（环境科学专业论文）双酚a对斑马鱼的生态毒性及致毒机制研究.pdf

摘要 1 组织切片试验发现，1 5 和4 5m g lb p a 暴露8 天，斑马鱼仔鱼的头部 和脑部的尺寸显著减小；心室也明显增大；肝细胞核仁破碎，没有集合在球形 细胞核的中心；肝脏中血细胞增多，正常肝细胞核减少。 2 代谢组学中，p c a 图分析可得，空白对照组与b p a 暴露组( 0 5 、1 5 和4 5 r a g l ) 成不同的簇状分布，证明8 天的b p a 暴露能显著导致斑马鱼的代谢组分变 化。从个体代谢组分上看、低浓度b p a 暴露能使斑马鱼体内的有益不饱和脂肪 酸、氨基酸、磷酸、葡萄糖和谷甾醇的百分含量降低，肌糖的百分率升高。 3 基因芯片找出了主要六个功能方面的5 0 个标志基因，包括：( 1 ) 信号传导， 如z g c l 0 0 9 3 3 、z g c 8 5 7 2 5 、a p o e b 等；( 2 ) 离子结合，如z g c 7 7 4 9 5 、e g r 2 a 、 s p 4 等：( 3 ) 核酸物质加合，z g c 5 5 5 2 1 、a 2 b p a l 、s e p t i n 2 等( 4 ) ；器官发育， 如b d n f 、p a k 2 b 、c l d n l 等；( 5 ) 代谢转化，如f a b p 7 a 、c t h l 、c s r p 2 b p 等；( 6 ) b p a 特有的氧化性特性，如b c k d h a 、h s d l 7 8 4 和t b x a s l ，以及内分 泌干扰特性，如c a l c a 和c y p 2 x 1 2 。同时，基因芯片能够对毒性暴露、组织 切片形态观察和代谢组学所得到的结果作出合理解释。 4 r e a l t i m e p c r 发现，与空白对照相比内分泌干扰标志基因a h r l 、e s r l 、 v t g l 、v t g 3 和c y p l a l 在低剂量b p a 暴露中都上调，证明了b p a 的内分泌 干扰特性。 5 1 5m g l 对于斑马鱼仔鱼是不安全的。甚至在5 0p g 几b p a 暴露下，仍然 有7 个标志基因表现为上调，这些基因会对斑马鱼仔鱼的离子结合、代谢、遗 传和信号传递造成影响。 本试验以斑马鱼为生物模式，综合应用各种现代生物技术，对环境内分泌 干扰物b p a 进行了从外在到本质的全面的研究，增强斑马鱼这一典型的模型生 物在环境监测领域的应用实效，同时为其他内分泌干扰物乃至其他环境污染物 的毒性作用提供了全面的依据。 关键词：双酚a ：斑马鱼；发育；基因芯片：代谢组学 a b s t r a c t a b s t r a c t e n d o c r i n e d i s r u p t s w e r et e s t i f i e dt ob e h a v e g r e a ti n f l u e n c eo n t h e e n v i r o n m e n t a lb i o l o g ya n dh u m a nh e a l t h , b u t 也e i rt o x i cm e c h a n i s m s ，e s p e c i a l l y t h o s ec o r r e s p o n d i n gt ot h eg e n el e v e l s ，a r es t i l lu n d e r g o i n gs m d y oi no r d e rt o i n v e s t i g a t et h et o x i ce f f e c t sa n dm e c h a n i s m so ft y p i c a le n d o c r i n ed i s r u p t s b i s p h e n o l a ( b p a ) ，t h et e c h n o l o g yo fz e b r a f i s hg e n ec h i p sw e r ea p p l i e da tt h er n al e v e lw h i c h a i m e dt oe x p l o r et h eb i o l o g i c a le f f e c t sc a u s e db yt h ec h a n g e so fg e n ee x p r e s s i o n w e a i m e dt of i n das e r i e so fb i o m a r k e r sw h i c hw o u l ds u p p o r tr e l i a b l ea n dd e t a i l e d e v i d e n c e sf o rt h ei n s p e c t i o na n da s s e s s m e n tt h ee f f e c t so fb p ai nt h ee n v i r o n m e n t t h ea c t i o nm o d ea n dp a t h w a yo fb p aw e r ea l s od i s c u s s e do nt h ed e v e l o p m e n to f z e b r f i s he x p o s e da ts o - c a l l e d “s a f el e v e l ”o fb p a t h et o x i ce f f e c t so fb p aa th i g hc o n c e n t r a t i o n s ( 5 - 2 5m g l ) w e r ea sf o l l o w s ： lb p aw a st o x i ca td i f f e r e n ts t a g e so fz e b r a f i s h ( a d u l tf i s h ，l a r v a lf i s ha n d e m b r y o s ) a d u l ta n dl a r v a lf i s hw e r em o r es e n s i t i v et h a ne m b r y o sa tt h el e t h a le f f e c t s ， a n de m b r y o sw e r es i g n i f i c a n t l ys e n s i t i v ea tn o n - l e t h a le f f e c t s t h eo r d e rf o rt h e s e n o n - l e t h a le f f e c t so fe m b r y o sw a s ：c o a g u l a t i o na n dd e l a y e dh a t c h b l o o dc i r c u l a t i o n b a l k p e r i c a r d i ae d e m a t a i l a b n o r m a la n dc u r v e dm a c k m e a n w h i l e ，t h e b i o a c c u m u l a t e da b i l i t yt ob p ai ne m b r y o st h a te x p o s e da t0h p fw a sm u c hh i g h e r t h o s ee x p o s e da t8h p f , a n d0h p fe m b r y o sa l s os h o w e dh i g h e rt o x i c i t ya tt h el e t h a l a n dn o n l e t h a le f f e c t s t h e r e f o r e ，z e b r a f i s he m b r y oa te a r l ys t a g ew a sm o r es e n s i t i v e t ot h eb p ap o l l u t i o n 8hp a u s e de x p o s u r et e s t i f i e df t l r t h e rt h a tt h em o s ts e n s i t i v e s t a g eo fz e b m f i s he m b r y o st ot o x i c i t yo fb i s p h e n o la w a sb e f o r et h eg a s t r u l as t a g e 2a c c o r d i n gt ot h eh p l ct e s t , i tw a sf o u n dt h a tt h eb p ac o n t e n t si nt h ee m b r y o s w e r ep o s i t i v er e l a t e dt ot h ee x p o s u r ec o n c e n t r a t i o n sa n dd u r a t i o n su n t i lt h ee m b r y o s d i e d w h e ne x p o s u r ec o n t i n u e df o r4 8ha t5m e r l eb p a ，t h et o t a l b o d yb p a c o n c e n t r a t i o n so fc r n b r y o sa n da d u l tf i s hw e r e3 7 3 5 7 + 3 9 7 6r t g ga n d1 5 5 7 8 + 1 7 9 7 r t g g s e p a r a t e l y t h ea c c u m u l a t ea b i l i t yo fe m b r y o sw a sn e a r l yt w i c et h a to fa d u l t f i s h 3b p aw a sn o te x i s t e di n d i v i d u a l l yi nt h ee n v i r o n m e n t i n v e s t i g a t i o no ft h e i i i a b s t r a c t c o m b i n e de f f e c t so fp e n t a c h l o r o p h e n o l ( p c p ) a n db p aw a sc a r r i e do u tw i mm e t h o d o ft h ee a r l yl i f es t a g e ( e l s ) t e s to nz e b r a f i s he m b r y o j o i n te f f e c te x h i b i t e d s y n e r g i s t i ca c t i o nb a s e do nt h ee n d p o i n to f 2 4hd e a t ha n da n t a g o n i s me f f e c tb a s e d o n t h ee n d p o i n to f 7 2hc a r d i a ce d e m a r e s e a r c ho ne n d o c r i n ed i s r u p t sh a sr e c e n t l ys h i f t e df o c u sf r o me x a m i n i n gt o x i c a n dl e t h a ld o s a g e so fe n v i r o n m e n t a lc h e m i c a l st ot h ee f f e c t so fp e r s i s t e n te x p o s u r et o l o wd o s e so nm o l e c u l a r , c e l l u l a ra n dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s i nt h i se x p e r i m e n t , e m b r y o sa t0h p fw e r ec o n t i n u a l l ye x p o s e df o r8d t h ee x p o s u r ec o n c e n t r a t i o n so f b p aw e r ea r o u n dt h es o - c a l l e d “s a f e l e v e l ( 1 5m g l ) t h a ts t a t e db yu se p a t h e t e c h n o l o g i e so fh i s t o l o g y , g e n ec h i p s ，r e a l t i m ep c r a n dm e t a b o n o m i c sw e r eu s e dt o t r yt of i n dt h eb i o m a r k e r sf o rt h eb p ap o l l u t i o n t h er e s u l t so b t a i n e db y t h ep r e s e n t e x p e r i m e n t sc l e a r l yi n d i c a t et h a t b p ae v e na ts o - c a l l e d “s a f e l e v e l ( 1 5m g l ) a f f e c t e db o t he m b r y o n i c l a r v a ld e v e l o p m e n ta n dg e n ee x p r e s s i o n 1t h eh i s t o l o g yt e s t sf o u n dt h a t ，a f t e r8de x p o s u r ea t1 5a n d4 5m g lb p a ，t h e s i z e so ft h es t r u c t u r e sa tt h eh e a da n db r a i nw e r es i g n i f i c a n td e c r e a s e d ；t h eh e a r t c h a m b e rw a ss i g n i f i c a n t l ye n l a r g e d ；t h en u c l e o l u si nu s u a l l yc e n t r a l l yl o c a t e di nt h e s p h e r i c a ln u c l e u s ，b u tt h ef r a g m e n t a t i o no ft h en u c l e o l u si nl i v e rc e l l sa t1 5a n d 4 5 m g lb p at r e a t m e n tw e r eo b s e r v e d ；c o n g e s t i o no fb l o o dc e l l sw e r ei n c r e a s e da n d n o r m a ll i v e rn u c l e iw e r ed e c r e a s e di nt h el i v e re e l l 2f r o mt h ep c ac h a r ti nt h em e t a b o n i c ss t u d y , i tw a sf o u n dt h a tt h ec l u s t e r so f e x p o s u r eg r o u p s ( 0 5 ，1 5a n d4 5m g lb p a ) w e r es e p a r a t eg r e a t l y w i t ht h ec o n t r o l s ， a n dt h e s et e s t i f i e dt h a tt h ep e r c e n t a g e so fm e t a b o l i cc o m p o n e n ti n8df i s hw e r e s i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e d 1 1 1 eg r e a tc h a n g e so f i n d i v i d u a lc o m p o n e n t si nf i s hw e r ea s f o l l o w s ：t h ep e r c e n t a g e so fn o n - s a t u r a t e df a t t ya c i d ，a m i n oa c i d ，p h o s p h o r u sa c i d ， g l u c o s ea n d - s i t o s t e r o lw e r ed e c r e a s e d ；t h ep e r c e n t a g e so fi n o s i t o li n c r e a s e d 35 0m a r k e rg e n e ss o r t e db y6m a i nf u n c t i o n sw e r ef o u n db yg e n ec h i p s ， i n c l u d i n g ：( 1 ) s i g n a lt r a n s m i tr e l a t e d ，f o re x a m p l e ，z g c 10 0 9 3 3 ，z g c 8 5 7 2 5 ，a p o e b ， e ta 1 ；( 2 ) i o nc o m b i n a t i o nr e l a t e d ，f o re x a m p l e ，z g c 7 7 4 9 5 ，e g r 2 a ，s p 4 ，e ta 1 ；( 3 ) a d d i t i o no fn u c l e i ca c i ds u b s t a n c e sr e l a t e d ，f o re x a m p l e ，z g c 5 5 5 2 1 ，a 2 b p a l ， s e p t i n 2 ，e ta 1 ；( 4 ) o r g a nd e v e l o p m e n tr e l a t e d ，f o re x a m p l e ，d n f , p a k 2 b ，c l d n 1 e ta 1 ；( 5 ) m e t a b o l i z et r a n s l a t i o nr e l a t e d ，f o re x a m p l e ，f a b p 7 a ，c t h l ，c s r p 2 b pe t i v a b s t r a c t a 1 ；( 6 ) s p e c i a l o x i d a t i v ec h a r a c t e r so fb p ar e l a t e d ，f o re x a m p l e ，b c k d h a ， h s d l7 8 4a n dt b x a s ，a n ds p e c i a le n d o c r i n ed i s r u p t i o nc h a r a c t e r sr e l a t e dg e n e s ， c a l c aa n dc y p 2 x 12 m e a n w h i l e ，t h er e s u l t so fg e n ec h i p sc o u l dg i v eg o o d e x p l a n a t i o n st ow h a tw ef o u n di nt h es t u d i e so fe x p o s u r et o x i c i t y , h i s t o l o g ya n d m e t a b o l o m i c s 4r e a l t i m ep c rf o u n dt h a ta l le n d o c r i n ed i s r u p t i o nr e l a t e dg e n e sa h r l ，e s r l ， v t g 1 ，v t g 3a n dc y p 1a 1w e r eu p r e g u l a t e da sc o n t r a s tw i t hc o n t r o lo n e s t h e s e p r o v e dt h ee n d o c r i n ed i s r u p t o rc h a r a c t e r s 5a l lt h er e s u l t sa b o v es h o w e dt h a t1 5 m g lb p aw a sn o ts a f ea t t h e d e v e l o p m e n to fz e b r a f i s h e v e na t5 0p 班b p a ，r e a l - t i m ep c rf o u n d7m a r k e rg e n e s i nt h e8dz e b r a f i s hw e r eu p - r e g u l a t e d ，a n dt h o s eg e n e sw o u l di n f l u e n c et h e i ri o n c o m b i n a t i o n , m e t a b o l i s m , g e n e t i cd e v e l o p m e n ta n ds i g n a lt r a n s m i t i ns u m m a r y , a l lk i n d so fm o d e r nb i o l o g i c a lt e c h n o l o g i e sw e r es y n t h e s i si nt h i s p a p e rt os t u d yt h et o x i ce f f e c t sa n dm e c h a n i s m so fb p a z e b r a f s i h - t h et y p i c a l b i o l o g i c a lm o d ew e r em o r eu s e f u la tt h ed e t e c t i o no fe n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n s k e yw o r d s ：b i s p h e n o la ；z e b r a f i s h ；d e v e l o p m e n t ；g e n ec h i p s ；m e t a b o n o m i c s n 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：卿口虎 铆孑年，) 月了e l 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：旆扰 ) 嘶年，z 月歹日 第一章概述 第一章概述 第一节环境内分泌干扰物概述 随着工业时代的发展，大量化学物质在环境中不合理地释放，以及现代农 业对农药的过分依赖都对环境造成了极大的污染。越来越多的证据表明，存在 于环境中一些人工合成的化学物质具有体内雌激素的生物效应，它们可干扰鸟 类、爬行类以及哺乳类野生动物或实验动物正常的内分泌功能，改变动物在发 育和成年阶段胞内信号过程，并由此造成动物的雌雄性别的改变以及畸形等病 变。人们称这类物质为环境雌激素( e n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s ) 、内分泌干扰剂 ( e n d o c r i n ed i s r u p t e r s ) 、内分泌活性化合物( e n d o c r i n ea c t i v ec o m p o u n d s ) 或内分泌干 扰化合物( e n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s 。e d c s ) 等。这些物质在环境中的暴露对 人类生殖健康负面影响的证据也越来越多。近年来的隐睾症、尿道下裂、子宫 内膜异位、阴阳人、发育不全等发病率的提高、女孩青春期提前都被认为和这 类物质的环境污染有关。 1 1 1 环境内分泌干扰物定义 环境内分泌干扰物，也称环境激素，是指可以改变内分泌系统结构或功能， 在生物个体及其后代、亚种群或种群水平上造成有害效应的外源性化学物质或 其混合物，它是基于科学的原则、数据、证据权衡和预防原则来确定的【。 1 1 2 环境内分泌干扰物的种类 环境内分泌干扰物主要包括3 大类：雌激素类、雄激素类以及甲状腺素类， 环境雌激素是其中研究得最多、最详细的一类，以至被人们认同是“环境内分泌 干扰物”的同义词。而环境雌激素又主要分为人工合成化学品、天然化合物、工 业化合品、农药类和金属类。其中工业化合品占主要成分，包括以下几大类。 ( 1 ) 烷基酚类 ( 2 ) 多氯联苯类( p c b s ) ( 3 ) 邻苯二甲酸脂类( p a e s ) ( 4 ) 双酚化合物( b i p h e n o l s ，b p s ) ( 5 ) - 恶英类( d i o x i n l i k ec h e m i c a l s ) 1 第一章概述 环境雌激素如何作用于生物体而产生生理效应，是否和内源雌激素一样通 过雌激素受体介导模式以及是否还存在其他的模式，一直是这一领域基础研究 的前沿工作。m c l a c h l a n 2 】和c o l b o m 习等人在进行了大量的实验工作以后首先提 出环境雌激素是以与内源雌激素类似的形式与雌激素受体结合，并和内源雌激 素一样通过雌激素受体介导而产生相应的生理效应。在受体介导模式中还发现 环境雌激素也通过其他的类固醇激素受体或其他受体系统产生生理效应。如通 常共平面芳香烃受体( a h ) 的激动齐l j ( a g o n i s t s ) 被认为是抗雌激素，许多持久性的高 氯代羟基多氯联苯( h o p c b s ) 已经报道具有抗雌激素活性，这表明这些羟基多氯 联苯可能是依赖芳香烃受体而产生毒性作用。另外，二恶英类化合物同样是通 过a h 受体反应产生抗雌激素的活性。p ，p - d d e ，利谷隆( 1 i n u r o n ) ，v i n c l o z o l i n 以及某些p a h s 可和雄激素受体结合，在体内和体外抑制其活性并具有抗雄激 素的生理效应。近来的一些证据表明其他的细胞核受体对环境化学物质也是敏 感的，如糖皮质醇激素受体和甲状腺激素受体等。 除受体模式外，环境雌激素通过直接调节细胞信号途径产生应答的证据也 很多，如高浓度的p , p - d d d 可增加小鼠子宫平滑肌细胞中钙的浓度。农药硫丹 ( e n d o s u l f a n ) l j f i 断氨基丁酸调控氯离子通道( g a b a ) 。一些p c b s 影响钙的体内平 衡( h o m e o s t a s i s ) 以及蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ) 的活性。最近又有关于氯代杀虫 剂可促进和加强有丝分裂的蛋白激酶( m a p k ) 活性的报道【4 】。一些氯代杀虫剂诱 导一些特异的e r 应答，但并不和e r 反应，这表明这种化学物质也许是激活一 些信号途径，而这些信号途径提高不依赖于配体行为中的e r 的活性。e 2 及其 一些羟基化物质，己烯雌酚( d e s ) 等物质对微管、钙调蛋白的影响导致染色体数 量和纺锤体的异常以及微核的形成，从而在受激素调节的肿瘤形成中发挥各自 不同的作用【5 1 。 总之，环境雌激素是一类复杂的物质，不管它们化学结构和内源雌激素的 结构相似与否，都可通过雌激素受体或其他细胞核受体以及直接通过胞内其他 信号传递系统( 如离子通、c a 2 + 浓度以及钙调蛋、微管的装配和解聚等) 的介导产 生生物效应。有关方面的研究是深入了解环境雌激素的作用机制的基础。 1 1 3 环境内分泌干扰物的生物效应标志物( b i o m a r k e r ) 内分泌干扰物的筛选与测试是建立在生物效应标志物的基础上的。生物效应 标志物是指示污染物有害效应的生物信号。对生物效应标志物比较详尽和精确 2 第一章概述 的描述是指通过测量体液、组织或整个生物体，能够表征对一种或多种化学污 染物的暴露和( 或) 其效应的分子、细胞、生理、个体或种群上的变化1 6 】。简而言 之，生物效应生物标志物就是可以衡量环境污染物的暴露效应的生物反应。在 污染物的作用下，生物的不同层次都有各自对应的污染效应和相适应的生物效， 应标志物【7 1 ，这些生物效应标志物在具体的测试中就是测试终点。e d c s 的不同 层次的生物效应标志物有：1 ) 分子水平：通常包括一些特异性酶和蛋白及相关的 m r n a ，它们指示污染物的暴露，包括卵黄蛋白原t g ) 、卵壳蛋白( z 印) 、类固 醇激素和细胞色素p 4 5 0 等；2 ) 细胞水平：包括细胞增值和细胞损伤；3 ) 组织水平： 包括性腺的形态学改变、肝脏和肾脏指数的改变和病理学损伤；4 ) 个体水平：受 损的生殖能力、畸形、生长、死亡；5 ) 种群水平：繁殖力下降、个体数量减少、 受精率下降、性别比例改变等。 表1 1 不同生物标志物举例 t a b l e1 1s a m p l e sf o rd i f f e r e n tb i o m a r k e r s 不同水平生物标忠物 受体结合 生化反应 生理变化 个体水平 群体 p a h s 与a h 受体结合 v r g 的诱导 尾部弯曲 活动性降低 雌雄比例 1 1 4 环境内分泌干扰物与人类健康的关系 人类暴露于e d c s 的可能途径有很多种。食品暴露：食品是人类暴露于e d s 的最重要来源，食品中的e d c s 多数是天然产生的植物雌激素。关于人类对食物 中植物雌激素的暴露( 特别是关于婴儿的饮食暴露) ，目前有较多的争论和争 论；医药品暴露：具有内分泌功能或副作用的药品很常见，在口服避孕药中雌 激素的使用尤其广泛；职业暴露；空气暴露：许多通过空气传播的化学品是e d c s ， 尤其是焚烧产物如二恶英和多环芳烃；饮用水暴露：地下水对由雨水带来的化 学物质的污染的抵抗力是相当脆弱的。 e d c s 可能引起人类出现一些有害效应，并与人类的一些疾病的发病率增加 有关，如精子数量下降、睾丸癌和前列腺癌发生率增加、隐睾症和尿道下裂增加。 此外，e d c s 还可能与妇女的多囊肿卵巢和子宫内膜异位、心血管疾病、甲状腺 紊乱和免疫缺损的发病率增加有关。目前还没有充分的证据证实以上所提到的 情况是由e d c s 的内分泌干扰作用引起或与内分泌干扰有关。然而，所出现的这 3 第一章概述 些情况都存在对e d c s 的敏感成分【8 1 。 1 1 5 环境雌激素对鱼类的生态危害 早在二十世纪八十年代，人们已经发现在纸浆厂附近采到的鱼类产生了生 理混乱，包括血浆中性激素水平改变、性腺的生长和性成熟延缓，这些表明附 近的水体受到了内分泌干扰物的影响。英国、美国、加拿大、瑞典等国家不同 河流或湖泊中发现雄鱼血浆中v t g 含量明显增高，v t g 作为环境雌激素的一项 重要指标表明这些河流或湖泊中含有具有雌激素效应的物质【9 j 。 m a t t h i e s s e n 等【1 0 】早在1 9 9 8 年报道了英格兰的河口和沿海的鲽鱼不仅雄性的 血浆中v t g 含量很高，同时发现雄性精巢中含有卵细胞，出现了精卵共存现象， 并且比率达到了2 0 。同年发现在美国某条河流中的平鲷雄性个体血浆中v t g 含量显著提高，发现两性共存现象比率达到1 0 0 。最近文献报道地中海中2 5 雄性旗鱼出现雌雄同体现象。关于鱼类雌雄同体现象同样在苏格兰、瑞典、 加拿大等不同国家的不同河流中被发现和报道。鱼类雌雄同体现象主要是由于 环境内分泌干扰物特别是环境雌激素或环境雄激素短期诱导产生的，在实验室 研究中已经得到了证实【1 m 12 1 。 鱼类长期暴露于被内分泌干扰物污染的水体中不仅出现雄鱼v t g 含量升高 和精卵共存比率增加，同时将改变鱼类自然状态下的性别比率，对繁殖产生严 重的损害。在美国发现被有机氯农药污染的水体中星鲽和鳎的繁殖受到严重损 伤。在加拿大由于受到牛皮纸浆厂排放的污水污染结果造成了大量接受水体中 底鲻出现性腺发育受阻同时造成了卵颗粒直径减小，受精率降低。加拿大的圣 劳伦斯海湾发现由于受到内分泌干扰物的污染造成了大量的美洲鲽后代孵化率 明显下降。在波罗的海流域中由于受到多氯联苯的污染造成了波罗的鲽的孵化 率显著的降低，而鳕鱼的生殖力明显的下降。 目前环境内分泌干扰物对鱼类繁殖的影响报道多为环境雌激素效应产生的 影响，但已有文献报道纸浆厂污水具有环境雄激素效应。在纸浆厂排水接受水 体中的食蚊鱼不仅出现了繁殖紊乱，同时出现了雄性化的现象。 总之，环境内分泌干扰物对鱼类的生态危害主要包括：雄鱼产生v t g 、性 腺出现雌雄同体、繁殖损伤、生殖力下降、受精率降低、性别比率的改变以及 生长发育受阻等。 一4 第一章概述 第二节双酚a 概述 双酚a ，又称异丙醇醚，英文名b i s p h e n o la ，简称b p a ，化学名又称二酚 基丙烷等。b p a 是苯酚、丙酮的衍生物，为重要的有机化工原料，是生产聚碳 酸( p c ) 树脂和环氧树脂( e p ) 的主要原料，又用于酚醛树脂( p f ) 、可塑性聚酷、抗 氧剂及聚氯乙烯( p v c ) 稳定剂等的制造，在食品包装材料、容器内壁涂料及婴儿 用品、玩具生产等方面有着重要的用途。在医药方面，还是一种杀真菌药。p c 树脂做成的奶瓶、要幼儿食具、咖啡具、饮料瓶及容器等具有透明度好、耐热、 耐高温及抗辐射等特点，因而倍受人们的喜爱。金属罐内壁涂料所用的e p 树脂、 p f 树脂及p c v 树脂，这些也都含有b p a 。我国是一个食品包装材料生产和使用 的大国，许多塑料制品、食具、容器及这些材料做成的各种罐装食品和饮料等 已成为人们生活的必用品随着塑料制品的广泛应用，双酚a 也造成了大范围的 环境污染，并且已经被证实为环境内分泌干扰物质。 1 2 1 双酚a 的基本性质 表1 2 双酚a 的主要物理化学参数 t a b l e1 2m a i np h y s i c - c h e m i c a lp a r a m e t e r so fb i s p h e n o la 化学名称 分子式 结构式 双酚a ( 2 ，2 - b i s ( 4 - h y d r o x y p h e n l ) p r o p a n e ) c 1 5 h 1 6 0 2 分子量 2 2 8 2 9 c a sn o 8 0 0 5 7 外观白色同体粉末 熔点 1 5 5 1 5 7 沸点 1 0 1 3k p a 下3 6 0 溶解性 3 0 0 m g l 溶于水 兰! 曼! ；! ：i ：i ：i 1 2 2 双酚a 在环境中的分布 双酚a 广泛存在于生产过程中产生的工业污水、生活污水以及污泥中。其中， 造纸废水的排放是b p a 污染的重要来源。 早在2 0 世纪7 0 年代中期一，日本就对东京有或没有各种工业污水排放的水 体进行了调查，发现1 4 个水样中的双酚a 浓度 0 0 5( 1 ) 与珏关系：1 9 l c 5 0 = 1 5 5 2 + 0 0 2 9 ( t e ) r 2 _ 0 6 2 1 ，p = 0 0 12 1 的是上调表达 的基凼， 8 0 ，温度为( 2 6 土1 ) ，最佳p h 值控制在8 左右，总硬度为6 8m g l ( 以c a c 0 3 计) 。每日喂 食2 次冷冻摇蚊幼虫( 来自非污染环境，经检测受试化合物低于检出限) 。驯养 2 5 第二章双酚a 对斑马鱼胚胎的毒性效应和生物蓄积研究 光周期为1 4 1 0h ( 昼夜) ，开灯刺激产卵。 ( 3 ) 实验用水 为了尽量避免实验过程中自来水所含物质干扰实验结果，整个实验过程中 的实验用水，包括稀释水和清洁用水，均为统一配制、充氧饱和、温度保持2 6 士1 恒定的重组水。我们参照i s o 标准7 3 4 6 3 ，并根据实际本地水质来配制 重组水，具体组分见表2 1 1 4 j 。 表2 11 0 0 0m l 重组水中各组分的含量( m g ) 和硬度( c a c 0 3m g l ) t a b l e2 1t h ec o n t e n t s ( r a g ) a n dh a r d n e s so f1 0 0 0m lr e c o n s t i t u t e dw a t e r ( 4 ) 鱼卵收集 为了防止成鱼掠食鱼卵，用不锈钢丝网覆盖收集器。玻璃或塑料仿植物体 固定在丝网上，作为产卵基质。给光2 0 - 3 0m i n 后完成交配和产卵，1h 后将鱼 卵收集器取出。在前一天尽可能晚或第2 天开灯之前将收集器放回缸内。 ( 5 ) 鱼卵选择 2 6 、1 5m i n 后受精卵经历第1 次分裂。接下来同步分裂形成4 、8 、1 6 、 3 2 细胞分裂体。挑选受精卵用来实验。未受精卵( 不分裂) 、分裂时呈明显的不规 则( 不均衡、水肿) 或是卵壳损伤的应拣出。 2 1 1 2 双酚a 双酚a ( b p a ) ，2 ，2 双( 4 羟基苯基) 丙烷，天津市福晨化学试剂厂产品，纯度 9 5 0 。称取一定量的b p a ( 纯度9 8 5 ) 粉末，加入少量无水乙醇助溶( 实际暴 露溶液中乙醇的浓度不超过0 0 1 ，经溶剂对照试验，此浓度对试验结果无影 响) ，再溶于重组水中，稀释到需要的浓度。 2 1 1 3 仪器 n 2 8 6 7 自动控光控温水族箱； 缸外过滤机：广东日生集团有限公司； c k 4 0 f 2 0 0 倒置显微镜：日本奥林匹斯有限公司； 1 6 0 x 双目立体显微镜：北京电子光学设备厂； n u n c 多孔细胞培养板：丹麦n a l g en u n ci n t e r n a t i o n a l s h p 2 5 0 g 光照培养箱：天津天宇机电有限公司实验仪器冻干设备分公司； 2 6 第二章双酚a 对斑马鱼胚胎的毒性效应和生物蓄积研究 钻石牌机械秒表( 测量心率) ：上海秒表厂； s t e p p e r4 11 可调节连续加样移液枪：瑞士s o c o r e x ； 自制的鱼卵收集器：玻璃缸( l x w x h = 3 0e m x l 8c m x 6e m ) ，上盖孔径为3m i l l 的不锈钢丝网，网上固定玻璃或塑料的植物仿造物作为产卵的诱导物； 用来收集卵的吸液管，以及用来准备不同浓度试液和稀释水的玻璃器具( 烧 杯，量筒，有刻度的量筒及移液管) ； 色谱柱：c1 8 柱( 3 9 x 1 5 0m m ，5 岬，w a t e r s ) ； h p l c 色谱仪( w a t e r s15 2 5 ) ； 荧光检测器( w a t e r s2 4 7 5 ) ； m u p i d2 小型电泳仪( a d b a n s 株式会社) ； i m a g em a s t e rv d s ( p h a r m a c i ab i o t e c h ) 。 2 1 2 试验方法及分析 2 1 2 1 毒性试验 ( 1 ) 胚胎试验使用t e p p e r4 11 可调节连续加样移液枪，将b p a 溶液加入2 4 孔细胞培养板中，每孔加入2m l 试液，放一枚挑过的发育良好的受精卵，进行 零时( 卵产出并受精1h 内，0 h p f ) 染毒试验。每块板中4 个孔为空白对照( 加 入重组水) ，其余2 0 个孔为同一试验浓度。板加盖后用透明胶带封好，以避免 蒸发而改变试验浓度。放入( 2 6 士1 ) 光照培养箱中培养。从得到鱼卵开始计时， 按照o e c d 标准方法定时观察并记录发育过程中的毒理学终点【】。本试验的 b p a 浓度为0 0 0 ，2 0 0 ，4 0 0 ， 6 o o ，8 0 0 ，1 0 o o ，1 5 0 0 ，1 8 0 0