（材料学专业论文）壳聚糖赖氨酸缀合物的制备及其凝血性能研究.pdf

摘要 本文采用赖氨酸修饰壳聚糖来改进其凝血性能，有望制得具有实用价值的止 血材料。主要内容包括以下部分： 一、 采用碳二亚胺偶联法在不同脱乙酰度壳聚糖分子链上缀合不同取代度的赖 氨酸，以红外光谱( f t i r ) 和元素分析测试法对壳聚糖一赖氨酸缀合物进行 表征，结果表明赖氨酸已缀合到壳聚糖分子链上，且其引入量随着加入量的 增加而提高。通过研究分析各组材料与血液有形成分( 主要是红细胞和血小 板) 及凝血因子的相互作用，初步评价了壳聚糖在修饰前后凝血性能的变化。 通过光密度测试和血细胞计数，考察了各组材料对红细胞和血小板的聚集特 性。壳聚糖能明显诱发红细胞聚集，这种凝聚作用随着脱乙酰度的增大明显 增强，且此聚集效果随材料用量的加大而提高。赖氨酸的引入对材料和红细 胞间相互作用的贡献并不明显。壳聚糖能在短时间内激活血小板，使其失去 碟状形态而成球形。随着壳聚糖脱乙酰度增加，其对血小板的粘附和聚集作 用显著增加。引入赖氨酸后，血小板聚集率和粘附数量均提高较大，且影响 程度和赖氨酸的引入量有关。壳聚糖衍生物血小板复合物可加速血纤维蛋 白胶的生成，且影响效果与衍生物对血小板的粘附聚集作用一致。部分活化 凝血活酶时间( a p t t ) 、凝血酶原时间( p t ) 和凝血酶时间( t t ) 的测定结果表明 壳聚糖不能直接作用于凝血因子，缀合赖氨酸后亦不能和凝血因子直接作 用。 二、比较了壳聚糖赖氨酸缀合物、壳聚糖一鸟氨酸缀合物及胶原的凝血性能，对 照结果表明，壳聚糖一赖氨酸缀合物对血小板的聚集能力与胶原接近，且其 与血小板之间并不仅是简单的静电相互作用，而可能和血小板膜表面物质存 在某种特异性结合( 特别是胶原受体g pia i ia ，g p i v ) 间存在特异结合， 因为其引发的血小板聚集率明显高于分子结构相似的壳聚糖及其与鸟氨酸 的缀合物。 三、细胞毒性实验结果表明，壳聚糖一赖氨酸缀合物细胞毒性较低。 关键词：壳聚糖，赖氨酸，红细胞，血小板，凝血因子 a b s t r a c t i nt h i sw o r k ，ap r o s p e c t i v eh e m o s t a t i cm a t e r i a lw a sp r e p a r e dv i am o d i f y i n gc h i t o s a n w i t hl y s i n e t h em a i nc o n t e n t so f t h et h e s i si n c l u d et w op a r t sa sf o l l o w s ： 1 c h i t o s a n - l y s i n ec o n j u g a t ew a sp r e p a r e db ym o d i f y i n gc h i t o s a n o fd i f f e r e n t d e a c e t y l a t i o nd e g r e e w i t h l y s i n eu s i n g1 - e t h y l 3 ( 3 一d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d ea n dn - h y d r o x y s u c c i n i m i d ea sc o u p l i n gs y s t e m ，a n dt h ep r o d u c t s w a sc h a r a c t e r i z e db yf t i ka n de l e m e n ta n a l y s i s c o a g u l a n tp o t e n t i a lo ft h e p r e p a r e dp r o d u c t sa n dc h i t o s a nw a sr e v i e w e dt h o u g h tt h e i ri n t e r a c t i o nw i t hb l o o d c o n t e n t s ，s u c h 弱e r y t h r o e y t e s ，p l a t e l e t sa n dc o a g u l a t i o nf a c t o r s r e db l o o d c e l l m a t e r i a l si n t e r a c t i o nw a sm o n i t o r e dt h r o u g hc h a n g e si no p t i c a ld e n s i t y , a n d r e db l o o dc e l l s n u m b e rw a sc a l c u l a t e db e f o r ea n da f t e rt h ee x p e r i m e n t , a n d p l a t e l e t m a t e r i a l s i n t e r a c t i o nw a se v a l u a t e di nt h es a m ew a y c h i t o s a nc a l l a p p a r e n t l yt r i g g e r t h e a g g r e g a t i o no f 豇y t h r o c y t e s ，a n d t h ee f f e c tw a s d o s e - d e p e n d e n ta n di nl i n ew i t hi t sd e a c e t y l a t i o nd e g r e ea sw e l la n dh a sl i t t l et o d ow i t hl y s i n e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tp l a t e l e tw a sa c t i v a t e da ss o o n 硒i tw a s e x p o s e dt o c h i t o s a nm e m b r a n e ，a c c o m p a n i e dw i t h c h a n g e i nm o r p h o l o g y p l a t e l e t sa d h e r e ds t r o n g l yo nt h es u r f a c eo fc h i t o s a n - l y s i n em e m b r a n ea n dw e r e b o u n dt oe a c ho t h e rt of o r ma g g r e g a t e dm a s s t h ed a t ai nf i b r i nc l o t - f o r m a t i o n t i m e ss h o w e dt h a tc l a i t o s a n - l y s i n e p l a t e l e tm i x t u r eg a l la c c e l e r a t et h ep r o c e s so f f i b r i n g e lf o r m a t i o n i nc o a g u l a t i o n a c t i v i t i e se x p e r i m e n t , a c t i v a t e d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i nt i m e ( a p t r ) ，p r o t h r o m b i nt i m e 口t ) a n dt h r o m b i nt i m ec h a n g e d l i t t l ei ne a c hg r o u p ，a n do n ec a nc o n c l u d et h a ta l lt h ed e r i v a t i v e sc a n ti n f l u e n c e c o a g u l a t i o nf a c t o r sd i r e c t l ya n dt h e i rh e m o s t a t i cp o t e n t i a lm a yb ei n d e p e n d e n to f i n t r i n s i cc o a g u l a t i o nc a s c a d e 2 i nc o m p a r i s o nw i t hd i f f e r e n tc h i t o s a nd e r i v a t i v e sa n dc o l l a g e ni nt e r m so f c o a g u l a t i o na c t i v i t y , t h er e s u l t si m p l yt h a tt h e r ei sp o s s i b l es p e c i f i ci n t e r a c t i o n b e t w e e np l a t e l e tm e m b e ra n dc l a i t o s a n - l y s i n e c h i t o s a n - l y s i n ec a na g g r e g a t e p l a t e l e t sa sg o o da sc o l l a g e n ，a n dt h i si sa l s ot h ec a s ei nb l o o dc o a g u l a t i o nt i m e 3 t h e c y t o t o x i c i t y o f c h i t o s a n - l y s i n ec o 厕u g a t e w e r ed e t e r m i n e d b y3 - ( 4 ， 5 - d i m e t h y l t h i a z d - 2 - y 1 ) - 2 ，5 - d i p h e n y l t e n t r a z o l i u mb r o m i d e ( m t t ) a s s a y ，a n dt h e r e s u l ts h o w e dv e r yl o wc y t o x i c i t yo ft h ec o n j u g a t e 1 蚀yw o r d s ：c h i t o s a n ，l y s i n e ，r e db l o o dc e l l ，p l a t e l e t , c o a g u l a t i o nf a c t o r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：易弘目 签字日期沙7 年月7 日 i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤壅盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：易气1 日 签字目期：，矿7 年月严日 导师签名： 签字日期： j ，具筘 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 过度失血是战伤致死的主要原因，也是事故和手术治疗过程中致死的主要原 因之一【h2 1 ，因此。止血日益成为医学界研究热点。外科止血是手术技术的核心 之一，良好的止血技术是保证手术成功的关键，其目的是通过直接阻断出血部位 血流或直接缝闭血管裂口，使血液不再从血管裂口或断端流出；同时使伤口与外 界隔离以减少感染机会，为清创创造良好的创面条件。传统的伤口止血材料主要 是急救包、四头带、止血带和绷带等，止血方法主要有人工挤压、烧灼术和伤口 缝创3 1 。 尽管多年来抗生素和杀菌剂方面的研究取得了长足进展，但感染依然是创伤 和手术创口治疗中面临的重大问题【4 】；另一方面，不完善的止血手段常需要病人 进行二次手术，特别是在皮肤创伤和脾、肾等软组织器官损伤的出血治疗中【5 】。 因此，研制一种具有止血功能的生物医用材料已显得非常紧迫。 通常，伤口敷料应具备如下要求【6 一卅： ( 1 ) 具有与人体皮肤相近的柔软性能，在湿润时也能保持一定的形态和强度； ( 2 ) 能保持创面的湿润环境，又较好的吸收伤口分泌物的能力，并有一定的 透气性； ( 3 ) 无毒，对人体不发生有害的反应和刺激，而且必须能够阻止细菌进入创 面以防止造成二次感染，避免伤口接触粒子和有毒的污染物，无热源； ( 4 ) 最好可促进肉芽生长和皮肤再生，加速愈合，减少疤痕。 1 2 凝血和止血机理 血液在材料表面上的凝固是材料表面与血液相互作用的结果。普通的材料作 为异物与生物体内的血液接触时，在1 2 r a i n 内就会在表面产生血栓。血栓的形 成与血浆蛋白质、凝血因子和血小板等多种血液成分有关，是一种复杂的级联反 应。因此，深入了解血液凝血的机理，对认识材料凝血性的本质及开发新的止血 材料都是十分重要的。 对于血液的凝固，体内存在着两个对立的系统：一是促使血液凝固和血栓生 成的凝血系统；另一是阻止血液凝固和消除血栓的抗凝血系统。凝血系统主要包 括血小板及把血纤维蛋白原转变为血纤维蛋白凝胶的所有凝血因子；抗凝血系统 第一章绪论 则主要由肝素、抗凝血酶及使血纤维蛋白凝胶降解的纤溶系统组成。当血液与异 物接触时，凝血系统就通过下列两种方式发挥作用： ( 1 ) 凝血因子的活化，最后导致血纤维蛋白凝胶的生成； ( 2 ) 血小板的粘附、释放和聚集，结果形成血小板血栓。 这两个过程的发生都来自吸附在异物表面的血浆蛋白质层的诱发。当异质材 料和血液接触时，血浆蛋白迅速吸附在材料表面，主要包括白蛋白、7 球蛋白、 血纤维蛋白原和凝血原酶等，被吸附的血浆蛋白介导了血小板在材料表面的粘 附。接着，血小板发生形变并被激活，同时引起血小板内容物的释放( 包括b 血小板球蛋白、5 羟色胺、腺苷核苷酸、儿茶酚胺、血栓素a 2 ( t x a 2 ) 和促凝血 激活物等) ，受损血管收缩。其中，腺苷核苷酸能促使更多的血小板在材料表面 的粘附，最终形成的血小板聚集体和不溶性血纤维蛋白以及被截留的血细胞共同 形成了血栓【9 1 0 】。 1 2 i 凝血过程 经典的凝血“瀑布学说 是以m a c f a r l a n e 、d a v i c 和r a t n a f f 的观点为基础， 即认为凝血过程式一系列凝血因子相继酶解激活的级联反应，生成凝血酶，最终 形成血纤维蛋白凝块。理论上凝血过程可分为三个阶段【1 2 】( 图1 1 ) ： 一、凝血活酶生成阶段，此阶段一般被分为内源性凝血和外源性凝血两个途 径。两条凝血过程主要在于其启动方式和参与的凝血因子不同，但它们并不是各 自完全独立，而是相互密切联系、彼此相互作用； 二、凝血酶生成阶段，此阶段为内源性凝血和外源性凝血两条途径的共同凝 血途径，是由x a 因子、v 因子和c a 2 十形成凝血酶原酶，使凝血酶原转化为凝血 酶； 三、血纤维蛋白形成阶段，此阶段是血纤维蛋白原在凝血酶的作用下生成纤 维蛋白单体，最终聚合成血纤维蛋白胶。 1 2 1 1 凝血活酶生成阶段 ( 1 )内源性凝血途径 内源性凝血途径是指参与凝血过程的凝血因子均来自 血液。这一凝血途径通常是因血液与带负电荷的异物表面( 如玻璃、白陶土、硫 酸酯和胶原等) 接触而启动( 接触激活) ，临床常以凝血时间( c l o t t i n gt i m e c t ) 或部分活化凝血活酶时间( a c t i c a t e dp a r t i a lt h r o m b o p l a s t i nt i m e a p t t ) 测定来反 映体内内源性凝血途径的状况。按反应的先后顺序可分为以下步骤【1 3 1 4 】： a 接触相激活因子因子与因子的激活 参与接触式相激活的凝血因子有4 个，为因子、因子、激肽释放酶原和 第一章绪论 高分子量激肽原；其中因子和高分子量激肽原能直接与异物表面结合。经过接 触式相激活，因子、因子和激肽释放酶原分别转化为相应的活性酶，而高分 子量激肽原在其中发挥辅因子功能。经过接触相激活，因子与因子相继被激 活，从而启动了内源性凝血途径，而且因子和前激肽释放酶的激活还能激活纤 溶系统、激肽系统和补体系统等。 b ，因子的激活 内源性途径中，经过接触相激活( 或通过其他途径如凝血酶引起者) ，因子 被激活转变为具有酶活性的因子x i a ，随即是因子x i a 激活而使其变为活化 的因子i x a 。 与凝血过程的其他步骤( 尤其是与其它依赖维生素k 凝血因子的激活) 相 比，因子的激活有以下特点：l 、激活速度相对较慢：2 、激活反应主要在液相 中进行，尽管因子可以在活化的血小板表面被i x a ，但其速度并不比在液相中 快。 c 因子在被因子i x a 激活时无需辅因子参与 因子激活的这些特点( 尤其激活速度相对较慢) 可能具有生理重要性，能 为凝血过程的进行提供重要的调整步骤。 d 因子x 的激活 在内源性凝血途径中因子被激活变为因子i x a 。因子i x a 的作用是激活因子 x ，其转为具有较强酶解活性的因子xa ，但单独的因子i x a 激活因子x 的效力 向当低，它要与因子v i a 结合成l ：1 复合物因子i x a 因子v e a ( 又称因子x 酶 复合物，t e l a s ec o m p l e x ) 后才能有效地激活因子x 。所以，内源性凝血途径中 因子x 的激活是由因子i x a 因子v m a 复合物来完成的，而这一反应还有赖于和酸 性磷脂表面( 包括血小板、单核巨噬细胞和血管内皮等) 的存在。 因子x a 生成以后即在c a 2 + 存在下在磷脂膜表面与因子v a 形成复合物( 凝 血酶原复合物) ，其作用是激活凝血酶原使之转变为凝血酶。 ( 2 ) 外源性凝血途径 外源性凝血途径是指参加的凝血因子并非全部存在于血液中，所需的凝血因 子还有来自血液以外的( 外源性) ，即组织因子( 凝血因子1 1 1 ) 。这一凝血途径是 因组织因子暴露于血液而启动，因此又称为凝血的组织因子途径。临床上常以凝 血酶原时间( p r o t h r o m b i nt i m e ，p t ) 测定来反映体内外源性凝血途径。 在正常人体内，组织因子并不与血液接触，但在血管损伤或血管内皮细胞及 单核细胞受到细菌内毒素、补体c 5 。、免疫复合物、白介素1 、肿瘤坏死因子等 因素的刺激时，组织因子得以与血液接触。现在已经证明组织因子有和v l l a 的 第一章绪论 受体，当其与血液接触时即会在c a 2 + 参与下与血液中的因子结合形成1 ：l 的复 合物( 因子组织因子) 。一般认为单独的因子或组织因子均无促凝活性，但 因子一旦与组织因子结合即很快被活化的因子x ( x a ) 激活为具有酶解活性 的因子v l l a ，从而形成因子v i i a 组织因子复合物，因子v i a 组织因子复合物生成 后能迅速激活因子x ，由此将启动外源性凝血途径。 1 2 1 2 凝血酶生成阶段 在x 因子被激活后( 经过内源性凝血途径和外源性凝血途径) ，所产生的xa 因在即在c a 2 + 存在情况下于磷脂膜表面与v a 因子结合形成l ：1 复合物( x a 因 子v a 因子复合物) ，此复合物称为凝血酶原酶复合物( 亦称凝血酶原激活复合 物) ，其作用是激活凝血酶原使之转变为凝血酶【i s , 1 6 。在凝血酶原酶复合物中， x a 因子是直接发挥蛋白水解作用的蛋白酶，即使在无c a 2 + 、v a 因子和磷脂存 在的条件下，x a 因子也能发挥凝血酶原的酶解激活物作用，但此时其效力相当 低；v a 因作为辅因子能使x a 因子对凝血酶原激活反应的最大速度提高近1 0 0 0 0 倍，而磷脂的存在又能使凝血酶原的l ( m 值降低1 5 0 倍，因此，凝血酶原酶 解复合物激活凝血酶原的速度较单独x a 因子的作用快1 0 5 倍。 凝血酶原被凝血酶原酶复合物催化激活而转变为凝血酶，这一过程是由xa 因在裂解凝血酶原分子中的两个肽键并使其释放出一小片段后来实现的。凝血酶 生成后，主要作用是催化纤维蛋白原向纤维蛋白单体转变，除此之外，它还可通 过多条途径加速和巩固凝血过程，主要包括： 激活v 、因子使两者分别转变为v a 、v l a 因子； 激活因子使其转变为v i i a 因子： 激活x 因子，促使纤维蛋白的交联； 激活因子； 引起血小板活化，从而为因子x 酶和凝血酶原酶复合物的形成提供有效的 膜表面等。 但另一方面，当大量凝血酶形成后，它又可以直接( 裂解) 和间接( 激活蛋白c ) 灭活v a 和v l a 因子，从而阻碍凝血过程的继续进行。 1 2 1 3 血纤维蛋白的形成与交联 血纤维蛋白原分子由a 、1 3 、1 ，三种链各2 条组成，每3 条肽链结合成索肽， 形成两条索肽链，两者的n 端通过二硫键相连。a 及b 肽链的n 端分别有一段 1 6 个及1 4 个氨基酸组成的一段小肽。凝血酶作用是切除这两段肽即得到纤维蛋 白单体。纤维蛋白单体的负电荷明显降低，分子之间氢键的供体和受体暴露，可 自动聚合成纤维蛋白聚合体。纤维蛋白聚合体是不稳定性或可溶性纤维蛋白，在 第一章绪论 氢键抑制剂( 尿素、单氯醋酸等) 存在时，又可分解为纤维蛋白单体。然而这种 不稳定的纤维蛋白聚合体在x 因子催化下共价交联，形成稳定性纤维蛋白。x i h 因子是一种惰性前酶，经凝血酶的催化而被激活成x 1 t l a 因子。x i l i a 因子是 一个谷氨酸酰胺转移酶，催化丫链n 端的谷氨酸与邻近丫链赖氨酸残基上的 氨基共价结合，a 肽链间也同样发生交联，但聚合的速度较缓慢。纤维蛋白单体 通过这种方式交联，形成稳定而不易溶解的纤维蛋白，并组成相当牢固的纤维蛋 白网。 图1 - 1 凝血过程示意图 叼m k ：高分子量激肽原：c i i n h ：c 抑制剂；a j i i i ：抗凝血酶i ； r f p i ：组织因子途径抑制剂；p l ：磷脂；“一”表示抑制 f i g1 - ls c h c r a eo f c o a g u l a t i o nc a s c a d e 1 2 2 血管在凝血和止血中的作用 血液在血管内正常状态处于流动状态，没有血小板的激活和凝血。若血管某 一点受到损伤，造成出血，则引起一系列物理和化学的变化。首先表现为局部血 管的收缩，继之血小板血栓形成，同时激活凝血系统形成纤维蛋白血栓，激活纤 第一章绪论 维蛋白溶解系统将多余的纤维蛋白凝块清除，然后内皮细胞和纤维组织增生，修 复血管。这些变化的机制十分复杂且精细。 人体内血管有三种，毛细血管、动脉和静脉。毛细血管结构简单，从管腔侧 向外有内皮细胞层和基底膜。动静脉管壁则分为三层，即内膜、中膜和外膜。内 膜分为内皮层、内皮下层和内弹性层，中膜主要由环形平滑肌构成，外膜则是疏 松的结缔组织。 内皮层和内皮下层在凝血和止血中发挥着重要作用。内皮细胞单层排列，覆 盖着整个血管内壁而与血流直接接触。内皮通过附着面的半桥粒和微丝粘着在内 皮下层。内皮细胞之间则存在多种细胞连接，不仅可以实现细胞之间的信号传递， 且可以调节内皮层的通透性。在血液系统中，内皮细胞通过合成、分泌、代谢多 种因子参与血管张力、血小板功能、凝血、纤溶系统的调节，使血液处于一种稳 态保证血液在血管内的正常流动。 内皮下层主要由基底膜、弹性纤维和微丝组成。当内皮受损后，血小板很快 附着与暴露的内皮下层。内皮下层中的胶原纤维是引起血小板粘附聚集的强诱导 剂，并能启动凝血系统。基底膜的成分之一是型胶原，它诱导血小板的能力比 胶原纤维差，虽能引起血小板的粘附，但不能诱导血小板的聚集。微丝也可诱导 血小板的粘附聚集反应。当内皮受损后，血管局部的平衡状态被打破，血小板会 很快识别暴露的内皮下层结构，发生粘附聚集反应，生成止血血栓。受损的血管 本身也会发生内源性收缩，使血流减慢，有利于血小板的附着。 1 2 3 血小板在凝血和止血中的作用 正常情况下血小板不与血管内皮表面接触，当血管受到损伤时，血小板会很 快粘附在暴露的血管内皮下的胶原纤维，并发生形态改变，由原来的盘状变为球 形，表面伸出许多细小的突起，随后血小板开始聚集，释放颗粒内容物，使更多 的血小板能参与此反应，这时形成的血栓较松软，不牢固【1 7 1 。凝血系统的激活， 使纤维蛋白原生成纤维蛋白，最后血小板收缩，生成牢固的血栓填充血管破损处 止血。 1 2 3 1 血小板的粘附 当血管受损时，血小板会很快粘附于暴露的内皮下组织。此过程包含两个步 骤：首先是血小板的运输，即血流中的血小板靠边到达受损血管表面附近，其次 与受损血管相互作用。 在粘附反应的初期，未活化的血小板附着在内皮下组织，称为原发粘附，开 始时粘附的血小板未发生变形，其后伸出伪足，展开平铺，更紧密地附着于血管 第一章绪论 表面，并释放颗粒物质，使更多的血小板活化。在粘附反应后期，活化的血小板 参与反应，称为继发反应。血小板粘附反应需要【1 8 1 9 2 0 1 ： 血小板膜糖蛋白g p n b 、g p u b i l i a ： 底物：胶原及内皮下层其它成分等； 粘附蛋白：v w f 、纤维结合蛋白等。 1 2 3 2 血小板的聚集 许多物质可引起血小板的聚集，根据作用机制的不同将这些物质分为两类， 第一类本身可引起血小板的聚集，不依靠血小板的释放或前列腺素的合成，如 a d p 和凝血酶，称为原发血小板聚集诱导剂；第二类是其本身不能引起血小板 的聚集，而是先引起血小板的释放或前列腺素的合成来诱发血小板的聚集，如胶 原等，成为继发血小板聚集诱导剂。 1 2 3 3 血小板的释放 是指血小板通过出胞作用选择性地将颗粒内容物释放至胞体外，而其它细胞 起仍保留在体内的过程，它是一种耗能过程。当血小板被活化变形，发生粘附、 聚集、膜磷脂代谢生成t x a 2 之后才出现释放反应。根据内容物的不同，将释放 反应分为两类：一类是仅释放致密颗粒内容物，可以通过5 - h t 来监测；另一 类反应是致密颗粒、叶颗粒甚至溶酶体内容物释放至胞体外。血小板的释放反应 式为如下过程：形态改变_ 粘附聚集_ 花生四烯酸的代谢_ 致密颗粒内容物的释 放+ a 颗粒内容物的释放_ 酸性水解酶的释放。 血小板的释放，一方面使更多的血小板参与止血反应，起信号放大作用，如 a d p 的释放；另一方面p f 4 、t g 等血小板因子和一些凝血因子的释放又起到促 凝作用。 1 2 3 4 血块的回缩 血小板被活化、粘附、聚集，初期形成松软的止血血栓，这时的血栓较脆弱， 容易脱落。凝血系统启动后，生成的纤维蛋白加入血栓，之后血块回缩，形成牢 固的血栓填在受损处止血。在电镜下可以看到，血小板处于纤维蛋白网的结点处， 纤维蛋白丝附着于血小板的伪足处而形成一个立体的网络结构。血小板的伪足伸 缩，牵动纤维蛋白丝而使整个血块收缩。 总之，血栓形成是以血小板为中心的止血过程。以前认为红细胞、白细胞是 被动参与此过程，目前对它们在止血中的作用有了新的认识，而倾向于“血栓形 成是以血小板为中心的，多细胞相互作用的过程的观点，认为内皮细胞、红细 胞和白细胞与血小板相互作用，主动参与止血。红细胞的存在使血小板聚集增多。 第一章绪论 白细胞与血小板间的作用较为复杂，一般认为为活化的白细胞抑制血小板的功 能，而活化的白细胞与激活的血小板之间通过其释放的活性物质有相互增强对方 功能的作用。内皮细胞对血小板有双重作用，当内皮细胞完整时，抑制血小板的 活化；当内皮细胞受损后，它又可释放多种活性物质，活化和增强血小板功能促 进止血。 1 3 伤口止血材料研究进展 伤口急救的主要目的是暂时性控制出血、尽快覆盖包扎伤口。将伤口与外界 隔离以减少感染机会，为清创创造良好的创面条件。平时严重交通伤、战时火器 伤、恐怖袭击、抢险救灾以及塌方、台风、地震、泥石流等自然灾害可造成短时 间内同时出现大批伤员。对这些伤员伤口的院前急救历来是创伤急救医学甚为关 注的问题。 传统的伤口止血材料主要是急救包、四头带、止血带和绷带等，有时还有大 量无菌敷料用于弥补急救包包扎止血的不足。大量无菌敷料难以携带和消毒保存； 急救包和四头带仅有无菌三角巾和l 2 块中小敷料，对大面积伤口以及复合伤、 多发伤伤口的覆盖、止血效果欠佳，往往要借助于止血带控制伤口出血。但不当 使用止血带可能造成创伤性截肢甚至死亡。 在组织表面使用止血剂的目的是使断裂的血管收缩闭合。止血机制通常是以 物理的方式形成支架结构，直接促进凝血过程，主要用于广泛渗血创面，且渗血 率不能过高。新型伤口急救止血材料往往来自于创面止血材料在创伤急救领域的 应用。目前已经开发出许多种类的创面止血材料，主要有：纤维蛋白胶、胶原蛋 白、多微孔类无机材料如沸石( z e o l i t e ) 等、羧甲基纤维素( 可溶性止血纱布) 、q 氰基丙烯酸酯类( c y a n o a c r y l a t e ) 组织胶等。 1 3 1 血纤维蛋白胶 血纤维蛋白胶又称纤维蛋白粘合剂( f i b r i n g l u e 或f i b r i n s e a l a n t ) ，是由数种源 自人血浆蛋白成分组成的具有止血和粘合作用的复合制剂，主要由人纤维蛋白原 和凝血酶组成，其主要成分是粘合蛋白( 高浓度纤维蛋白原、凝血因子、纤维结 合蛋白和纤维蛋白溶酶原) 、凝血酶和氯化钙【2 1 2 2 】。由于主要成分源于人体，人 纤维蛋白胶具有良好的组织相容性，毒副作用，使用后逐渐被组织吸收。 纤维蛋白胶模拟血液凝固过程的终末阶段的反应历程，即通过凝血酶激活纤 维蛋白原形成具有粘性的凝胶状纤维蛋白凝块，从而使伤口止血、愈合，达到止 血和粘合的效果。粘合过程可在数秒钟内完成，且于数日内被组织吸收，并对局 第一章绪论 部组织有促使生长和恢复修补作用。 人纤维蛋白胶的作用原理除与血液凝固的最后阶段相似外，还和以下诸因素 的综合作用有关【2 3 2 4 1 ： 粘合蛋白中除含高浓度纤维蛋白原外，还有凝血因子、纤维结合蛋白和 纤维蛋白溶酶原。在c a 2 + 作用下，纤维蛋白发生聚合，当其与凝血酶和氯化钙混合 后，在血小板的参与下，形成不溶性纤维蛋白； ， 凝血酶可酶解纤维蛋白原，使其a 泖b b 链释放出纤维蛋白a 肽和b 肽， 从而改变纤维蛋白原分子的电荷和构象，形成纤维蛋白单体。纤维蛋白单体通过 氢键及静电引力作用聚合成可溶性纤维蛋白。纤维蛋白原浓度的高低往往与纤维 蛋白胶的粘合速度成正相关。 由于c a 2 + 的存在，凝血因子可被凝血酶激活成凝血因子x n a ，除可使纤 维蛋白原单体形成纤维蛋白凝块外，还可与纤维结合蛋白等粘性糖蛋白交联而使 纤维蛋白凝块固定于创伤部位。鉴于纤维结合蛋白既是一种细胞附着因子，又是 一种具有调理作用的趋化因子，故它能协助有关细胞迁移到纤维蛋白胶的使用部 位。 在纤维蛋白胶制品中，常以抑肽酶作抗纤溶剂，其作用是抑制纤溶酶对不 溶性纤维蛋白的降解，使形成的凝块持久。 凝血酶能对纤维蛋白原聚合成纤维蛋白速度起调节作用。 人纤维蛋白胶是一种血液制品，如灭活病毒不彻底可传播病毒，故应有明确 的应用指征和适应症。人纤维蛋白胶反复应用亦可发生过敏反应甚至过敏性休 克，也可导致出血性并发症。 1 3 2 胶原蛋白 胶原蛋白止血剂包括明胶海绵、微晶胶原( m i c r o c r y s t a l l i n ec o l l a g e ) 、增凝明 胶海绵等，胶原止血途径包括：激活部分血液凝血因子的活动：引导血小板 附着，产生释放反应和聚集；对渗血伤口的黏着和对损伤血管的机械压迫起到 填塞作用【2 5 ，2 6 。也有学者认为，胶原止血机制只与血小板的作用有关，而与血 液中凝血系统关系不大，主要是缩短血栓形成时间。有研究表明，胶原蛋白在自 然状态下止血效率最高，不需进行交联或变性成明胶，而且副作用少，是较为理想 的创面止血材料。明胶类材料止血速度较慢，对血小板等血液成分的牵拉能力以 及和创面组织附着力均差，容易破裂，因此，常与其他类创面止血材料，如壳聚 糖合用作为止血材料。 1 3 3 无机止血材料沸石 第章绪论 据报道，美军在阿富汗战争以及伊拉克战争中使用了一家美国公司( z m e d i c a ) 生产的止血海绵( 商品名为q u i c k - c l o t ) 来对战伤伤口进行止血。该材料 主要成分是一种沸石( z e o l i t e ) 。使用时将其覆盖在出血伤口上，可迅速吸收血块 中的水份，加速凝血过程，使血痂提早形成。由于止血过程会产热，所以，在大面 积出血伤口上使用时会产生组织热损伤。此外，若要对动脉出血进行止血，必须 在该敷料外层再环行包扎一种伤口加压敷料，这样也会对患肢血液循环造成一定 影响。 1 3 4 可溶性止血纱布 可溶性止血纱布在国外又称速即纱( s u r g i c e l ) ，一种再生氧化纤维编织纱块， 属于羧甲基纤维素类止血材料【2 7 】。它有良好的组织相容性，柔软而菲薄，易于包 敷、填塞等操作，密切接触伤口后，可使血液凝血成分聚集在其周围，在2 - 8m i n 完成止血。由于可以吸收，常用于手术创面出血以及渗血不易停止的部位，如骨 面渗血等。由于其止血时间较长，对出血迅猛者效果较差，不适合单独作为伤口 止血材料，但可以作为伤口包扎敷料辅助的止血材料用于伤口表面。 1 3 5 q 一氰基丙烯酸酯类( c y a n o a c r y l a t e ) 组织胶 q 氰基丙烯酸酯( c y a n o a c r y l a t e ) 最早由a r d i s 于1 9 4 9 年合成，1 9 5 9 年 c o o v e r 发现了其在外科手术中可以黏接机体组织而引起人们的广泛注意。近四 十年来先后有近十种q 氰基丙烯酸酯类在国外投入临床试用。鉴于某些a 氰 基丙烯酸酯类不同程度存在组织毒性、刺激性，目前国内外i 晦床使用较多的是q 氰基丙烯酸乙酯、q 氰基丙烯酸正丁酯、q 氰基丙烯酸正辛酯，已被证实无 毒、无致癌性、组织相容性好且止血作用显著。1 9 9 9 年加拿大学者比较了q 氰 基丙烯酸正丁酯与q 氰基丙烯酸正辛酯在治疗儿童面部裂伤方面的效果，证实 二者基本一致，只是后者更有柔软感。我国在上世纪6 0 年代中期合成了q 氰 基丙烯酸正丁酯及其异丁酯。7 0 年代开始，西安化工研究所合成了a 氰基丙 烯酸辛酯用于创面闭合、止血，获得了广泛应用与推广。9 0 年代初，第三军医大 学野战外科研究所将西南师范大学化学系研制成功的复方q 氰基丙烯酸异戊 酯( 复方5 0 5 i ) 用于1 0 3 例创伤伤口清创止血、伤口闭合获得一定成效，黏合止血在 6 0s 内。2 0 0 3 年有学者采用气雾剂型a 氰基丙烯酸烷基酯组织胶直接喷洒到 猪大面积渗血伤口内，结果在数秒内完全止血；而对伴有大动脉出血的伤口采用 伤口近心端先扎止血带临时止血，擦干伤c i 内血迹后向伤口喷洒该组织胶，1 0 m i n 后放松止血带的止血方法止血成功率高，副作用小，是较为理想的止血方法f 2 9 】。 第一章绪论 综上所述，各种止血性伤口急救材料都有各自的特点，但是任何一种都未能 完美地解决伤口出血尤其是伴有大动脉破裂伤口出血问题。相信随着各种新型伤 口止血材料的问世，必将使伤口出血得到更有效的治疗。 1 4 甲壳素壳聚糖止血机理及应用 甲壳素 b 一( 1 4 ) - 2 - 乙酰胺基一2 一脱氧一d - 葡萄糖 广泛存在于甲壳纲动物 虾、蟹的甲壳，昆虫的甲壳，真菌和植物的细胞壁中，其结构中，基于酰胺基团 的三维空间氢键使得甲壳素具有较高的结晶度。壳聚糖 b 一( 1 4 ) - 2 - 胺基- 2 - 脱氧一d 一葡萄糖 是一种独特的碱性多糖，由甲壳素脱乙酰化而制备。甲壳素的脱 乙酰化很难达到完全，大多数产物是n _ 乙酰化葡糖胺( n a g ) 和n 一葡糖胺的共 聚物，壳聚糖的脱乙酰度一般大于5 5 。由于甲壳素和壳聚糖源自生物体，具有 无毒、无抗原性和生物相容性，可在体内降解、吸收等特性，在医药方面的用途越 来越引起人们的重视1 3 0 l 。甲壳素和壳聚糖本身具有凝血特性，壳聚糖的凝血效 果与它的物理性状和化学性质有关【3 l3 2 3 3 1 。 许多生物大分子，如粘多糖、磷脂及细胞外基质蛋白都显负电性；在p h 6 8 的环境中，壳聚糖即质子化而显正点性【3 4 】。大量文献表明，壳聚糖的血栓形 成能力部分归结于它和生物大分子之间的静电相互作用【3 5 3 6 1 。壳聚糖止血相关 化学性质还包括分子量、脱乙酰度、质子化程度和结晶度。高度有序的分子链三 维结构赋予了甲壳素优良的止血能力。下面就血液中相关成分和两种材料的作用 逐一加以讨论。 1 4 1 血小板 血小板是血液凝固中的主要成分，它可被多种异物材料活化而介导凝血过 程，包括金属、玻璃和塑料，同时释放出多种促进伤口愈合的细胞因子【3 7 3 8 9 1 。 优化血小板和异物材料的相互作用可为止血材料的设计提供有效的依据。 1 4 1 1 甲壳素和血小板的相互作用 当血小板和甲壳素纤维接触时即产生如下活化反应j 伪足出现并延长，形变， 整合素复合物的活化，钙离子信号的激活，磷脂酰丝氨酸和q 颗粒中p 选择蛋白 在膜表面的暴露，x 因子与血小板的粘合和血纤维蛋白单体的加速聚合。血小 板和甲壳素材料的接触反应以及两者复合体对血纤维蛋白胶形成的影响具体可 归纳为四个步骤【4 1 4 2 】( 图卜2 ) ： ( 1 ) 几乎所有主要血浆蛋白通过非特异性的化学物理吸附过程紧密结合在 第一章绪论 甲壳素材料表面； 血小板表面蛋白亚基介导血小板在甲壳素血浆蛋白基质上的粘合。这 种粘合作用包括血小板表面蛋白在甲壳素纤维上的化学吸附和血小板 表面受体与被吸附的血浆蛋白之间的特异相互作用，即多点粘附。比如， 血小板表面蛋白受体1 33 和g pib 分别通过血纤维蛋白原和v w f 连接到材 料上。大量研究证明，a b b3 和g pib 一在血小板和血浆蛋白的相 互作用中起着重要作用； 血小板细胞内液中钙离子信号的产生和磷脂酰丝氨酸在膜表面的表达 共同导致了整合素跨膜信号的激活； 富磷脂酰丝氨酸血小板界面凝血酶的产生加速了内源性凝血过程，这一 步依赖于x n a 因子的活化。x l a 因子的功能取决于整合素的激活，即整合 素信号和磷脂酰丝氨酸在膜表面表达的结合。 够蟛跏炳； 咪薯露融 图1 - 2 甲壳素血小板介导凝血酶形成过程 f i g i - 2s c h e m ef o rp g l c n a c p l a t e l e t - m e d i a t e da c c e l e r a t i o no f t h r o m b i ng e n e m f i o n 甲壳素对血小板的粘附作用还和它独特的1 3 型结晶结构有关。甲壳素纤维中 含有5 0 条聚乙酰化葡糖胺( p - g l c n a ) 分子链，这些分子链取向一致并平行排列、 通过分子间氢键形成独特1 3 构像。纤维的尺寸比血小板小得多( 纤维长约1 0 0 u m ， 宽约0 5 u r n ) ，所以纤维可以截留血小板形成结构类似于血小板一纤维蛋白网状结 构m 图卜3 ) 。 ) ) ) 2 3 4 ( k ( 第章绪论 圈1 - 3 血小板在甲壳素纤维上的粘附 f i gl - 3 i n t e r a c t i o n so f p o l y - n - a c e t y ig l u c o s a m i n e f i b e r s i nc o n t a c t w i t h p l a t c l c t s 1 4 i 2 壳聚糖和血小板的相互作用 s u g a i l l o r lt 等在犬血中加入柠檬酸抗凝，在血液采集后的2 4 0 m i n 内分别测 定微晶状脱乙酰度为5 8 的壳聚精盐酸盐、棉花、胶原盐酸盐所引起的1 3 一血小 板球蛋白( 1 3 一t g ) 和血小板第四因子( p f 一4 ) 的含量。实验结果表明，脱乙酰 度5 8 壳聚糖盐酸盐引起的1 3 一t g 和p f 一4 的释放量明显高于胶原盐酸盐组和棉 花组。另外扫描电镜下观察到血小板粘附到壳聚糖上后即有伪足出现且其数 量显著大于血小板和棉花接触时出现的伪足数目 2 6 1 在研究壳聚糖对牛血小板 作用的实验中观察到，当血小板接触壳聚 糖膜表面时即失去原来碟状而呈球形 “1 ( 图1 4 ) 。通常情况下，血小板呈 圆盘状，当受到有一定刺激物作用时叩 发生粘附或变形反应，血小板被激活， 变成球形或伸出伪足。上述实验说明壳 聚糖能够明显地粘附并激活血小板。 b t g 和p f 一4 均来自于血小板中的n 颗粒，是血小板的特征蛋白质，同时也 是血小板活化后的释放物，从而可作为 血液凝固的评估参数。壳聚糖引起的 b t g 和p f 一4 释放量远大于胶原和棉 花，因此，和后两者相比，壳聚糖能够 更好地活化血小板。血小板不仅能牢固 地粘附在壳聚糖表面，且还迸一步相互 聚集”。 图1 4 牛血小板粘附与壳聚糖膜表面后的j 嘭卷 f i g1 4b o v i n ep l a t e t e t 戢p o s e dt ob a mc h i l o s a n f i l mf o r3 0 st h e o r l g i ls h a p ew a s o s lo n a d h c s