（微电子学与固体电子学专业论文）硅基表面固定蛋白质分子的温度特性研究.pdf

中文摘要 中文摘要 随着信息技术的发展，开发新的信息材料和研究新的器件构造成为今后微电 子技术发展的一个重要方向。自1 9 8 3 年美国开始设想研究生物芯片计算机以来， 各发达国家掀起了对这方面研究的热潮，蛋白质分子开关是生物计算机的最基本 构件，所以系统研究蛋白质分子的物理特性尤其是温度特性对微电子的发展具有 重要的实际意义。 本课题是对硅基表面固定的蛋白质分子牛i g g 展开的温度特性研究。阐述了 蛋白质分子特点、蛋白质分子的固定方法、并对蛋白质分子的电流与温度的关系 进行了理论分析。利用化学修饰的方法，首先对淀积在硅片上的铂膜进行表面改 性，使其表面产生活泼羧基基团，然后通过活化液，利用蛋白质分子与羧基之间 的化学缩合反应，将蛋白质分子牛i g g 固定在硅基表面，然后对其温度特性进行 了实验测试与分析。结果表明，硅基表面固定i g g 蛋白质分子的电流随温度的升 高而降低，其电流的温度系数为一2 7 4 4 o c 。 关键词：硅基表面；i g g 固定；蛋白质分子；温度特性 目录 a b s t r a c t w i t ht h e d e v e l o p m e n to fi n f o r m a t i o nt e c h n o l o g y ，d e v e l o p i n gn e wi n f o r m a t i o n m a t e r i a la n dn e wc o m p o n e n ts t r u c t u r eh a sb e c o m ea ni m p o r t a n td i r e c t i o no f m i c r o e l e c t r o n i ct e c h n o l o g yd e v e l o p m e n t s i n c e19 8 3u sh a ss t a r t e dt o s t u d yt h e b i o l o g yc h i pc o m p u t e r ，e a c hd e v e l o p e dc o u n t r yh a sr a i s e dt h eu p s u r g eo nt os t u d yo n t h i sa s p e c t a st h ep r o t e i nm o l e c u l a rs w i t c hi st h em o s tb a s i cc o m p o n e n to fb i o l o g i c a l c o m p u t e r , i ti sg r e a ts i g n i f i c a n tt ot h em i c r o e l e c t r o n i ct e c h n o l o g y d e v e l o p m e n tt o s y s t e m a t i c a l l y s t u d i e dt h e p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c e s p e c i a l l y t h e t e m p e r a t u r e c h a r a c t e r i s t i co ft h ep r o t e i nm o l e c u l a r i nt h i sp r o j e c t ，w es t u d i e dt h et e m p e r a t u r ec h a r a c t e r i s t i co ft h ep r o t e i nm o l e c u l a r c a t t l ei g gw h i c hw a si m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fs i l i c o nw a f e r w ee l a b o r a t e dt h e f e a t u r eo ft h ep r o t e i nm o l e c u l a r ，t h ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o d so fp r o t e i nm o l e c u l a r , a t t h es a m et i m e ；t h ec u r r e n t - t e m p e r a t u r er e l a t i o n s h i po ft h ep r o t e i nm o l e c u l a rw a s a n a l y z e dt h e o r e t i c a l l y f i r s t l y ，w eu s e dt h ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o nm e t h o dt om a k e s u r f a c em o d i f i c a t i o no ft h ep l a t i n u mm e m b r a n ew h i c hw a sd e p o s i t e do nt h es i l i c o n w a f e r , s ot h a ti t ss u r f a c ec o u l dh a v el i v e l yc a r b o x y lg r o u p s s e c o n d l yb yt h ea c t i o no f t h ea c t i v a t i o ns o l u t i o n ，u s i n gt h ec o n d e n s a t i o nr e a c t i o nb e t w e e nt h ep r o t e i nm o l e c u l a r a n dt h ec a r b o x y lg r o u pt oi m m o b i l i z ep r o t e i nm o l e c u l a rc a t t l ei g go nt h es i l i c o n - b a s e d s u r f a c e t h e nt e s t e da n da n a l y z e di t st e m p e r a t u r ec h a r a c t e r i s t i c t h er e s u l ti n d i c a t e d t h a t ，t h ec u r r e mo fp r o t e i nm o l e c u l a rc a t t l ei g gd e c r e a s e da l o n g 、) l ，i t ht h ei n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e ，t h ec u r r e n tt e m p e r a t u r ec o e f f i c i e n ti s - 2 7 4 4 o c k e y w o r d s ：s i l i c o ns u r f a c e ；i g gw a si m m o b i l i z e d ；p r o t e i nm o l e c u l a r ；t e m p e r a t u r e c h a r a c t e r i s t i c 黑龙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉婆太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 _ ：一p 学位论文作者签名： ) 参久弓 签字日期：芦d 年r 月3 0 l i 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉江太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉江太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名：。) 砂云够 导师签名： 签字日期：a o 年r 月? d 日 签字日期：力d 年上月粕日 学位论文作者毕业后去向： 汐c 、兀汐掀、别啊九幺 竹酷篇 皿那 怖泓 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 引言 1 9 4 6 年第一台电子计算机诞生以来，由于微电子技术迅速发展，使电子信息 产业成为发展最迅速的产业之一。半导体器件的微型化发展要求，使得计算机的 体积减小、功耗大幅度降低，芯片集成度也已达到1 0 8 - - 1 0 9 数量级【1 1 0 作为微电子 技术发展基础的硅基材料，现在仍处于主导地位，然而由于其加工工艺及自身性 能的影响，目前硅基材料在信息技术的发展过程中遇到了如下的一些主要障碍 2 1 1 3 1 ：如传统的半导体光刻技术的发展已接近极限；目前器件所用的硅单晶材料对 生长、掺杂工艺也提出了越来越高的难度和要求；由于半导体器件集成度的不断 提高，元器件间距也己接近极限距离，而元器件的间距的不断缩小，使得元器件 附近由于电流的通、断信号感应而产生的干扰日益加重，从而进一步影响器件运 算速度的提高，同时大量元器件的高度集成致使硅芯片的散热问题成为难以克服 的障碍等等。而且芯片的尺寸每缩d x - - 分之一，其制造成本就会变为原来的五倍【4 j 。 同时因为电子作为目前信息技术中的信息载体所具有的固有限制，使得硅基材料 已无法满足以微电子技术为核心技术的信息产业技术今后的发展需要【5 】。在这一背 景下，发展新的信息材料和研究新的器件构造将成为今后微电子技术发展的一个 重要方向。 1 2 本课题研究意义 上世纪7 0 年代以来，科学家们在生物电子学方面陆续有了一些重大发现：首 先是发现了“有信息 和“无信息”这两种状态可以代表脱氧核糖核酸的不同状 态；接着又发现了“开”和“关这两种电态功能也存在于一些有机化合物分子 当中，这样一个有机物分子就可以相当于一个分子开关；后来又进一步发现蛋白 质分子中的氢也具有“开和“关 这两种状态，也就是说一个蛋白质分子就可 以看成是一个开关旧。这一系列的发现促使了生物电子学新领域的诞生，随着生物 黑龙江大学硕士学位论文 工程和微电子技术这两种高科技的互相渗透，以美国为首的各发达国家掀起了对 生物计算机方面的研究热潮，预示着生物计算机时代即将到来 7 1 。蛋白质分子开关 是生物计算机的最基本构件，所以系统研究蛋白质的物理特性尤其是温度特性对 微电子技术的发展具有重要的实际意义。 1 3 本课题相关领域研究进展 自从发现了蛋白质分子中的氢具有“开 和“关”两种电态功能，激发了研 究者们设计研制生物电子元器件的灵感，利用蛋白质分子的这一特性可以制作生 物分子开关，为各种逻辑存储器件和分子超大规模集成电路芯片的进一步研制奠 定基础。目前，有关蛋白质在半导体方面特性的研究和生物电子元器件方面的研 制已经成为研究热点，并取得了一定的进展。 1 3 1 蛋白质分子半导体特性研究进展 早在上世纪4 0 年代初，a s z e n t - - - g y i o e r g y i 率先提出了蛋白质分子可能具有 半导体性质和能带结构的预言，并给出了一般蛋白质分子的禁带宽度在2 5 e v 之 间理论计算结果【引。2 0 世纪6 0 年代，e l e y 又通过电导度实验证明了蛋白质的半导 体性质，实验测得大多天然蛋白质分子的禁带宽度在2 6 e v 3 1 e v 之间【9 】。此后， 科学家们从能带的角度出发对蛋白质分子做了大量计算，并对蛋白质分子的电子 结构提出了许多不同的模型，但是这些模型大多存在明显不足【l o l 。如日本的右卫 门佐等人采用a s m o s c f 法计算了类似肽结构的甲酰胺的能带间隔，计算结果约 为7 e v ，接近实验值，但是由于他们所用方法缺乏一般性，不能被广泛采用【1 1 】。 1 9 8 8 年，南开大学的王磊光根据以往的计算和实验，提出蛋白质大分子具有 非晶半导体的性质【1 2 】。 1 9 9 6 年，黑龙江大学温殿忠、雷鸣亮采用晶体轨道法给出了蛋白质分子的能 带理论公式，从理论上说明某些蛋白质具有半导体特性【1 3 】。 2 0 0 4 年，湖北大学的张彦海等从q 一螺旋蛋白质分子的电子传递角度出发，建 立了一种二维网格模型，计算并得出其禁带宽度符合a s z e n t - - - g y i o e r g y i 提出的蛋 第1 覃绪论 白质分子的禁带宽度标准的结论【1 4 j 。 2 0 0 5 年，陈志远等根据b 折叠蛋白质分子中的电子传递机制，建立了一种网 格模型，计算并得出这种蛋白质分子的禁带宽度基本符合a s z e n 岣i o e r g y i 提出 的一般蛋白质分子的禁带宽度标准的结论【1 5 1 。 目前，尽管在蛋白质分子的能带结构计算方面取得了一定的进展，但是仍然 很难实现对蛋白质作完整的分子计算，这仍是蛋白质研究课题中的一个重要方向。 1 3 2 蛋白质电子元器件研究进展 由于光敏蛋白质材料一细菌视紫红质( b a e t e r i o r h o d o p s i n ，简称b r 蛋白质) 分子的许多优良特性，如热稳定性和光化学稳定性极好，一般情况下可十年不变； 高的空间分辨率；光谱使用范围较宽；响应速度快；量子效率高等等，促使目前 光敏蛋白质分子元器件的发展比较快，所以b r 蛋白质元器件的研究也就成为一大 热点【1 6 1 ，目前在光存储和光信息处理等方面均取得了一定的研究进展，如b i r g e 等利用b r 的分支光循环特性研制了双光子三维存储器【1 刀。l i n d v o l d 利用b r 膜研 制了光寻址的空间光调制器【1 8 】，在公共信息显示方面有重要应用。富士公司研制 成功了模拟人眼来识别物体的形状和运动状态的图像识别仪，这个识别仪的基本 构件就是用b r 蛋白质制成的一种生物传感器【6 】。 1 9 9 7 年，w i l l e r 等人通过两种方法，使硝基螺旋吡喃和葡萄糖氧化酶等发色 团发生共价偶联，如图1 1 所示，再与电化学电极成功组装成生物光电开关，促进 了生物光电器件方面的发展【1 8 1 【1 9 1 。 2 0 0 1 年，曹轶宾成功研制出了r c p s s p d d a 一4 a t p a u 自组装膜，通过一系 列的实验研究，得出了r c 蛋白质能将光能有效地转化为电能的结论，开辟了生物 传感器设计的另一途径 2 0 1 。 1 9 9 7 年日本的“三菱电子 和s u m m t o m 公司的科学家成功研制生物二极管。 虽然这种生物二极管的实际应用还存在很多技术问题，但确实已朝超级芯片的产 生迈出了关键的一步刚。 黑龙江大学硕士学位论文 舢豇 h 2 n l y s 争t 哗k 虬爹 o l l s - c h h 2 - c n h 图1 1 金电极上硝基螺旋毗喃与葡萄糖氧化酶连接的示意图 f 螗1 - 1d i a g r a mo f n i t r o s p i r o p y r a na n dg o xc o n n e c t i o no ng o l de l e c t r o d e s 2 0 0 4 年，美国麻省理工学院的的马克鲍多研究小组开发出一种新型电池，这 种电池是以菠菜叶绿素中的蛋白质为能源的。目前这种新型电池最多能连续工作 2 1 天，而且它的能量转换率也较低只有1 2 1 2 2 。 2 0 0 7 年，美国能源部西北太平洋国家实验室( p a c i f i cn o n h w e s tn a t i o n a l l a b o r a t o r y ，简称p n n l ) 的研究人员在提纯的s h e w a n e l l ao n e i d e n s i s 细菌外膜蛋白 质中成功地观察到了蛋白质与细胞外化学物质电子传输过程，这使制造微型生物 电池成为可能。但是这种新型生物燃料电池发电量小，与活细菌电池的发电量相 当且持续时间非常短，仅仅几秒钟，离实际的商业应用还有相当长时间因】。 此外，2 0 0 6 年3 月在日本召开的第5 3 应用物理学相关联合演讲会上，松下电 器产业与日本奈良尖端科学技术大学研究生院组成的研究小组提出使用蛋白质制 作驱动f p d 的t f l i ( 薄膜晶体管) 和非挥发性内存的技术。2 0 0 8 年4 月，在日本 千叶县召开的日本应用物理学会会议上，科学家们发布了由东京大学、松下公司、 东京工业大学和大阪大学联合开发的利用蛋白质制造高性能存储器的技术，这些 技术都是利用了金属微粒的自组装性质，将含有金属微粒的蛋白质溶液涂布到玻 璃和硅衬底上以后，金属微粒就会按照基本固定的间隔规则整齐地排列， 圉1 之使用蛋白质制作的薄膜晶体管t f t 的过程 f i g l - 2 p t o o e s s o f u s i n g p r o t e i n t o p r o d u c e d t h i n - f i l m w a l a s i s t o r l t t 如图12 所示1 2 4 1 。再经过清洗和干燥处理，并加热至5 0 0 ( 3 后，硅衬底上就会只留 f 金属且其排列较规则整齐，当对其加上电压就会有电流通过，以此来获得存储 器必备的电学特性，然后利用传统的半导体技术，在硅衬底上制作电极，从而制 成相关器件 2 4 1 。这种器件的成功研制，为研究突破硅基半导体技术光刻极限提供 了一个新的研究方向。 1 4 主要研究内容 本课题是对固定在硅基表面的蛋白质分子展开的温度特性研究，我们利用化 学修饰的方法，首先使淀积在硅片上的金膜表面产生活泼基团，从而将蛋白质分 子固定在基片上。然后测试其温度特性、为进一步检测电学、磁学和力学等物理 方面的特性奠定基础。具体研究工作内容如下： ( 1 ) 搜集课题相关资料，了解课题国内外相关领域的发展概况； ( 2 ) 研究蛋白质分子的固定原理及方法，确定实验方案并进行实验研究，对 方寨中存在的实际问题进行改进； ( 3 ) 对蛋白质分子的电流温度关系进行理论分析，完成硅基表面固定蛋白质 分子的温度特性进行测试。 黑龙江大学硕士学位论文 1 5 本章小结 本章从课题研究的背景出发，介绍了本研究课题的目的意义，重点阐述了课 题相关领域的国内外研究进展，包括蛋白质分子半导体特性和蛋白质电子元器件 的研究进展，并对本课题的主要研究工作进行了简单介绍。 第2 章蛋白质分子的特点 2 1 引言 第2 章蛋白质分子的特点 蛋白质是一类重要的生物大分子，是生命现象的主要物质基础。元素分 析表明，蛋白质主要含有碳、氢、氧、氮等元素，此外，还含有少量的硫， 有些蛋白质还含有一些其它的元素，主要是磷、铜、铁、碘、锌和钼等【2 5 1 。 蛋白质的分子量变化范围很大，大约5 0 0 0 10 0 00 0 0 或更大一些，生物界中 蛋白质的种类估计在1 0 4 0 1 0 5 0 数量级，造成种类如此众多的原因主要是参 与蛋白质组成的氨基酸在肽链中排列顺序不同基础【2 6 1 。 2 2 蛋白质分子的结构 氨基酸是带有氨基的有机酸，它由一个氨基、一个羧基、一个氢原子和 个r 基团组成【2 7 1 ，如图2 1 所示。氨基酸中口碳原子( 即与羧基c o o h 相连的碳原子) 周围的4 个不同的基团按照四面体排布，两个互为镜象的形 式称为l 一异构体和d 异构体，而组成蛋白质的基本单位是2 0 种l 异构体的口- 氨基酸，这2 0 种l 异构体的口氨基酸在结构上的不同之处在于它们的侧链 ( 即图2 1 中的r 基团) 不同【2 8 1 。氨基酸通过自身的羧基与氨基相互脱水缩合 形成肽键，进一步形成肽链，肽链是规则的线性长链，肽链又通过折叠成特 定的空间构象后，才能称为蛋白质【2 9 1 。因此，在一定程度上，氨基酸的序列 决定了蛋白质的空间结构。 h r i o c 。一 l n h 3 + 图2 1 氨基酸的化学结构式 f i g 2 1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fa m i n oa c i d 黑龙江大学硕士学位论文 肽键从结构来看就是酰胺键，只是它不是单纯的羧基与氨基的反应产物，而是两 个口氨基酸间的酰胺键，是一组靠得很近的酰胺键【3 们。n 原子上的未共用电 子对与c = o 双键中的兀电子云发生的电子共振相互作用( r e s o n a n c ei n t e r a c t i o n ) ， 使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转，因此使肽键处在一个刚性的平面上， 此平面被称为肽键平面【3 1 1 。两个肽键平面之间的口碳原子，可以作为一个旋 转点形成二面角( d i h e d r a la n g l e ) ，二面角的变化，决定着多肽主键在三维空间 的排布方式，是形成不同蛋白质构象的基础【3 2 1 。如图2 2 所示，绕c 口一n 键轴旋转的二面角( c n c 口一c ) 称为t o ，绕c a c 键轴旋转的二面角 ( n - - c a c n ) 称为、i ，原则上9 和、l ，可以取1 8 0 0 + 1 8 0 0 之间的任意值， 这样我们就可以用9 和、i ，这两个二面角或扭角来描述多肽链主链的各种可能 构象【3 3 1 。 r 图2 2 肽链结构图 f i g 2 - 2t h es t r u c t u r eo fp e p t i d ec h a i n 2 3 维持和稳定蛋白质分子构象的化学键 蛋白质分子最显著的特征是蛋白质分子在天然状态下均有其独特而稳定的构 象，构成蛋白质分子的所有原子在三维空间中的结构排布就是蛋白质分子的构象， 又称空间结构、立体结构、三维构象、高级结构等，主要包括蛋白质的二级结构、 超二级结构、结构域、三级结构和四级结构【2 8 1 。蛋白质分子的结构又决定了蛋白 质的特殊功能及其活性。而蛋白质分子中各部分之间的相互作用又是决定蛋白质 第2 章蛋白质分子的特点 能否形成稳定天然结构的关键因素，这些相互作用是共价键和非共价键，共价键 包括肽键和二硫键，非共价键又包括氢键、离子键、疏水键和范德华力等，如图 2 3 所示【3 4 1 。共价键的结合强度很大，一般的外界因素对其影响很小，虽然非共价 键较共价键的结合力要小得多，容易断裂，但由于非共价键在蛋白质分子中数目 众多，因此它们在维持蛋白质分子的严密空间结构及其生理功能方面扮演着十分 重要的角色【3 5 】。 图2 - 3 维持蛋白质分子构象的各种化学键 乱氢键；b 离子键；c 疏水键；d 二硫键 f i g 2 3t h e v a r i o u sc h e m i c a lb o n d st om a i n t a i nt h ep r o t e i nm o l e c u l es 缸u c t l j r e a h y d r o g e nb o n d ；b i o n i cb o n d ；c h y d r o p h o b i cb o n d ；d d i s u l f i d eb o n d 2 3 1 氢键 氢键是一种特殊形式的偶极偶极键，它是由两个电负性原子对氢原子的静电 引力作用所形成的【3 6 1 。可用如下的通式表示： - i 瑚 d 、a 是电负性强的原子( 如氧、硫、氮等) ，d 是质子给予体，a 是质子接受体， h a 是氢键，洲是共价键。氢键是质子给予体d 和质子接受体a 之间的一种 黑龙江大学硕士学位论文 特殊类型的相互作用，氢键的键能比共价键弱，比范德华力强，在生物体系中为 8 4 3 3 4 k j m o l ，键长为0 2 5 - - 0 3 4 n m ，比共价键短口8 】。 氢键是形成和稳定蛋白质二级结构的最主要的作用。同时由于水中也有很多 的氢键，所以生物机体的结合水也可与处于蛋白质分子的表面能形成氢键的侧链 产生相互作用来稳定蛋白质分子的结构1 3 7 。 2 2 2 离子键 又称盐键，氨基酸侧链的极性基团，能解离出阳离子或阴离子，阴阳离子间 由于静电引力作用而形成离子键p 8 】。离子键具有较强的亲水性，且绝大部分分布 在蛋白质分子的表面，因此离子键的存在可增加蛋白质分子的水溶性【3 9 1 。 2 3 3 范德华力 蛋白质分子中的一个原子的原子核吸引另一个原子的外围电子时，会导致这 些原子的正负电荷中心发生瞬时的相对偏离，形成瞬间偶极，这些瞬间偶极之间 所发生的相互作用，被称为色散力，也称为范德华力( v a nd e rw a s l ) 1 2 7 1 。它是一种 普遍存在作用力，且与原子间的距离有关，当原子间距大约为0 4 - - 0 6 n m 时，这种 力就表现出较大的集合性质。范德华力比较弱，一般为0 4 1 8 - - 一0 8 3 6 k j m o l ，但是 由于蛋白质分子内的原子数目非常多，范德华力又具有可加性，所以这种力也是 不能忽视的1 4 0 。 2 3 4 疏水键 构成蛋白质分子的氨基酸的侧链基团的性质是不同的，有些是含有电荷 的基团或具有显著的电偶极矩的侧链，它们很容易与极性溶剂分子一水分子 产生相互作用，或是形成氢键，或是融合于水中，故相应氨基酸称为亲水性 氨基酸；而另一些残基的侧链是非极性的，不表现出和水或其他极性基团有 相互作用的能力和倾向，所以这种氨基酸则称为疏水性氨基酸【2 8 1 。疏水键就 是由氨基酸残基上的非极性基团为避开水而聚集在一起所产生的一种聚集力 【4 1 1 。它是维持蛋白质的三级结构的最主要的稳定力量。 第2 章蛋白质分子的特点 2 3 5 二硫键 二硫键由一条或两条肽链上的两个半胱氨酸残基的巯基经脱氢氧化生成，因 此它属于共价键【4 2 1 。其主要作用是加固由氢键、范德华力、离子键、疏水键等非 共价键所维持的蛋白质分子的严密的空间结构，但二硫键并不存在于所有的蛋白 质分子当中，由于这种共价键较强的结合力，所以含有二硫键的蛋白质分子，会 因为二硫键的断裂，使其空间结构遭到破坏【4 3 】。 以上介绍了稳定和维持蛋白质分子构象的化学键，包括氢键、离子键、范德 华力、疏水键和二硫键等。可以看出氢键主要是维持蛋白质二级结构的，疏水键 主要是维持蛋白质三级结构的，离子键主要是维持蛋白质四级结构的。除了上述 的这些化学键，还存在一些因素影响蛋白质分子的空间结构，如配位键，温度、 p h 值等等】。总之，是上述蛋白质分子中众多因素共同作用来形成和维持蛋白质 分子的空间结构的【4 5 1 。 2 4 本章小结 本章从蛋白质分子的基本构成单元一氨基酸出发介绍了蛋白质分子的结构特 点，重点介绍了维持和稳定蛋白质高级结构的因素，包括氢键、离子键、疏水键、 范德华力、二硫键等。 黑龙江大学硕士学位论文 3 1 引言 第3 章蛋白质分子的固定方法 近年来随着生物电子学的诞生，生物分子器件的研究得到越来越广泛的 关注，使得微电子技术和蛋白质工程这两种高技术相互渗透。所以研究蛋白质分 子的温度特性可以为蛋白质分子电子器件的研制提供实验基础和理论支持。然而 目前还未见有相关文献报道。研究硅基表面固定蛋白质分子的温度特性，蛋白质 分子的有效固定是首先要解决的问题。 3 2 蛋白质分子的固定原理 我们将蛋白质分子在固定基体材料表面的稳定吸附定义为蛋白质分子的 固定，所以蛋白质分子结构的灵活性会因这种稳定吸附在一定程度上受到约 束【4 6 1 。前面我们说过蛋白质是由多条肽链通过折叠成特定的空间构象而形成 的生物大分子。由肽链结构可知，其一端存在一个自由的羧基( c o o v 0 ，另一端则 都存在一个自由的氨基( - n h 2 ) t 3 1 1 ，因此由它所形成的蛋白质分子是两性电解质，蛋 白质分子表面就带正电和负电，但其表面净电荷的正负性，是由蛋白质分子所处 溶液的p h 值所决定的【4 7 】。 固定基体材料的表面电荷与蛋白质分子表面的相反电荷所产生的静电作用力 将是蛋白质分子固定在基体材料表面的主要推动力h 8 】。所以蛋白质分子在基体材 料表面的固定吸附效果将主要取决于蛋白质分子表面的碱性氨基酸和酸性氨基酸 基团的密度、蛋白质分子的三维空间构象和固定基体材料本身的表面电性【4 9 1 。因 此我们在蛋白质分子固定的实际过程中要综合考虑这些因素来提高蛋白质分子在 材料表面的固定效果【5 0 1 。 3 3 蛋白质分子的固定方法 蛋白质分子的固定技术是从2 0 世纪6 0 年代随着酶固定技术发展起来的 第3 章蛋白质分子的固定方法 现代生物工程领域的一项新兴技术，目前已经有了一定的进展并取得了较大 的成果【5 1 1 。在固体材料表面固定的蛋白质分子有去折叠的趋势一方面蛋白质 分子结构发生改变，另一方面会使蛋白质分子表面暴露的疏水侧链与固体材 料表面产生疏水作用，同时因为固定后蛋白质分子的排列往往是无规则的， 所以蛋白质分子的固定会对其生物活性产生一定的影响【5 2 1 。因此保持蛋白质 分子良好地生物活性，不影响其形状和功能，也是判断蛋白质分子是否有效 固定的一个重要方面。目前，蛋白质分子的固定化方法主要有：吸附法 ( a d s o r p t i o n ) 、共价结合( 偶联) 法( c o v a l e n tb i n d i n g ) 、交联法( c r o s s l i n k i n g ) 、 包埋法( e n t r a p m e n t ) ，如图3 1 所示【5 3 】。 a ) 吸附法b ) 共价结合法 c ) 交联法d ) 包埋法 图3 1 蛋白质分子的固定化方法 f i g 3 1p r o t e i nm o l e c u l e si m m o b i l i z e dm e t h o d s 3 3 1 吸附法 吸附法是一种利用静电作用和物理作用力来固定蛋白质分子的方法，范 德华力、疏水作用、万电子亲和力、静电作用和氢键是蛋白质分子与基体材 料之间的主要吸附力。吸附法是最简单的固定方法，根据蛋白质分子与基体 黑龙江大学硕士学位论文 材料间吸附力的性质，又分为离子吸附和物理吸附【5 们。 1 、离子吸附法。根据蛋白质具有两性的多电解质特性，在其解离状态下 通过静电引力( 即离子键合作用) 而使蛋白质分子固定在离子交换剂上的固 定化方法，因此这种离子交换剂所带电荷是与蛋白质分子所带电荷相反的 【5 5 1 。离子吸附法操作比较简单，蛋白质分子的固定效果比较牢固，在工业上 有广泛的应用。 2 、物理吸附法。使用硅胶、活性碳、多孔玻璃、石英砂和纤维素等作为 吸附剂，利用其对蛋白质分子很高的吸附能力而将蛋白质分子固定到材料基 体的表面上的固定方法【5 6 1 。这是一种最古老的方法，操作简单，基体材料能 够反复利用，反应条件比较温和，但由于蛋白质分子与基体的固定结合不牢 固易脱落，所以应用不多【5 7 1 。 3 3 2 共价结合法 共价结合法是利用材料基体表面的反应性基团与蛋白质分子中的某些基 团反应形成共价键如醚键、酰胺键、酯键等，而将蛋白质分子固定在材料表 面固定化方法。这种固定化方法的前提条件是基体材料表面要有n h 2 、o h 、 c o o h 这些反应性基团，因此，首先就要对基体材料进行表面改性处理，所 以使得材料的表面设计成为科学家们研究的一个重要方面1 5 引。共价结合法克 服了吸附法中蛋白质分子不能长时间固定在材料基体表面且易脱落的缺点 【5 外。目前常用的共价结合法有： 1 、重氮法。这种方法一般的操作步骤是：先用n a n 0 2 和稀h c i 处理在 表面带有氨基的固定基体材料表面上形成重氮盐衍生物，然后这些重氮盐再 与蛋白质分子上酪氨酸的酚基或组氨酸的咪唑基形成相应的偶氮衍生物，也 可以由a 一氨基或8 氨基与两分子重氮盐反应得到双偶氮化合物，从而实现蛋 白质分子的固定【6 们。 2 、肽键法。这种方法是将表面带有羧基或氨基的基体材料与蛋白质分子中的 氨基或羧基直接偶联形成肽键，从而将蛋白质分子固定在基体上 6 1 】。 第3 章蛋白质分子的固定方法 3 3 3 交联法 交联法是利用双功能或多功能试剂直接与蛋白质分子发生反应，使其彼 此交联形成网状结构的固定化蛋白质【6 2 1 。交联法与共价结合法都是使用化学 结合的方法来实现蛋白分子的固定的，他们的区别是交联法使用的是戊二醛， 联苯胺2 ，2 双磺酸、1 ，5 二氟2 ，4 二硝基苯胺、已二酰亚胺酸二甲酯等交 联剂6 3 1 。由于交联固定法化学反应比较激烈，多数情况下会导致固定化蛋白 质分子的活性较脆弱，另外这种方法所用的交联剂一般价格较贵，因而限制 了该方法的广泛应用6 4 1 。 3 3 4 包埋法 包埋法是在聚合物材料的微囊结构或格子结构中定位蛋白质分子。这种 方法固定的蛋白质分子是被包埋起来，可以有效地防止蛋白质分子的释放， 对蛋白质分子的生物活性的破坏也较小，而且不影响包埋体外的小分子物质 渗入体内与蛋白质分子接触6 5 】。同时因为这种方法操作较为简便，所以相对 来说一种比较理想的方法，目前应用较多。但是在该方法中，包埋体所用材 料会对底物和氧的扩散产生不同程度的阻碍从而影响蛋白质分子的固定效果 【6 6 1 。常用的方法包括：凝胶包埋和微囊包埋。 除了单独使用上述各种方法外，目前两种方法结合运用是应用较多的， 如吸附交联、包埋交联等6 7 1 。固定化技术的研究目前虽然已经非常深入， 但在方法的运用中不同程度地存在着这样或那样的缺点，所以新技术的研究 与开发也一直是固定化技术的重要任务6 8 1 。目前研究的新的固定化技术方法 主要有溶胶凝胶固定化、膜固定化、超微载体固定化、无载体固定化、亲和 配基固定化、絮凝吸附固定化、组合固定化等【6 9 1 。 3 4 蛋白质分子固定方法的选择 前面我们介绍了许多蛋白质分子的固定化方法，但是并不是所有的蛋白 黑龙江大学硕士学位论文 质分子的固定都能应用一种统一的方法【7 0 1 ，那么如何选择一种最佳的固定化 方法也是影响蛋白质分子固定效果的关键因素。基体材料表面的几何性质、 物理特性( 如电性能) 和化学性能、蛋白质分子的性质还有材料表面与蛋白 质分子的作用效率都将影响蛋白质分子的固定效果【7 1 1 。所以我们在选择蛋白 质分子的固定方法时要综合考虑蛋白质分子的结构、性质和基体材料表面的 物理化学特性7 2 1 。 3 5 本章小结 本章首先介绍了蛋白质分子固定的原理，重点阐述了蛋白质分子的固定化方 法：共价结合( 偶联) 法、吸附法、交联法、包埋法，包括各种方法的原理、 优缺点比较，并对如何选择合适的蛋白质分子的固定化方法进行了简单讨论。 第4 章硅基表面固定蛋白质分子的实验研究 第4 章硅基表面固定蛋白质分子的实验研究 4 1 引言 综合考虑课题研究的要求和本实验室的实际条件，本课题采用共价结合 法固定牛i g g 蛋白质分子( 免疫球蛋白) 。在制作有金属电极硅片上，通过化学修 饰的方法，使硅基表面产生活泼的基团，利用共价结合的方法把蛋白质分子固定 到硅基表面上，其基本过程如图4 1 所示。 l j 硅基表面上的活泼基团蚴牛i g g t _ 、 a ) 硅基表面预处理b ) 活泼基团修饰在硅基表面上c ) 将牛i g g 固定在硅基表上 图4 1 硅基表面固定蛋白质分子的基本过程 f i g 4 一lt h eb a s i cp r o c e s s e so f c a t t l ei g gi m m o b i l i z a t i o no ns i l i c o nw a f e r 4 2 实验原理 本课题我们首先用葡聚糖修饰硅基表面，在其表面上修饰上羧基基团，然后用 黑龙江大学硕士学位论文 1 一乙基3 ( 3 二甲基氨基丙酸) 碳二亚胺( e d c ) n 一羟琥珀酰亚胺( n h s ) 作为活化液来活化硅基表面羧基，然后通过蛋白质分子与硅基表面的羧基反应， 将蛋白质分子牛i g g 固定在硅基表面上，实验原理如图4 - 2 所示。 0 觐l c 姗璐 - _ _ _ _ _ - 坚巨一巨 图4 - 2 在葡聚糖修饰的硅基表面上固定蛋白质分子的实验原理 f i g 4 - 2p r i n c i p l eo f t h ei m m o b i l i z a t i o no f p r o t e i n st ot h ee a r b o x y m e t h y l d e x t r a n - m o d i f i e ds i l i c o n s u r f a c e 4 3 材料与试剂 材料：淀积有厚度为5 0 n m 铂膜的单晶硅片。 主要试剂：牛免疫球蛋白抗原( 牛i g g ) 、磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e d s a l i n e t w e e n 2 0 ，p b s t 0 0 1m o l l ，p h7 o ) ( 北京索莱宝科技有限公司) ； n - 羟琥珀酰亚胺( n h y d r o x y s u c e i n i m i d e ，n h s ) 、疏基十一烷醇 ( 11 - m e r c a p t o 一1 - u n d e e a n 0 1 ) 、表氯醇( e p i c h l o r o h y d r i n ) 、二甘醇二甲醚 ( d i e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h y le t h e r ) 、溴乙酸( b r o m o a c e t i ea c i d ) ( s i g m a 公司) ； 1 一乙基- 3 ( - 3 - 二甲基氨基丙酸) 碳二亚胺( 1 - e t h y l 一3 ( 一3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e ，e d c ) ( 上海生工生物工程技术服务有限公司) ；葡聚糖t 5 0 0 ( 上海共价化学科技有限公司) ；其余试剂均为分析纯。 4 4 实验过程 1 、硅片清洗：将硅片先在丙酮中超声清洗1 0 m i n ，然后用n 2 吹干。再 用p i r a n h a 溶液( 浓h 2 s 0 4 和双氧水的混合溶液，体积比7 ：3 ) 浸泡5 m i n ， 第4 章硅基表面固定蛋白质分子的实验研究 取出后用去离子水清洗，最后用n 2 吹干备用。 2 、为使硅基表面成为亲水性表面，我们先将硅片浸入到溶剂是无水乙醇： 水( 体积比8 ：2 ) 巯基十一烷醇的溶液中反应6h ，溶液浓度为5 x 1 0 一m o l l 。 3 、将硅片浸入到o 6m o l l 的表氯醇溶液中反应4h ，注意此溶液的溶 剂为体积比为1 ：1 的二甘醇二甲醚和0 4m o l l 的n a o h 的混合液。 4 、用去离子水、无水乙醇、去离子水清洗。 5 、将硅片浸入到葡聚糖溶液中2 0h ，来处理传感表面，葡聚糖溶液的配 制方法是在1 0 m l 的0 1m o l l 的n a o h 溶液溶解3 9 葡聚糖。 6 、为形成羧甲基化的硅基表面实现共价固定蛋白质分子，将硅片浸入到 1m o l l 溴乙酸中反应1 6h ，溴乙酸溶液的溶剂为2m o l l 的n a o h 溶液，实 验过程中要注意避光。 7 、将硅片浸入到新配制的e d c n h s 的混合溶液中活化处理6h ，来激 括硅基面的羧基基团( c o o h ) ，其中e d c 的浓度为0 2 m o l l ，n h s 浓度为0 0 5 m o l l ，溶剂为o 1m o l l 的m e s ( 2 吗啉乙磺酸) 的缓冲溶液，实验过程中 注意避光。 8 、浸入到浓度为2 m g m l 的牛i g g 溶液( p b s 缓冲液，p h 7 0 配制) 中 置于4 冰箱2 4 h 。 9 、用o 2m o l l 的乙醇胺盐酸缓冲液p h 8 0 来屏蔽没有反应的羧基和n h s 形成的中间体，时间为o 5 h 。 这样就完成了蛋白质分子在硅基表面的固定，最后用p b s 缓冲液清洗后 浸于p b s 缓冲液中置于4 。c 冰箱中保存待测。蛋白质分子在硅基表面固定的 结构如图4 - 3 所示，图中1 是硅片，2 是金膜或铂膜，3 是巯基亲水性表面，4 是葡聚糖，5 是羧甲基化的基体和牛脑免疫球蛋白质形成的肽键，6 是牛脑免疫球 蛋白质i g g ，7 是n a c l 溶液( 1 0 m m 0 1 ) 。 蛋白质分子的固定过程中要注意：( 1 ) 因为表氯醇、二甘醇二甲醚和溴 乙酸是三种有毒试剂，因此实验过程中要注意采取必要的防护措施；( 2 ) 葡 聚糖溶液处理硅基表面后会有多余的葡聚糖附着在硅基表面上且比较粘稠， 黑龙江大学硕士学位论文 图4 - 3 蛋白质分子在硅基表面固定的结构不慈图 f i g 4 - 3t h es t r u c t u r ed i a g r a mo fp r o t e i nm o l e c u l e si m m o b i l i z e do nt h es i l i c o ns u r f a c e 这些葡聚糖会因溶解到随后的各种溶液中发生反应影响蛋白质分子的固定效 果，更为严重的是这些葡聚糖会包裹与表氯醇真正结合的最里一层的葡聚糖 分子，使蛋白质分子脱落，所以在此步骤完成后一定要彻底清洗掉多余的葡 聚糖。( 3 ) 因为每一步聚的持续时问长，为降低对固定效果的影响，所以要 采取措施减少试剂蒸发。 4 5 实验结果与讨论 4 5 1 硅基表面固定蛋白质分子的s e i j 分析 我们使用f e i 公司的q u a n t a2 0 0 型扫描电子显微镜来观察硅基表面固定 牛i g g 分子的表面形貌。图4 4