（生物化学与分子生物学专业论文）丙酮酸脱羧酶基因的克隆与表达.pdf

摘要 丙酮酸脱氢酶复合体是a 酮酸脱氢酶复合体家族中重要的一员，它是由丙酮酸 脱羧酶( e 1 ) 、二氢硫辛酸乙酰转移酶( e 2 ) 和二氢硫辛酸脱氢酶( e 3 ) 三种不同的酶 及t p p 、硫辛酸、f a d 、n a d + 、c o a 和m 9 2 + 6 种辅助因子组装而成。丙酮酸脱氢 酶复合体在线粒体中催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰c o a ，而乙酰c o a 再进入三羧 酸循环被彻底的氧化分解，从而为生物体的生命活动提供必要的能量。丙酮酸脱羧 酶参与丙酮酸氧化脱羧过程中第一步反应，这一步是整个反应中唯一的不可逆反 应。如果此酶的活性受到抑制，则生物体的有氧代谢受阻，导致生物体内不能充分 地利用氧，细胞的呼吸作用也会受到了严重的阻碍。由于氧不能被充分利用，生物 体内氧会积累过多，从而导致细胞内活性氧代谢的失衡，即增加了活性氧，如超氧 阴离子、单线态氧等。如果这类氧自由基没能得到及时的清除，就会引起生物膜上 的不饱和脂肪酸过氧化和脱膜脂作用，从而损伤或破坏膜结构，最终导致细胞死亡。 如果以丙酮酸脱羧酶为靶标的抑制剂能够强有力地抑制丙酮酸脱羧酶，则导致生物 体死亡。但是如何从大量的化合物中筛选出具有高活性的丙酮酸脱羧酶的抑制剂是 一个有待于解决的问题。本研究试图通过基因工程的方法构建丙酮酸脱羧酶的基因 工程菌，通过其表达得到大量的丙酮酸脱羧酶；并且建立快速简便的分离纯化方法， 从而制备出大量的纯的有活性的丙酮酸脱羧酶，为抑制剂的筛选提供必要的靶标 酶。 本实验对大肠杆菌丙酮酸脱羧酶( 同二聚体类型a 2 ) 进行了克隆和表达。也 对表达得到的包涵体进行了研究。在细菌破碎之前我们使用了两种方法对收集的大 肠杆菌进行处理，分别在收集的大肠杆菌中加入或者不加入非离子变性剂( s 。) ， 然后根据载体( p g e x k g ) 的特点采用亲和层析的方法得到纯化的大肠杆菌丙酮酸 脱羧酶，测活结果发现前者得到的大肠杆菌丙酮酸脱羧酶活力远比后者高，其活力 达到3 4 8 u m l ，而后者活力只有1 7 3 u m l 。 利用编码拟兰芥丙酮酸脱羧酶的a 亚基和b 亚基的c d s 序列分别与水稻的总基 因组进行序列比对，得到了与拟兰芥丙酮酸脱羧酶基因的a 亚基和b 亚基相对应的同 源性都高于9 0 的两条序列，并以这两条序列来设计引物对水稻丙酮酸脱羧酶( 异 四聚体类型一a 2 8 2 ) 进行了克隆和表达。利用真核表达体系酵母，通过甲醇诱 导表达。在通过甲醇诱导表达后，分别得到了水稻丙酮酸脱羧酶的a 亚基和b 亚基， 将a 亚基和8 亚基在体外组装成有生物活性的丙酮酸脱羧酶进行了初步的研究。 通过本实验的研究，得到了大肠杆菌的丙酮酸脱羧酶，为今后的以丙酮酸脱羧 酶为靶标的抑制荆的筛选提供了必要的物质保障，也为进一步研究丙酮酸脱羧酶和 抑制剂的作用机制提供了必要的理论基础。同时，通过对水稻丙酮酸脱羧酶的a 亚 基和b 亚基的研究，为以后更好的研究异四聚体类型丙酮酸脱羧酶奠定了基础。 关键词：丙酮酸脱羧酶；大肠杆菌；水稻：酵母；克隆；表达 l i a b s t r a c t p y n l v a t ed e h y d r o g e n 弱ec o m p l e xi so n eo fa k c t oa d dd e h y d r o g e n a s ec o m p l e x i l y ，w h i c hi n c l u d sp y m v a t ed e c a r b o x y l a s e ( e 1 ) ，d m y d r o l i p o y la c e t y l t r a n s f e r a s e ( e 2 ) a n dd i h y d r o 王i p o y l d e h y d r o g c n a s e 饵3 ) a n ds i xc o f a c t o r s t h ef u n c t i o no fp y r i l v a t e d e h y d r o g e n a s ec o m p l e xi st oc a t a l y z et h eo x i d a t i v ed c c a r b o x y l a t i o no fp y n l v a t ea i l d p r o d u c ea c e t y l c o e n z y m ea n 柚ha i l dc 0 2i i lm i t o c h o n 埘a a tt h es 姗et i m e ，t h e a c e t y l - c o e n z y m ea i so n eo f t h ei m p o n 觚ts u b s t r a t e si n 由et ( ac y c l ea l l di so x i d j z e dt o p r o d u c ec 0 2a i l dt h e np r o v i d ee n e r g yt oo t h e rp h y s i o l o 百c a l r e a c t i o n o l l l yt h ef i r s ts t 印 o fa no x i d a t i v ea c t i 0 1 l si si e v e r s i b l e i ft h ec o r r e s p o n d i n gi n h i b “o r si n h i b i te 1 ，t h ec e n c a i l n o tm a k eu s eo fo x y 誉m t h ea c c u m u l a t i o no fo x y g e ni sh a r m f i l lt om e 剿血o f o r g a i l i s m ，f o re x a r n p l e ，i tw o u l dd i s t u r bt h ec o n s t n l c t i o no fc e l lm e m b r a i l e ；t h u sl e a d i g t oo r g a i i i s md e a t l l h o w e v e r ，t 1 1 eq u e s t i o n0 nh o wt oc h 0 0 s eal l i g he f f i c i e n c yi n h j b i t o r 丘o mm o u s a n d so fi n h i b i t o r sc a n n o tb es o l v e d h 1t h i se x p e r i m e n t ，t h er c c o m b i n a n t e x p r c s s i o ns y s t e mh a sb e e nc o n s t n l c t e dt of a d l i t a t et h ep r e p a r a t i o no faq u a n 斑y0 fe 1 w “hh j g hp u r i t ya i l da c t i v i t y s oa st 0s o i v et h eq u e s d o no fs h i f t i n gt h ep y r t i v a t c d e c a r b o x y l a s ei n l l i b i t o r sw j t hh 迢沮a c t i v i t y i nt h i sr e s e a r c h ，呐od i f f e r c n tt y p e so fp y m v a t ed e c a 出o x y l a s eg c n e s ，n 帆e da 2a n d a 2 8 2 h a v eb e e ns u c c c s g f u l l yd o n e da n de x p r e s s e d f i f s y ，a 2 f 幻m 晟矗w a sd o n c d 0y e c t o rp g e x - k ga n dc h e 珊 o m b j n 卸tp r o t c j n w a so b i a i n e d a si sw e l l1 【n o w n ，j t ，sv e yd i f f i c u l tt op r o d u c et h eh e t e r o l o g o u sp t o t e i l l s o fi n t e r e s ti nt h ef o n no fs 0 1 u b l eb o d y 1 h r o u g ht h es t u d i e so fp y m v a t ed e c a r b o x y l a s eo f e c o l j ，w es u c c e s s f u l l ys o l v e dt h ek e yp r o b l e mo fi n d u s i o nb o d yw i t hs k lw h i c hi sa d o 丑_ j o nd e n a t u r ef e a g e n t t h ef e s u 】t ss h o w e dt h a tw i l ht b e 觚斌m 曲to fs k 乙p y r u v a t e d e c a r b o x y l a s eo b t a i n e di nt h es o l u b l eh a c t i o ne x e n e di t sa c t i v t i t ya t3 4 8 u ，m 1 ，w h i l e w i t h o u h et t e a t m e n to fs k lt h et a t g e tp r o t e i nw a so b t a i n e di ni n c i u s i o nb o d ya n do n l y s h o w e dt h ea c t i v i t ya t1 7 3 u ，m la f t e rd e n a t u r a t i o na n dr e n a t u r a t i o n 。 s e c o n d l y ，a st 1 1 es e q u e n c eo f c ep y m v a t ed e c a r b o x y l a s ei su n k n o w l l ，w eb l a s t e d r i c eg e n o m e w i t ht h es e q u e n c eo fc d so fp y r i l v a t ed e c a r b o x y i a s ef r d m4 r 口6 珏窄s 括 曲4 ，缸n d t h e nas e q u e n c ed i s p l a y e dm o r ct h a n9 0 h o m o l o g yt o r 口6 i 螂厶啦口矗口以口 i i i a n dw er e g a r d e di ta st h eg e n eo fr i c ep y n l v a t ed e c a r b o x y l a s e t h i ss e q u e n c ew a sc l o n e d i n t oe u k a r y o t i ce x p r e s s j o nv e c t o fa n dt h e ne x p r e s s e di np f 曲抽p 口s 幻，括t oo v e 币m d u c e p o s t t r a n s l a t i o n a l l ym o d i f i e dp r o t e i no fi n t e r e s t i n d u c e db ym e t l i a n o l ，t b es p e c i a lp r o t e i n h a sb e e ny i e l d e d t 1 l er e s u i t sf o ms d s p a g ea n 8 l y sp r o v i d e df u n h e re v i d e n c e 如ru s t h a tw eh a v es u c c e s s f u u vc 1 0 n e da i l de x p r e s s e dt h eas u b u n i ta l l dbs u b u n i to fp y m v a t e d e c a r b o x y l a s eg c n eo fr i c e ，r c s p e c i i v e l y f u r t h e 肿o f e ，w eh a v e t r e dt oa s s e 功b l ea s u b u i t 觚dbs u b u n i t 胁v f 打_ dt op r o d u c cf i l n c t i o n a lp y m v a t ed e c a r b o x y l a s e f o rt h e d 瓶c u l t yt o 醛s e m b l eaf u n c t i o n a lp y n a t ed e c a r b o x y l a s eb o 也w i n las u b u n “a n db s u b u n n 加诹阳稍t l l o u tt h eh e l po fm o l e c u l a rc h a p e 加n e ，w eh a v en o t o b t a j n e da f u n c t i o n a lp ) r n l v a t ed e c a r b o x y l a s ey e t 0 nt h ew h o i e ，t h ep y r u v a t ed e c a r b o x y l a s c 矗o me c d 肛w a sg a i n e d ，a n dt h i sp r o v i d e d s o m ec o n v e i e n c ef o rm es e l e c t j o no fc o m s p o n d i n gi n h j b i t o l sa i l da l s ot h er e s e a r c l l e s0 n f u n c t i o n a lm e c h a n i s mb e t 、】l r e e nt h e m a tt b es 锄et i m e ，o u rr c s e a r c h e so nas u b u n i ta n d 8s u b u n i to fp y m v a t ed e c a r b c l x y l a s eo fr i c el a y e dt h ef o u n d a t i o nf o tf i l n h e te x p l o r a t i o n i n t o 也es t n l c t i o na n df i l n c t i o no fa 2 8 2t y p eo fp y m v a t ed e c a 而o x y l a s e k e yw o r d s ：p y 邝v a t ed e c a r b o x y l a s eg e n e ；e c d n ；r i c c ； 只出抽p 傩幻r 妍c 1 0 1 l i n ge x p r e s s j o n 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名轻房衫 日期：p 啊酷r 月“日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 储龇瓣出作者签名：吨互彤 日期：妒6 年、r 月，日 导师签名： 日期：嘶厂月似角 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回童迨塞堤銮蜃泄卮! 旦坐生；旦二生；旦三生筮查! 储魏9 蛩宏杰作者签名：、罩哟 日期：6 犁厂月日 导师签名 日期：抽解j 月彤日 前言 1 丙酮酸脱氢酶复合体的概述 a 酮酸脱氢酶复合体家族在生物体内占据着重要的生理作用，这个复合体家族 包括三个成员：丙酮酸脱氢酶复合体( p y m v a t ed e h y d r o g e n a s ec o m p l e xp d h c ) 、a 酮 戊二酸脱氢酶复合体( a o x o 四u t a f a t ed e h y d r o g e n a s ec o m p l e xo g d h c ) 和支链a 一酮酸脱 氢酶复合体( b r a n c h e d c h a i na 0 x o a c i dd e h y d r o g e n a s ec o m p i e xb c d h c ) 。其中丙酮酸 脱氢酶复合体是存在于微生物、哺乳动物及高等植物中的一个定位于线粒体中的多 酶复合体。在糖代谢过程中，丙酮酸脱氢酶复合体对其有着直接的影响。丙酮酸氧 化脱羧形成乙酰辅酶a 的反应是在丙酮酸脱氢酶复合体的催化下形成的，生成的乙 酰辅酶a 则进入三羧酸循环被彻底氧化分解，从而为生物体提供大量的能量。因此， 若丙酮酸脱氢酶复合体发生变异，一些主要靠丙酮酸来得到乙酰辅酶a 的组织，尤 其是脑组织就不能合成脂肪酸i ”，从而引发生理上的病变。正因为丙酮酸脱氢酶复 合物在生命体中占据着如此一个关键的代谢位置，所以它也就一直是生物学，医学 及农学等领域的研究热点。 1 1 丙酮酸脱氢酶复合体的分布及组成 丙酮酸脱氢酶复合体除了分布于微生物、哺乳动物及高等植物的线粒体中以 外，在植物体的叶绿体等中也存在着丙酮酸脱氢酶复合体。丙酮酸脱氢酶复合体 ( p d h c ) 是由丙酮酸脱羧酶( p y r u v a t ed e h y d r o g e n a s ep d c e 1e c1 2 4 1 ) 、二氢硫辛 酸乙酰转移酶( d i h y d r 0 1 i p o y la c e t y l t r a n s f e r a s ed l a t e 2e c2 3 1 1 2 ) 和二氢硫辛酸脱 氢酶( d j h y d r o j j p o y 】d e h y d r o g e 蚰s e d u ) he 3e c1 8 1 4 ) 三种不同的酶及t p p 、 硫辛酸、f a d 、n a d + 、c o a 和m g “6 种辅助因子组装而成吼这3 个酶在丙酮酸脱 氢酶复合体的催化反应过程中以首尾相接的形式发挥作用。首先是丙酮酸脱羧酶 ( e 1 ) ，它是以a 2 或者a 2 8 2 的形式存在，a ，b 亚单位的分子量分别是4 1 和3 6k d a ，人类 的丙酮酸脱羧酶的晶体学研究已经证明了这一点【3 j 。并且丙酮酸脱羧酶是以焦磷酸 硫胺素( t h i a m j nd i p h o s p h a t e 四p ) 和m 矿+ 作为它的辅助因子的。第二个组成部分是二 氢硫辛酸酰基转移酶，它的分子量是5 2 k d a 的单体，硫辛酸是该酶的辅助因子，与 之共价结合。第三个组成部分是二氢硫辛酸脱氢酶，其分子量是5 5 k d a ，它是以二 聚体的形式存在。此外，在丙酮脱氢酶复台体中还包括调节丙酮酸脱氢酶活性的丙 酮酸脱氢酶激酶佃d k ) 、丙酮酸脱氢酶磷酸酶( p d p ) 和分子量是5 2k d a 的蛋白x 。 目前关于蛋白x 的作用仍不十分清楚1 4 l ，推测可能是帮助乙酰基团在丙酮酸脱氢酶 复合体周围运动。 革兰氏阴性菌的丙酮酸脱氢酶复合体是1 个由2 4 个e 2 分子为核心，被1 2 个e 1 ( a 2 ) 二聚体和1 2 个e 3 ( a 2 ) 二聚体围绕着的非常大的复合体。而革兰氏阳性菌和真核生物 的丙酮酸脱氢酶复合体则是一个由6 0 个e 2 、3 0 个e 1 ( a 2 8 2 ) 四聚体和1 2 个e 3 ( a 2 ) 二聚体 包围的复合体。另外，相对于革兰氏阴性菌而言，革兰氏阳性菌和真核生物的p d h c 多了一个e 3 结合蛋白( b p ) 【5 1 l 【“。真核生物的p d h c 的核心是由e 2 的内部结构域和 b p 组成【7 】o 哺乳动物、植物和线虫的p d h 活性受到丙酮酸脱氢酶激酶( p d k ) 、丙酮 酸脱氢酶磷酸酶( p d p ) 的磷酸化和去磷酸化调节。 丙酮酸脱氢酶复合酶系的分子量大约是7 1 0 6k d a 。因为其巨大的分子量，至 今还役有弄清楚这整个复合体的晶体结构。但是，对丙酮酸脱氢酶复合体( p d h c ) 的单体组分的三维结构的研究已经取得了很大的进展。到目前为止，已经报道了一 些p d h c 的单体的三维结构，如：大肠杆菌【b 】和人的e 1 的晶体结构【3 、棕色固氮菌、 嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠球菌的e 2 的立体结构、嗜热脂肪芽孢杆菌的e 2 的亚基结构 域、嗜热脂肪芽孢杆菌、大肠杆菌和棕色固氮菌的e 2 硫辛酸结构域、酵母的e 3 立体 结构等m 【1 0 】。 1 2 丙酮酸脱氢酶复合体的催化机理 丙酮酸氧化脱羧形成乙酰c o a 的反应是在丙酮酸脱氢酶复合体催化下的在真核 细胞线粒体基质中进行的一个反应，这是一个连接酵解和三羧酸循环的中心环节。 在这个丙酮酸氧化脱羧是产生乙酰c o a 和n a d h 的反应中，所需的丙酮酸脱氢酶复 合体是存在于线粒体膜上的。整个反应的完成还需要焦磷酸硫胺素( 口p ) 、硫辛 酸、f a d 、n a d + 、c o a 和m 矛+ 六种辅助因子来共同作用。其整个反应过程是相当 的复杂，它总的催化反应可总结如下： 丙酮酸脱氢酶复台体 c h 3 c o c o o h + g d a s h + n a d + 斗c h 3 c o s c o a + c 0 2 + n a d h + h + t p p 、硫辛酸、f a d 、n d + 、c o 和h f 在这个反应过程中，首先丙酮酸与丙酮酸脱羧酶的辅助因子t p p 连接。田p 的 2 硕士学住论文 m a s t e r s t h e s l s 关键结构是噻唑环，噻唑环上的氮和硫原子之间碳原子上的氢比大多数有= c h 一基 的氢更容易解离，使该碳原子形成反应性很强的负碳离子，因而可亲核攻击丙酮酸 的羧基形成加成物。t p p 的噻唑环上的n 带有正电，可作为电子穴，使脱羧后产生 羟乙基仲p 。然后由二氢硫辛酸乙酰转移酶催化是的羟乙基氧化形成乙酰基，同时 转移给硫辛酸与酶蛋白的赖氨酸e 氨基所形成的硫辛酰胺上，形成了乙酰硫辛酰胺。 二氢硫辛酸乙酰转移酶e 2 还催化乙酰硫辛酰胺上的乙酰基转移给c o a 形成乙酰 c o a 。二氢硫辛酸脱氢酶使被还原的硫辛酸重新氧化，将氢传递给辅基f a d ，生成 f a d h 2 。最后，副l h 2 再使n a d + 还原形成n a d h l l l 】。三个酶参与整个催化反应过 程见图1 ： o w 洲矿 图1 丙酮酸氧化脱羧反应机理 f i g 1p ”1 l v a t eo x i d a t i v ed e c a a r b o x y l a t i o n 陀a c 虹o nm e c h 如i s m k 硫辛酰；e n 刁e ：p ) ，n l v a t ed e c a i b o x y l a s e ( e 1 ) ，d i h y d m l i p o i ca c i da c e 叫e o l 2 ) ，d i l l y d r 0 1 i p o i c d e h y d r o g e n a 但3 ) ；c o f a c i o r ：t p p ，c o a s h ，r 气d + ，n a d ，硫辛酸，m 矿+ 1 3 丙酮酸脱氢酶复合体的调控 由于丙酮酸到乙酰c o a 是一个重要的步骤，处于代谢途径的分支点，所以这个 反应体系受到严密的调节控制。 首先是产物抑制。丙酮酸氧化脱羧作用的二个产物乙酰c o a 和n a d h 都抑制丙 酮酸脱氢酶复合体，乙酰c o a 抑制乙酰转移酶，n a d h 抑制二氢硫辛酸脱氢酶组分， 但是这个抑制效应可以被相应的反应物c o a 和n a d 十逆转。 其次是核苷酸的反馈调节。酶体系的活性由细胞的能荷所控制。特别是丙酮酸 脱羧酶组分受g t p 抑制，为a 】p 所活化。当细胞内富有立即可利用的能量时，丙酮 酸脱氢酶体系活性降低【2 】。丙酮酸脱氢酶复合体的活性主要是通过丙酮酸脱氢酶的 磷酸化和脱磷酸化来调节。丙酮酸脱氢酶激酶通过在丙酮酸脱羧酶的3 个丝氨酸残 基发生磷酸化作用而使丙酮酸脱氢酶失活【1 2 】。当酶上的磷酸基团被专一的磷酸酶水 解时，又恢复活性州。 细胞内a t p ，a d p 和n a d h ，n a d + 的比值增高时，酶的磷酸化作用增加。但是丙 酮酸抑制磷酸化作用。c a ”增加去磷酸化作用，胰岛素也可刺激去磷酸化作用，从 而增加丙酮酸氧化脱羧反应的速度。 此外，当细胞间的能量电荷高的时候，p d h 激酶的活性加强。c a 2 + ，m 矿+ 是丙 酮酸脱氢酶复合体磷酸酶主要辅助因子。然而，p d h 磷酸酶调节丙酮酸脱氢酶的活性 的机理目前还没有完全搞清楚。 2 丙酮酸脱羧酶的研究进展 2 1 丙酮酸脱羧酶的结构组成 丙酮酸脱羧酶是丙酮酸脱氢酶复合体催化丙酮酸氧化脱羧的第一个酶。经研究 发现，不同物种来源的丙酮酸脱羧酶e 1 的结构组成是不同的。革兰氏阳性菌( 如大 肠杆菌) 的丙酮酸脱氢酶复合体中的丙酮酸脱羧酶是由两个相同的a 亚基组成的一 个同二聚体( a 2 ) ，分子量约为1 0 0 k d a ：而革兰氏阴性菌和真核生物的丙酮酸脱羧 酶则是由两个a 亚基和两个8 亚基组成的一个异四聚体( a 2 8 2 ) ，其a 、8 亚基的分子 量分别约为4 1 和3 6k d a 【1 4 1 。不同物种的丙酮酸脱氢酶系以及它的丙酮酸脱羧酶的 结构组成见表1 ： 表1 不同物种的丙酮酸脱氢酶组成成分 t a b l 。1c o m p o s j t i o no ft h ep y n l v a t ed e h y d r o g c n e a s ec o m p l e x 劬md m r e n ts p e c j e s d e 3 ( 4 9 5 8 k d a ) 哺乳动物( m a m m a l s ) 酵母( y e a s t ) 植物( p l a n t ) 大肠杆菌( e c d “) 固氮菌似v m e 如n d 豇) 哺乳动物( m a m m a l s ) 酵母( y e a s t ) 植物( p i 蛆t ) 2 2 丙酮酸脱羧酶的特性 虽然从上述的论述中得知不同物种的丙酮酸脱羧酶在结构上是不同的，但是， 这两种不同类型的丙酮酸脱羧酶( a 2 和a 2 8 2 ) 又具有一些共性，如它们都具有两个 活性位点，它们都以t p p 和m g “作为辅助因子的。一直以来，科学家们把有关丙酮 酸脱羧酶的空间结构与功能的关系的研究作为研究的重点，当然也就成为了研究的 热点。到目前为止，人们已经研究清楚了一些物种的丙酮酸脱羧酶的三维结构，比 如大肠杆菌i8 1 、运动发酵单胞菌【1 5 l 、d e s h f ，d 诚 幻咖一f c n n 船【1 6 1 、入【3 l 等。 从这些研究中发现，虽然这两种不同类型的丙酮酸脱羧酶在基因序列上没有同 源性，但是它们的口p 结合区域的序列却有着很高的同源性。几乎所有的 p 依赖 型酶都有个保守结构：g d g x 2 4 2 7 n n ，x 代表任一氨基酸【1 7 】。这些丙酮酸脱羧 酶的活性位点都具有一些共同的特点： 1 活性位点位于两个亚基之间的界面处； 2 1 1 p p 保守区的两个残基与二价阳离子非共价( 如m 矿+ 、c a 2 + ) 结合。 3 什p 结合部位的些氨基酸残基( 如p h e 、n i ) 帮助t p p 保持在“v ”结构， 因为“v ”结构是催化反应必须的。 4 嘧啶环的n l 位通过氢键结合到谷氨酸盐，能影响1 1 p p 上的4 位氮基和即pc 2 氢键的活性【1 8 1 【1 9 1 【2 0 1 。 高等生物的一个重要代谢调控机制是通过对酶的磷酸化和去磷酸化来进行的。 同样，高等生物的p d h c 也是如此。磷酸化和去磷酸化作用对p d h c 的调节是由p d k 和p d p 所参与二个过程组成： 1 p d k 催化的丙酮酸脱羧酶的磷酸化，从而使其失去活性； 2 p d p 催化已磷酸化的丙酮酸脱羧酶去磷酸化而使其复性。 经研究发现，p d k 是十分紧密地与e 2 核心结构相结合的。用游离的p d k 催化 游离的丙酮酸脱羧酶的磷酸化反应速度要比p d h c 复合体状态的丙酮酸脱羧酶的磷 酸化速度低7 倍。p d k 与e 2 的结合区域是e 2 的l 2 区，在它们的结合过程中，硫辛酰基 在介导p d k 与e 2 的l 2 区结合方面发挥着重要的作用1 2 1 】。 另外，在有p d h c 参与的催化反应中的产物和底物对于p d h c 的活性也具有一定 的调节作用【矧。 2 3 丙酮酸脱羧酶的基因表达研究进展 随着科技的进步，人们用于研究基因的手段也日新月异，对于基因的研究也取 得了长足的进步。特别随着是一些模式生物全基因序列的测定，如：大肠杆菌、拟 兰芥、果蝎等，对于一些功能基因的研究更是取得惊人的成果。近几年来，人们对 于丙酮酸脱羧酶的基因也有了较清楚的认识。模式生物的丙酮酸脱羧酶的基因序列 也逐渐的得到证实。现已知大肠杆菌的丙酮酸脱羧酶是由两个相同的a 亚基组成， 并且大肠杆菌的全基因组序列已经测定并公布在g e n e b a n k 上。因而，可以从 g e n e b a n k 上直接查找到大肠杆菌丙酮酸脱羧酶的序列，其登陆号为u 0 0 0 9 6 。 虽然水稻的全基因组序列已经测定并公布，但是，它还有很多基因序列的功能 还没有得到证实，水稻的丙酮酸脱羧酶基因就是其中一个。我们在g e n e b a i l l 【上通过 搜索查找也查了一些与之相关的基因序列，但是其都是通过对其他物种的研究，而 推测得出的水稻丙酮酸脱羧酶基因序列。我们知道，植物模式生物中一个典型代表 是拟兰芥，经过各国科学家的不懈努力，拟兰芥的许多基因序列的功能现在都得到 了证实。拟兰芥的丙酮酸脱羧酶就是都得到了证实的其中一个。同时，拟兰芥和水 稻在进化上又有着高度的同源性。故而，我们可以利用拟兰芥丙酮酸脱羧酶的编码 序列和水稻基因组做一个序列比对，结果得到了一个与拟兰芥同源性大于9 0 的序 列。我们以此序列作为我们研究的对象，并对得到的这个序列进行功能分析和鉴定， 并进一步证实。 基因工程技术的发展给许多难以分离的蛋白质的获得提供了必要的保障。目前 利用基因工程技术构建高效表达的工程菌以获得大量的蛋白，也成为科学研究者感 兴趣的研究方向和目标。在有关丙酮酸脱羧酶基因工程的研究中，国外进行得较早 也较深入，在国内这方面的研究较少。到目前为止，许多生物体的丙酮酸脱羧酶的 基因已经在不同的宿主中得到表达。但是以在大肠杆菌中表达的丙酮酸脱羧酶和构 建表达以a ：8 ：异四聚体构成的丙酮酸脱羧酶居多。例如哺乳动物的支链a 一丙酮酸脱 氢酶复合体的e 1 a 和e 1 b 距单位在大肠杆菌中实现了高效超量表达i 纠【2 4 】f 2 5 l ：人的丙 酮酸脱羧酶在不仅在大肠杆菌中进行了表达【2 6 l ，而且在酵母阳中也实现了超量表 然怒。 达：另外，拟兰芥的丙酮酸脱羧酶在昆虫细胞【2 8 j 中以及来自于嗜热性脂肪芽孢杆菌 的e 1 在大肠杆菌内1 2 9 j 也都得到了表达等。 为了实现a 2 8 2 异四聚体的高效表达并在表达后得到有生物功能的丙酮酸脱羧 酶，r i c h a r dn p e f h a m s f ”l 曾把嗜热脂肪芽孢杆菌的丙酮酸脱羧酶的a 、8 亚基分别 在含有麦芽糖融合蛋白( m b p ) 的载体上进行表达，然后把得到的亚基在体外组装 成有生物活性的丙酮酸脱羧酶。但是由于m b p 的对a 2 b ：异四聚体的形成有空间阻止 的作用，所以得到的_ 丙酮酸脱羧酶的活性不是很高。m u l c h a n ds p a t e l 瞄1 把人的丙 酮酸脱羧酶的a 、b 亚基构建到同一个含有h i s 标签的载体上进行共表达，也得到了 有生物活性的e 1 。j 锄a m i e r n v k 【邪】等人把拟兰芥的丙酮酸脱羧酶的两个亚基构建的 载体在昆虫细胞中得到了超量表达。除了对丙酮酸脱羧酶组分的进行基因工程研究 之外，研究者们对e 2 、e 3 组分的基因也进行了克隆和表达【3 0 】，【3 1 】t i 埘。 2 4 丙酮酸脱羧酶的应用 在人类的遗传病中存在着一类p d h c 缺陷的代谢疾病，它是由先天的丙酮酸脱 氢酶复合物中e 1 、e 2 和e 3 的基因突变所造成的糖代谢阻碍，导致机体内丙酮酸大量 积累。大量积累的丙酮酸被乳酸脱氢酶催化转化为乳酸，体内积累大量的乳酸，从而 引起乳酸中毒，故该疾病被取名为乳酸血症【3 3 1 。目前已经发现了近8 0 种引起乳酸血症 的p d h c 的突变，其中大部分发生在丙酮酸脱羧酶的a 亚基上，而人的丙酮酸脱羧酶 的a 亚基的基因位于x 染色体上的p 2 2 1 2 2 2 【矧。因此，乳酸血症是与性别有关的，男性 多表现为严重的代谢障碍，而女性主要是神经性疾病【3 5 l 。故依靠三羧酸循环作为乙酰 辅酶a 的来源受阻，同时a t p 的产量亦减少，从而导致代谢障碍，组织受损。对于人类 来说，临床表现以脑组织受损的症状为典型。造成丙酮酸脱氢酶缺乏的原因以丙酮酸 脱氢酶e 1 a 突变后的机能障碍较普通。 鉴于丙酮酸脱羧酶在代谢中的重要作用，开发它的抑制剂和激活剂一直就是研 究开发的熬点。b u i i l i e f 3 6 】等人已经报道合成了多个丙酮酸脱羧酶的抑制剂，但是由 于这些抑制剂具有很高的毒性而不能应用。b u t l i n 等1 3 7 】研制了一种新型的抑制剂n 乙酰基杂环化合物，此化合物主要应用于治疗人类糖尿病、脉管炎、心机萎缩、高 血脂和动脉硬化等疾病。同时，n 乙酰基杂环化含物对人体具有很强的副作用，所 以也没有得到实际的应用。目前，有研究表明胰岛素【3 8 】能够激活丙酮酸脱羧酶。因 此，在探索新结构、新靶标的意义上，开发以丙酮酸脱羧酶为靶标的具有低毒的抑 制剂，将会打开抑制剂和激活剂研究的一个全新的领域。 顾士举位论文 m a s t e r st h e s i s 3 研究的目的和意义 目前世界上已开发应用了数百种不同结构的商品化除草剂，但是其作用靶标位 点是有限的。而采用靶标相近或者相似的除草剂轮换使用，则使杂草抗性问题变得 尤为严重。因此，如何开发出更多的具有新靶标酶的商品化除草剂已经成为当前的 一个重要课题。丙酮酸脱氨酶复合体是一个具有开发农药新产品意义的作用靶标， 目前尚无以它作为靶标的商品化除草剂。此外，目前一些报道的丙酮酸脱羧酶的抑 制剂大部分是”p 的结构类似物如h e ，珊p 等。而以丙酮酸结构类似物作为丙酮酸脱 羧酶的抑制剂很少，能应用于实践中的更是少之又少。本课题组以丙酮酸脱羧酶为 靶标，通过生物合理设计的方法设计合成出了大量的丙酮酸的结构类似物，以期其 能作为丙酮酸脱羧酶的抑制剂而作为强有力的除草剂。但是，如何从大量的化合物 中筛选出具有高活性的丙酮酸脱羧酶的抑制剂一直是捆扰我们的而又急需要解决 的问题。此前，我们主要是通过购买商品化的丙酮酸脱羧酶来进行筛选，但是，商 品化的丙酮酸脱羧酶的成本高，不适宜于长期大量的筛选。 所以，本研究就试图通过基因工程的方法构建丙酮酸脱羧酶的基因工程菌，通 过其来表达来得到大量的丙酮酸脱羧酶；并且建立快速简便的分离纯化方法，从而 制各出大量的纯的有活性的丙酮酸脱羧酶。因此，通过本实验的研究，将能为今后 的抑制剂的筛选提供大量的实验材料，也大大地的降低实验成本。这对于我们进一 步设计合成和开发出具有我国知识产权的农药有着重要的战略意义。同时也为进一 步研究丙酮酸脱羧酶的结构与功能的关系和研究丙酮酸脱羧酶与抑制剂的作用机 理提供必要的理论基础。 1 材料、试剂及仪器 1 1 材料 材料与方法 1 1 1 菌株和质粒 实验中所采用的菌株是d h 5 a 和b l 2 1 ( d e 3 ) ，大肠杆菌表达质粒载体是 p g e x k g 。酵母菌株是g s l l 5 ；酵母表达质粒载体是p h i l s l 。菌株和质粒均为华 中农业大学作物遗传改良实验室保存。 1 1 2 引物 1 1 - 2 1 克隆所使用的大肠杆菌丙酮酸脱羧酶引物 本实验中所用的引物是根据在g c n e b a i l k 中公布的大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶复 合物e 1 ( a c c e ) 组分的序列( 2 6 6 4 b p ) 来设计引物。引物是由上海生工生物工程公 司合成。引物序列及含有酶切位点见表2 ： 表2 ：p c r 扩增引物序列 t a b l e2 ：s e q u e n c eo fp c ra m p l i f i c a n p r i m e r s 1 1 2 2 克隆所使用的水稻丙酮酸脱羧酶引物 本实验中所用的引物是根据在g e n e b a n k 中公布的拟兰芥的丙酮酸脱氢酶复合 物e 1 的编码序列a 亚基( u 2 1 2 1 4 ) 组分的氨基酸编码序列( 1 5 6 3 b p ) 和b 亚基 ( u 0 9 1 3 7 ) 组分的氨基酸编码序列序列( 1 5 8 7 b p ) 和水稻的总基因组做序列比对后 得到的序列来设计引物。引物是由北京奥科生物公司合成。引物序列及含有酶切位 点见表3 、4 ： 硕士学位论文 m a s t e r st h b s i s ! ! ! = = = = = ! = = ! ! ! ! = = ! ! = ! ! = = = = = ! ! ! ! ：! ! ! ! ：! 表3 ：p c r 扩增引物序列 i h b l e3 ： s e q u e n c eo fp c ra m p l i f i c a t i o np f i m e r s 表4p c r 扩增引物的用途及其扩增产物的大小 t a b l e4u s e s0 fp r i n l e r s 柚ds i z eo fp c r p r o d u c t s p d c a - f 瓜 p d c b 胍 a o x l f r 水稻丙酮酸脱羧酶亚基 1 ，1 7 3 b p 水稻丙酮酸脱羧酶亚基 1 ，1 2 5 b p 检测重组d n a 是否整合到酵母染色体上 1 2 试剂 1 2 1 主要试剂 各种d n a 限制性内切酶、t 4 d n a 连接酶、e xt a q d n a 聚合酶和d n a 分子 量标准( d l 0 0 0d n am a r k e r ) 为1 独a r a 产品，d n a 凝胶回收试剂盒购于上海生 工生物工程公司。蛋白质分子量标准购于上海生命科学院。主要的生化试剂均为国 产分析纯( a r ) 。 1 0 1 2 2 溶液的配制 大肠杆菌质粒d n a 抽提溶液 溶液i ：5 0 m m o 帆，t r j s - h c i ( p h 7 6 ) ，l o m m 0 1 le d t a ，高压灭菌2 0 m i n 。在 使用时加入r n a s ea1 0 0 i i g m l 溶液i i ：o 2 m m o l l n a o h ，l s d s ；使用时l ：1 混合即为溶液i i 溶液i i i ：1 3 2m m o l l k a c ( p h 4 8 ) ；h a c s d s p a g e 用： 2 s d s 上样缓冲液：o 1 m m o l ln i s h c l ( p h6 8 ) 、2 0 0m m o l l 二硫疏糖醇 ( d t t ) 、4 十二烷基磺酸钠( s d s ) 、0 2 溴酚兰、 2 0 甘油： 5 t r i s 一甘氨酸电泳缓冲液：9 0 0 m l 去离子水中溶解1 5 1 9t r i s ( p h8 3 ) 和9 4 9 甘氨酸，然后加入5 0 m 1 1 0 ( v v ) 的s d s ，用去离子 水补至1 0 0 0 帅】； 染色液的配制：在甲醇：水( 1 ：1 ，v ) 9 0 m l 与1 0 m l 冰乙酸混合液中加入 o 2 5 9 考马斯亮兰r - 2 5 0 ： 脱色液的配制：甲醇：水( 1 ：1 ，v ，v ) 9 0 m l 与1 0 m l 冰乙酸混合即为脱色液 b u f f e r a ：5 0 m m o l l t r i s - h c l ( p h6 8 ) 、0 5 衄o l