（环境科学专业论文）优势复合菌群降解氯酚类化合物的特性研究.pdf

a b s t r a c t d e m i n a mm i x e db a c t e r i aw h i c hw c a ea b l et ou t i l i z ec h l o r o p h e n o la ss o l ec a l l ，c m 础 a n d 哪s o u r e w e r oi s o l a t e d , i n , e u b a t e da n dd o m e s t i c a t e df i - o m t h e a c t i v a t e ds l u d g ec o l l e e t e df r o mt h er e t u r n e ds l u d g ew e l lh o l ei nt h en a n j i n gc h e m i c a l c o m p a n y si n d u s t r i a lw a a t c w a t e rt r e a t m c r tp l a n t b yi d e n t i f i c a t i o n , d o m i n a n tm i x e d b a c t e r i ai n c l u d e df o u rk i n d so f b a c t e r i a , l e p s e u d o m o n a s 、a t c a t i g e n e s ，m y c o p i a n a 、 f l a v o b a c t e r i u m b yb a c t e r i ag r o w t h - i n h i b i t i o nt e s t , t h ei s o l a t e dm i x e db a c t e r i aw e l 专 f o u n dt ob em o l et o l e r a n tt od a l o r o p h e n o l st h a nt h eb a c t e r i al i o mn a t u r a lw a t e r s ( q i n g h u a ir i v e r ) i na d d i t i o n , t h 母t o l e r a t i o n o fd o m i n a n tm i x e db a c t e r i ab y d o m e s t i c a t e dw i t h4 - e h l o r o p h e n o ls e l e c t i v em e d i u mw a si m p r o v e ds i g n f f i c e n f l y , a n d t h et o x i e t 7o fc o m p o u n d ss t u d i e do ub a c t e r i aw a sa f f e c t e db yt h es u b s t i t l a e n t k i n d s , q u a n t i t ya n dp o s i t i o n u s i n gd o m e s t i c a t e dc o m p l e xb a c t e r i aa sa ni n o c u l u m ，t h eb i o d e g r a d a b i l i t yo f 2 - e h l o r o p h e n o l 、3 - e h l o r o p h e n o l 、4 - c h l o r o p h e n o l 、2 ，4 - d i c h l o r o p h e n o l 、 m - d i h y d r o x y b e r l z e n e 、p - d i h y d r o x y b e n z e n e 、m - m t r o p h e n o la n dp - n i t r o p h e n o lw a s d e t e r m i n e db y s h a k i n g - f l a s k t e s tu n d e rd i f f e r e n tw a t e re n v i r o n m e n t t h e m e t a b o l i s m i er e l a t i o n s h i p so ft h ed o m i n a n tm i x e db a c t e r i aa n dr i v e rb a c t e r i aw e r e s t u d i e d i tw a sp r o v e dt h a tm i x e db a c t e r i ad o m e s t i c a t e db y 4 - c h l o r o p h e n o lc o u l dg r o w a n dm e t a b o l i z et a k i n gc h l o r o p h e n o l ss t u d i e da ss o l ec a r b o ns o u r c ea n de n e r g ys o u r c e h o w e v e r , 4 - c h l o r o p h e n o lw a sm o s tr e a d yb i o d e g r a d a b l e , a n dt h eo r d e ro ft h ef i n a l r e m o v a lr a t ew a s ：4 - e h l o r o p h e n 0 1 ( 9 3 ) 2 一e h l o r o p h e n o l ( 8 7 ) 3 - c h l o r o p h e n o l ( 8 0 ) 2 , 4 - d a l o r o p h e n o l ( 6 9 ) ；m - d i h y d r o x y b e n z e n e ( 9 3 ) p - d i h y d r o x y b e n z e n e 1 ) ； a n dm - n i t r o p h e n o l ( 9 4 ) p - n i t r o p h e n o l ( 8 8 ) t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fa 1 ) o r i g i n e m i c r o b ei nw a t e rt oa l lt a r g e tc o m p o u n d sw a su n s a t i s f i e d , b u tt h ed e g r a d a t i o nr a t e so f c o m p o u n d sw e r eg r e a t l yi m p r o v e dw h e na d d i n gt h ed o m e s t i c a t e dm i x e db a c t e r i ai n w a t e r t h e r ew e g ec o - m e t a b o l i s me f f e c t sb e t w e e na b o r i g i n em i c r o b ea n dm i x e d b a c t e r i at od i f f e r e n tt a r g e tc o m p o u n d s ， a n dt h es u s p e n ds u b s t a n c e sa n do r g a n i c s u b s t a n c e sc o u l da l s oa f f e c tt h em i x e db a c t e r i a lg r o w t h , p r o p a g a t i o na n dm e t a b o l i s m t h e b i o d e g r a d 出i h t y o ft w oe o e x i s u m ts u b s t i t u t e d p h e n o l s , s u c h a o 2 0 c h l o r o p h e n o l a n d 3 - c h l o r o p h e n o l2 - c h l o r o p h c n o l a n d 4 - c h l o r o r d a e n o l , 2 - c h l o r o p h e n o la n d2 争c h l o r o p h e n o l , 3 c h l o r o p h e n o la n d2 , 4 - c h l o r o p h e n o l ，a n d4 - c h l o r o p h e n o la n d2 ，4 - c h l o r o p h e n o lw e l es t u d i e d b yc o m p a r i n gt h ed e g r a d a t i o nc u r v eo fc o e x i s t e n tc o m p o u n d sw i t ht h a to ft h e s i n g l eo n e s , w cc o u l df i n dt h a tt h ep r e s e n c eo f2 , 4 - c h l o r o p h e n o li n h i b i t e dt h e d e g r a d a t i o nr a t eo f4 - c h l o r o p h e n o li nt h ei n i t i a ls t a g e sd u et ot h ei n c r e a s e dt o t a l t o x i c a n tc o n c e n t r a t i o n , h o w 曰咐d i d n ti n f l u e n c eo b v i o u s l yi t sf i n a lr e m o v a lr a t e t h e m e t a b o l i ce ! 伍c i e n c yo f2 4 c h l o r o p h e n o lw a si m p r o v e dw h e nm o l e r e a d i l y d e g r a d a b l e4 - c h l o r o p h e n o lc o e x i s t e d , a n dt h er e m o v a lr a t eo f2 , 4 - c ：h l o r o p h e n 0 1w 蠲 1 0 0 ，a n dt h ed e g r a d a t i o nr a t ec o n s t a n tw a qi n c r e a s e db ym o r et h a n2 0 i ns u m m e r y , t h el a gp h a s ea n dt h et i m et or e a c hd e g r a d a t i o nb a l a n c ea p p e a r e d l o n g e rc o m p a r e dw i t ho n l yo n es i t u a t i o n t n cc o e x i s t e dc h l o r o p h e n o l si n h i b i t e d m i x e db a c t e r i a lm e t a b o l i s m i ca c t i v i t y t h e r ew f f f ec o m p e t i t i o ne f f e c tf o rc o - e x i s t a n t c o m p o u n d sa tt h eb e g i m f i n g 。b u ta na d d i t i v ee f f e c to ra n t a g o n i s mw a sf o u n dw h e n t a k i n gf i n a lr e m o v a lr a t e 嬲t e s te n d p o i n t k e y w o r d s ：c h l o r o p h e n o l s ，m i x e db a c t e r i a , t o l e r a t i o n , b i o d e g r a d a t i o n , c o - m e t a b o l i s m 学位论文独创性声明： 本人所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工 作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。如不实，本人负全部责任。 论文作者( 签名) ： ( 注：手写亲笔签名) 学位论文使用授权说明 角，褴 如t 刀年占月2 - 1 日 河海大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘 版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件或电子文档，可以采用影 印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一 致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅。论文全部或部分内容 的公布( 包括刊登) 授权河海大学研究生院办理。 论文作者( 签名) ： ( 注：手写亲笔签名) 孙够 劬7 年月z f 日 第一章绪论 第一章绪论 1 氯酚类化合物的来源、在环境中的行为及其毒性 1 1 氯酚类化合物的来源及用途 氯酚是一类非常重要的工业原料，被广泛应用于溶剂、染料、防腐剂、除草 剂、杀虫和杀菌剂等的生产中：加氯的水体、氯化芳烃的泄漏【”和含氯有机物的焚 烧等也会产生氯酚。目前，氯酚类化合物对环境的污染主要来源于木材防腐剂( 例 如五氯苯酚) 、工业废水( 例如纸浆漂白废水) 、事故性泄漏及有机物的燃烧释放物 等。 作为工业原料，一氯酚可用于生产多氯酚，二氯酚被用于生产2 , 4 - - - 氯苯氧 乙酸( 2 , 4 - d ) ，三氯酚常被用作抗菌剂，如纺织品的防霉剂，木材和胶生产过程的 保护剂等，2 ，4 ，5 一三氯酚被用于生产2 , 4 ，5 三氯苯氧乙酸( 2 ，4 ，5 及相关产品， 2 ，4 ，6 - 三氯酚不仅可用作皮革和木材的防腐剂，也是合成四氯酚和五氯酚以及其 它杀菌剂的生产原料。以上这两种三氯酚和2 , 3 ，4 , 6 四氯酚的产量较少。五氯酚 ( p c p ) 被广泛的用作木材防腐剂，粘结剂中的添加剂，结构材料，植物，皮革， 涂料，造纸和油井钻探的污泥中，在美国的年产量高达1 2 5 亿吨。 氯酚进入环境后，因这类化合物的水溶性在芳香类化合物中相对较大，在 2 0 c 下，2 一氯酚( 2 - c p ) 的溶解度为2 8 5 1 0 4 m g l ，2 , 4 - - - - 氯酚( 2 ，4 - d c p ) 的 溶解度为4 5 x 1 0 3 m g l ，2 , 4 ，6 三氯酚( 2 ，4 ，6 - t c p ) 的溶解度也达到约8 0 0m e l 。 同时由于土壤等固体物质对它的吸附和固定作用较弱 2 - 3 】，故可以以水为载体广 泛地扩散。许多学者在土壤、沉积物、固体废弃物、污泥、地下水、地表水给雨 水中均已检测到氯酚的存在 1 2 氯酚类化合物在环境中的行为 氯代芳烃类物质通过挥发、扩散、溶解、吸收、吸附等作用在生态系统中迁 移。如p c p 在有机质含量高的沉积物和悬浮物上的吸附效果非常明显，其吸附 量正比于底泥中的有机质含量。其次，氯酚的被吸附量与环境水体中氯酚的浓度 也有很好的线性关系，线性相关系数在0 9 8 以上【6 1 。 其中少部分通过生物降解、光解、水解、电离等作用转化为其它代谢物质， 河海大学硕士毕业论文优势复合菌群降解氯酚类化合物的特性研究 大部分则富集于土壤、沉积物及生物体内，对人类和动植物构成持久而严重的威 胁。氯代芳烃能够在生态系统的水体、土壤中以蒸汽形式进入大气介质或吸附在 大气颗粒物上，由于难以降解，一般通过长距离地迁移后，其仍会以原化合物的 形式返回地面。正是由于该类化合物的难降解和挥发性或半挥发性特性，使其能 在全球范围内迁移。 1 3 氯酚类化合物的危害 由于污水排放，农药使用，泄漏事故等种种原因进入环境中的氯代酚类化合 物会对各种生物产生毒害作用m ，严重时会导致整个生态系统的破坏。几乎所有 的氯代有机物都有毒，其中很多化合物被认为具有“致癌、致畸、致突变”效应 ( 三致效应) 或可疑的三致效应。同时近年来的研究表明，许多氯代有机化合物是 内分泌干扰物或是潜在的内分泌干扰物，当它们长期低剂量存在时，容易使人和 生物的内分泌系统紊乱。低氯酚可能不致癌或致畸，但对多种细菌和酵母有致突 变作用。有些氯酚如三氯酚会与t c d d ( 一- - 恶英) 混杂，而己知t c d d 是致畸性化 合物。 无论氯酚类化合物是否具有三致效应，由于它能使细胞蛋白质发生变性和沉 淀，因而对各种细胞都有损伤作用。李玉梅等人在研究氯代芳烃对江水细菌的生 物毒性时发现，氯原子的存在，对化合物毒性的贡献要比甲基( - - c h 3 ) 、胺基 ( 一n h 2 ) 更大，且氯原子个数越多，其毒性越科盯。陆光华等人在研究氯代芳 烃对绿藻的4 8 h 急性毒性时也发现，氯酚能够有效抑制绿藻的生长，2 ，4 ，6 - t c p 对绿藻的半数有效浓度( e c 5 0 ) 约为3 0 m g l ，p c p 的e c 5 0 值仅为3 8 m g l t g l 。 天然有机物的氯化和水消毒剂均能产生卤代酚副产物，长期饮用被氯酚污染 的水，可引起头昏、出疹、贫血及各种神经系统症状。许多氯酚化合物降解过程 的中间产物例如氯代邻苯二酚或者是氯代开环产物也具有毒性，会对生物体的生 长产生抑制作用。 氯酚类化合物对环境的污染己受到了世界性的关注。美国环保署公布的6 5 类1 2 9 种优先污染物名单包括从一氯酚，二氯酚，三氯酚，五氯酚等十几种氯酚 类化合物。我国制定的国家危险品名录包括了从一氯酚到五氯酚等各种氯酚。 我国的污水综合排放标准( g b 8 9 7 8 1 9 9 6 ) 也对氯酚的排放做出了具体规定，要求 1 9 9 8 年1 月1 日以后建设的一切排污单位，对氯酚的排放必须遵循以下标准( 表 第一章绪论 2 氯酚类合物生物修复技术的研究 2 1 微生物对氯酚类化合物的降解研究 氯酚类化合物通常被认为是环境外来化合物，环境微生物由于缺乏与之降解 相适应的酶系统，所以表现出难以生物降解性能，但是在长期的接触驯化过程中， 微生物的遗传变异和质粒传递特性，使很多微生物具有了降解或部分降解氯代芳 香化合物的能力。到目前为止，已经发现并分离出多种对氯酚类芳香化合物具有 代谢功能的微生物。 ( 1 ) 细菌 肖春玲等人以2 , 4 - d c p 为降解底物，分离得到了3 株高效降解菌，降解率分 别为6 3 2 、5 7 1 和4 7 4 ，经鉴定都属于芽孢杆菌属【1 0 1 。 m a d s e n 等报道了在厌氧条件下分离培养降解氯酚的细菌该细菌为革兰氏阳 性菌，端生芽抱，并稍有弯曲的杆菌，为梭状芽抱杆菌属，在有丙酮酸和酵母膏 存在时生长速度最快，可以利用丙酮酸为惟一碳源，并且利用丙酮酸发酵产生等 分子数的乙酸【1 l 】。 钟文辉等人从2 , 4 - d c p 生产厂排污口污泥中分离并筛选到两株以2 , 4 - d c p 为唯一碳源和能源生长、具有降解2 ，4 - d c p 能力的细菌g t 2 4 1 1 和g t l 4 1 - 2 ，经 鉴定确定它们都属于假单胞菌属( p s e u d o m o n a s 够) 。菌株g t 2 4 1 1 在2 5 3 0 的 河海大学硕士毕业论文 优势复合菌群降解氯酚类化合物的特性研究 最适温度下能在4 8 小时内将6 0 - 1 0 0 m g l 的2 , 4 - d c p 降解至8 - 1 2 m g l ，而菌株 g t l 4 1 - 2 在2 5 - 3 0 的最适温度下，能在3 6 小时内将6 0 - 1 0 0m g l 的2 , 4 - d c p 降 解至2 5 3 0 m g ，l 。g c i v l s 分析表明，两菌株能将2 , 4 - d c p 彻底降解，未积累中 间代谢产物。经3 8 ( 2 热处理菌株g t 2 4 1 1 中有1 9 丧失了2 , 4 - d c p 降解能力【1 2 】 i c 唧o h a r a 等报道了分离假单细胞菌属p i k e t t i i 来降解2 , 4 ，5 - t c p 。这种菌株可 以用2 , 4 ，6 - t c p 作为唯一碳源从土壤生物种群中被分离出来。这种菌使l m o l 的 2 , 4 ，6 - t c p 释放出3 m o l 氯离子。这种菌株r p i c k e l 埘id t p 0 6 0 2 在高细胞浓度下可 降解多种氯酚【1 3 1 。 宋建华等从曾受p c p 污染废水的活性污泥中，经驯化富集和分离筛选获得 一株p c 降解菌，菌号为c s - w - 9 8 5 。在2 4h 内该菌降解w ( p c p ) = 4 0 0 1 0 r 6 达 9 0 以上。该菌短杆状，大小为0 6 - 0 8i lm x0 9 1 2 t lm ，无芽孢，一端生单 鞭毛；革兰氏染色阴性，好氧，氧化酶阳性，接触酶阳性；最适生长温度为2 8 最适生长p h 为6 5 - - - 8 0 。根据以上结果将该菌归于假单胞菌属 ( p s e a d o m o n a s s p ) 。该菌在p s 7 9 0 、2 8 c 和大生物量条件下能有效地降解高浓 度p c p ；在该菌降解p c p 时，添加某些营养物如牛肉膏、葡萄糖有利于p c p 的 降解【。 ( 2 ) 真菌 在研究真菌降解氯化木素时，人们发现一些能够分泌木素解聚酶的真菌同样 可以降解各种氯代芳烃类化合物，并且具有较高的降解能力。 对从鸡舍粪便中分离得到的1 1 6 株真菌的研究表明，5 9 的菌株能利用 2 ，3 ，4 ，6 四氯酚，去除率从1 到8 3 不等。将摇瓶培养物密闭保温5 d ，在好氧 和厌氧条件下转化，表现出这种转化能力的真菌包括曲霉( a s p e r g i j j u ss p ) 、拟 青霉( p a e c i l o m y c e ss p ) 、青霉( p e n i c i l l i u ms p ) 和帚霉( s c o p u l a r i o p s i ss p ) f 悯。 白腐菌是属于担子菌亚门的一类真菌，自1 9 8 5 年b t m a p u s 等在s c i e n c e 上报 道白腐菌对持久性环境污染物质的降解之后，白腐菌就受到微生物学家和环境毒 理学家的关注f 1 6 1 。根据大量的研究报道，白腐菌能够对芳香族化合物起到到目前 为止已知的最佳的降解效果，其中就包括氯酚类芳香化合物。白腐菌通过分泌胞 外酶木素过氧化酶和锰过氧化酶降解氯酚，通过对中间产物进行分析表明， 醌和醛类物质是主要的中间产物”7 1 。以2 ，4 d c p 为例，2 , 4 - d c p 首先经木素过氧 第一章绪论 化酶氧化形成2 氯1 年苯二醌，然后被还原形成2 氯1 , 4 - 二苯酚，再甲基化后， 又可形成木素过氧化酶的底物2 氯1 羟甲基苯。在木素过氧化酶和锰过氧化酶 的相继作用下，最终发生破环反应。苯环开裂后的产物就容易被其他微生物代谢 了。 ( 3 ) 复合菌 安淼等人从经长期驯化的活性污泥中分离出一组具有协同作用并能以氯代 酚作为唯一碳源的复合菌，它由假单胞菌( 两p “面女d 麟e b ) 、鞘氨醇单胞菌 呐确妒n 脚跟) 和寡养单胞菌 甜曲印_ j l d 坍d 船够) 组成【1 扪。 耿亮等人从扬子石化工业污水处理厂回流污泥井提取活性污泥样品，通过分 离、培养和驯化，得到能以氯代酚类化合物为唯一碳源和能源的耐受复合菌，经 鉴定，其组成包括黄杆菌属( f l a v o b a e t e r i u m ) 、不动杆菌属( a c i n e t o b a c t e r ) 、产 碱杆菌属( a l c a l i g e n e s ) 、枝动杆菌属( m y c o p i a n a ) 、假单胞菌属( e s e u a o m o n a s ) 等五种细菌。通过细菌生长抑制实验证明，分离得到的复合菌对氯酚的耐受性高 于自然水体中( 长江) 的混合细菌，而且经2 - c p 选择性培养基驯化后，复合菌 对毒物的耐受性也明显提高，对环境酸碱性的变化有很强的适应性，可适应p h 值从3 5 到9 5 的广泛范围【1 9 1 。 ( 4 ) 高效工程菌 用遗传工程等现代生物技术手段来扩大和提高微生物降解环境污染物的功 能，对于消除环境中的有毒有害污染物具有巨大的潜力。迄今为止，人们己构建 了若干工程菌用于处理环境污染物质。 l e b r b a e h 等把来自n a h 7 质粒的编码水杨酸水解酶的、h g 基因引入到假 单胞菌b 1 3 菌株中，使该b 1 3 菌株增加了利用水杨酸和氯代水杨酸的能力2 0 1 。 质粒分子育种是c h a k r a b a r t y 等提出的培育新功能菌株的一种方法。这种方 法是在有选择压力条件下于恒化器长期混合培养过程中，通过各种微生物间质粒 的自然传递和相互作用来完成。c h a k r a b a r t y 等把从堆放有毒废物垃圾处分离的 细菌接种至恒化器中，同时还有意识地接种具降解质粒c a m 、t o l 、s a l 、p a c 2 1 和p a c 2 5 的几个假单胞菌菌株以便为代谢途径的进化提供基因。试验开始时， 恒化器中培养基= ! j n a 低浓度的2 , 4 , 5 - t ( 5 0 ) 肛g m l 和较高浓度带降解质粒菌株利用 的底物( 2 5 0 ) g m l 的甲基苯甲酸盐、水杨酸盐和氯代苯甲酸盐。连续培养2 周后， 河海大学硕士毕业论文 优势复合菌群降解氯酚类化合物的特性研究 逐步提高培养液中2 , 4 。5 - t 浓度，减少降解质粒所要求的底物浓度。最后得到了 一株能以2 , 4 ，5 - t 作为唯一碳源和能源的洋葱假单胞菌a c l l 0 0 。以同样来源的菌 株单独在试管里以2 ，4 ，5 t 为碳源进行长期的富集培养时，未能获得以2 ，4 ，5 - t 作 碳源时的培养物【2 1 1 。 罗如新等发表了降解氯苯的邻苯二酚1 , 2 - 双加氧酶( c 1 2 0 ) - 基因克隆和表达研 究结果。作者将邻苯二酚1 2 双加氧酶基因直接克隆至表达载体p k t 2 3 0 上，获 得重组子p k t 2 3 0 - p ，重组子转化不具开环酶活性的甲胺磷降解假单胞菌菌p 2 ， 获得的转化子具有高效的邻苯二酚l ，2 双加氧酶( c 1 2 0 ) 酶活圈。 2 2 微生物对氯酚类化合物的降解机制 氯代酚类化合物与苯酚或烷基酚相比，更难以被微生物降解，主要原因在于 高负电性的氯原子使苯环成为一个难以被氧化的疏电子环。氯代酚类化合物降解 的关键在于脱氯。根据脱氯过程中电子的得失，可将氯代酚类化合物生物降解分 为氧化脱氯和还原脱氯。除了脱氯机制以外，氯代酚类化合物还有共代谢降解机 制。 2 2 1 氧化脱氯机制 在好氧条件下，氯代酚类化合物的降解是在一系列酶的作用下通过进入电子 呼吸链来进行的，它的开环裂解需要通过氧从苯环分子中获得电子来完成。由于 氯原子对苯环上的电子产生强烈吸引，使苯环上电子云密度大大降低而成为一个 疏电子环，因而氯代酚类化合物较难发生亲电反应，氧化过程难度增加，取代氯 原子越多，环上的电子云密度就越低，越难以被氧化降解。氯代酚类化合物好氧 生物降解中的脱氯作用可分为先开环再脱氯和先脱氯再开环两种情况： ( 一) 先开环再脱氯 在好氧条件下，低氯代酚类化合物的降解反应一般遵循一种相似的先开环再 脱氯的机制。首先在羚化酶的作用下在苯环上加入另外一个轻基，形成重要的中 间产物氯代邻苯二酚。氯代邻苯二酚在加氧酶的作用下开环形成相应的氯代粘糠 酸，然后在内脂化过程中脱出氯离子。氯代邻苯二酚的氧化脱氯脱氯过程如图 1 1 所示。多氯代酚的降解与低氯代酚有着不同的途径。d i n e s h 等研究了真菌对 2 , 4 ，5 三氯代酚的降解过程【2 3 1 。降解开始于木质素氧化酶催化作用下脱去羟基对 第一章绪论 位的氯原予将其氧化成2 ，5 - 二氯1 ，4 苯醌，2 ，5 - 二氯1 ，4 二羟基苯则是醌的还原 产物，再进一步由过氧化酶催化的氧化脱氯反应使苯环上的氯全部被羟基取代， 在开环之前苯环上的氯已经被全部脱去，使得苯环容易打开，进而被完全矿化。 p c p 有着与三氯代酚相似的降解过程，由催化酶作用首先在对位发生羟基化反 应，生成四氯代对苯二酚，而后连续脱去3 个氯，生成l ，2 三经基苯，该化合 物开环后最终矿化成c 0 2 。 o hao c i o 一命 图l - 1 氯代邻苯二酚的氧化脱氯过程 通常认为，在芳香烃的生物降解过程中，当取代基是烷烃时，儿茶酚发生间 位开环；氯代芳烃则经邻位开环。但研究表明，在一定的条件下，氯代芳烃好氧 降解过程中氯代儿茶酚也存在间位开环例。h o l l c n d c r 等在以4 - c p 和4 m p 为底 物富集培养过程中筛选得菌株c o m a m o n a s t e a t o t e r o n ij i - 1 5 ，能同时降解4 - c p 和 4 m p 2 5 】。对其降解中间体及降解酶的检测都证实在该菌的作用下，4 - c p 是经间 位开环降解的，降解路径如图1 - 2 。在经甲酚驯化的a l c a l i g e n e se u - t r o p h u sj m p 2 2 2 对2 , 4 - d c p 和p s e u d o m o n a s c e p a c i a p l 6 6 对4 氯苯甲酸降解过程中氯代儿茶酚的 间位开环也得到了证实【2 6 】。 河海大学硕士毕业论文优势复合菌群降解氯酚类化合物的特性研究 图1 - 2 4 - c p 的好氧生物脱氯降解途径 ( 二) 先脱氯再开环 在从p c p 污染的环境中筛选得到的f l a v o b a c t e r i u m s p 和l 叻o d o c o c c u s c h l o r o p h e n o l i c u s 能降解p c p 和其它一些多氯酚吲。在好氧条件下的降解过程为， 它们先将c p s 苯环氧化生成氯代醌，然后再逐步脱去氯取代基生成单氯酚或苯 酚。f l a v o b a c t e r i u m s p 对p c p 的降解路径如图1 3 t z s 。d e n g - y ul 等发现，在 2 , 4 ，6 - t c p 的降解菌株a z o t o b a e t e r s pg p l 对酚类化合物的降解过程中存在上面两 种降解路径：苯酚的降解是经儿茶酚降解的；2 , 4 ，6 一t c p 和2 ，6 - d c p 的降解首先 对位氧化生成醌【2 9 1 。飚巧o h o m 等报道了经2 ，4 ，6 - t c p 诱导的p s e u d o m o n a s p i c k e t t i i 菌株d t p 0 6 0 2 可将含对位氯的酚转化成相应的氯醌；而经4 - c p 诱导时，该菌能 将邻位缺氯的氯酚经氯代儿茶酚的路径降解2 7 1 。 o h 卫卜 图1 - 3 四氯酚的好氧生物脱氯降解途径 第一章绪论 2 2 2 还原脱氯机制 还原脱氯是指氯代酚类化合物在得到电子的同时去掉一个氯取代基并且释 放出一个氯离子的过程。还原脱氯主要发生在厌氧条件或缺氧条件。由于氯原予 强烈的吸电子性，使苯环上电子云密度降低，在好氧条件下，氧化酶很难从苯环 上获取电子而发生氧化反应，而且氯原子取代个数越多，苯环上的电子云密度就 越低，氧化就越困难。而在厌氧或缺氧条件下，环境的氧化还原电位较低，电子 云密度较低的苯环在酶作用下容易受到还原剂的亲核攻击，从而氯原子被取代， 显示出较好的厌氧生物降解性。还原脱氯使氯原子数目减少，降低这些难降解有 机物的毒性，易于降解中问产物。 还原脱氯是一种重要的氯代酚类化合物的降解机制，自上世纪8 0 年代以来， 众多学者进行了相关的研究。对沉积物中2 , 4 d c p 的还原降解过程的研究发现， 2 , 4 - d c p 首先脱掉邻位的氯生成4 - c p ，然后脱掉第二个氯生成苯酚，最终被彻底 降解为甲烷和c o z t 3 0 j ，相关研究还发现，羚基邻位的氯比其它位置的氯容易脱 除【州。因此对于3 , 4 - d c p ，3 , 5 d c p ，由于这两种二氯代酚的氯不在羟基邻位， 较其它二氯酚更难被降解。b e a - v e n 等通过接种降解菌研究了沉积物中三氯酚和 五氯酚在厌氧条件下的还原脱氯过程，发现2 , 4 ，6 - t c p 降解的中间产物包括：苯 酚，4 - c p ，2 , 4 - d c p ，甲基酚等；五氯酚降解的中间产物包：2 ，3 ，4 ，5 四氯酚， 3 , 4 , 5 - t c p ，3 ，5 d c p ，3 - c p ，苯酚，甲基酚等【3 2 1 。 图1 42 , 4 - d c p 的还原脱氯过程 c 0 2 + c h 4 2 2 3 共代谢降解机制 1 9 5 9 年l e a d b e t t e r 和f o s t e r 首先发现甲烷是可供p s e u d o m o n a sm e t h a n i c a 生 长的唯一碳源物质3 3 1 。在甲烷存在下，p s e u d o m o n o u s m e t h a n i c a 生长可以氧化乙 河海大学硕士毕业论文优势复合菌群降解氯酚类化合物的特性研究 烷为乙酸，丙烷为丙酸和丙酮，丁烷为丁酸和甲基乙基酮。而乙烷、丙烷及丁烷 这三种物质都不可作为单一碳源物质维持p s e u d o m o n a sm e t h a n i c a 生长。 l e a d b e t t m 和f o s t e r 用共氧化( c o o x i d a t i o n ) 来描述微生物氧化非生长基质而不利 用氧化过程产生的能量的过程。随后j e n s 建议采用更广泛的定义共代谢 ( c o - m e t a b o l i s m ) 来描述这一过程，并扩展到微生物氧化脱氯过程的研究。共代谢是 指微生物依赖可利用碳源和能源在正常生长过程中氧化非生长基质的过程。它也 描述了在可利用碳源支持下休眠细胞( r e s t i n gc e l l ) 对非生长基质的氧化。现在对微 生物共代谢作用一般定义为：只有在初级能源物质存在时，才能进行的有机化合 物的生物降解过程。在这一过程中，生物体依赖初级基质的消耗而生长，同时具 有降解不可利用碳源和能源物质的能力。 s p a i n 和h a g g b l o m 等研究发现生长在酚或甲苯上的p s e u d o m o n a a p u t i d p i 产 生的一种加氧酶能够将几种一氯酚和二氯酚单羟基化成氯邻二酚，羟基化的化合 物在纯培养中不能被继续降解，但在混合培养中则很容易被其它细菌所转化【蚓。 施汉昌等研究了厌氧条件下不同污泥中投加葡萄糖对2 , 4 ，6 - t c p 降解的影响 p 5 1 。结果表明：补充碳源大大提高了啤酒废水污泥对氯代酚的降解作用；但对于 有机废水污泥来说，补充碳源所起的作用就不很明显；对造纸废水污泥，补充碳 源条件下的降解常数小于氯代酚作为唯一碳源条件下的降解常数，表现为抑制作 用。该研究说明，不同的微生物种群具有不同的降解酶系统和代谢机制，不能简 单的认为投加易降解碳源就会促进共代谢作用。 2 3 氯酚类化合物生物降解的影响因素 ( 1 ) 生长基质 微生物通过对生长基质的代谢提供足够的碳源和能源作为供微生物生长，并 诱导产生相应的降解酶来降解非生长基质。耿亮等研究采用添加苯酚作为生长基 质对氯代苯酚生物降解特性的影响，结果表明当3 氯酚与苯酚共基质时，共代谢 作用明显，l om g l 苯酚存在的情况下，3 氯酚的最终去除率从未添加时的8 2 7 增加到8 9 2 ，同时，随着苯酚浓度的不断增大，3 氯酚的降解迟滞期有所延 长，达到降解平衡的时间也不断延迟，但最终的去除率得到不断提高【l9 】。 ( 2 ) 营养物质 微生物需要的营养物质有碳素营养源、氮素营养源、能源、生长因子、无机 第一章绪论 盐和水。医此，若要微生物能够健康快速的生长，除了需要投加生长基质来保证 足够的碳源之外，还需要投加一定量的生长基质无法提供的物质，如氮、磷、铁、 维生素以及一些微量元素等。 ( 3 ) 无机盐 在农药、制药，染料工业所排放的废水中，一般都含有一定量的n a c l 或硫 酸盐，而无机盐的重要生理功能之一是构成酶的组分和维持酶的活性，所以有盐 类的存在对有机物的生物降解会产生影响。研究表明，高盐环境下微生物代谢酶 活性受阻，生物增长慢，产率系数低，水体密度增加，影响污泥絮凝性。处理含 盐废水反应器中溶解氧浓度降低。高盐环境下的污泥较一般污泥糖类、蛋白质含 量低而脂类、r n a 含量高。高盐环境及盐浓度的变化对生物处理有抑制作用冈。 ( 4 ) 温度 温度是微生物的重要生存因子，适宜的温度能使微生物以最快的生长速率生 长，温度过高或过低，都会抑制微生物的快速生长。赵金辉等人的研究结果表明， 随温度升高( 2 0 c 一3 0 c ) ，氯代芳烃类化合物的降解百分数增大，降解动力学常 数也随着温度升高而增大。为了进一步了解微生物能否在过低和过高温度下降解 氯代芳烃类化合物，实验在4 和4 0 c 条件下进行。结果表明，在4 c 条件下， 氯代芳烃类化合物均未发生降解，但若将它们放置在室温条件下( 2 5 - a ：2 c ) 一段 时间后，水样又开始降解；不过在4 0 c 条件下的降解明显低于在室温条件下的 降解【3 7 1 。这说明，能够降解氯代芳烃类化合物的微生物的最佳生长范围在3 0 c 左右。低温时，这些微生物处于休眠状态，若在适宜的温度条件，这些微生物仍 能恢复活性。高温时，抑制微生物对污染物代谢，降解速度明显减慢。 2 4 氯酚类化合物的主要生物处理技术 2 4 1 好氧生物处理技术 目前对含氯酚废水的好氧生物处理研究主要集中在单氯酚或低氯代酚的处 理技术上。 好氧的活性污泥法处理工业废水是一种经济的、净化效果好的方法，其运行 的历史较长，经验和理论都很丰富，但该法具有的缺点是特别不耐冲击，即影响 运行因子较多，废水中污染物的浓度变化，特别是一些有抑制作用污染物的浓度 变化，会对细菌的生化活动有显著抑制作用。但经过驯化的活性污泥可以抗拒氯 河海大学硕士毕业论文优势复合菌群降解氯酚类化合物的特性研究 酚等有毒难降解有机污染物的抑制。 投菌法是针对所要去除的污染物质，利用特别培养的优势菌种对该污染物质 进行有效降解的方法。投菌法在美国、德国、日本等国已被采用，用以改善活性 污泥法处理效果，尤其适用于对含氯酚等难降解有机物废水的治理。目前，已筛 选出针对多种难降解有机物的微生物菌种。但所投加菌种在新的环境中的适应性 和再生是投菌法急待解决的问题。为了增加优势菌在生物处理装置内的浓度，提 高难降解有机物的处理效率，固定化技术已被用来处理部分含难降解有机物的废 水。对p c p 、氯苯胺、d d t 等有毒难降解有机物的固定化细胞处理研究也有报 道。如b r i o t r o l 研制了一种优化利用黄色杆菌处理木材防腐废水的工程系统，从 实验室小试、中试到实际应用的b a t 系统( b r i o t r o la q u e o u st r e a t m e n t ) 均属于固定 化细菌系统。该装置可以处理含p c p 8 0 - 1 2 0m g l 的地下水，也可用于处理 c o d c r 4 4 0 0 - 6 7 0 0m g ：l 及b o d 5 1 3 0 0 1 6 0 0 m g l 的p c p 、杂酚油和其它木材处理 付产物的复杂废水。与活性碳吸附和化学氧化法相比该系统的运行费用较低【3 肌。 生物膜法是一种耐毒性基质较强的生物处理方法，但处理的水质不如活性污 泥法好，将两者结合使用是处理含难生物降解有机化合物废水的重要手段之一。 具有代表性的是旋转式接触生物反应器( 即r b c 生物反应器) 。某些r b c 支撑料 是由7 - - 醇丙烯酸j 旨( g l y c o l r n c t h a c r y l a t e ) 树脂构成，形成双对直角而同时在同 r b c 内组合成厌氧一好氧两段反应器的搭配流程，它无论在水利学、传质及流 程搭配方面都有大的改进。可用r b c 处理含2 - c p 、2 ，4 - d c p 、2 , 4 ，6 - t c p 、p c p 、 2 硝基酚、二乙基酞和丁基酞时。处理2 - c p 、2 ，4 - d c p 、2 , 4 ，6 t c p 时，其去除 率分别为6 8 2 ，8 8 7 ，8 5 6 ，c o d 去除率8 7 7 。 p u h a k k a 等以硅藻土为载体，利用以m c p 、d c p 为唯一碳源和能源驯化一 年的城市污水处理厂污泥接种的纯氧曝气流化床反应器处理3 4 - 1 3 0m g i