sa n t r a l z o n ei ng r o u pa ，b ，c ，dw e r e ：1 0 64 - 0 4 3s c o r e s ，0 7 24 - 0 3 2s c o r e s ，2 194 - o 5 7 s c o r e s ，1 8 74 - o 4 8s c o r e s t h ee x p r e s s i o nl e v eo fc g r pi nr a t sa n t r a lz o n ei n g r o u pbw e r es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a ng r o u paa n dg r o u pc a n d g r o u pd ( p o 0 5 ) t h ee x p r e s s i o nl e v eo f c g r pi nr a t sa n t r a lz o n ei ng r o u pa w e r es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a ng r o u pca n dg r o u pd ( p o 0 5 ) ，t h e e x p r e s s i o nl e v e o fc g r pi nr a t sa n t r a lz o n ei ng r o u pdw e r es t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a ng r o u pc ( p 0 0 5 ) ；t h ee x p r e s s i o no fs pi nt h er e s to f t h e g r o u pw e r en o ts t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( 6 ) g a s t r i cg e ll a y e r t h i c k n e s s ：t h e t h i c k n e s so f r a tg a s t r i cg e ll a y e ri ng r o u pa 、b 、c 、dw e r e7 2 2 24 - 6 2 1 1 x m ，4 1 7 6 4 - 5 2 8 p m ，71 3 44 - 4 8 7 1 x m ，6 0 2 84 - 5 2 7 1 x m t h et h i c k n e s so fr a tg a s t r i cg e l l a y e ri ng r o u pb w e r es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a ng r o u paa n dg r o u pc a n dg r o u pd ( p o 0 5 ) ，t h et h i c k n e s so fr a tg a s t r i cg e ll a y e ri ng r o u pdw e r e s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a ng r o u pa a n d g r o u pc ( p o 0 5 ) ，t h et h i c k n e s s o fr a tg a s t r i cg e ll a y e ri ng r o u paw e r es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a ng r o u p aa n dg r o u pc ( p 0 0 5 ) ( 7 ) g a s t r i cm u c o s a l sb a r r i e r ： t h ed a m a g eo fg a s t r i cm u c o s a lb ym a c r o s c o p i c ：t h eg a s t r i co fg r o u paa n dg r o u p cw e r es m o o t h ，g r o u pb sg a s t r i cs h o wh y p e r e m i a ，p u n c t a t ee r o s i o n g r o u pd g a s t r i cm u c o s as h o w sc o n g e s t i o n ，n oe r o s i o n t h es c o r eo fg a s t r i cm u c o s a li n j u r y ( g u t hs t a n d a r dm o d i f i e ds c o r e ) i ng r o u pa 、b 、c 、dw e r e ：0 ，2 7 4 24 - 3 61s c o r e ， 0 ，9 214 - 2 3 2s c o r e m u c o s a li n j u r y ss c o r ei ng r o u pb w a ss i g n i f i c a n t l yg r e a t e r t h a na ，c ，d ( p o 0 5 ) m u c o s a li n j u r y ss c o r ei ng r o u pdw a ss i g n i f i c a n t l y g r e a t e rt h a na ，c ( p o 0 5 ) t h ec h a n g eo f r a tg a s t r i cm u c o s ap a t h o l o g i c a l ： g r o u pa a n dg r o u pc g a s t r i cm u c o s aw e r en o r m a le p i t h e l i a lc e l l s ，a r r a n g e di n n e a tr o w s ，a n dn om u c o s a ll o s s ，c o n g e s t i o n ，e d e m a ，i n f l a m m a t o r yc e l li n f i l t r a t i o n a n dg l a n d u l a rd i s o r g a n i z a t i o na n dn e c r o s i s t h eg a s t r i cm u c o s a lo fg r o u pb s u r f a c em i c r o s c o p y , e p i t h e l i a ld a m a g e ，s h e d d i n g ，m u c o s a le d e m a ，n e u t r o p h i l 8 i n f i l t r a t i o n ，e v e nv i s i b l eu l c e rl e s i o n s t h eg a s t r i cm u c o s a lo fg r o u pde p i t h e l i a l c e l l sw i t hm i l dl o s s ，c o n g e s t i o n ，e d e m a ，a n dn od i s t u r b a n c eo fg l a n d u l a rs t r u c t u r e a n de p i t h e l i a lc e l ln e c r o s i s ，i n f l a m m a t o r yc e l li n f i l t r a t i o n i n j u r yo fr a tg a s t r i c m u c o s ap a t h o l o g yp o i n t s ( m a s u d as t a n d a r dm e t h o d ) i ng r o u pa ，b ，c ，dw e r e ： o 1 24 - o 3 8s c o r e ，3 9 14 - 1 1 0s c o r e ，o 1 14 - o 2 5s c o r e ，1 2 1 士o 2 8s c o r e t h e g r o u pb sp a t h o l o g i c a lt i s s u ed a m a g ew a ss i g n i f i c a n t l yg r e a t e rt h a nt h eg r o u pa ， c ，d ( p o 0 5 ) ，t h ed a m a g eo fp a t h o l o g i c a lt i s s u ei ng r o u pd w a ss i g n i f i c a n t l y g r e a t e rt h a na ，c ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：1 i n t r a g a s t r i c a d m i n i s t r a t i o no fe t h a n o lc a nb es u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e dt h em o d e lo fg a s t r i c m u c o s a li n j u r yi nr a t s ；2 i n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o no fc a pw i t h5 m g k g dc a n r e d u c e dt h ea c i ds e c r e t i o ni ng a s t r i ci nr a t sw h i c hi n j u r y i n gb ye t h a n o l ；3 i n t r a g a s t f i ca d m i n i s t r a t i o no fc a p w i t h5 m g k g dc a ni m p r o v eg a s t r i cm u c o s a l s t h i c k n e s so fg e ll a y e ri nr a t sw h i c hi n j u r y i n gb ye t h a n o l ；4 c a p5 m g k g d ， i n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o nc a ni m p r o v eg a s t r i cm u c o s a li n j u r y i nr a t sw h i c h i n j u r y i n gb ye t h a n o l ；5 c a pr e d u c eg a s t r i ca c i ds e c r e t i o na n dp r o t e c tg a s t r i c m u c o s a l sg e ll a y e rm a yb er e l a t e dw i t hc g r p , n os i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o nw i t ht h e sp k e yw o r d s ：c a p s a i c i n ；g a s t r i cm u c o s a ld a m a g e ；a c i d ；v r l ；c g r p 9 - - ! ! ! 刖舌 乙醇在人们生活中的消费越来越多，饮酒人群的消化道疾病发生率明 显高于非饮酒人群，研究显示乙醇对消化道粘膜有损伤作用。 辣椒素( c a p s a i c i n ，c a p ) ，其化学名称为反8 甲基n 香草基6 壬烯基 酰胺，是辣椒中的主要活性成分。根据大量研究显示c a p 具有镇痛、止痒、 抗炎、抗氧化等重要药理作用。近年研究发现c a p 对消化功能有一定影响， 其中c a p 对胃肠动力、胃酸分泌、胃粘膜屏障等的影响已引起国内外学者 的极大兴趣。c a p 对胃粘膜屏障的影响报道不一，研究显示小剂量c a p 灌 胃有胃粘膜保护作用，但大剂量的c a p 却可使该作用消失 1 】。多数研究发 现小剂量c a p 可能抑制胃酸分泌，同时可能促进胃粘液分泌，但大剂量c a p 可能促进胃酸分泌【2 - 5 1 。 本研究通过建立乙醇诱导胃粘膜损伤的动物模型，观察c a p 连续灌胃 对大鼠胃酸分泌，胃窦组织内v r l 、c g r p 、s p 的表达，胃粘膜屏障等的影 响，探讨c a p 对乙醇引起的胃粘膜损伤的影响及其可能的作用机制。 1 0 材料与方法 1 实验动物 清洁级s p r a g u e d a w l e y ( s d ) 雄性大鼠4 8 只( 泸州医学院实验动物中 心) ，体重18 0 9 - - 2 4 0 9 之间。 2 主要实验试剂 9 5 的辣椒素，郑州贝拜欧生物技术有限公司 2 戊巴比妥钠，泸州医学院药理教研室提供 无水乙醇，泸州医学院药理教研室提供 5 0 l 醇，泸州医学院药理教研室提供 生理盐水，泸州医学院附属医院分子医学中心实验室提供 h e ( h e m a t o x y l i n e o s i n ) 染液，泸州医学院病理科提供 多聚甲醛，泸州医学院病理科提供 兔抗大鼠v r l 多克隆抗体，s i g m a 公司 兔抗大鼠c g r p 多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司 兔抗大鼠s p 多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司 生物素标e - 抗试剂盒( 通用型) ，北京博奥森生物技术有限公司 即用型s - p 免疫组化试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司 试剂盒内容： ad a b 浓缩液( 2 0x ) 3 m 1 b 过氧化氢浓缩液( 2 0 ) 3 m l ct b s 浓缩缓冲液( 2 0 ) 3 m l 3 主要实验仪器 动物饲养器具( 泸州医学院分子生物中心实验室动物房提供) b x6 0 显微镜( 日本o l y m p u s ) p m 1 0 a d 显微照相机( 日本o l y m p u s ) 6 l d 低温离心机( 湖南离心机总厂) 图象处理系统( k s 4 0 0 ，德国z e i s s 公司) l e i c a 病理组织切片机( 德国) 3 7 x e 倒置显微镜( 上海光学仪器厂) 恒温推片烤片机( t k 2 1 8 型，湖北孝感市泰维电子设备有限公司) ； 恒温孵育箱( w k 8 9 1 ，3 7 。c ，宁波) 灌胃针 手术器械一套 4 实验方法 4 1c a p 的配制 取9 5 1 拘c a p1 0 5 2 6 9 ( 即含c a pl g ) 溶于生理盐水1 0 0 0 m l 中，即 可得l m g m l 的c a p 溶液。 1 2 4 2 酚酞指示剂的配置的配制 将酚酞1 9 溶于1 0 0 m 1 9 5 z , 醇中配成l 酚酞指示剂溶液。 4 3 实验动物及处理 4 3 1 动物及饲养环境 s d 大鼠质量在1 8 0 9 - - - 2 4 0 9 之间，用代谢笼饲养，温度2 3 。c - v 2 5 。c ， 湿度5 5 - - 6 5 ，自由饮水，普通杆状饲料喂养。 4 3 2 实验分组 s d 大鼠4 8 只，雄性，随机分为4 组： a 组( 对照组) 1 2 只 b 组( 乙醇模型组) 1 2 只 c 组( c a p 组) 1 2 只 d 组( 乙醇+ c a p 组) 1 2 只 4 4 实验方法 s d 大鼠饲养2 周以适应环境。具体实验方法如下 天 天 a 组：大鼠自由进食进水，生理盐水1 0 m l k g 日分2 次灌胃，连续1 4 b 组：大鼠自由进食进水，5 0 7 , 醇1 0 m l k g j 分2 次灌胃，连续1 4 c 组：大鼠自由进食进水，c a p5 m g k g l 了分2 次灌胃，连续1 4 天 d 组：大鼠自由进食进水，c a p5 m g k g l j + 无水乙醇两者体积之比为 1 ：1 混合后( 即乙醇浓度为5 0 ) 分2 次灌胃，连续1 4 天 所有大鼠于实验结束前2 4 h 开始禁食( 不禁水) ，然后进行标本采集。 4 5 标本采集 距实验大鼠末次灌胃2 4 h 后处死大鼠。具体操作步骤如下： ( 1 ) 用质量分数为2 的戊巴比妥钠4 0 m g k g 对大鼠行腹腔注射麻醉。 ( 2 ) 无菌条件下打开腹腔暴露内脏，结扎食管胃连接部和幽门部，将 整个胃取出，沿胃大弯剪开胃并用2 m l 生理盐水清洗胃内容物，收集清洗液 用于胃酸测定。 ( 3 ) 将胃粘膜平铺于操作台上，垂直切取1 6 m m 厚度胃壁厚片( 用胶 布将两只双面刀片平行固定于载玻片两侧，刀刃侧平行，载玻片厚约 1 6 m m ) 。 ( 4 ) 肉眼观察大鼠胃粘膜损伤指数并取胃粘膜组织行病理组织学检 查。 ( 5 ) 取大鼠胃窦组织约0 5 c m o 5 c m ，用免疫组化方法检测v r l 、 3 次，收集清洗液一并放入l o m l 刻度的离心试管中，以1 5 0 0 r p m 速度离心 1 0 分钟，取l m l 加酚酞试剂一滴，用0 0 1 m o l l n a o h 滴定直至胃液先呈黄 色再转为红色2 秒不消失，为终点，记录耗去n a o h 的毫升数。计算方法： 胃总酸度( m m o l l ) = 耗去n a o h ( m 1 ) x n a o h ( 浓度) 1 0 0 0 。 4 6 2 免疫组化法检测胃窦组织内v r l 、c g r p 及s p 的表达情况 4 6 2 1 取材：在各组大鼠胃窦取一大小约0 5 c m 0 5 c m 的胃全层组织一块， 在生理盐水中漂洗干净后，立即放入4 的多聚甲醛溶液中固定2 一 4 h 。组 织标本常规石蜡包埋，5 9 m 连续石蜡切片2 张，用免疫组化链霉菌抗生物素 蛋白一过氧化物酶( s t r e p t a v i d i np e r o x i d a s e ，s - p ) 法分别进行v r l 、c g r p 、 s p 免疫组化染色。 4 6 2 2 组织切片在6 0 恒温箱中过夜，取出后立即置于二甲苯中脱蜡，下 行梯度酒精中脱苯、水化。具体如下： 二甲苯( i ) 5 m i n 二甲苯( i i ) 5 m i n 酒精( 1o o ) 2 m i n 酒精( 9 5 ) l m i n 酒精( 7 5 ) l m i n 4 6 2 3 脱蜡和水化后，p b s ( p h 7 4 ) 振洗3 次，每次5 m i n 。 4 6 2 4 每张切片加一滴3 过氧化氢+ 2 甲醛溶液，阻断内源性过氧化物酶 的活性，室温下孵育3 0 m i n 。p b s 振洗3 次，每次5 m i n 。 4 6 2 5 抗原修复：切片浸泡于柠檬酸缓冲液中，医用微波炉2 档修复抗原 1 0 m i n ，室温冷却，p b s 振洗3 次，每次5 m i n 。 4 6 2 6 除去p b s ，每张切片加l 滴正常非免疫性动物血清，封闭非特异性 抗体，室温下孵育3 0 m i n 。 4 6 2 7 除去血清，每张切片加1 滴第一抗体( 工作效价分别为l ：1 0 0 、 l ：1 0 0 ) ，4 c 过夜，对照组以p b s 代替一抗作阴性对照。次日p b s 振 洗3 次，每次5 m i n 。 4 6 2 8 除去p b s ，每张切片加l 滴生物素标记的第二抗体，室温下孵育 3 0 m i n ，p b s 振洗3 次，每次5 m i n 。 4 6 2 9 除去p b s ，每张切片加1 滴过氧化物酶标记的链和亲霉素溶液，室 温下孵育3 0 m i n ，p b s 振洗3 次，每次5 m i n 。 4 6 2 1 0 除去p b s ，每张切片加1 滴新鲜配制的d a b 溶液。显微镜下观察 1 - 3 m i n ，自来水冲洗。苏木素复染1 5 m i n ，上行梯度酒精脱水，二甲苯透明， 中性树胶封片，显微镜下观察。