（材料学专业论文）新型海藻酸盐明胶水凝胶的研究.pdf

中文摘要 海藻酸钠和明胶均是天然生物材料，因其价格低廉、安全可靠及生物相容性 良好被广泛应用于组织工程及相关领域。然而，海藻酸盐本身的降解速率缓慢， 其水凝胶降解方式不可控，降解产物因分子量过高难于从体内排除。这些缺陷在 一定程度上限制了海藻酸盐在组织工程中的应用。而明胶常温下易凝胶的性质为 其水凝胶制备过程中的操作带来很大的不便。本文利用部分氧化海藻酸钠和改性 明胶发生的s c h i f f 碱反应制备出可注射性共价交联水凝胶。 首先以高碘酸钠为氧化剂对海藻酸钠进行了氧化改性。氧化体系采用水- 乙醇 体系。红外光谱( f t m ) 测试结果表明氧化产物的分子结构中出现了醛基结构。 采用盐酸羟胺滴定法测定了氧化产物的氧化度，以粘度法表征了相对分子质量。 结果证实氧化温度上升时，氧化产物的相对分子质量显著降低；增加氧化剂量可 获得较高氧化度的氧化海藻酸钠，但同时也降低了氧化产物的相对分子质量：相 同条件下水乙醇体系的分子量要高于纯水体系分子量，同时可利用较少溶剂得 到较高产率的氧化产物。模拟生理条件下( 3 7 、p h7 4 ) 氧化海藻酸钠具备良 好的水解降解性能。 在水溶性碳二亚胺( e d c ) 的催化作用下利用乙二胺对明胶进行改性，使原始 明胶中的部分羧基转变为氨基。采用t n b s 法测试明胶的氨基含量。结果表明增 加乙二胺的用量，可以获得改性度较高的改性明胶。氨基的增加使得明胶溶液粘 度降低，室温下可保持较好的流动性。 上述两种改性聚合物可共价交联形成水凝胶。红外光谱测试结果表明：水凝 胶的分子结构中出现了s c h i f f 碱特征峰；流变性能测试表明，通过调整氧化海藻 酸钠的氧化度、改性明胶的改性度及反应物的浓度，可把此类水凝胶的凝胶时间 控制在3 0 一- 2 5 0 s 之内，强度和流变学测试结果揭示水凝胶的力学性能可在一定 范围内调控。在模拟生理条件下，水凝胶的降解速率与氧化海藻酸钠的降解趋势 相吻合，说明此类水凝胶的降解主要依赖于氧化海藻酸钠的水解。细胞毒性试验 结果表明选择合适的氧化海藻酸钠和改性明胶的配比，可保证凝胶膜细胞毒性为 0 级水平，细胞相容性良好。 关键词：氧化海藻酸钠，改性明胶，共价交联水凝胶，凝胶时间，降解 a bs t r a c t a l g i n a t ea n dg e l a t i na r eb o t hn a t u r a lb i o m a t e r i a l s ，t h e yh a v eb e e nw i d e l yu s e di n t i s s u ee n g i n e e r i n ga n do t h e rr e l a t i v ef i e l d sb e c a u s eo ft h e i rl o wp r i c ea n dg o o d b i o c o m p a t i b i l i t y h o w e v e r ，a l g i n a t ei t s e l fh a sav e r ys l o wd e g r a d a t i o nr a t e ，a n di t s g e l sd e g r a d e di na nu n c o n t r o l l a b l em a n n e r , r e l e a s i n gh i g hm o l e c u l a rw e i g h ts t r a n d s t h a tm a yh a v ed i f f i c u l t yb e i n gc l e a r e df r o mt h eb o d y b e s i d e s ，a tr o o mt e m p e r a t u r e t h es t a r t i n gg e l a t i ni sn o ts o l u b l e ，i nw a t e ru n l e s st h et e m p e r a t u r ei sr a i s e da b o v e3 7 。c ， b e c a u s ei th a si n t e r m o l e c u l a rp h y s i c a lc r o s s l i n k a g e s t oc i r c u m v e n tt h e s ep r o b l e m s ， w em o d i f i e db o t ha l g i n a t ea n dg e l a t i nt oc h a n g et h e i rp h y s i c a lo rc h e m i c a lp r o p e r t i e s i nt h i sp a p e r ，p a r t i a l l yo x i d i z e ds o d i u ma l g i n a t ew a sc o v a l e n t l yc r o s s - l i n k e dw i t h a m i n a t e dg e l a t i nv i as c h i f f sb a s ef o r m a t i o nt op r e p a r ean o v e l 叫e c t a b l eh y d r o g e l s o d i u ma l g i n a t ew a so x i d i z e du s i n gs o d i u mp e r i o d a t e i ra n a l y s i sc o n f i r m e dt h e c h a r a c t e r i s t i cp e a ko fa l d e h y d eg r o u pi nf h eo x i d i z e da l g i n a t e a d d i t i o n a l l y ，t h e d e g r e eo fo x i d a t i o n ( o d ) o rt h ea l d e h y d ec o n t e n t sw e r em e a s u r e db yu s i n gt i t r a t i o n m e t h o d s t h eo do fs o d i u ma l g i n a t ee n h a n c e da l o n gw i t ht h ei n c r e a s i n ga m o u n t so f a d d e ds o d i u mp e r i o d a t e s t h em o l e c u l a rw e i g h t so fs o d i u ma l g i n a t ew e r eh i g h e ri n w a t e r - e t h a n o lt h a np u r ew a t e rs y s t e m o x i d a t i o ni nw a t e r - e t h a n o ls y s t e mh a st h e a d v a n t a g eo fg e n e r a t i n gl a r g eq u a n t i f i e so ft h eo x i d i z e da l g i n a t ei nh i g h e ry i e l du s i n g l e s ss o l v e n t o x i d i z e ds o d i u ma l g i n a t eh a dac o n t r o l l a b l eb i o d e g r a d a b i l i t yu n d e r p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n ， g e l a t i nw a sm o d i f i e dw i t he t h y l e n e d i a m i n ei nt h ep r e s e n c eo fe d ct oc o n v e r tt h e c a r b o x y lg r o u p si no r i g i n a lg e l a t i ni n t oa m i n og r o u p s a d d i t i o n a l l y ，a m i n oc o n t e n t s w e r em e a s u r e du s i n gt n b s t h ea m i n oc o n t e n t se n h a n c e da l o n gw i t ht h ei n c r e a s i n g a m o u n t so fa d d e de d t h ei n t r o d u c t i o no fa m i n og r o u p si ng e l a t i ni m p r o v e di t s s o l u b i l i t ya n df a c i l i t a t e dg e l a t i nd i s s o l v i n gi nw a t e ra tr o o mt e m p e r a t u r e o x i d i z e ds o d i u ma l g i n a t er e a c t e dw i t ha m i n a t e dg e l a t i nt of o r mc o v a l e n t l y c r o s s l i n k e dh y d r o g e l s i ra n a l y s i sc o n f n m e dt h ec h a r a c t e r i s t i cp e a ko fs c h i f f sb a s e g r o u pi nt h eh y d r o g e l b yi n c r e a s i n gt h eo d ，a m i n oc o n t e n ta n dc o n c e n t r a t i o no f r e a c t a n t s ，g e l a t i o nt i m ec o u l db ec o n t r o l l e df r o m3 0 st o2 5 0 s t h ed y n a m i cs h e a r m o d u l u sa n dc o m p r e s s i v em o d u l u so ft h eh y d r o g e l sc o u l db em o d u l a t e db yt h e g e l l i n gc o n d i t i o n s t h ed e g r a d a b i l i t yo fh y d r o g e l sw a sd e p e n d e n to no x i d i z e da l g i n a t e a n dh a das u i t a b l eb i o d e g r a d a b i l i t yu n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n c y t o t o x i c i t y e v a l u a t i o nu s i n gl 9 2 9f i b r o b l a s t sa sm o d e ls y s t e ms h o w e dt h a tt h ec o v a l e n t l y c r o s s - l i n k e da l g i n a t e - g e l a t i nh y d r o g e l sw e r en o n t o x i ci np r o p e rc o m p o s i t i o n s k e yw o r d s ：o x i d i z e da l g i n a t e ，a m i n a t e dg e l a t i n ，h y d r o g e l ，g e l a t i o nt i m e ， d e g r a d a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼太堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：羽、言蕉 签字日期：砌7 年月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丞洼太堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丞洼太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 到言荏 签字日期：二缈7 年月冲e l 导师签名： 氍孵 l 稗醐：嘲年1 月哕日 第一章绪论 1 1 组织工程 1 1 1 组织工程的概念 第一章绪论 人的生命过程中很可能遭受疾病困扰和意外创伤，组织和器官的缺损或功能 的衰竭在日常生活中也非常常见。临床上，一般采用器官移植、外科修复、人工 取代物、医疗器械以及药物来进行治疗。其中，常用的自体器官移植虽然效果显 著，无免疫排斥，但必须从健康部位取材，造成新的缺损，并且供区有限；同种 异体移植避免了自体器官移植中产生新创伤的缺点，但会长期存在免疫排斥反 应，而且供体并不能满足大量患者的需要；人工取代物一般为生物惰性材料，不 能与受损的组织和器官愈合形成一个整体：医疗器械不能替代器官的全部功能， 也就不能很好地修复受损的组织和器官。因此，需要采用一种新概念、新方法进 行受损组织和器官的修复和再生，组织工程技术应运而生。 在2 0 世纪8 0 年代，y a n n a si v 等采用可降解胶原多孔材料作为模板进行皮肤 再生的研究【i 】。1 9 8 7 年美国国家基金委员会举行的关于生物工程的小组讨论中提 出了组织工程的术语。1 9 8 8 年在美国加州塔霍湖举行了第一次组织工程会议， 并定义组织工程的概念1 2 1 。1 9 9 3 年l a n g e rr 和v a e a a t ij p 在科学杂志上发表关 于组织工程的综述，将组织工程的研究推向新的高潮，并逐渐形成组织工程学这 一新学科【3 l 。 组织工程的概念1 4 是运用工程科学和生命科学的原理及方法，从根本上认识 正常和病理的哺乳动物组织和结构功能的关系，并研究生物学的替代物，以恢复、 维持和改进组织的生物功能。它是一个综合细胞生物学、材料科学、生物化学、 化学工程、生物医学工程学和移植学等多学科的交叉领域，其基本思路主要分为 体外构建和体内构建两种。体外构建大致过程是将细胞在体外培养扩增后，吸附 于预先设计的生物学支架上，构成细胞支架复合体，植入机体相应的病损部位。 随着细胞长入，支架材料逐渐降解吸收，最终形成具有正常生理结构与功能的新 生组织，从而达到器官再生的目的。这种方法构建的组织形成和成熟过程基本上 在体外完成，便于观察和评价，相关影响因素也容易分析和控制，并可实现产业 化。体内组织构建大致过程是：将体外培养扩增的种子细胞与生物材料混合，直 接植入体内或短时间培养后再植入体内，随生物材料被机体逐渐降解吸收，细胞 不断分泌特异性细胞外基质，复合物最终在体内环境中逐渐形成特定组织或修复 第一章绪论 相应的组织缺损。体内组织构建的优点是操作过程简单，体外培养周期短，不需 要特定的培养装置和培养环境，完全依赖于体内环境促进组织再生和成熟。组织 工程是生命科学发展史上的又一新的里程碑，标志着医学将走出器官移植的范 畴，步入制造组织和器官的新时代。 组织工程研究的范围已涉及：软骨、皮肤、胰腺、肝脏、肾脏、膀胱、输尿 管、骨髓、神经、骨骼肌、肌腱、心脏瓣膜、血管、肠、乳房等方面，这些医疗 产品的研制成功将使目前使用的机械或电子人工器官相形见绌，由于其结构和功 能更加接近天然组织器官，就能为组织缺损或器官衰竭的病人提供更好的治疗。 3 0 多年前英国医学家威尔逊提出的“人类将在自己的身上安装各种人造器官 的 预言将逐步成为现实。 1 1 2 组织工程的研究内容 组织工程的研究内容主要集中于三个方面【5 】：( 1 ) 种子细胞；( 2 ) 细胞外基质替 代物支架材料：( 3 ) 生长因子。以下就这三个方面分别进行阐述。 1 1 2 1 种子细胞 种子细胞是组织工程化组织能够再生的首要物质基础。种子细胞可以来源于 自体、同种异体甚至异种组织。异体或异种细胞虽来源广泛，但因免疫排斥反应 等问题，无法用于病损组织的永久性修复，因此，真正用于修复组织缺损的细胞 仍主要来源于自体。一般来讲，用于组织构建的种子细胞必须满足以下几点要求： 来源广，数量充足；增殖力强，可大量扩增；具备特定生物学功能；纯 度高，具备特定功能的细胞占主导；无免疫排斥反应。这些要求是种子细胞能 够再生特定组织或修复特定组织缺损的重要保证。种子细胞分类倾向于按细胞分 化程度进行。根据分化阶段不同，可将种子细胞分为胚胎干细胞、成体多潜能干 细胞、定向干细胞( 祖细胞) 和终末分化组织细胞。定向干细胞和终末分化细胞研 究重点集中于扩增技术、延缓老化及阻止去分化等几个方面。而对胚胎干细胞和 成体多潜能干细胞，在进行扩增技术、延缓老化等研究的同时，更重要的是如何 将这些细胞定向诱导为具有特定生物学功能的组织细胞或其前体细胞。 1 1 2 2 细胞外基质替代物支架材料 细胞外基质替代物支架材料即生物材料是组织工程研究的桥梁和纽带。它是 种子细胞在形成组织之前赖以生存和依附的三维支架，为细胞的增殖、分化、营 养交换、新陈代谢以及细胞外基质分泌等生理活动提供空间场所并引导再生组织 基本形状。 支架材料在体内组织再生过程中发挥几方面的作用【6 】：( 1 ) 在结构上加强缺损 第一章绪论 部位的强度；( 2 ) 阻碍周围组织长入；( 3 ) 作为体外接种的细胞在体内扩增和增殖 的支架；( 4 ) 利用与细胞整合以及受体的相互作用，作为一种细胞功能调节因素； ( 5 ) 作为细胞生长因子和基因的生物载体。 1 1 2 3 生长因子 生长因子是指组织工程中采用的特异性因子，其作用是用来诱导细胞的正常 生长、迁移、分化并分泌胞外基质等功能并最终形成新的组织或器官，如采用骨 形成发生蛋白( a m p ) 诱导骨的形成；表皮生长因子( e g f ) 促进伤1 ：3 愈合；成纤维 细胞生长因子( f g f ) 促进成纤维细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞的有 丝分裂，也可促进神经元细胞的分化和存活，还是一种潜在的血管生成促进因子； 转化生长因子p ( t g f b ) 促进软组织和硬组织的愈合、诱导骨生长等。 1 2 组织工程用支架材料 组织工程中一个重要的组成部分是支架材料。支架材料在新的组织未完全形 成之前，起到细胞外基质的临时作用，随着细胞新陈代谢过程的进行，细胞自身 分泌胞外基质，增殖、迁移和分化，支架逐步降解，随着新的组织逐渐形成，支 架的临时细胞外基质作用的使命也就完成。 组织工程学中理想的支架材料应具有【7 1 ： 良好的生物相容性。无毒、不致畸形，降解产物对细胞无毒、不会引起局 部炎性反应；适当的生物降解性。降解速率应与组织细胞生长速率相适应，降 解时间能根据组织生长特性进行调控；具有三维立体多孔结构，孔隙率最好达 9 0 以上，且有很高的面积体积比。高孔隙率和较大的面积体积比利于细胞粘附 生长、细胞外基质沉积、营养物和氧气进入、代谢产物排出、以及血管和神经长 入；具有可塑性和较好的力学强度。可预先制作成一定形状，并具有一定的力 学强度，为新生组织提供支撑，能保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学 特性；材料表面微环境利于细胞黏附、增殖，能激活细胞特异基因表达，维持 细胞正常表型表达。 可用于制备支架材料的生物材料按照其化学属性可分为有机高分子材料、无 机材料等；按照来源可分为天然材料、合成材料和复合材料等。 1 2 1 天然材料 天然材料往往是生物衍生的聚合物，一般生物相容性良好。天然高分子材料 有甲壳素、壳聚糖、胶原、弹性蛋白、透明质酸盐、纤维素、海藻酸盐、葡聚糖、 琼脂糖和明胶等。天然无机物有羟基磷灰石、珊瑚礁等。但天然材料的质量会因 第一章绪论 产地及来源的不同而有所差异，存在着天然产品在批次之间性能和质量的重现性 波动很大的缺陷。 1 2 2 合成材料 组织工程支架采用的合成材料一部分为无机材料，如生物陶瓷、生物玻璃等， 包括硫酸钙( 石膏) 、碳酸钙( 珊瑚) 、磷酸钙如羟基磷灰石( h a ) 、磷酸三钙( t c p ) 、 磷酸氢钙( d c p d ) 、磷酸四钙( t t c p ) 、非晶态磷酸钙( a c p ) 、磷酸八钙( o c p ) 以及 脱有机质骨或各种磷酸钙的复合物。大部分为生物可降解型合成高分子材料，包 括聚乙醇酸( p g a ) 、聚乳酸( p l a ) 以及它们的共聚物p l g a 、聚己内酯( p c l ) 、聚 羟基烷基酸酯( p h a ) 、聚酸酐、聚磷睛等。合成材料可根据需求来进行分子设计， 且性能的重现性好，可批量生产。但同天然材料相比，其生物相容性较差。 1 2 3 复合材料 各种天然材料、合成高分子材料、陶瓷材料、生物衍生材料既可单独用作支 架材料，也可相互搭配或组合形成大量性质各异的复合材料。复合材料可以很好 地避开单一材料的缺点，实现优势互补，是支架材料研究的热点。组织工程中支 架材料的生物活性取决于支架材料的组分。支架材料科学的组合、合适的成分对 种子细胞的粘附、生长、分化及自身的活性等都极为关键。近来有研究将鼠骨髓 间充质细胞分别种植于胶原海绵支架、p g a 胶原海绵支架和经紫外线处理的 p g a 胶原海绵支架中进行对照观察。结果显示i 单纯的胶原海绵支架明显变形， 而p c 後胶原海绵支架则较好地保持了它们的原貌，经紫外线处理的p g a 胶原海 绵支架碱性磷酸酶活性最高，扫描电镜显示细胞粘附数目最多，而p g a 胶原海 绵支架次之。这说明p g a 胶原海绵支架和经紫外线处理的p g a 胶原海绵支架较 单纯的胶原海绵支架更有利于细胞的粘附和生长【s 】。 1 3 组织工程用水凝胶 1 3 1 水凝胶的结构与特性 水凝胶是一类能够吸收并保有大量水分的具有交联网络结构的聚合物【9 1 ，在 聚合物网络结构中含有亲水基团或亲水的链段，它们在水环境中能够与水结合。 从而形成水凝胶结构，这种水凝胶结构使得亲水的小分子能够在其中进行扩散。 水含量占凝胶干重的1 0 - - 2 0 ，有时甚至达到凝胶干重的几千倍。水凝胶中的水 可使溶于其中的物质以及低分子量物质从其间渗透扩散，具有膜的特性，因此凝 4 第一章绪论 胶中水的特性将决定整个水凝胶对营养物质的传输和细胞代谢产物的排出能力 【l 们。一般认为，水凝胶聚合物具有良好的生物相容性，原因就在于该聚合物大 量吸收水分的特性，大量吸收的水分充斥于聚合物网络中，较大程度地伸展被交 联的大分子链，使整个材料具备了一种流体的性质，这与充盈有大量水性液体的 机体组织极其相似，柔软、润湿的表面以及与组织的亲和大大减少了刺激性。 水凝胶的溶胀过程实际上是两种相反趋势的平衡过程：溶剂水力图渗入到网 络内使体积膨胀，导致三维分子网络伸展；同时，交联点之间分子链的伸展降低 了高分子聚合物的熵值，分子网络有弹性收缩力，力图使分子网络收缩。当这两 种相反的倾向相互抵消时，就达到溶胀平衡。研究表明，渗透压是水凝胶溶胀的 推动力【1 1 1 。当干凝胶开始吸水时，首先进入基体的水分子是水化极性最强的亲水 性基团，称为初级结合水。随后凝胶网络开始溶胀，疏水基团也参与了与水分子 的相互作用，这部分水称为疏水性结合水或二次结合水。初级结合水和二次结合 水通常总称为结合水。接着，在渗透的驱动力下，网络开始吸收多余的水分。这 些附加的溶胀力与共价交联或物理交联竞争，导致弹性网络收缩力的产生，由此 水凝胶会达到一个平衡溶胀度且仍保持其形态。在离子、极性和亲水性基团被结 合水饱和后，网络吸收的多余溶胀水被称为自由水，它填充于网络链间的空间中 以及大孔或空洞的中心。如果网络链是可降解的，这在网络溶胀后，水凝胶将以 一定的速率开始降解或溶解。 水凝胶独特的结构决定了它具有诸多优异的特性，这也是其之所以能够广泛 应用于组织工程的原因：( 1 ) 丰富的水环境能够对细胞和药剂起到保护作用( 如 多肽、蛋白、寡核苷酸、d n a ) ；( 2 ) 为细胞的营养输送以及细胞新陈代谢产物的 排出提供良好的传输通道；( 3 ) 容易用细胞粘附配体修饰；( 4 ) 一些水凝胶可实现 原位注射：( 5 ) 通常具有良好的生物相容性。但是水凝胶通常力学强度较弱，消 毒困难，而且当其作为预成形支架时，在体外不易在包载药物和细胞后交联成为 凝胶。 1 3 2 组织工程水凝胶的设计参数 在选择或合成适当的水凝胶支架材料时，应综合考虑物理性能、传质性能和 生物相互作用，这些性能或设计参数由支架的用途和支架植入部位的环境来决定 【l2 1 。例如，当支架被用于包载细胞时，要求凝胶过程对细胞无伤害，凝胶后对 细胞以及周围组织无毒，能为细胞和组织的营养传输和代谢产物的排除提供良好 的通道，此外还应该具有足够的力学强度用以提供力学支撑【l3 1 。在此，物理性 能主要包括力学性能和凝胶形成的流变学，而扩散属于传质性能的要求，无毒害 性则是生物学性能。为了得到所需性能的水凝胶，其设计和合成应从物理性能、 第一章绪论 传质性能和生物相互作用等多方面综合考虑。以下分别从物理、传质、生物设计 三个方面介绍组织工程用水凝胶支架相关设计参数。 1 3 2 1 物理性能 许多组织工程支架是用来填充组织的缺损部位，并为组织再生提供生长框 架，此时材料的物理性能将决定其实用性。这些特殊的物理性能包括凝胶形成机 理和流变行为，凝胶力学特性和降解性能。高分子主链内在的性质、交联密度、 交联类型、交联分子尺寸以及周围环境因素都对凝胶的物理性能起到决定作用。 凝胶的形成机理和流变行为影响着材料与细胞之间的相互作用，影响着支架 的释放行为。凝胶过程造成的温度上升、p h 值变化，以及产生的各种小分子都 可能导致蛋白变性，对细胞造成伤害甚至死亡。为了避免这种情况的出现，可以 在包载生物活性物质和细胞之前预先进行支架的成型，但是又失去了水凝胶在注 射固化前能够包埋细胞、生物分子的特有性能。目前已经成功制备海藻酸 1 4 , 1 5 、 p e o 1 6 1 、壳聚糖【1 7 】和p ( p f c o e g ) t 1 8 】等水凝胶释放载体，这主要是因为它们凝胶 前后的性能具有一定的可控性，包括凝胶速率和流体性能。 一旦支架在体内成形后，组织生长修复能力就部分依赖于支架材料宏观和微 观的力学性能。在宏观上，支架应该具有一定的承载能力，为组织生长提供稳定 的力学支撑；在微观上，细胞的生长、分化以及最终组织的形成都依赖于细胞上 的承载 1 9 - z 1 。因此，支架必须还具有承受特定载荷和传递载荷的能力，这就需要 对材料的弹性、压缩性、粘弹性、拉伸性和失效应变等进行设计。对于水凝胶而 言，这些性能由高分子和交联剂的特性、凝胶条件( 温度、p h ) 、溶胀性和凝胶 的降解性决定。 考察水凝胶降解动力学时应以组织工程的应用为根据。在控制释放和功能组 织再生领域中，凝胶的降解是一个关键的参数，而在细胞免疫隔离包埋时却又应 避免降解。理想的支架材料，其降解速率应该与新生组织生长相协调，或者与控 制释放所需速率相同。水凝胶的降解途径主要包括水解【2 2 】( 如合成水凝胶 p e g p l a ) 、酶解【2 3 】( 如胶原、透明质酸、壳聚糖、p e o 和溶解冽( 如离子交 联型海藻酸水凝胶) 等。 1 3 2 2 传质性能 理想的水凝胶支架应该具有气体、营养物质、蛋白质、细胞、代谢产物进出 的良好传质性。在支架内部，分子扩散的距离和速率取决于材料与分子的特性与 相互作用。材料的高分子链段、高分子尺寸和交联剂浓度都影响着凝胶纳米结构 的形成【2 5 1 ，因此小分子的分子量、分子尺寸决定了在凝胶空隙中的扩散速率。 最后应按照支架的用途确定扩散性和材料选取。在用于分子释放时，应优先 第一章绪论 考虑从支架内自由向外扩散的有限性；而作为包载细胞的植入物时，主要考虑提 高氧气、营养物质的供应和代谢物的排除。 1 3 2 3 生物学性能 由于组织工程用水凝胶最终要植入体内，因此材料应该具有无毒、无致敏性， 并能促进细胞功能的表达( 如细胞的粘附、增殖、分化) 、组织的成长。胶原与 明胶都是天然细胞外基质和组织的主要组成物，理论上它们与机体的相互作用良 好。p ( p f c o - e g ) 在体外细胞培养时发现对细胞有轻微的毒性，并在体内没有引 起严重的炎症反应1 2 们。壳聚糖通常是被认为无毒，但对嗜中性细胞却有一定的 刺激作用【2 7 1 。海藻酸盐则被认为m 单元含量较高时具有免疫反应【2 8 1 。 许多凝胶虽然对细胞无毒，又不引发慢性炎症反应，但由于缺少细胞粘附配 体造成无法促进细胞粘附，或者由于凝胶强亲水性特征阻止了细胞外基质成分 水溶性蛋白在凝胶表面的吸附，此时则需要对凝胶的表面进行修饰【2 9 域用与细 胞有受体配位作用的多肽序列结合【3 0 】。通常采用的多肽序列是精氨酸甘氨酸 天冬氨酸( i 犯d ) ，因为大多数的细胞都能与r g d 结合。此外还有精氨酸谷氨酸 天冬氨酸缬氨酸( r e d 、，) 、酪氨酸异亮氨酸甘氨酸丝氨酸精氨酸( y i g s r ) 、 异亮氨酸赖氨酸缬氨酸丙氨酸缬氨酸( w ) 等。 采用细胞生长因子是调节细胞功能的另一种途径，可以将生长因子和生长因 子衍生多肽共价修饰于凝胶表面，并且可以将多种因子共同修饰以促进组织的形 成 3 1 】。例如用骨形态发生蛋白- 2 ( b m p - 2 ) 修饰海藻酸盐凝胶，促进了成骨细胞 的迁移和支架的钙化【3 2 1 。 1 3 3 水凝胶的形成机理 迄今为止，水凝胶的形成主要有物理交联和化学交联两种主要途径。物理交 联水凝胶的形成主要靠次级键价力的作用如离子间相互作用、氢键及结晶作用等 等，而化学交联水凝胶通过共价键形成。以下将从这两方面对水凝胶的形成机理 进行阐述。 1 3 3 1 物理交联水凝胶 物理交联型水凝胶是指由于分子缠结和离子、氢键、疏水相互作用的存在而 形成的网络结构。大致可分为离子交联型和温度响应型两种。形成物理交联水凝 胶的条件之一就是体系中物理交联点的形成。物理交联点的形成可以通过多种方 式。如离子间的相互作用、疏水相互作用、结晶及氢键作用等。近几年来，物理交 联形成的水凝胶越来越引起人们的重视，主要是因为避免了小分子毒性交联剂的 使用，后处理比较简单。物理交联的另一个优点是可以原位形成凝胶。 第一章绪论 离子交联型水凝胶可分为两种：聚电解质与带相反电荷的多价离子键合时所 形成的物理交联型水凝胶又称为离子包埋型水凝胶，例如海藻酸钙水凝胶 3 3 - 3 5 】。 带相反电荷的两种聚电解质相互作用形成的物理交联体系则称为聚电解质复合 物。例如海藻酸盐聚赖氨酸复合水凝胶【3 6 】。这种结构能稳定凝胶并减少多孔性。 阴离 高价阳离子 离子包埋型水凝胶 聚电解质复合型水凝胶 图1 1 水凝胶的离子交联机理示意图 f i g 1 ls c h e m a t i co f m e t h o d sf o rf o r m a t i o no f t w ot y p e so f i o n i ch y d r o g e l s 温度响应型水凝胶也分为两种：升温型和降温型。升温型主要是指在低温时 为液体，当温度升到一定值时形成凝胶，存在最低临界溶解温度( l c s t ) ，典型 代表为聚异丙基丙烯酰胺( p n i p a a m ) 。低于l c s t 时，焓变起主导作用，分子 链中的极性基团与水分子形成氢键使聚合物溶解在水中：当温度高于l c s t 时， 熵变( 疏水作用) 起主导作用，疏水的异丙基在c o i l - - g l o b u l e d 尸发生脱水，导致 聚合物分子在水中沉淀，但其分子链中大量的羰基仍然能与水分子形成氢键【37 1 ， 因此，温度高于l c s t 时，水凝胶的形成主要是由于疏水作用导致分子链聚集形 成交联网络。降温型主要是指在高温时为液体，当温度降到一定值时形成凝胶， 典型代表是明胶和琼脂糖。二者都只能溶解在水中。随着温度的下降，在水溶液 中自由卷曲的分子链重新排列形成规则的三重螺旋结构( 明胶) 或双螺旋结构( 琼 脂糖) 而导致成核及晶体生长【3 8 1 。由多个螺旋聚集形成的螺旋导致分子链之间 互相连接而形成交联网络，该聚集体成为凝胶网络的物理交联点。而升温时，其 结构又回到原来的自由卷曲构象。因此，此类水凝胶具有可逆性。 回睫 第一章绪论 功 譬哆 - - 图1 2 温度响应型物理交联水凝胶的溶胶凝胶转变示意图【3 9 】 f i g 1 - 2t h e r m a lg e l a t i o nm e c h a n i s mo f a g a r o s ei nw a t e r r a n d o mc o i l sb e c o m eh e l i c e s ，w h i c h s u b s e q u e n t l ya g g r e g a t et of o r ma d j u n c t i o nz o n e so fg e l ，a l o n gw i t ht h ed e c r e a s eo ft e m p e r a t u r e t 3 9 3 两性嵌段或接枝共聚物在水中能借助疏水缔合作用自组装形成胶束或层状 的有序结构。利用这一原理也可制备物理交联型水凝胶。p i s t e l 4 0 等的研究发现， p e g 与p l g a 的两嵌段或三嵌段共聚物及其星形聚合物缔合交联形成水凝胶。利 用嵌段共聚物通过物理交联形成水凝胶的例子有p e g p n i p a a m 【4 l 】共聚物等。 他们合成了异丙基丙烯酰胺低聚物与p e g 的星型嵌段共聚物，该聚合物是异丙基 丙烯酰胺低聚物通过链段间疏水相互作用形成的坚固缔合网络。此类水凝胶强度 高且脱水收缩率低，凝胶过程迅速，有望用于药物释放体系、细胞包囊及解剖栓 塞材料。 1 3 3 2 化学交联水凝胶 化学交联型水凝胶是运用传统合成的方法或光聚合、辐射聚合等技术，引发 共聚或缩聚反应产生共价键而形成的共价交联网络。化学交联水凝胶结构比较稳 定，强度较高，反应可控制性较好，易于手术中的操作，但由于需其它物质参与， 并伴有化学反应，因此对细胞的影响较大。通过对引发体系各项参数的优化及其 它操作条件的严格控制能够降低或消除体系对细胞的影响以满足组织工程的需 要。 ( 1 ) 自由基交联 自由基聚合反应交联是用于水凝胶设计与合成比较常用的方法。目前自由基 聚合主要采用两种途径：是通过一种或多种低分子量的烯类单体在交联剂的存 在下直接进行聚合反应；二是先使原本不具有聚合反应活性的一些水溶性聚合物 转变为含有可聚合反应基团的衍生物，再进行交联共聚反应。自由基的产生主要 通过添加热引发剂或光引发剂，引发大分子单体上的官能团进行聚合和交联。 热引发聚合中，官能团一般是c = c 双键，主要采用氧化还原引发体系。氧 化还原引发剂水溶性较好，活性较高，但会引起整个水凝胶体系的p h 值的变化， 9 第一章绪论 且副产物可能会影响细胞的存活和生长，所以引发体系的选择至关重要。组织工 程中常用的有过硫酸铵四甲基乙二胺和过硫酸铵抗坏血酸等，主要用于p p f 及 其共聚物的交联。 光引发聚合中，含光敏性官能团( 如叠氮) 的前驱物可在u v 照射下直接聚 合；含双键官能团的前驱物可通过加入光引发剂后在u v 照射下聚合。光引发聚 合速率较快，副产物较少。但必须严格控制u v 光的照射强度及照射时间、引发 剂浓度及反应时的温度变化。 占+耋 单体l 交联剂 、以 气i 八尸、i 八厂 八气、 商分子 、 ， 占+ - - - - - - 八浆或珑分子交联 l 贫穿水凝胶辩绻 水磁投h 掰 图1 - 3 自由基聚合交联形成水凝胶的示意图【4 2 】 f i g 1 - 3s c h c m et os h o wt h ef o r m a t i o no fc r o s s l i n k c dh y d r o g c l sb yf r c cr a d i c a lr e a c t i o n s 4 2 ( 2 ) 结构互补基团反应交联 一些生物相容性聚合物结构中通常含有o h 、- c o o h 、- n h 2 等基团，这些基团 不仅使聚合物有很好的水溶性，而且可以通过结构互补官能团之间发生加成及缩 合等化学反应，彼此之间可形成共价交联键从而形成水凝胶。如异氰酸酯1 4 3 】与胺 或醇反应生成脲或聚氨酯、氨基与活性酯如n 羟基琥珀酰亚胺反应形成胺化合 物4 4 1 、氨基或硫醇与乙烯基通过加成反应生成胺【4 5 】或者硫化物 4 6 1 、酸和醇生成 酯、醛基和氨基形成s c h i 妇碱f 4 。 l o 圉囤 第一章绪论 双宵能坼 体或聚台物 多官强团聚合物 多官缘闭交联嗣 圈 未凝股嘲络 图l 一4 多官能团反应物通过缩合反应形成水凝胶示意图 f i g 1 - 4s c h e m et os h o wt h ef o r m a t i o no f c r o s s l i n k e dh y d r o g e l sb yp o l y f u n c t i o n a lr e a c t i o n s 除了水溶性聚合物通过交联可以形成化学交联型水凝胶外，疏水性聚合物转 变为亲水性并交联产生的网络体系也属于化学交联型水凝胶。例如聚醋酸乙烯酯 水解转化为聚乙烯醇，或聚丙烯腈( p a n ) 分子水化形成含有不同比例的丙烯腈、 氨基和羧基的聚合物分子结构。改性后的聚合物分子如果通过琉水相互作用转变 成凝胶三维网络则属于物理交联水凝胶；而极性基团发生反应形成了交联结构， 则属于化学交联水凝胶。 疏水聚合物 水化、氧化、硫酸化等 疏水相互作用 极性基团 物理交联水凝胶 化学交联水凝胶 图l 一5 疏水聚合物化学改性后形成水凝胶的机理图 f i g 1 - 5s c h e m et os h o wt h ef o r m a t i o no f h y d r o g e l sb ym o d i f i e dh y d r o p h o b i cp o l y m e r s ( 3 ) 生物特异性结合 生物特异性结合是通过生物学中某些蛋白质之间存在特异性识别的方法使 聚合物形成凝胶。常见配对的蛋白质有生物素( b i o t i n ) 与抗生物素( a v i d i n ) 、配体 ( l i g a n d ) - 与受体( r e c e p t o r ) 等。由图1 - 6 中可见，在聚合物链上接枝配体，然后利 拶辩 第一章绪论 用它能与细胞膜上的受体进行特异性结合，细胞成为聚合物交联网络的交联点从 而形成凝胶。该方法非常有利于细胞在凝胶内的粘附，且整个体系非常安全。 - 。一 ! j n 0 ，戤7 7- o l g a n d 二r e c e p l o r 0c e l i p o l y m e r 图1 - 6 通过特异性受体配体作用形成高分子链细胞网络结构的示意图【4 8 】 f i g 1 - 6s c h e m a t i cd e s c r i p t i o no f c e l lc r o s s l i n k e dn e t w o r kf o r m a t i o nb ys p e c i f i cr e p t o r - l i g a n d b i n d i n gi n t e r a c t i o nb e t w e e np o l y m e rc h a i n sa n dc e l l s t 4 8 】 1 3 4 原位可注射水凝胶 原位可注射水凝胶是近年来出现的新型水凝胶体系。通过注射的方法将具有 一定流动性的生物材料植入体内，因此很容易充满整个具有不规则形状的缺损部 位，手术创伤非常微小。该体系可由酸碱度、温度的变化或者多价离子的存在而 产生溶液凝胶相转变，或通过共价键而形成水凝胶。同预成型的聚合物支架材 料相比，原位可注射水凝胶具有可以与细胞混合均匀、与修复组织之间嵌合连接 好、塑型容易的特点，且治疗简单、有效，符合现代微创手术的要求。注入材料 可在损伤部位形成所要求形状的凝胶，这样可以对复杂或多维的损伤部位进行更 好的填充，并可在凝胶过程中添加各种治疗试剂，增强治疗效果的同时减少频繁 的外科手术给患者带来的痛苦。在凝胶形成过程中，可交联的高分子混合物可与 组织很好的粘合，大大增强凝胶与组织的界面结合力【4 9 】。 原位可注射水凝胶的诸多优点引来越来越多研究人员的关注，但是许多问题 还有待注意和解决：首先，原位注射形成水凝胶的凝胶过程发生在特定的生理温 度下，这就要求高分子反应物在体温条件下生成凝胶，同时在反应过程中没有毒 副产物的生成。其次，所有的反应物及反应试剂都需要是无毒的，并且能够耐潮 湿、富氧的环境。另外，凝胶过程需足够快以便临床应用，但应保证凝胶发生之 前反应物能够充分混合，也就是说要控制一定的反应速率以满足原位凝胶过程的 可控性。 第一章绪论 1 4 海藻酸盐水凝胶 1 4 1 海藻酸钠概述 海藻酸钠是f d a 批准用