（环境科学专业论文）东海海域麻痹性贝毒毒性早期预测指标及快速检测方法的研究.pdf

a b s t r a c t t h ep o i s o n i n ga n dd e a t he v e n t sc a u s e db yt h e a l g a e - d e r i v e dt o x i n sa r e s o m e t i m e sr e p o r t e da r o u n dt h ew o r l d ，i nw h i c hp a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n ga n d d i a r r h e t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n ga r et h em o s tl i f e - t h r e a t e n i n gt o x i n s p s pt o x i n s ， d i s t r i b u t i n gw i d e l yi nm a r i n ee n v i r o n m e n t ，a r ep o t e n tn e u r o t o x i n sw h i c hc a nb l o c k v o l t a g e g a t e ds o d i u mc h a n n e l so l le x c i t a b l ec e l l sa n df i n a l l yr e s u l ti ns i g n so f p a r a l y s i s t h ea c c i d e n tr a t eo ft h er e dt i d ei si n c r e a s i n gq u i c k l yi nc h i n a so f f s h o r e a r e a sa n da m o n gt h e mt h ee a s tc h i n as e ah a sb e c o m eh i g ho c c u l t c n c co fr e dt i d e o v e rr e c e n ty e a r s t op r o b ei n t ot h ep r e l u d em a r k e ro ft o x i c i t yo fp a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ( p s p ) ，t h em i c ew e r ee x p o s e dt o 1 i - t g k gt o x i ng t x - 1 ，4 ，t h es a m p l i n gt i m e sw e r e 6 0 ，9 0 ，12 0m i nr e s p e c t i v e l y t h r o u g ht e s t i n gt h ec o n t e n t so fn e u t r a lt r a n s m i t t e r s a c h , n oa n dt h ea c t i v i t i e so ft h e i rc a t a l y s te n z y m e sa c h e , n o s ，w ed i s c u s st h e i r p r o b a b i l i t i e st ob et h eb i o i n d e xo fp s et h el e v e l so fg s h 、g s h - p xa n ds o d a c t i v i t yw e r ea l s om e a s u r e d t h er e s u l t ss h o wt h en e u t r a lt r a n s m i t t e r si nt h eb r a i no f a c u t ee x p o s u r em i c ec h a n g es i g n i f i c a n t l yc o m p a r e d 晰mc o n t r o lg r o u p ( p o 01 ) ，a t t h es a m et i m et h es e n s i t i v e n e s sa n dd u r a t i v i t yh a v eb e e nr e f l e c t e d ，埘t l lw h i c hw e c o n c l u d et h a tt h e ym i g h tb et h eb i o i n d e x e so fp s eb e s i d e s ，t h ee l e m e n t a r yr e s e a r c h o na n t i - o x y g e ni nl i v e ra n dk i d n e yi n d u c e db yp s p s h o w s ，t h eg s h l e v e li nl 【i d l l e yi s s e n s i t i v eb u tw en e e dt oc o n f i r mt h i sc o n c l u s i o nt h r o u g hf u r t h e re x p e r i m e n t c o m b i n e dw i t ht h es e n s i t i v eb i o i n d e x e sc o n f i r m e db e f o r e ，w em a k ea n i n t e n s i v es t u d yo nc h a n g i n gr e g u l a r i t yo fp s pt o x i n si nm i c eb l o o da n db r a i ni no r d e r t ob u i l daf a s td e t e c t i o nw a y t h eg t x - 1 ，4e x p o s u r et i m ew a sf i x e do n15m i na n ds i x d o s e sw e r e0 5 ，1 ，3 ，5 ，7 ，9 l x g k g n e u t r a lt r a n s m i t t e r sa c h l a c h ea n dn o 1 0 sw e r e o b s e r v e d t h er e s u l t ss h o wt h er e l a t i o nb e t w e e na c h l a c h eb i o i n d e xa n dg t x 一1 ，4 d o s eh a sa s s u m e dad o s e - e f f e c tc h a n g ei nv e r ys h o r tt i m e ( 15m i n ) t h ec o n c e n t r a t i o n c u r v ew a y , w h i c h i m p r o v e st h et r a d i t i o n a lm b aw a y , c a nb eu s e di nd e t e r m i n i n gp s p t o x i n si ns e a s h e l l s w i t l ll l i g hs e n s i t i v e ，l o wl i m i ta n dl i t t l ei n j u r y , t h i sn e w w a yo ff a s t d e t e c t i o no fp s ph a sg r e a tp o t e n t i a l k e yw o r d s ：p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ；n e u r a lt r a n s m i t t e r s ；e a r l yb i o - i n d e x ； f a s td e t e c t i o n 上海师范大学硕士学位论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：陈雪 日期：2 0 0 9 - 4 - 2 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：陈雪 日期： 2 0 0 9 - 4 2 导师签名：于金莲 日期：2 0 0 9 - 4 - 2 8 7 上海师范大学硕士学位论文 1 赤潮概述 第一章绪论 1 1 赤潮定义 赤潮( r e dt i d e ) ，目前国际学术界多称为有害藻华( h a r m f u la l g a lb l o o m s ，简 称为h a b s ) ，是指在一定的海洋环境条件下，海水中某些浮游植物、原生动物 或细菌爆发性增殖或高度聚集，从而使海水变色的一种生态异常现象【1 1 1 2 1 。应当 说明的是，赤潮并不一定都是红色的，由于其发生的原因、种类和数量的差异， 水体会呈现出不同的颜色，有红色、绿色、黄色、棕色等。目前，世界上已有3 0 多个国家和地区不同程度地受到过赤潮的危害，日本是受害最严重的国家之 一。近十几年来，由于海洋污染日益加剧，我国赤潮灾害也有加重的趋势，由分 散的少数海域逐渐发展到成片海域，一些重要的养殖基地受害尤重，给生态环境 和人类健康带来巨大损失。 1 2 赤潮爆发的原因、范围及其危害 随着我国沿海工业、农业、海水养殖业以及旅游业的迅速发展，工业废水、 含化肥和农药的江河入海水、生活污水以及海水养殖污水的过度排放，使得近海 海水中氮、磷营养元素大量增加，造成近岸水体富营养化；海水渔业的过度捕 捞亦造成海洋生物的食物链失衡，加上全球气候的变迁、海洋运输的发展，这些 原因都导致赤潮发生的频率增高、范围扩大、危害严重，加剧了海洋环境质量 的日趋恶化【3 1 。 近年来我国近海赤潮发生次数呈明显增加趋势。2 0 0 4 年，国内发生了多起规 模较大的赤潮事件，其中包括5 月份发生在东海浙江沿海海域的原甲藻赤潮，面 积达1 0 0 0 0 平方千米，世界罕见；6 月1 1 - 1 8 日，在渤海黄河口海域发生了棕囊藻 和米氏凯伦藻赤潮，总面积超过5 0 0 0 平方千米；在南海大亚湾海域，6 月1 4 1 7 日也发生了面积超过1 0 0 平方千米的红海束毛藻赤潮。长期以来，赤潮发生次数 较多的地区有广东、山东、浙江、辽宁和上海近海，其中长江口、珠江口、辽东 湾、杭州湾、莱州湾、大亚湾以及天津近海等是赤潮的多发区。据国家海洋局调 3 上海师范大学硕士学位论文 查资料显示，2 0 0 7 年，全海域共发生赤潮8 2 次，累计面积1 1 6 1 0 平方公里，其中东 海全年共发生赤潮6 0 次，累计面积约98 0 0 平方公里，占首位，赤潮高发期集中 在5 7 月f 4 j 。2 0 0 8 年，全海域共发生赤潮6 8 次，累计面积1 3 7 3 8 平方公里，赤潮 累计面积增力h 2 1 2 8 平方公里。其中，渤海1 次，面积3 0 平方公里；黄海1 2 次，累 计面积1 5 7 8 平方公里；东海4 7 次，累计面积1 2 0 7 0 平方公里；南海8 次，累计面积 6 0 平方公里1 5 1 。可见，东海仍为我国赤潮的高发区，其赤潮发生次数和累计面积 分别占全海域的6 9 和8 8 。 目前，赤潮已成为一项全球性的海洋公害，1 9 9 0 年联合国将赤潮列为世界三 大近海污染问题之一。其危害的主要表现形式有： 首先，危害其他物种的生存，破坏海洋生态系统。有害赤潮藻类分泌的粘液 吸附在海洋动物的鳃、呼吸道粘膜上，致使鱼、虾、贝等窒息死亡；大量藻类密 集于海面表层，使阳光和氧气难于透过，造成水下其它生物缺少氧分和阳光，生 存繁殖受限；赤潮后期，藻类大量死亡，在细菌分解作用下，造成环境严重缺氧 或产生硫化氢等有害物质，使海洋生物缺氧或中毒死亡。这些过程既恶化了海洋 生态系统，又严重破坏了海洋资源，对海洋生物和人类的生存环境构成了极大的 威胁。 其次，产生毒素，威胁人类健康。有些赤潮生物能够分泌毒素，当鱼虾、贝 类处于有毒赤潮区域内，摄食这些有毒生物时，虽不能被毒死，但生物毒素可在 其体内积累，其含量大大超过食用时人体可接受的水平。这些鱼虾、贝类如果不 慎被人食用，就会引起人体中毒，严重时可导致死亡。海洋中可引发赤潮的藻类 约有3 0 0 多种，其中有毒赤潮藻为8 0 种左右【6 】。因误食含赤潮毒素的贝类、鱼类 引起的人体中毒、死亡的事件在世界各国范围内每年都有发生。据统计，自2 0 世纪6 0 年代以来，我国已有6 0 0 多人因误食有毒的贝类而中毒，其中2 9 人死亡。 2 0 0 2 年，福建宁德、青田、罗源等地先后有5 0 多人因食用甲锥螺而中毒，其中3 人死亡；2 0 0 5 年，广州、香港等地相继发生多起因食用怀疑受藻源毒素污染的“带 子 而导致的中毒事件；2 0 0 7 年5 月，发生在香港的6 名男女因误食有毒扇贝引起 中毒的报道，再次给人们敲响了警钟。毒素已成为赤潮危害中最严重的形式之一。 1 3 我国东海海域有害赤潮的现状与趋势 近年来，我国东海沿岸地区大量工农业废水和生活污水向海洋排放，使近海 4 上海师范大学硕士学位论文 水域富营养化进程加速，海洋赤潮发生的频率、规模和危害大增。至l j 2 0 0 0 年为止， 东海区已记录的赤潮事件共1 5 9 次，占全国沿海赤潮发生总数的4 4 2 ；2 0 0 2 年， 东海海域共发现赤潮5 1 次，累计面积超过9 0 0 0 平方公里，发生次数占全国海域的 6 5 ：2 0 0 4 年，东海海域共发现赤潮5 3 次，累计面积约1 7 8 8 0 平方公里，发生次 数占全国海域的5 6 ；2 0 0 6 年东海海域记录赤潮5 1 次，累计面积约1 5 1 7 0 平方公 里，发生次数占全国海域的4 9 ；2 0 0 7 年东海海域记录赤潮6 0 次，累计面积9 7 8 7 平方公里，发生次数占全国海域的3 7 。 受长江径流等陆源输入影响，东海海域形成了其特有的富营养环境，目前已 经成为我国赤潮发生最严重的区域之一( 见图1 1 ) 。东海赤潮发生区域主要位于长 江口及其邻近海域，其中长江口附近、浙中南近海海域、厦门近岸海域为东海赤 潮多发区。其中长江口及其邻近海域赤潮发生最为频繁。赤潮的高发期主要集中 在每年的5 - - 6 月，而且毒赤潮频率高，约占总数的2 0 。据统计，2 0 0 1 年至2 0 0 7 年，东海赤潮总发现次数接近4 0 0 次，是渤海、黄海和南海3 个海域之和的1 7 倍 7 1 。 赤 潮 次 敦 图1 - 1 我国各海区赤潮发生次数统计( 2 0 0 7 ) f i g 1 - 1s t a t i s t i c so fh a b se v e n ti nc h i n as e a ( 2 7 ) 作为我国赤潮高发的“重灾区，东海的流场和地理环境非常适合藻类的生 长。近年来，该海域赤潮暴发呈现出发生时间不断提前、持续时间不断加长、发 生面积不断扩大、有毒有害藻类逐渐增加等特点【8 】。2 0 0 2 年，舟山口外几百平方 公里海域就出现了有毒的“亚历山大藻”；2 0 0 5 年，一种直接对鱼类有害的“米 氏凯伦藻 更是霸占了东海1 5 0 0 0 平方公里海域，造成了重大经济损失。由于藻 类品种的广泛性和复杂性，未来东海赤潮仍然有大规模向有毒有害演变的趋势， 5 上海师范大学硕士学位论文 一旦出现更大规模的有毒藻赤潮，如“米氏凯伦藻”的“姐妹藻 等，将严重威 胁该海域的生态安全和人类健康。由此可见，我国东海海域已成为富营养化严重、 特大规模赤潮频发的典型赤潮高发区，结合东海典型赤潮藻毒素开展其快速检测 技术的研究具有重要现实意义。 2 赤潮毒素研究概况 在世界范围内，由赤潮毒素引起的人体中毒和死亡事件屡见不鲜，同时毒素 的污染对水产加工业也造成了巨大的经济损失，因此赤潮藻毒素已成为世界海洋 环境研究者的研究热点之一。虽然藻毒素大多来自于有毒赤潮藻类，但藻类产生 的毒素往往通过贝类、鱼类等媒介富集，造成人类中毒，因此这些毒素通常被称 为贝类毒素而不是赤潮藻毒素。根据中毒症状及毒素传递媒介的类型，贝毒分为 以下五种：麻痹性贝毒( p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，p s p ) 、腹泻性贝毒( d i a r r h e t i c s h e l l f i s hp o i s o n i n g ，d s p ) 、记忆缺失性贝毒( a m n e s i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，a s p ) 、 神经性贝毒( n e u r o t o x i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，n s p ) 、西加鱼毒( c i g u a t o x i n s ，c t x ) 以及溶血性毒素( h e m o l y t i ct o x i n s ) 等【9 】( 其比较见表1 1 ) 。其中p s p 和d s p 是 我国海洋赤潮生物中最为常见的两种。 表1 1 几种赤潮藻毒素的比较 t a b 1 1c h a r a c t e r i s t i c so fh a bt o x i n s 6 上海师范大学硕士学位论文 2 1 麻痹性贝毒( p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，p s p ) 麻痹性贝毒( p s v ) 是目前己知的藻毒素中分布最广、发生毒素事件次数最频 繁，同时对人类影响最为严重的一种毒素。据文献记载最早发生该类中毒事件的 地区，集中在欧洲和北美的一些海域【l 们，而我国目前由食用染毒贝类引起的中 毒事件，主要发生在东海和南海海域。我国海域常见的p s p 产毒藻类有4 种：塔 玛亚历山大藻阳t a m a r e n s e ) 、链状亚历山大藻臼c a t e n e l l a ) 、微小亚历山大藻 搿m i n u t u m ) 和链状裸甲藻俺c a t e n a t l u ) 。一些经济贝类，如翡翠贻贝、栉孔扇 贝、文蛤、青蛤、近江牡蛎和织纹螺等经过食物链的作用滤食这些有毒藻类，极 易在体内积累p s p 毒素。人类误食染毒贝后易发生p s p 中毒甚至死亡。据不完全 统计，我国f 1 2 0 世纪9 0 年代以来，已先后发生几十起p s p 中毒事件。1 9 9 1 年3 月 2 8 日大亚湾附近居民因食用受赤潮毒素污染的翡翠贻贝，造成4 人中毒，2 人死亡； 2 0 0 2 年，福建宁德、青田、罗源等地先后发生5 0 多人因食用甲锥螺而中毒，其中 3 人死亡；2 0 0 4 年7 月，宁夏银川市发生了一起居民因食用市场销售的海产品织纹 螺引起的p s p 中毒事件，共5 5 人中毒，其中1 人死亡，麻痹性贝毒再次引起国家 卫生部的高度重视。p s p 的毒性很强，摄入l m g 即可致人死亡，其化学性质非常 稳定，烹调加热不能消除其毒性【i l 】。因而市售贝类p s p 的含量及毒性水平是人们 极为关注的问题，也是保证海产品的质量和促进海产品出口贸易的一个必要条 件。 2 2 腹泻性贝毒( d i a r r h e t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，d s p ) 腹泻性贝毒( d s p ) 是由有毒赤潮藻类鳍藻属( d i n o p h y s i s ) 和原甲藻属 7 上海师范大学硕士学位论文 ( p r o r o c e n t r u m ) 中部分藻种产生的一类脂溶性天然化合物，主要成分为软海绵酸 ( o k a d a i ca c i d ，o a ) 及其衍生物。食用贝类引起的腹泻性症状早在6 0 年代就在荷兰 与日本发现，腹泻性贝毒( d s p ) 主要分布在欧洲与日本，我国近海产d s p 毒素的 有毒赤潮藻也很广泛。近年来对中国沿海部分海区贝类毒素的调查显示【1 2 1 ，辽 东湾、胶州湾等海域d s p 的存在比较普遍。在胶州湾海域发现d s p 的“肇事藻 之一渐尖鳍藻fd i n o p h y s i sa c u m i n a t a ) ；1 9 9 7 年秋至1 9 9 8 年春广东沿海多次赤潮发 生期间的几种优势赤潮藻类中也有利玛原甲藻( p r o r o c e n t r u mt i m a ) 和具尾鳍藻 ( d i n o p h y s i sc a u d a t e ) g - 在t 1 3 】；中国黄海、东海和南海均发现有具尾鳍犁1 4 1 。到目 前为止，尚未见人类因中腹泻性贝毒而致死的报道，但它的分布范围广、发病 率高，几乎所有发达国家都在本国海域发现和检出本类毒素。腹泻组分o a 及其 衍生物枷t x 1 和d t x - 3 还是肿瘤促进因子，同时具有遗传毒性，可引致d n a 加合物的形成【”】。由于其潜在的药理作用、生物活性和毒理机制，o a 被列入十 大海洋生物毒素之列【1 6 1 。因此有关d s p 的研究不仅受到赤潮界的重视，而且已 引起医药领域和细胞生物学研究者的关注和青睐。日本海洋生物工程研究公司已 成功实现了利用水华束丝藻制取石房蛤毒素( s a x i t o x i n ，s t x ) 、海洋细菌生产河豚 毒素，为赤潮生物代谢产物的开发利用、新型海洋药物重要导向化合物的发现与 研究开创了先河。 2 3 记忆缺失性贝毒( a m n e s i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，a s p ) 由记忆缺失性贝毒引起的中毒事件1 9 8 7 年首先发生于加拿大，人们食用染毒 贻贝三天后出现一系列消化系统症状和神经症状，包括记忆力的丧失、昏迷。该 事件导致3 人死亡以及一部分人永久性的短暂记忆力缺失现象。后研究发现该产 毒藻为硅藻中的拟菱形藻属( p s e u d o n t t z s c h i a ) ，毒素被确认为软骨藻酸( d o m o i c a c i d ) ，之后在北美、北欧一些国家，澳大利亚以及日本都发现此属的其它一些种 类有毒。目前a s p 毒事件在欧洲和北美报道较多【1 7 1 9 1 ，我国尚未有发现毒素 的研究报道。然而值得注意的是，在对2 0 0 4 - 2 0 0 5 年连续两年四季度长江口及邻 近海域有毒藻类和赤潮毒素的调查【2 0 】中发现，该海域存在多种有毒种类，其中 包括产记忆缺失性贝毒( a s p ) 的尖刺拟菱形藻、多列拟菱形藻和多纹拟菱形藻； 有毒藻在5 - 6 月份出现频率最高。及时对有害藻种产生及增长进行监测，有利于 阻止有毒藻进入到食物链中，从而在源头上杜绝赤潮毒素对公众健康、水环境及 8 上海师范大学硕士学位论文 自然资源的危害。 2 4 神经性贝毒( n e u r o t o x i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，n s p ) 神经性贝毒( n s p ) 的危害相对较小，早先分布主要局限于美国的墨西哥湾沿 岸，1 9 9 3 年新西兰大规模的n s p 中毒事件的发生说明其产毒藻的分布范围广于预 料【2 1 1 。目前, - - i p a 肯定的n s p 产毒藻为短裸甲藻( g y m n o d i n i u mb r e v e ) 。除了对人的 影响之外，n s p 毒素还可导致大量的鱼类死亡。神经性贝毒的主要致毒机理为， 与麻痹性贝毒抑制钠离子内流的作用不同，n s p 对神经细胞膜上的钠通道有刺激 其钠离子通透性增大的作用，从而增加神经细胞膜的去极化作用而导致神经传导 的异常。 2 5 西加鱼毒( c i g u a t o x i n s ，c t x ) 西加鱼毒( c i g u a t o x i n ，c t x ) ，又称雪卡毒素，是目前发现的危害性较严重 的赤潮生物毒素之一，主要存在于珊瑚鱼的内脏、肌肉中，尤以内脏中含量为高 p 2 。目前已发现三类西加鱼毒，即太平洋西加毒素( p a c i f i cc i g u a t o x i n ) 、加勒比海 西加毒素( c a r i b b e a ne i g u a t o x i n ) 和印度西加毒素( i n d i a nc i g u a t o x i n ) 。近十几年来， 随着人类对海洋蛋白依赖性的增加，在世界范围内平均每年发生的c t x 中毒人数 达到5 万多人。有证据表明，由于鱼类的徊游性和鱼类产品的贸易扩大，西加毒 素的影响范围已从加勒比海沿岸逐渐扩大到其他海域地区【2 3 1 。我国南海诸岛、 台湾海峡和香港地区常有c t x 中毒事件发生，西加毒素已成为影响各国渔业经济 发展和公共卫生的一大障碍。 3 麻痹性贝毒结构、毒性和分析方法 3 1 麻痹性贝毒的化学结构 麻痹性贝毒( p s p ) 的基本结构是有两个胍盐基的四水化嘌呤( 图1 2 ) 。目 前已经分离出的p s p 大约2 0 种化合物属于石房蛤毒素( s t x ) 一族。两个亲代 化合物是s t x - n 一羟基类毒素衍生出的新石房蛤毒素( n e o s t x ) ，大多数衍生物是 这两个特定位置硫酸盐化的结果。根据r 4 基团的不同将p s p 分为四大类： 氨基甲酸酯类毒素s t x 、n e o s t x 、膝沟藻毒素l _ 4 ( g t x l 4 ) 9 上海师范大学硕士学位论文 n 磺酰氨甲酰基类毒素g t x 5 ( b 1 ) 、g 6 ( b 6 ) 、c 1 4 脱氨基甲酰基类毒素d c s t x 、d c n e o s t x 、d c g t x l - 4 n - 羟基类毒素h y s t x 和h y n e o s t x 其中氨基甲酸酯类中的s t x 、n e o s t x 、g t x l - 4 最常见，而s t x 占p s p 的8 5 以上，也是目前人类研究最广泛的一类p s p 2 4 1 。 r 1 h 2 n 图1 2 麻痹性贝霉霉素的结构 f i g1 - 2t h es t r u c t u r eo fp s p t o x i n s 3 2 麻痹性贝毒的毒性效应 p s p 是有效的膜神经毒素，能造成神经细胞电压敏感性钠离子通道( v s s c ) 高亲和力障碍【2 5 1 。p s p 通常与细胞膜离子结合，引起细胞膜内外正常离子的流动 失衡，造成膜电位反常，使人出现晕眩、休克等神经中毒症状。p s p 毒素中，s t x 毒性最大。d a x i o 2 6 1 等研究了s t x 对成年猫的毒性作用，研究表明注射 s t x 0 0 l i n g k g ，猫大脑中s t x 的浓度峰值为1 8 1 n g g ，说明s t x 在浓度较高时， 能够透过血脑屏障进入大脑。s t x 属于非二肽神经毒素，它以钠离子通道蛋白作 为其专一的靶分子，是钠离子通道的阻断剂 2 7 1 ，老鼠腹腔注射s t x 的l d s 0 是 1 0 9 9 k g 。 从中毒症状看，p s p 毒素作用的靶为神经、呼吸、心血管等系统。p s p 毒素 可能有局部麻醉、降压、肌肉松弛、抗肿瘤等活性。在研究中发现【2 8 i p s p 对大鼠 肝、肾功能损害相对比较严重，造成这种情况的原因可能与p s p 的代谢有关。过 去一直认为p s p 在体内不存在代谢转化通过肾排出，最近一份研究表明【2 引，经口 染毒的p s p 在体内除通过泌尿系统排出外，还可以经肝脏代谢转化，经过肠道排 泄。亚急性实验的病理学检测结果显示( 染毒大鼠) 肝、肾、骨胳肌等组织均有 不同程度的病理学改变，表明p s p 的慢性毒性行为与急性中毒情况有所不同，p s p 1 0 上海师范大学硕士学位论文 存在一定的蓄积毒性。大多数p s p 通过胃肠粘膜被吸收，s t x 的排出主要由肾小 球过滤作用参与【2 9 1 。 3 3 麻痹性贝毒的检测分析现状 随着赤潮毒素的危害越来越多地被人们所重视，对海水中特别是食用海洋生 物中贝类毒素的监测已在世界范围内达成共识，对藻毒素开展快速灵敏监测技术 研究的需要就显得尤为迫切。如今已建立的赤潮毒素检测方法大致可以分为两 类：生物测试法和物理化学检测法。 3 3 1 生物测试法 目前唯一得到国际公认的a o a c 标准生物检测p s p 的方法是1 9 3 7 年由 s o m m e ra n dm a y e r 建立的小鼠生物法( m o u s eb i o a s s a y 。m b a ) 。小鼠法【3 0 1 主要 是通过向固定种系和体重的小鼠腹腔注射毒素样品提取液，记录小鼠的存活时间 来计算样品毒素的量。m b a 方法相对简单，能测定所抽提的全部毒素的毒性， 是目前所有实验室认可的标准检测方法。现阶段我国在进出口海产品贝毒检测及 调查分析沿海p s p 的污染状况时广泛使用p 1 1 。这种方法是从个体水平上反映污染 物的毒性作用，但不能测定毒素的组分和结构，而且容易出现假阳性结果。因此， m b a 法只作为毒素的最初筛选方法，需要进一步准确地检测毒素必须结合其他 方法。 细胞毒性监测( c e l lb i o a s s a y ) 是利用毒素对细胞的毒性作用来监测毒素存 在与否的一种技术。以赤潮毒素中的p s p 贝毒细胞毒性监测为例【3 2 1 ，这些毒素可 以作用于n a + 通道位点1 ，阻断n a + 内流，当在培养的细胞中加入n a + 通道活化剂 藜芦定或n a + k + a t p 酶抑制剂乌本苷，细胞会由于n a + 内流过多而造成肿胀， 甚至死亡。但如果在以上过程中同时加入具n a + 通道阻断作用的p s p 毒素，n a + 内流会因拮抗作用而受到限制，使得细胞成活，由此可以确定毒素的存在，并作 出定量估计。细胞毒性监测方法无需事先知道毒素的特异受体部位，因此往往作 为毒素活性检测的首选方法。美国已有商品化的p s p 细胞毒性试验试剂盒。由于 美国及西方国家严禁出 1 p s p 标准品，加上我国基层单位一般无细胞培养条件， 所以该方法尚未在我国建立并应用。 随着现代分子生物学技术的发展，细胞监测方法已发展到基于基因水平上的 研究。f a i r e y 3 3 】等将c f o s 基因引入藻毒素监测技术中，通过构建c f o s 荧光素酶信 1 1 上海师范大学硕士学位论文 使基因，将样品中毒性的大小通过测定酶活力的方法定量的表达出来。由于信使 基因异常灵敏，从而使这种测试方法在水中藻毒素含量极低时即可检出，为测定 藻毒素毒理活性、监测藻毒素污染提供了快捷灵敏的手段，是一种很有潜力的生 物监测方法。 3 3 2 物理化学检测法 利用麻痹性贝毒毒素在碱性条件下被氧化生成荧光物质而建立的高效液相 色谱法( 1 1 i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 是目前报道使用最多的 p s p 检测法，该方法准确、灵敏度高、既能定性又能定量，能分析各种麻痹性贝 毒结构组分刚。刘仁沿、付云娜等【3 5 】采用h p l c 法分析检测了我国沿海双壳贝 类体内赤潮毒素；吴施卫、江天久等【3 6 】对广东省近岸海域1 8 个地点的贝类样品 进行了h p l c 检测。考虑到仪器设备昂贵、毒素标准物质缺乏等缺点，限制了其 在基层的普及应用，我国仅有少数几个单位购买了分析p s p 的h p l c f l d 仪器设 备。此外，质谱分析方法与色谱技术结合( l c m s ) 的运用，从根本上提高了色 谱法检测的选择性及灵敏性，但这一技术还需要纯化的毒素质谱分析数据提供定 性检测的数据。 免疫监测技术的基本原理在于应用毒素诱发免疫反应产生抗体，利用抗体对 抗原的特异性识别来对毒素进行监测。酶联免疫吸附法( e n z y m e 1 i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 是免疫技术中应用较多的一种测定方法，广泛用于 p s p 、d s p 、n s p 等赤潮毒素的监测中。其优点是灵敏度高、特异性强、仪器设 备简单、样品前处理过程简单，特别适于现场监测和大量样本快速筛查，近年来 在国外分析化学领域受到高度重视并得到迅速发展。国内仅有郭皓、张纹等【3 7 。8 】 报道过e l i s a 技术在贝类毒素检测方面的运用；于兵、罗辉武等【3 9 2 , 0 对e l i s a 方 法作了相关的比较研究。近十年来，基于免疫技术开发的藻毒素e l i s a 检测试剂 盒发展迅速，国外的一些化学试剂公司已有商品化的成套试剂盒( 如 r i d a s c r e e n r ；s a x i t o x i nt e s t r ) 出售，我国已有使用购进的国外试剂盒分 析检i 贝w j v s p 的文献报道【4 l 】，但进口的试剂盒价格昂贵，而我国在赤潮藻毒素的免 疫诊断试剂盒开发技术上几乎是空白。尽管受到各种条件限制，e l i s a 技术由于 其高灵敏性，仍然是目前研究的热点。 其他物理化学检测方法如毛细管电泳法近几年也被尝试用于赤潮毒素的分 1 2 上海师范大学硕士学位论文 离检测。李大志【4 2 】等( 2 0 0 2 ) 成功地运用c 唧技术发现了大连海域黑石礁海区扇 贝的软骨藻酸污染。但传统的c e u v 法检测灵敏性较低，并且往往受样品中其它 生化物质的干扰。利用二极管阵列检测器取代单波长u v 检测器可以在一定程度 上提高检测的选择性【4 3 1 。由于藻毒素结构复杂、功能多变且具有不稳定性，因 此仪器分析方法发展相对缓慢，主要用于定量检测各种已知类型的毒素，并对新 发现的毒素进行结构、性质等方面的分析。 3 4 检测分析技术的未来发展趋势 经过2 0 多年的发展，麻痹性贝毒的检测分析技术已从最初的生物受体法，逐 渐发展形成了化学法、免疫法、细胞内毒性法等多种筛选技术。在上述介绍的各 种检测方法中，e l i s a 试剂盒的开发是国内外研究的热点，但需投入大量资金； h p l c 技术因其操作简单、适应范围宽，备受推广：l c m s 因实验成本较高，目 前开展的研究不是很多；生化检测技术则因其可操作性的限制，未得到广泛的应 用。但作为高灵敏度的检测方法，生化检测技术依然是今后发展的主要方向。 现有的监测手段多是对鱼、蚌类等海洋生物的某个器官进行检测，这些方法 不能对p s p 毒性进行早期预测。当发现毒素时，污染已经产生，对渔业的损害也 已经造成，往往不能达到及早预报和及早防治的目的。因此亟需建立和完善快速、 灵敏的麻痹性贝毒毒性早期检测方法，对环境进行有力且准确的监测及预报，及 早阻止污染物进入到食物链，将毒素对环境的损害降到最低。 3 5 本论文关于麻痹性贝毒早期预测指标的研究 污染物对个体的影响无论多复杂，或最终的影响如何严重，最早的作用都是 从细胞内分子水平上作用开始，然后逐步在细胞、器官、个体、种群、群落、生 态系统各个水平上反映出来。所以从分子水平筛选赤潮毒素的毒性具有早期预测 的价值 4 4 1 。目前国际上关于赤潮藻毒素毒性效应研究的发展方向与研究热点是 从分子水平上，在低剂量短时间无行为效应的情况下，研究赤潮藻毒素的毒性作 用。国内外的研究现状反映出关于赤潮藻毒素的毒性早期预测成为了研究的热 点和难点。根据麻痹性贝毒的致毒机理，p s p 毒素是一种典型的n a + 通道阻滞剂， 通过阻滞n a + 进入细胞内，使膜失去极化状态，从而广泛地阻断神经肌肉的传导 1 3 上海师范大学硕士学位论文 而产生麻痹，可见它具有典型的神经毒性作用。探讨其毒性信息传递的分子机制 对寻找该毒素的早期预测指标具有重要意义。本论文主要从第一信使、第二信使 两个方面讨论麻痹性贝毒的毒性信息传递的分子机制，为早期预测指标的确定提 供依据。 4 快速检测指标的介绍 麻痹性贝毒对生物神经系统或心血管系统有高特异毒性，它是细胞膜n a + 通道高度专一性阻滞剂，能阻滞神经细胞的兴奋和传导。针对p s p 属于神经性毒 素这一特点，选择神经信号传导的第一信使和第二信使作为研究对象，对筛选出 早期预警指标具有重要的意义。本论文选择了传统上关于神经毒素对信号传导作 用研究较广泛的指标神经递质和氧化损伤作为筛选指标，寻找麻痹性贝毒的 生物标志物。 4 1 神经递质类筛选指标简介 神经系统通过化学物质作为媒介进行信息传递的过程称为化学传递。化学传 递物质即是神经递质( n e u r o t r a n s m i t t e r ) ，主要在神经元中合成并储存于突触前 囊泡内。信息传递过程中由突触前膜释放到突触间隙，作用于相邻神经元突触后 膜，从而产生生理效应。按照神经信息生物学的划分，神经递质属于细胞外的信 使物质，被称为第一信使【4 5 l 。 胆碱能神经递质乙酰胆碱( a c h ) 是最早被确定的一种神经递质。它在外周 神经和中枢神经中都有广泛的分布。在外周神经中，a c h 主要分布于躯体运动神 经、交感副交感的节前纤维、副交感的节后纤维等；在中枢神经系统中，a c h 主要存在于大脑皮层、纹状体、海马、丘脑等处，与学习记忆、感觉运动等神经 活动有密切关系。乙酰胆碱的合成过程包括三种物质：胆碱乙酰化酶或称乙酰转 移酶( c h o l i n ea c e t y l a s e ，c h a c ) 、胆碱( c h o l i n e ) 和乙酰辅酶( a ) 。乙酰胆碱 酯酶( a c h e ) 属于水解酶类，主要分布于神经系统、肌肉、红细胞等，哺乳动 物脑中乙酰胆碱酯酶的含量占全部a c h e 的8 0 9 0 。它是膜结合蛋白质，至少有 三分之二的酶结合于细胞膜上【4 6 1 ，在中枢及外周神经系统与乙酰胆碱( a c h ) 受体 一起参与完成神经神经及神经肌肉突触之间动作电位的传递，其主要生理功能 1 4 上海师范大学硕士学位论文 是催化水解a c h ，使之水解成为胆碱和乙酸：乙酰胆碱+ h 2 0 一乙酸+ 胆碱，从而 维持神经冲动的正常进行【4 7 4 引。a c h e 活性中心由丝氨酸、组氨酸、谷氨酸、丙 氨酸、色氨酸和两个甘氨酸共7 个残基组成，直接作用于a c h 的催化三元体可能 是丝氨酸、组氨酸和色氨酸3 个残基组成的【4 9 】。如a c h e 活性降低或失活，则引 起乙酰胆碱在中枢胆碱能突触、神经肌肉接头等处的积累，神经传递受到阻碍， 动物会表现出各种病状，如惊厥、麻痹等【5 0 】。 乙酰胆碱酯酶是一个很经典的毒理指标，五十年代末，w e i s s 就提出对自然 水环境中极低浓度的有机磷杀虫剂可用鱼脑或无脊椎动物的乙酰胆碱酯酶 ( a c h e ) 活力抑制程度来检测，这个方法随即为许多学者接受。现在一般已确认， 2 0 以上的a c h e 抑制证明暴露作用的存在，5 0 以上的a c h e 抑制表明对生物的 生存有危害，对于检测非急性毒性极为有用。多年来，这项指标一直为生态毒理 学研究所采用，最近资料表明这项生化指标已被用到定量结构活性关系( q s a r ) 的研列5 1 1 。 1 9 8 0 年前后，f u r c h g o t t 等 5 2 - 5 3 】提出了介导内皮依赖性血管舒张现象的物质一 一内皮细胞舒张血管因子，后经实验证实其本质即为一氧化氮( n o ) 。近年来， n o 作为典型的逆行信使分子，参与了神经传导与发育及长时程增强( l t p ) 的诱导 和维持等过程，在学习和记忆中起到重要作用，因此日益受到研究者们的重视。 一氧化氮( n o ) 是既具有神经递质功能，又兼有自由基特性的气体分子。大量研 究表明【5 4 】，n o 的过量表达与氧化损伤及神经毒性作用关系密切。n o 在体内巨噬 细胞、嗜中性粒细胞、肝实质细胞中的释放则可能与体内炎症和免疫功能密切相 关。过量的n o 既是弱的氧化剂，也可以同强氧化剂，如0 2 发生反应，生成 o n 0 0 - 产物，抑制线粒体呼吸链，进而导致神经退化性疾病【5 引。同时，过量的 n o 还可促进神经细胞内产生内源性活性氧，进而启动细胞凋亡程序【5 6 1 。体内n o 由一氧化氮合酶( n o s ) 唯一催化合成，n o s 催化精氨酸水解，再氧化生成瓜氨 酸和n o ，瓜氨酸可通过精氨酸代琥珀酸重新合成精氨酸。n o 作为一种非经典的 神经递质，它不储存于突触囊泡中，不通过胞裂方式释放，而是以扩散方式到达 临近靶细胞，产生细胞生理效应。n o 对靶细胞的直接作用是活化可溶性鸟苷酸 环化酶，进而催化生成细胞内第二信使c g m p ，诱导细胞内多种信息传导机制。 由于n o 是一种性质活泼、极易扩散的气体分子，在体内半衰期极短，目前多是 1 5 上海师范大学硕士学位论文 以n o s 活性来反映n o 的水平。 4 2 氧化损伤类筛选指标简介 脂质过氧化是指活性氧自由基攻击生物膜中多烯不饱和脂肪酸( p u f ) 而引 起的一系列氧化过程【5 刀。在生理状态下，生物体内的自由基不断地产生，也不 断地被消除，处于平衡状态的自由基浓度是极低的。在病理情况下，环境物理因 素或外源性化学物质直接或间接诱导产生的自由基得不到及时清除，或者内源性 自由基的产生和消除失去了正常平衡，常常会造成自由基对机体的损伤【5 8 】。自 由基主要攻击机体内的脂质使之发生过氧化，过氧化脂质在人体内积累可以逐渐 消弱甚至破坏细胞的正常生理功能，使蛋白质