（材料学专业论文）材料表面微图形化的制备及其生物相容性研究.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 生物材料的生物相容性包括血液相容性和组织相容性，其中血液相容 性是心血管材料的重要衡量指标。它与材料表面粗糙度、表面成分、表面 亲疏水性等有密切关系，因此表面改性被认为是改善材料表面抗凝血性能 的重要途径。表面微图形化技术通过控制血小板在材料表面的粘附和内皮 细胞的粘附及生长行为，进而改善材料的血液相容性，己成为生物材料表 面改性的一个新的研究热点。 本文首先采用光刻技术、湿法刻蚀技术在硅基材料表面制备出了沟槽 宽度为l o - - - 4 0 9 m 微图形，它们分别是硅硅图形、二氧化硅硅图形，再在 硅基图形表面采用非平衡磁控溅射技术和等离子体技术制备出了氧化钛 氧化钛图形、氧化钛- - 氧化硅图形和自蛋白氧化钛图形，由此获得不同 尺寸、不同亲疏水性的微图形化表面。采用扫描电镜、光学显微镜和台阶 仪来检测微图形表面形貌，表明制备出的微结构具有较高的尺寸精度和表 面质量。采用x 射线衍射仪分析氧化钛薄膜的晶体结构，发现微图形化表 面对氧化钛薄膜的晶体结构有一定的影响，表面基体性质和表面形貌影响 锐钛矿和金红石型氧化钛薄膜的形成。采用x 射线能谱仪来分析微图形表 面元素的分布，结果表明制备出了二氧化硅硅和氧化钛- - 氧化硅结构， 以及薄膜覆盖完整的氧化钛氧化钛图形结构。采用接触角测试仪分析材料 表面亲疏水性，并研究了微图形化表面对其的影响。结果表明，采用微图 形化获得了一定粗糙度的表面，使得硅微图形和氧化钛微图形表面的亲疏 水性发生了一定的改变。 采用血小板粘附实验来评价微图形化表面的血液相容性，用光学显微 镜和扫描电镜观察血小板粘附数量与形态变化，微图形表面形貌和微图形 表面化学成分使血小板有选择性的粘附，血小板较多的粘附在微图形脊或 较为疏水性的氧化钛薄膜表面。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 i 页 通过种植在微沟槽图形表面的内皮细胞的生长行为来研究微图形化对 内皮细胞生长行为的影响，采用深度均为3 岬的硅硅( 沟槽宽度为1 5 ， 3 0 ，4 0 i _ t m ) 和氧化钛氧化钛( 沟槽宽度为1 5 ，2 0 ，3 0 ，4 0 i t m ) 微图形来 进行微图形化表面对内皮细胞生长、引导行为的影响的定量分析。采用倾 向角( o ao r i e n t a t i o na n g l e ) 来评价微图形对细胞倾向性的影响，采用细 胞形态变化指数( f if o r mi n d e x ) 来评价微图形对内皮细胞形态变化的影 响。结果表明，微图形化表面对内皮细胞生长起到一定的接触引导作用。 关键词：微沟槽图形；光刻技术：非平衡磁控溅射；血液相容性； 内 皮细胞 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 ii 页 a b s t r a c t b i o m a t e r i a l sb i o c o m p a t i b i l i t yc o n t a i n sb l o o dc o m p a t i b i l i t ya n dt i s s u e c o m p a t i b i l i t y f o rc a r d i o v a s c u l a ri m p l a n t e dm a t e r i a l s ，b l o o dc o m p a t i b i l i t yi s a ni m p o r t a n tm e a s u r i n gi n d e x ，w h i c hh a sc l o s er e l a t i o nt om a t e r i a ls u r f a c e p r o p e r t i e s ，s u c ha ss u r f a c et o p o g r a p h y , s u r f a c es t r u c t u r ea n dc o m p o s i t i o n ，a n d s u r f a c ew e t t a b i l i t y a c c o r d i n g l y , s u r f a c em o d i f i c a t i o ni sr e g a r d e da sae f f e c t i v e m e a n st oi m p r o v et h ea n t i c o a g u l a t i o no fb i o m a t e r i a l s s u r f a c em i c r o 。p a t t e r n f a b r i c a t i o nt e c h n o l o g y ，a sas i g n i f i c a n tm e t h o dt oc o n t r o lt h ea d h e s i o no f p l a t e l e ta n dt h ep r o l i e r a t i o no fe n d o t h e l i a lc e l l so nm a t e r i a l s ，h a sb e c o m ea n i m p o r t a n ta p p r o a c hf o rt h es u r f a c em o d i f i c a t i o no f b i o m a t e r i a l s i nt h i sp a p e r , as e r i e sm i c r o - g r o o v ep a t t e r n ss u r f a c ew e r ef a b r i c a t e db y p h o t o l i t h o g r a h y ，w e te t c h i n gt e c h n i q u e ，u n b a n l a n c e dm a g n e t r o ns p u t t e r i n g t e c h n i q u ea n dp l a s m at e c h n i q u e b yc h a n g i n g t h e e c h n i q u e ，t h e d i f f e r e n t m i c r o g r o o v es u r f a c ew e r ef a b r i c a t e d ，s u n c ha s s i s im i c r o p a t t e r n ，s i 0 2 s i m i c r o p a t t e r n ，t i 0 2 t i 0 2m i c r o p a t t e r n ，t i 0 2 s i 0 2m i c r o p a t t e r na n da b s t i 0 2 m i c r o p a t t e r n t h eo p t i c a lm i c r o s c o p e ，s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) i m a g e sa n ds u r f a c ep r o f i l e r m e t e rr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef a b r i c a t e ds a m p l e s h a dh i g h f i d e l i t y t h e s t r u c t u r eo ft i 0 2t h i nf i l mw a sa n a l y z e db yx r a y d i f f r a c t i o n ( x r d ) ，i ts h o w e dt h a tt h es u b s t r a t ep r o p e r t ya n ds u r f a c et o p o g r a p h y a f f e c t e dt h ec r y s t a ls t r u c t u r e t h ec o n t a c ta n g l e so fr e l e v a n tm i c r o p a t t e r n sw e f g t e s t e d ，i na d d i t i o n ，t h e s u r f a c e w e t t a b i l i t y w a sa f f e c t e d b y s u r f a c e t o p o g r a p h y t h es u r f a c eh y d r o p h i l ei n c r e a s e db yi n c r e a s i n gt h e s i s i p a t t e r n s u r f a c e r o u g h n e s s ，w h e r e a s t h eh y d r o p h o b i c t yi n c r e a s e db yi n c r e a s i n gt h e t i 0 2 t i 0 2p a t t e r ns u r f a c er o u g h n e s s 西南交通大学硕士研究生学位论文第lv 页 t h eb l o o dc o m p a t i b i li t yo fm i c r o p a t t e m e ds u r f a c ew a se v a l u a t e db yi n v i t r op l a t e l e ta d h e s i o nt e s t i n g ，a n dt h eo p t i c a lm i c r o s c o p ea n ds e mw e r eu s e d t oo b s e r v et h eq u a n t i t ya n da c t i o no ft h ea d h e r e n tp l a t e l e t t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ep l a t e l e t sw e r es e l e c t i v l ya d h e r i n gb yb o t ht h em i c r o p a t t e r n e ds u r f a c e a n dt h ep r o p e r t yo ft h ep a t t e r ns u r f a c e p l a t e l e tm o s t l ya d h e r e do nt h em o r e h y d r o p h o b i cs u r f a c e ，s u c ha st i 0 2s u r f a c e t h ee n d o t h e l i a le e l l sw e r ec u l t u r e da n ds e e d e do nt h em i c r o r o o v e d s u r f a c e s i s i ( w i t ht h ew i d t h so f15 ，3 0 ，4 0 1 x m ) a n dt i 0 2 t i 0 2 ( w i t ht h ew i d t h s o fl5 ，2 0 ，3 0 ，4 0 1 a m ) m i c r o g r o o v e sw e r eu s e dt oo b s e r v et h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s o ft h e e n d o t h l i a lc e l lb e h a v i o ro n m i c r o g r o o v e d s u r f a c e i nt h i s a n a l y s i s ，o r i t a t i o na n g l e ( o a ) w a su s e d t oe v a l u a t et h ec o n t a c tg u i d a n c e i n t r o d u c e db ym i c r o g r o o o v ea n df o r mi n d e x ( f i ) w a su s e dt od e s c r i b et h ec e l l s h a p ec h a n g e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em i c r o p a t t e r n e ds u r f a c ec a ni n t r o d u c e t h ee n d o t h e l i a lc e l l sg r o w t h i n g k e yw o r d s ：m i c r o g r o o v ep a t t e r n ；p h o t o l i t h i t h y ；u n b a n l a n c e dm a g n e t r o n s p u t t e r i n g ；b l o o dc o m p a t i b i l i t y ；e n d o t h e l i a lc e l l 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 9 页 声明尸明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师的精心指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。文中除特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南交通大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 本学位论文成果是本人在西南交通大学读书期间在导师指导下取得的，论 文成果归西南交通大学所有，特此声明。 论文作者签名： 导师签名： 枷眸乡月刁e l 歹壬慈兰 7 勿孳 7 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 第1 章绪论 引言 生物医用材料( b i o m e d i c a lm a t e r i a l s ) 又称生物材料，是一类以医疗为目的， 用于人工器官修复、理疗康复、诊断、检查、治疗疾病等医疗保健领域，对人 体组织、血液不产生不良影响的功能材料【l 2 j 。生物材料的发展经历了三个阶段： 2 0 世纪六七十年代兴起的第一代生物材料惰性生物材料，它所遵循的原则 是尽量将受体对植入器械的异物反应降到最低；2 0 世纪8 0 年代中期，生物材 料由生物惰性转向生物活性，即使材料具有活性和可控的生物降解性，能够在 生理条件下发生可控的反应；2 0 世纪9 0 年代后期研究的在分子水平上刺激细 胞产生特殊应答反应的第三代生物材料，这类生物医用材料将生物活性与可降 解材料这两个独立的概念结合起来，在可降解材料上进行分子修饰，引起细胞 整合素的相互作用，诱导细胞增殖、分化，以及细胞外基质的合成与组装，从 而启动基体的再生系统 ”】。 生物材料植入体内后，需要满足特定的生物功能性，如人工心脏需具有高度 的机械性能和耐疲劳性能等；另一方面，生物材料不可避免地与体液、组织和 细胞相接触，必须满足与生物长期或短期接触所需具备的与生物体环境的相容 性，使材料与器官、组织、细胞、细胞器及生物大分子相互容纳。生物相容性 包括两个方面：1 ) 材料反应，主要包括材料在生物环境中被腐蚀、吸收、降解、 磨损、失效等；2 ) 宿主反应，包括局部和全身反应，如炎症、细胞毒性、凝血、 过敏、致癌、畸变和免疫反应等。 生物材料的生物相容性主要包括血液相容性和组织相容性。血液相容性是指 生物材料与血液接触时在材料表面不发生凝血及溶血现象，不引起血浆蛋白的 变性，不破环血液的有效成分。组织相容性是指生物材料与组织接触时不会对 组织和细胞产生毒害作用，不影响细胞正常生理功能，不引起周围组织的免疫 反应。【5 】 1 1 材料表面性能对生物相容性的影响 材料表面性能对生物相容性影响的因素主要有：表面形貌以及表面粗糙 度、表面成分和结构、表面亲疏水性、表面荷电性能和表面自由能、表面蛋 白质的粘附能力、异质不均匀性等。 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 1 1 1 材料表面形貌及表面粗糙度 表面形貌是影响生物材料表面血液相容性的重要因素之一。材料表面应避 免血液产生停滞或涡流，粗糙度越高的材料暴露在血液上的面积越大，凝血的 可能性也就越大；但相反，表面光洁的玻璃凝血现象也很严重。但在一定范围 内的粗糙结构或微相分离结构能够使材料表面优先吸附白蛋白、抑制血小板血 栓、降低凝血因子接触活性。可有效促进内皮细胞在生物材料表面的粘附与生 长，改善材料表面的血液相容性。【o 7 j 生物材料表面微观形态对表面性能有很大影响。生物材料表面拓扑结构， 如：表面粗糙度、表面微图形孔洞大小及分布、沟槽的尺寸和取向等影响细胞 的粘附、铺展、增殖、分化和功能表达等。生物材料表面的微结构域可以调控 细胞与基质的信号传导，从而影响细胞粘附结构域的形成和细胞骨架的发育， 最终形成具有高度取向性的细胞图案。早在1 9 6 4 年，c u r t i s a s u - - 8 等就报道了 细胞对它们所处环境的表面形貌有所反应，从此以后，就陆续有研究者报道了 不同类型的细胞对材料表面形貌有着强烈的反应，随着微米与纳米技术在生物 工程领域中的应用，人们进一步研究了微米与纳米材料表面形貌与细胞生长两 者之间的关系。研究表明：材料表面的形貌有一定特殊的细胞效应，并能改变 细胞的功能，细胞在不同粗糙度的表面的粘附行为有很大影响：粗糙的、表面 呈多孔形态和几何条纹状的结构有利于细胞形态改变并影响细胞的迁移运动 9 , 1 0 1 。细胞沿着沟槽或脊状微形貌的取向生长称为“接触引导”，细胞在三维空间 的取向生长和运动可以允许生物组织的再生。 1 1 2 表面化学结构和成分 材料表面的化学结构、化学成分对材料的生物相容性有很大的影响。对 于无机薄膜材料而言，j u n y i n gc h e n g i 】等在不同晶体结构的氧化钛薄膜表面进 行人脐静脉血管内皮细胞的培养实验，结果表明，晶态氧化钛薄膜表面内皮细 胞生长情况良好，基本维持原形态，并呈“铺路石”状均匀覆盖在薄膜表面；而 在非晶态氧化钛薄膜表面，内皮细胞发生变形，并未完全覆盖薄膜表面。同时， 在氧化钛薄膜中掺杂不同量的h 或t a 元素可以改变薄膜表面的成分，也将会 极大影响表面内皮细胞的粘附与生长。 西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页 1 1 3 表面亲疏水性 一般地，具有较强亲水性和强疏水性表面的材料都具有良好的血液相容 性，材料表面的亲疏水平衡是调节蛋白质吸附、影响细胞黏附的一个重要因 素【1 2 】。一般而言，亲水性的材料表面选择性地吸附白蛋白和更利于细胞黏附，而 疏水性表面易吸附纤维蛋白原和丫一球蛋白，而这两种蛋白的吸附极易引起血 小板的粘附与聚集。同时，生物材料的亲水、疏水平衡也是影响细胞粘连的重 要因素，只有适宜的亲水疏水平衡才适宜细胞的生长。但对于不同种类细胞， 此平衡值各异。 细胞膜具有一定的亲水性，亲水性的表面有利于培养液的渗透和细胞的粘 附生长。研究表明，材料表面并非亲水性越强，内皮细胞的粘附和生长就越好， 由于细胞与材料表面的粘附是以蛋白质为介导的，过于亲水的表面是不利于蛋 白吸附的，所以材料表面具有适宜的亲疏水平衡才有利于内皮细胞的粘附和生 长 1 3 】。这是因为：细胞与材料表面的粘附位被称为焦点接触( f o c a lc o n t a c s ) ， 焦点接触的连接距离只有1 0 1 5 r i m ，而细胞必须具有低的运动性才能形成有效 的焦点接触。另外也可以通过细胞外基质蛋白如纤连蛋白( f i b r o n e c t i n ，f n ) 、粘 连蛋白( v i t r o n e c t i nv n ) 来促进焦点接触的形成，由于细胞与材料表面的粘附 是以蛋白质为介导的，因此，需要具有一定的疏水性才能吸附蛋白。所以，具 有一定亲疏水平衡的表面才有利于内皮细胞的粘附和生长。 1 1 4 表面化学基团或抗凝生物分子 在生物材料表面涂敷一层具有良好血液相容性的抗凝生物分子或蛋白是 目前生物材料表面改性的一个重要研究方向。常用的各种抗凝剂如肝素、白蛋 白、血栓改性蛋白、水蛭素等，可以有效抑制血液中的凝血因子活化及血小板 的聚集与活化。 白蛋白是一种抗凝血蛋白，它可以减少血小板和白血球的吸附，并抑制血 栓形成。若材料表面选择性吸附白蛋白，会减少纤维蛋白原和血小板的吸附， 增加材料的抗凝血性能。在材料表面固定白蛋白可以提高其血液相容性。 t i m o t h y 【m 】等在玻璃毛细管内表面共价固定白蛋白后，表面吸附的血小板的数量 减少了6 4 。a n a n c i 巧】等用硅烷和戊二醛作为偶联剂，在纯钛表面固定了白蛋 白。b r y n d a t 】等利用牛血清蛋白与肝素在聚乙烯、聚醚氨酯、醋酸纤维素、锗、 亲水或疏水硅片及云母表面组装超薄膜，改善了材料表面血液相容性。 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 1 2 材料表面微图形技术及在生物材料中的应用 生物材料植入体内后，必须包括与至少一种界面即材料与生物系统相 接触的表面的反应，因此，生物材料的表面性质在一定程度上决定了植入器械 的成功与否，这就使得生物材料表面改性技术成为生物材料研究的永久性课题。 采用各种表面工程技术( 等离子体技术【i7 塌j 、离子束【1 引、物理或化学气相沉积 技术【2 0 】、溶胶凝胶技术【2 、光化学技术【2 2 】等) ，对传统材料表面进行改性，已 成为改善无机材料血液相容性的重要途径。表面覆膜技术改性作为改善无机材 料表面血液相容性的重要手段。自八十年代一来，研究的热点主要集中在氧化 物薄膜( 氧化钛t i o 膜 2 3 - 2 6 1 、氧化铝a 1 2 0 3 2 7 】等) 和氮化物膜( 氮化铡2 8 1 、氮 化硅【2 9 】等) 等方面。在生物材料表面制备出合适的表面或结构，使其能够优先 吸附理想的蛋白质，形成一个与血液相容的钝化层，成为表面处理技术来改善 材料血液相容性的重要途径。 1 2 1 材料表面微图形化技术 随着微纳米技术的进步和人们对细胞和微环境间相互作用的认识加深，一 系列微制造技术被引入到生物材料中。由于正常的人体组织是有序化的结构， 细胞在体内呈现规则性、有序化的排列，因此，通过微图形技术，在生物材料 表面模仿并构筑类似于细胞生长的有序化微环境，成为生物材料表面改性研究 的新的热点。 材料表面微图形技术主要包括：光刻技术、软刻蚀技术、电化学技术和自 组装技术等。 光刻技术是半导体制造中的关键技术之一，是一种图像复制和刻蚀相结合 的技术，它包括光学( 紫外、远紫外、极紫外) 、电子束、离子束、x 射线和扫 描隧道显微镜( s t m ) 、纳米光刻等方法。其中光学光刻生长效率高、技术工 艺成熟而成为当前和今后一定时期加工的主流。由于光刻技术制造的图形精确 度高、重复性能好、制作的图形尺寸精度达到从几百微米到几十纳米，在生物 材料表面微图形化中得到了广泛的应用 3 0 , 3 1 。 软刻蚀技术是区别于传统的光刻技术的一种微图形制备技术。它是通过带 图案的弹性模板来实现图案的转移，其最重要的是p d m s 弹性印章的制备。作 为非光刻微米和纳米量级的微加工方法，其加工的分辨率可容易达到5 衄 1 0 0 9 m 。软刻蚀技术克服了传统光刻技术的缺陷，可以在平面和曲面上制备微 西南交通大学硕士研究生学位论文第5 页 图形。软刻蚀技术常见的主要有：微接触印刷( m i c r o c o n t a c tp r i n t i n g ，r t c p ) 3 2 3 、 近场光刻蚀( n e a r - f i e l dp h o t o l i t h o g r a p h y ) 【3 3 】、纳米压印( n a n o i m p r i n t l i t h o g r a p h y , n i l ) 3 4 , 3 5 等技术方法，其中纳米压印技术由于突破了关键技术， 成为今年来备受瞩目的软刻蚀技术。 光刻技术、软刻蚀技术可制作尺度较小的精细图形，但要在体积庞大的材 料表面制作图形却面临巨大的挑战，而电化学微加工技术正好弥补这一缺点。 电化学微加工( e m m ) 就是利用阳极电化学溶解原理有选择性地完成材料去除 的微加工技术，材料去除是以离子溶解的形式进行的，电化学微加工技术由于高 的加工速度而具有广泛的应用前景酬。 自组装是活性分子通过非共价作用( 如：氢键、范德华力、静电力等) 自 发吸附在异相界面上形成的有取向、紧密排列的有序单分子膜；一些生物大分子 基于其特定的三级结构，通过分子片断间的相互作用，自发地组装、堆积形成 多层次的空间结构，并最终实现其生物功能，由此从自组装的单分子薄膜发展 到功能化的多层膜【3 7 】。目前研究最多的自组装单层膜分为：由脂肪酸、有机硅 及其衍生物和烷基硫醇在金表面自组装单层膜，烷烃长链分子的头部基团与基 底材料相结合，形成致密单层，尾部基团从表面伸向外部，通过这些尾部基团 可以改善材料表面的化学性质。自组装技术一般可和光刻技术、软刻蚀技术相 结合得到微图形。 光刻技术、软刻蚀技术、电化学技术和自组装技术成为当今制备微图形技 术的关键手段，同时结合离子体辅助化学技术【3 8 1 、利用电场力排列细胞技术1 3 9 1 、 激光刻蚀技术【矧、非平衡磁控溅射沉积f 4 l 】等可获得良好改性的生物化表面。 1 2 2 微图形技术在生物材料中的应用 1 细胞与微图形间的相互作用 生物材料表面微图形化研究的出发点是：利用图形化的表面，将所研究的 细胞限定在特定的空间位置上，并进一步研究微图形对细胞的贴附、铺展的影 响，构建具有图形化功能结构的表面，促进生物材料表面功能化和生物化。在 实际的研究中，往往针对不同细胞对其所依附的基底作出表面拓扑形貌的微加 工或化学修饰，从而在生物材料上应用特定的表面形貌以达到控制细胞特定行 为的目的。研究特定表面对细胞行为的影响主要集中在组织工程中和器官修复 中细胞的取向运动能，如骨替代材料移植时，粗糙表面能提高细胞附着；牙科 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 修复时希望能引导牙龈上皮细胞定向附着和生长，促进牙周组织再生；利用神 经组织工程修复时控制神经轴突的生长和延长等。 在研究微图形对细胞的影响时，常利用微图形技术获得的不同的微图形形 状( 如表1 1 ) 。在研究中，除了选择合适的微图形技术外，微图形的形状及其 分布、细胞的类型、基底材料的选择等也是常需考虑的问题。a k s a l e m 4 6 c h r i s t o p h e rs 【47 】等利用等离子体刻蚀和电化学技术相结合，在s i n 基底 上制得5 - - 一9 0 p m 的孔洞结构的微图形，并研究内皮细胞和纤维原细胞的行为发 现：内皮细胞在8 0 - - - 9 0 微米的区域黏附性很差，在3 0 微米以下，细胞的生长、 增殖情况良好；纤维原细胞在5 0 微米以下具有良好的生物学性能。x i o n g i u 4 8 , 4 9 1 等在钛和羟基磷灰石微图形表面研究不同宽度和深度的图形对骨细胞的影响， 发现图形深度为1 0 微米宽度为8 微米时对骨细胞的影响较大。由于一般细胞的 尺度范围是1 0 到3 0 微米，当图形的尺度等于或约小于细胞所能铺展的最大尺 度时，细胞的形状和铺展行为受图形的影响大。材料表面形貌与细胞相互作用 的研究表明，通过选择合适的材料基底并结合微图形技术，构建有利于细胞生 长的微环境具有一定的可行性。生物材料表面的微图形化，有望促进并调控特异 细胞的生长和空间分布。 表1 - 1 微图形化技术及研究的细胞 微制造技术光刻技术 5 0 , 5 1 】、软刻蚀技术、 电化学微加工【5 3 1 、白组装技术州 图形类型沟槽脊( 报道最多) 5 5 - 5 7 、 网格 5 8 】、圆柱【5 9 】、圆孔f 6 0 1 等 细胞类型内皮细胞、骨细胞f 6 2 】、神经细胞、 纤维原细胞删、巨噬细胞6 5 , 6 6 等 2 微图形技术生物材料在抗凝血及内皮化中的应用 微图形技术在生物芯片【4 2 】、基因检测 4 3 删、硬组织植入器械【4 5 】、与血液接 触的生物材料改性等方面得到了广泛的应用。作为直接与血液相接触的生物材 料，抗凝血性能是心血管植入材料首先需要考虑的问题，表面抗凝分子与蛋白 的固定可以改善生物材料表面的抗凝血性能。综合利用微图形技术，可在图形 化表面选择性地接枝生物大分子，形成图形化的有序功能表面，可以改善材料 的抗凝血性能。 血管内皮细胞位于血液和血管组织之间，呈单层细胞覆盖，是介于血管壁 西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页 和血液之间的屏障结构，它不仅能完成血液和组织液的代谢交换，而且能合成 和分泌多种生活活性物质，以保证血管正常的收缩和舒张，起到维持血管张力， 调节血压以及抗凝血和抗凝平衡等特殊功能。在材料表面种植、培养血管内皮 细胞是提高材料抗凝血性的最理想途径。 在生物材料表面形成微图形，并引导内皮细胞有序铺排形成内皮化成为研 究的热点。a g n e s em a g n a n i 6 7 等利用光刻技术在玻璃基底上制造出宽度为1 0 ， 2 5 ，5 0 ，l o o p a n 沟槽结构的微图形，并在其表面进行内皮细胞的培养，发现在 l o t m 的条纹区域细胞有选择性的沿着一定的方向结成列队吸附并增殖，细胞 形成伪足斑纹牢固地吸附在有微图形的区域，而在1 0 0 “m 条纹区细胞的吸附的 很少。内皮细胞在微图形化材料表面生长行为的研究表明，微图形化技术的应 用有力地促进了与血液相容的生物材料的发展。 1 3 本课题的研究意义与研究目的 1 3 1 研究意义 通过国内外的研究发现：细胞( 如内皮细胞) 在识别材料表面特征时可以响 应微米和纳米尺度的表面拓扑结构，并产生接触引导；且完整的内皮细胞化是 最好的抗凝血表面，内皮细胞化是解决血液接触生物材料生物相容性的最佳途 径；生物材料t i o 薄膜被证实具有良好的血液相容性和潜在的内皮化能力；微 图形技术( 如光刻技术) 可以在材料表面获得类似于细胞生长环境的规则、有 序的微纳米级别的图形结构。因此可以结合微图形制备技术和t i o 薄膜制备技 术，在材料表面形成微图形结构，以此来调控血小板和内皮细胞在生物材料氧 化钛薄膜表面的行为具有一定的研究意义。 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 1 3 2 研究目的 本课题主要在硅片表面制备出s i s i 、s i 0 2 s i 、t i 0 2 s i 0 2 、t i 0 2 t i 0 2 、 t i 0 2 a b s 等不同微图形化的表面，研究表面物理化学性质、微米图形对血小板 粘附、内皮细胞生长行为的影响。 研究内容与研究方案 1 4 1 研究内容 1 ) 利用光刻技术和湿法刻蚀技术得到尺度为10 l g n - 4 0 岫沟槽结构的微 米级硅基图形 2 ) 利用非平衡磁控溅射获得特定成分的t i o 薄膜，结合光刻技术、非平衡 磁控溅射技术和等离子体技术获得一系列氧化钛微图形化表面 3 ) 对微图形化表面进行物理化学性质表征 3 ) 血小板粘附实验 4 ) 内皮细胞培养实验和微图形对内皮细胞影响的定量分析 5 ) 评价微图形形貌、表面成分、表面亲疏水性对生物相容性的影响 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 1 4 2 研究方案 s i 基底热氧化 获得二氧化硅氧化层 上 微图形化 紫外光刻 - 湿法刻蚀 的制备 获得光刻胶s i 0 2 图形获得s i 基微图形 上 上 非平衡磁控溅射沉积氧化钛薄膜 上上 1 洗去光刻胶 获得 获得t i 0 2 s i 0 2 微图形 t i 0 2 用0 2 2 等离子体自组装白蛋白 微图形 获得白蛋白t i 0 2 微图形 微图形化 表面形貌分析：s e m 台阶仪 表回理化 性质 表面成分分析：x r d e d x 的检测 表面润湿性分析：接触角测量 1 l r 生物相容性 血小板粘附实验 评价 内皮细胞粘附实验及分析 1lr 实验结果分析 西南交通大学硕士研究生学位论文第10 页 己i 吉 ji 口 第2 章微图形化表面的制备及表征 光刻技术作为半导体制造及相关领域最关键的技术之一，在近几十年 内取得了很大的发展。光刻技术由于获得的图形分辨率高、操作方便等原 因，在诸多领域中得到应用。 臣卫s i l lc o n = z i l ic o nd io x i d e 曩囊p h o t o r e z is t 上 葛_ 团臣习 图2 - 1光刻技术流程图 i ) 硅片热氧化；2 ) 涂敷光刻胶；3 ) 曝光；4 ) 显影： 5 ) 刻蚀s i 0 2 ；6 ) 剥离光刻胶；7 ) 刻蚀s i ；8 ) 去s i 0 2 层 光刻技术流程图如图2 1 ：首先在硅片表面氧化一层二氧化硅层，再 在其表面涂敷一层光刻胶，经过紫外辐照和显影后进行湿法刻蚀得到所需 的硅基微图形。 光刻主要是通过光刻胶，借助能量如紫外光、深紫外、电子束、离子 束等，把掩膜板上的图形复制到光刻胶上，而刻蚀就是通过光刻胶暴露区 。域来去掉晶圆最表层的工艺。刻蚀工艺主要有两大类：湿法刻蚀和干法刻 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 1 页 蚀。长期以来主要借助于化学药剂来进行湿法刻蚀，随着半导体工艺的成 熟，干法刻蚀称为未来科技发展的趋势。 硅的各向异性刻蚀的原理即根据刻蚀液对单晶硅不同晶面上的刻蚀速 率不同，获得梯形的图形( 如图2 2 ) 。对于氢氧化钾、四甲基氢氧化铵等各 向异性的刻蚀液而言，在硅各个不同晶面上的刻蚀速率比较为：( 1 0 0 ) ( 1 1 0 ) ( 1 l1 ) ，即一般认为硅( 1 1 1 ) 晶面为刻蚀的中止面。 s i o s 图2 - 2 硅各向异性刻蚀原理图f 6 8 】 i 0 2 图2 - 3非平衡磁控溅射结构示意图 本文采用非平衡磁控溅射( u b m su n b a l a n c e dm a g n e t r o ns p u t t e r i n g ) 技术在硅片、光刻胶s i 0 2 注：本论文中微图形名称均采用脊沟槽结构书写】、 西南交通大学硕士研究生学位论文第12 页 s i s i 微图形三种不同样品表面制备氧化钛薄膜。本文中采用u b m s 四靶 非平衡磁控溅射系统制备薄膜，其结构如图2 3 。该设备在常规磁控溅射 靶的基础上改变磁场分布，使得某一极的磁场相对于另一极相反的部分增 强或减弱，从而在保证较高的沉积速率的同时产生较广的等离子体区域， 使得薄膜在沉积过程中得到一定的离子轰击，得到较为致密的性能优良的 薄膜。 2 1s i 基微图形的制备 2 1 1 实验材料及实验仪器 表2 1 微图形制备所需实验材料 名称规格生产厂家 硅片 c 1 0 0 r a m 厚度5 1 0 5 4 0 9 m ， 峨眉半导体厂 n ( 1 0 0 ) 型 带氧化层硅片1 0 0 m m ，氧化层厚度为2 5 0 n m重庆2 4 所 紫外正型光刻胶b p 2 1 2 型北京化学试剂研究所 四甲基氢氧化铵成都金山化学试剂有限公司 主要实验仪器 真空烧结炉、匀胶机( k w _ 4 a 型，中科院微电子研究所) 、掩膜对准 曝光机( h 9 4 1 7 g 型口1 0 0 ，四川南光真空科技有限公司) 、恒温烘箱、恒 温水浴箱。 2 1 2 光掩膜板及图形的选择 掩膜板在微图形制备过程中占据非常重要的作用，它是图形转移复制 的模版。根据实验要求采用微阵列图形，图形设计为沟槽阵列。本论文中 西南交通大学硕士研究生学位论文第13 页 采用x i o n gl 6 8 1 设计的掩膜板，图形为1 0 4 0 “m 的微阵列的方形区域， 方形区域的尺寸为6 m m 的正方形，两区域间前后左右的间隔均为4 m m 。 其中黑色为不透光区域，白色为透光区域。本实验中均采用4 i n c h 的掩膜 板。如图2 4 即为掩膜板的设计示意图。 沟槽图形中最重要的参数是脊宽度a ，沟槽宽度b ，沟槽底的宽度c 和沟 槽的深度h ( 如图2 5 ) 。其中a 和b 是掩膜板设计值，沟槽底部的宽度c 值随刻蚀沟槽的深度h 的变化而变化，c = a 一2 h * c t g o ，其中沟槽v 型面与底 面的夹角0 是一确定值，h 与刻蚀液、刻蚀速率和刻蚀时间等因素有关。 h a = b c = a 2 h e t g0 0 = 5 4 7 4 h 图2 - 5 微图形设计示意副6 8 】： a 脊的宽度；b 沟槽宽度；c 沟槽底的宽度； h 沟槽深度；0 各项异性刻蚀的角度 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 4 页 2 1 3 光刻及湿法刻蚀实验 1 硅片热氧化 洁净的硅片表面需一层带有均匀二氧化硅层的氧化层作为牺牲层。硅 片表面氧化处理，其化学反应公式如下2 1 所示： & + q 寸& q ( 2 1 ) 4 i n c hn 型( 1 0 0 ) 单晶单面抛光硅片先进行如下预清洗处理：先在丙 酮溶液中超声清洗1 0 m i n ，以去除表面的有机物玷污，后用去离子水超声 清洗5 m i n 并吹于。 表2 2 硅片氧化参数 氧化过程开始温度( )结束温度( )氧化时间( h ) 升温 1 51 0 0 02 保温 1 0 0 01 0 0 0l 降温 1 0 0 0室温( 2 5 ) 洁净硅片经预处理后放入真空烧结炉中进行氧化。氧化过程参数如表 2 2 。获得的硅片氧化层厚度约为2 5 0 n m 。由于此方法获得的氧化硅致密性 不够好，故后续实验中均采用购自重庆2 4 所的带氧化层的硅片。 2 光刻实验【6 8 】 光刻是通过光刻设备把图形转移到光刻胶上，光刻实验操作步骤如下： ( 本实验光刻操作均在十万级黄色环境的洁净间内进行) 预烘：经氧化后的硅片若放置一段时间后会在表面吸附水分，故需要 预烘去除水分，获得比较疏水的表面，保证光刻胶和其表面的粘附性。预 烘在恒温烘箱中进行，温度为1 2 0 c ，时间为1 5 m i n 。 匀胶：预烘后硅片需要在匀胶机上涂敷一层均匀的b p 2 1 2 紫外正型光 刻胶。该光刻胶受紫外光照射后，光照区的邻重氮萘醌磺酸发生分解，放 出氮气形成烯酮，烯酮遇水形成茚羧酸而易溶于稀碱；未曝光的区域由于 西南交通大学硕士研究生学位论文第15 页 碱的作用，重氮化合物上的树脂发生偶合反应形成氮化合物，使其分子量 增加，溶解度降低。本实验采用低速和高速相结合的匀胶方式。低速为5 0 0 转分，匀胶时间1 2 s ；高速为2 5 0 0 转分，匀胶时间为6 0 s ，获得光刻胶的 厚度约为1 5 岬。 前烘：匀胶后的硅片需要在恒温烘箱中进行前烘来除去光刻胶溶剂中 的水分，前烘温度为9 5 士5 ，时间为1 5 m i n 。 紫外曝光：前烘后的硅片置入光刻机中进行紫外曝光。紫外波长为 3 6 5 n m ，光刻机的功率为2 0 0 w ，曝光时间2 0 s ，光强约为7 4 m w c m 2 显影：曝光后的硅片置入5 o n a o h 显影液中显影2 0 s ，吹干后用金相 显微镜进行显影观察，此时得到的是光刻胶s i 0 2 的微图形。 坚膜：显影后的图形需在恒温烘箱中1 2 0 进行坚膜( 即烘干) 1 5 r a i n 处理，以保证保证在刻蚀过程中光刻胶粘附的牢固性。 3 湿法刻蚀实验 经光刻实验后，即可获得光刻胶s i 0 2 的微图形( 如图2 1 中图4 ) 。光刻 实验后需经过湿法刻蚀过程得到硅基微图形。湿法刻蚀过程主要分为：氧化 层刻蚀、光刻胶剥离、硅基底刻蚀、氧化层剥离等过程。( 见图2 1 中5 8 ) 氧化层刻蚀采用b o e ( 即h f n h 4 f 的水溶液) 刻蚀液，该刻蚀液具 有只腐蚀s i 0 2 氧化层而不伤及硅基底的能力；光刻胶的剥离采用热丙酮溶 液；硅基底刻蚀采用了两种各向异性的刻蚀液一t m a h ( 四甲基氢氧化铵) 。 氧化层刻蚀：采用b o e ( 溶液的体积比为l ：7 该0 蚀液，反应温度为2 5 ， 反应时间为3 m i n 。此时获得的是光刻胶( s i 0 2 ) s i 的微图形( 如图2 1 中图 5 ) 。刻蚀s i 0 2 的速度约为：1 0 0 n m m i n 。 光刻胶的剥离：b o e 刻蚀后的硅片经去离子水冲洗，放入4 0 。c 的热 丙酮溶液中清洗2 0 m i n ，表面的光刻胶会被剥离，得到s i 0 2 s i 的图形( 如 图2 1 中图6 ) ，此时图形的深度为氧化层的厚度。 硅基底的刻蚀：采用2 5 w t 四甲基氢氧化铵( t m a h ) 溶液进行硅基 底的各向异性刻蚀，反应温度为8 5 ，分别反应4 m i n ，1 0 m i n ，2 0 r a i n 并在反 西南交通大学硕士研究生学位论文第16 页 应过程中注意搅拌。最后采用与前面相同的腐蚀s i 0 2 的条件来去除氧化 层，获得s i s i 微图形。 在光刻、湿法刻蚀过程制备出如下s i 基微图形：光刻胶i s i 0 2 ， s i 0 2 s i ，s i s i 微图形。 2 2t i 0 2 图形化的制备 本文采用两种不同的工艺手段，分别在光滑硅表面、光刻胶s i 0 2 微图 形表面和s i s i 微图形表面沉积氧化钛薄膜。如图2 - 6 即为氧化钛薄膜在各 种不同表面沉积后的示意图：( a ) 先在显影后的光刻胶s i 0 2 微图形表面沉 积氧化钛薄膜，得到t i 0 2 ( 光刻胶) t i 0 2 图形，再洗去光刻胶，得到 t i 0 2 s i 0 2 的微图形 6 9 , 7 0 1 ；( b ) 在湿法刻蚀后的s i s i 微图形表面直接沉积 氧化钛薄膜，得到t i 0 2 t i 0 2 微图形结构；( c ) 直接在光滑的硅片表面沉积 氧化钛薄膜；( d ) 直接在带有氧化层的