（外科学专业论文）41bbl转基因胃癌细胞总rna转染树突状细胞疫苗的研究.pdf

目录 州洲i i i i i i i | i i m m m y 19 0 0 8 8 1 中文摘要 1 英文摘要 4 研究论文4 1 b b l 转基因胃癌细胞总r n a 转染树突状细 胞疫苗的研究 前言+ 8 刖舌 ”一“”一一”“一”“”。石 材料与方法“9 结果 2 0 附图 2 2 附表 2 8 讨论 2 9 结论 3 1 参考文献 3 2 综述树突状细胞疫苗的抗肿瘤研究进展3 5 致谢 4 9 个人简历5 0 中文摘要 4 1 b b l 转基因胃癌细胞总r n a 转染树突状细胞疫苗的研究 摘要 目的：胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近几年发病率呈上升趋势， 且发病亦趋于年轻化，而进展期胃癌的综合治疗效果较差，其5 年生存率 徘徊在3 0 左右。其难以治愈的原因之一与肿瘤的免疫逃逸有关，抗肿瘤 免疫以t 细胞介导的细胞免疫为主，t 细胞的活化需双信号刺激，其中第 二信号由抗原提呈细胞( a n t i g e n p r e s e n t i n gc e l l ，a p c ) 上的共刺激分子与t 细胞上的相应配体提供，缺乏第二信号的作用可导致t 细胞特异性无应 答反应。大量研究证实肿瘤细胞可通过缺乏共刺激分子的方式逃避机体免 疫。 树突状细胞( d e n “t i cc e l l ，d c ) 是体内功能最强大的抗原提呈细胞， 能够在体内外诱导并维持初始免疫反应。其功能表现在识别和吞噬病原 体，将大分子抗原加工成肽段，刺激未致敏t 细胞产生特异性免疫应答。 用树突状细胞疫苗治疗肿瘤是当前肿瘤治疗领域的热点之一，在诸多类型 的树突状细胞疫苗中更多研究者将目光集中在用全肿瘤信息负载d c ，以 多个抗原表位的免疫反应，有效地防止由于抗原变异而引起的免疫逃避。 4 1 b b 4 1 b b l 是c d 2 8 b 7 之外的另一对重要的协同刺激信号， 4 1 b b l 属于肿瘤坏死因子( n 师) 超家族成员，主要表达于活化的b 细胞 和t 细胞、单核细胞、树突状细胞( d c ) 、神经母细胞瘤细胞及一些肿瘤 细胞上。主要在初次免疫应答的后期起作用，4 1 b b l 可协同c d 2 8 或单 独发挥对静止t 细胞的活化作用，维持t 细胞的生存及免疫记忆应答。 本研究将4 1 b b l 基因导入胃癌细胞，并提取此胃癌细胞总砌悄转 染树突状细胞制备肿瘤疫苗，并观察疫苗的体外抗肿瘤效应，为胃癌的临 床免疫治疗奠定一定的理论基础。 方法： 1 用脂质体法把p m 日t n e o 4 1 b b l 基因导入6 15 小鼠前胃癌细胞c 内， g 4 1 8 进行筛选至长出g 4 1 8 抗性克隆，成为姗c 4 1 b b l 细胞。 2 逆转录聚合酶链反应( r e v e r s e 仃觚s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i l lr e a c t i o n ， r - t - p c r ) 鉴定转染细胞中4 - 1 b b l 基因l i l 】 矾a 的存在。 中文摘要 3 自6 1 5 小鼠骨髓组织中分离树突状细胞( d c ) ，并进行体外培养使之进一 步成熟。 4 用脂质体包裹m c 4 1 b b l 细胞总砌怕转染小鼠树突状细胞，制备 d c 4 1 b b l i 之n a 疫苗。 5 取6 1 5 同种异体小鼠脾淋巴细胞，与d c 、c 4 1 b b l d c 混合培养， 利用m t t 法测各组淋巴细胞增值率。d c 、c 4 1 b b l d c 与小鼠淋巴 细胞共培养后刺激t 细胞产生特异性c t l 细胞，利用m t t 法测定肿瘤 细胞的杀伤率；e l i s a 法测定幼稚d c 、d c 、c 4 1 b b l d c 培养上清 中i l 1 2 的含量及m c 4 1 b b l d c 、d c 与t 细胞共培养后上清中i f n - y 含量。 所有实验数据用s p s s1 3 o 统计软件处理，p o 0 5 时认为差异具有显著性。 结果： 14 1 b b l 基因转染m c 细胞后的鉴定： m c 经脂质体法转染4 1 b b l 基因、g 4 1 8 筛选后，均获得阳性克隆 ( 姗c 4 1 b b l ) 。提取c 4 1 b b l 细胞总r n a ，经r t - p c r 可得到6 1 6 b p 的特异性条带，证实有4 1 b b l 的讪a 较强表达。 2 树突状细胞的形态学观察： 倒置显微镜下观察，培养第3 天，细胞数量明显增加，体积增大，部 分细胞悬浮生长并聚集成团，呈集落样生长。培养第5 天，以悬浮生长为 主，体积无明显变化，部分细胞出现足状突起或毛刺状突起，集落明显增 多。转染后1 2 h ，细胞形态基本恢复至未转染前状态。 3m t t 法测定转染前后d c 对淋巴细胞的增殖能力： 刺激细胞与效应细胞比值分别为1 ：2 0 、l ：1 0 、l ：5 时各组 m c 4 1 b b l d c 对t 细胞的增殖作用( o 0 9 3 o 0 1 2 、0 1 8 7 o 0 1 3 、o 1 8 7 o 0 1 3 ) 均强于相应比值下d c 对t 细胞的增殖作用( o 0 6 0 o 0 1 4 、o 1 4 8 0 0 1 7 、o 1 9 5 o 0 1 5 ) ；且随刺激细胞与效应细胞比值增高，增值作用逐 渐增强。 4m t t 法测定转染前后d c 激活t 细胞杀伤肿瘤的活性： 靶细胞与效应细胞比值分别为1 ：2 0 、l ：1 0 、l ：5 时各组m c 4 1 b b l d c 激活c t l 细胞对肿瘤细胞的杀伤率( o 5 3 3 o 0 9 2 、o 3 2 1 o 0 1 8 、o 2 1 8 o 0 2 5 ) 高于d c 激活c 1 1 l 细胞对肿瘤细胞的杀伤率( o 3 4 2 o 0 2 3 、o 2 6 7 中文摘要 o 0 2 4 3 、0 1 4 7 o 0 3 1 ) ，p o 0 5 ；且随效靶比增大，杀伤率逐渐增高。 5e l i s a 法测定培养液上清中i l 1 2 、i f n y 的含量： i l 1 2 由多到少依次为c 4 1 b b l d c ( 2 0 2 4 0 2 4 9 4p 咖1 ) 、 d c ( 1 7 0 8 8 3 9 3 3p 咖1 ) 、幼稚d c ( 1 0 2 8 8 2 3 9 0 p m 1 ) ，d c 明显高于幼 稚d c 。c 4 1 b b c ( 9 4 5 l 2 9 2 5p g m 1 ) 与t 细胞共培养后上清中 i f n - y 含量高于d c 组( 5 9 7 9 1 6 3 9p 咖1 ) 。 结论： l4 1 b b l 基因应用脂质体法转染后，可以在小鼠胃癌c 细胞内稳定表 达；且应用转染后的c 细胞的总对她转染d c 后可以得到稳定活性 的d c 疫苗。 2m c 4 1 b b l d c 对t 细胞的增殖作用强于d c ；且c 4 1 b b l d c 培 养液上清中i l 1 2 的含量明显高于其余各组。提示此疫苗可提高t 细胞增 殖能力及机体免疫力。 3 c 4 1 b b l d c 激活肿瘤特异性t 细胞对胃癌细胞的杀伤力强于其他 组，且c 4 1 b b l d c 与t 细胞共培养后上清中i f n y 含量高于d c 组。 提示此疫苗具有较强的抗肿瘤作用。 关键词：4 1 b b l ；树突状细胞；转染；肿瘤免疫；胃癌； 英文摘要 t h ea n t i - t u m o re f f e c t si n d u c e db yd e n d r i t i cc e u st r a n s i e c t e d w i t ht o t a lr n af r o mm u r i n eg a s t r i cc a r c i n o m ac e l l sw i t h 4 一l b b lg e n e a b s t r a c t o b j e c t i v e ：g a s 仃i cc a n c e ri so n eo ft h em o s tc o m m o nm a l i g n a n tt u m o r s i nc h i n a i nr e c e n t y e a r s ，t h e i n c i d e n c ei s r i s i n g ，1 e d i s e 嬲et e n d st 0 y o 吼g e r c o m l ) r e h e n s i v et r e a t m e n to fa d v a l l c e dg a s t r i cc a n c e ri sp o o r 1 1 1 eo n e c a u s eo fd i 街c u l tt 0c u r em a l i g n a n tt u m o r sr e l a t e st 0t u m o ri m m u n ee s c 印e 山m - t u m o ri m m u n i t yi st - c e l l 一m e d i a t e dc y t o i n u n u n i 够t h ea c t i v a t i o no ftc e u n e e d sd o u b l es i g n a l ss t i m u l u s t h es e c o n ds i g n a li sp r o v i d e db yc o s t i m u l a t o 巧 m o l e c u l e so n 锄t i g e np r e s e n t i n gc e l la n dc o r r e s p o n d i n gl i g 孤do ntc e l l t h e a b s e n c eo f t h es e c o n dd i g n a lh a sb e e ns h o 、mt ol e a dt 0tc e ua n e 嘲，a1 0 to f s t u d i e ss h o wt h a tt 哪o rc e uc 锄e s c 印eb o d yi m m u n eb ya b s e n c eo f c o s t i m u l a t o d e n d r i t i cc e l l si st h em o s tp o w e r m l 锄t i g e np r e s e n t i n gc e l l s ，i tc a l l i n d u c e sa n dm a i n t a i n s 也ei n i t i a li m 【i m n er e s p o n s ei nv i v oa n dv i 仃0 d c sa r e u i l i q u e l yp o t e n ti 1 1m e i ra b i l i 锣t oc 印t u r e ，p r o c e s s 甜l dp r e s e n ta n t i g e n st ot c e l l s n o wm a n yi i l v e s t i g a t o r sc o n c e n t r a t eu p o nd cv a c c h l el o a d e dw h o l e t u m o ri m f o m a t i o nt op r e v e n ti 咖u n ee v a s i o nc a u s e db ya n t i g e n i c 删a t i o n 4 1 b b 4 1 b b li st h e 汕e rc o u p l ei m p o n a 呲c o s t i n m l a t o 巧s i 印a lb e s i d e s c d 2 8 b 7i 1 1i m 姗m er e s p o n s ea 1 1 dt 啪o ri 舢m u n i 够4 1b b l b e l o n g st 0u 1 仃a - f a m i l yo ft u m o rn e c r o s i sf a c t o r ( ，n 师) a n da c t i v a t e sr e s t i n gt c e l l ss e p a r a t e l y o ri nc 0 0 r d i n a t i o nw i mc d 2 8 4 1b b le x i s t so nt h ec e um e m b r a n es u p e r f i c i a l ， a i l di te x p r e s s e s o na c t i v a t e dtc e l la n db c e l l ，m o n o c y t ，a n dd e n d r i cc e l l ，n e u r 0 b l a s t o m aa n ds o m et u m o rc e l l i tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l em a tm a i n t 撕n se x i s t e n c e 锄dm e m o 巧r e s p o n s eo ft 1 y i l l p h o c ”e s 4 1b b 4 一lb b lm a yp r o v i d ean e w b i o l o g i c a lt h e r 印yo f c a n c e r 1 1 1 i s s t u d y w 销t h a tm ec o s t i m u l a t o 巧m o l e c u l e4 lb b lg e n ew 嬲 仃锄s f e c t e di i l t 0g 删cc a n c e rc e l l s ，廿l e nm e 删r n ao fg a s 仃i cc a n c e rc e l l s 4 英文摘要 t r 锄s f e c t e dd c ，p r o d u c t i o no ft u m o rv a c c i n e s ，t oo b s e r v et h e 舭t i t u m o re f r e c t i nv i 臼o a sf o rc l i n i c a li m m u n o t h e r 印yo fg a s t r i cc a n c e rt ol a ym et h e o r e t i c a l f o u l l d a t i o nf o r 如r t h e r m e t h o d s ： 1i n s e r tm el i p o s o m e - m e d i a t e dp m k i t n e o 膳一1b b lg e n ei n t om eg a s t r i c c a n c e rc e l l so ft 1 1 e615m i c e ，t h ep o s i t i v ec l o n i n gt h e n 劬mi m om f c 4 1b b l c e l lt l m d u 西g 4 18s e l e c t 2a s s a yt h ee x i s t e n c eo f4 1b b lg e n em i 斟ai nt l l et m s f 宅c t i o n a lc e nw i t h r e v e r s e 缸。a n s c r i p t i o n p c i 屯( r 工p c r ) 3s e p e r a t et h ed e n d r i t i cc e l l s 丹o m615m i c e 。sm y e l o i dt i s s u e ，t l l e nc u l t u r ei i l v i t r 0t 0i n c r e a s em e q u a n t i 锣a 1 1 dp r o m o t em 删i o n 4w a pu pt 1 1 et o t a li 斟ao fm f c 4 1b b lc e l lw i t hl i p o s o m ea n dt r a i l s f e c t o u s e d e n d r i t i cc e l l st om m t h ed c 4 1b b l i 己n av a c c i n e 5s p l e n i cl y i n p h o c ”e so ft l l es 锄er a c ew e r eh a r v e s t e d 自o mm i c ea n d c o c u l t u r e dw i md c sa i l dm 匝c 4 1b b l d c so fi n a c t i v a t i o n t h ep r o l i 传r a t i o n r a t eo ftc e l l sw a sc a l c u l a t e db y 们 td c s ，匝c 4 1b b l d cc e n sa n dtc e l 1 sw e r em i x e da n dc u l t u r e d t h eh um t eo ft u m o rc e l l sw a sc a l c u l a t e db va 仉t c y t o k i n e sw e r er e l e a s e di i ls u p e m a t a n t sw e r em e a s u r e df i o rb i o a c t i v ei l 12 a n di f n 吖b ye l i s ak i t s a ns t a t i s t i c a la n a l v s e sw e r ec a r r i e do u tw i t hs p s s13 oa n dp o 0 5w e r e c o n s i d e r e ds i 朗i f i c a m r e s u l t s ： 1t h ee x p r e s s i o no f4 一lb b lm r n ab yi m p c ra n dc e l ls h 印eo b s e a t i o no f c e l ls e l e c t i n ga f t e r4 一lb b l g e n et r a l l s f e r e d i n t on cc e u s w bg o tp o s i t i v ec o l o n ec a l l e d 匝c 4 1b b la r e r4 1b b l g e n et r 刁l n s f e r e d i n t o615m o u s ec e l l sm f cb yt 1 1 em e t h o do fl i p o s o m e sa n ds e l e c t e db y g 4l8 t o t a lr n aw a se x l 勰c t e d 矗o mn c 4 1 b b la r l d 匝cc e l l s t h ec d n a w a s s y n t h e t e db yr e v e r s e 仃a n s c r i p t i o n 6 16 b p s p e c i f i cs t r a pw a sg o 慨nb yp c r a n l p l i f i c a t i o nw i t hm o u s e4 1b b ls p e c i f i cp r i m e r si nn 伍c 4 1b b lc e l l s 、h i c hi i l d i c a t e d4 1b b lm i 斟aw a se x p r e s s e d 鼬r o n g e ri nt l l i sc e nl i n e 2t bo b s e r v ec e u su n d e ri n v e r t e dm i c r o s c o p e 5 英文摘要 c e l l sn u m b e r 洫c r e a s e da n dm ec e l lc l u s t e r sw e r eg e n e r a t e di i lt h i r dd a yo f c u l t u r e d c sw e r es u s p e n s i o n 铲o w t ha i l dg e n e r a t e dl o t so fc e l lp r o c e s s e sa 1 1 dc u l t u r e u 乙sw e r es u s p e n s l o n 一灯o w t ha i l dg e n e r a t e dl o t so fc e 玎d r o c e s s e s 锄d s p i c u l a t e di nf i n hd a yo fc u l t u r e r r a n s f e r r e dd c sa r e r 12h o u r sr e c o v e r e d v i 玛i n 印p e 黝c e 3m i x e d l y r 印h o c ”er e a c i o n tc e l l sc y c l i n gw e r em o r e e 所c i e n t l ya c t i v a t e db y 匝c 4 1b b l d c ( o 0 9 3 士 o o12 ，o 18 7 士o o13 ，o 18 7 士o ol3 ) t h a l ld c ( o 0 6 0 士o o1 4 ，o 14 8 士o ol7 ，o 19 5 士o o 15 ) a tt h ei n d i c a t e ds t i m u l a t i o nt or e s p o n d i n gr a t i o ( 1 ：2 0 ，1 ：1o ，1 ：5 ) 4c y t o t o x i c i 够a s s a y s 1 、l m o rc e l l sw e r em o r e e m c i e n t l yk i l l e db yt c e l l so f c 4 1b b l d c g r 0 u p ( o 5 3 3 士o 0 9 2 ，o 3 2 l 士o 0 1 8 ，o 2 l8 士o 0 2 5 ) t h a nd cg r o u p ( o 3 4 2 士o 0 2 3 ，o 2 6 7 士o 0 2 4 3 ，0 1 4 7 士o 0 3 1 ) a tt h ei n d i c a t e de 行e c t o r ：t 鹕e t ( 1 ：2 0 ，l ：1 0 ，1 ：5 ) 5c y t o l ( i n e s 5 1t h el e v e lo fc e l lf a c t o ri l 1 2 s e c r e t e e l i s aa n a l y s i ss h o 、dm a ti l 12s e c r e t ef r o mh i 曲t ol o w ：m f c 4 1b b l d c ( 2 0 2 4 0 士2 4 9 4 p g m 1 ) ，d c ( 17 0 8 8 士3 9 3 3 p g m 1 ) ，i m m a t u r ed c ( 1o 2 8 8 士2 3 9 o p g m 1 ) 5 21 1 1 el e v e lo fc e l lf a c t o ri f n 吖s e c r e t e e l i s a a n a l y s i ss h o w e dt h a ti f n 一丫s e c r e t e 行o mh i g ht ol o w ：m f c 4 一lb b l d c ( 9 4 5 1 士2 9 2 5p g m 1 ) ，d c ( 5 9 7 9 士1 6 3 9 p 咖1 ) c o n c l u s i o n ： 11 1 1 e4 - 1b b l g e n ei s 仃a n s f e r e di n t om f cc e l l sb yl i p o s o m e sa n dt h j sg e n e e x p r e s s e ss t a b l y t h ed cv a c c i n eh 嬲t l l e 鼬l ea c t i v 时a r e rt r a i l s f e 玎e db y t h et o t a lr n ao f 4 1 b b l 脚c 一 2tc e l lp r o l i f - e r a ：t i o na r em o r e e f ! f i c i e n t l ya c t i v a t e db y c 4 1b b l d c sn l a l l d c s i l l2o f 仃：m s f e c t e dd c sa r eh i g h e r 廿l a l lo t h e rd c si ns u p e m a t a i l t s t h e v a c c i l l es h o w sm a tt 1 1 e p r o l i f e r a t i o no ftc e na n db o d y si m m l m i t yc a i lb e e n h a n c e d 3t u m o r l 【i l l i n ga b i l i t yt oa c t i v a t es p e c i f i ct - c e no fm c 4 - 1b b l d cg r o u p a r eh i 曲e r 吐l a nu i 】【_ t r ；a 1 1 s f e c t e dd c s g r o u pa n di f n 吖ms u p e m a t 锄t sc u l t u r e d w i n ltc e l l sa r eh i g h e rm a nu i i t r a n s f e c t e dd c s i n 吼l p e m a ：t a n t s t h ev a c c i n e 6 英文摘要 一一一 s h o w st h a tm 匣c 4 1b b l 】d cv a c c i n ec a np r o m o t em e a n t i t u m o ra c t i v i 锣 k e yw o r d s ：4 1b b l ；d e n d r “i cc e l l ；t o t a lr n a ；t u m o ri m m u n e ；g a s t r i c c a r c i n o m a 研究论文 4 1 b b l 转基因胃癌细胞总r n a 转染树突状细胞疫苗的研究 屿e - 莉暑 胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位居各种恶性肿瘤之首，近 几年发病率呈上升趋势，且发病亦趋于年轻化。虽然已采取了手术、化疗、 放疗、中医中药等多手段的综合治疗，生存率较以往有所提高，但仍无大 的治疗突破，特别是进展期胃癌【i l 。其难以治愈的原因之一与肿瘤的免疫 逃逸有关。抗肿瘤免疫以t 细胞介导的细胞免疫为主，t 细胞的活化需双 信号刺激，其中第二信号由抗原提呈细胞( a p c ) 上的共刺激分子与t 细胞 上的相应配体提供，缺乏第二信号的作用可导致t 细胞特异性无应答反 应【2 】。大量研究证实肿瘤细胞可通过缺乏共刺激分子的方式逃避机体免 疫。参与组成“双信号 学说的第一信号的抗原呈递细胞包括单核吞噬细 胞系统、树突状细胞( d e n d r e t i cc e l ld c ) 和b 细胞。 树突状细胞是体内功能最强大的抗原提呈细胞，能够在体内外诱导并 维持初始免疫反应。d c 在分化成熟过程中分为两个阶段，未受到抗原刺 激时，大部分处于非成熟阶段，有强大的抗原摄取功能【3 】。在摄取抗原或 受到刺激后分化为成熟d c ，高表达m h c i 、m h c i i 及共刺激分子，分 泌t 细胞激活所需的各种细胞因子，具有强大的抗原递呈及t 细胞激活 功能【4 】。4 。1 b b 4 1 b b l 是c d 2 8 b 7 之外的另一对重要的协同刺激信号， 4 1 b b l 属于肿瘤坏死因子( 耵盯) 超家族的成员，为i i 型跨膜糖蛋白，主 要表达专职抗原提成细胞及一些肿瘤细胞上【5 】。主要在初次免疫应答的后 期起作用，4 1 b b l 可协同c d 2 8 或单独发挥对静止t 细胞的活化作用， 维持t 细胞的生存及免疫记忆应答起重要作用【6 1 。本研究将共刺激分子 4 1 b b l 基因转染后的胃癌细胞总砌妊转染树突状细胞制备胃癌疫苗， 从而使此疫苗中融合了t 细胞活化的双信号，增强了其肿瘤杀伤活性。 研究论文 材料与方法 1 材料 1 1 细胞株 小鼠前胃癌细胞株( c ) 购自中科院上海细胞生物研究所，采用 1 0 f b s r p m l l 6 4 0 培养液传代。 1 2 实验动物 s p f 级6 1 5 小鼠，雌雄各半，鼠龄6 8 周，体重1 8 2 0 9 ，购于天津中 国医学科学院血液学研究所实验动物中心，动物合格证号：s c x k ( 津) 2 0 0 4 o 0 0 1 。小鼠购回后饲养于河北医科大学第四医院实验动物中心。 1 3 主要仪器 c 0 2 培养箱( t c2 3 2 3 型)美国s 砸l d o n 公司 台式离心机德国h e r a e u s 公司 超净工作台美国b i o l o g i c a l 公司 倒置相差显微镜( l h 5 0 a 型)日本o i m 汩u s 全自动高压蒸汽消毒器日本三洋公司 电子分析天平( j a 5 0 0 3 )上海精科天平厂 无菌培养瓶美国c o s t a r 公司 无菌培养板美国c o s t a r 公司 8 0 超低温冰箱日本三洋公司 1 5 2 超低温冰柜日本s 朋啊o 公司 恒温水浴箱哈尔滨东联公司 低温高速离心机德国h 甜i c h 公司3 0 r f 7 5 6 型紫外分光光度计国产上海 g e n e n p9 6 0 0 型p c r 仪美国p e 公司 r s 2 8 高速低温离心机德国贺利氏公司 u 忡凝胶扫描系统美国u v p 公司 微量移液器德国g i l s o n 公司 d f c u 电泳仪北京六一仪器厂 酶联免疫检测仪( h t 2 型)奥地利缸曲o s 公司 1 4 主要试剂 研究论文 p m 日t n e o 4 1 b b l 质粒由h i d e oy a g h 教授惠赠； c o l id h 5q 菌株由本院科研中心提供； 限制性内切酶x h o i 、n o t i纽英伦生物技术( 北京) 有限公司 r p m l l 6 4 0 培养基美国g i b i c 0 公司 p b s 粉剂北京中杉金桥生物技术有限公司 胰蛋白酶美国g i b i c o 公司 胎牛血清杭州四季青生物有限公司 二甲基亚砜( d m s o )天津化学试剂厂 t r i z o lr e a g e m 美国i n v i 仃o g e n 公司 c 【) n a 合成试剂盒美国f e m e n t a s 公司 g o t a q 绿色体系美国p r o m e g a 公司 2 0 0 0 b pd n a l a d d e r 美国f e m e n t a s 公司 t r i s 美国d o w 化学公司 琼脂糖美国p r o m e g a 公司 氯仿北京化学试剂厂 异丙醇北京化学试剂厂 乙醇北京化学试剂厂 超纯质粒小提取试剂盒，北京天根生物技术有限公司 脂质体( l i p o f - e 晚吼i n l m 2 0 0 0 )i n v i t r o g e n 公司 重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( 吼g m c s f ) 美国r e p r o t e c h 公司 重组小鼠白细胞介素4 ( m i l 4 )美国r e p r o t e c h 公司 重组小鼠白细胞介素2 ( r r i l i l 2 ) 美国r e p r o t e c h 公司 丝裂霉素c美国g i b i c o 公司 m 丌粉美国g i b i c o 公司 小鼠淋巴细胞分离液美国g i b i c o 公司 小鼠i l 1 2e l i s a 试剂盒深圳欣博盛生物科技有限公司 小鼠i f n 吖e l i s a 试剂盒深圳欣博盛生物科技有限公司 自配试剂： l b 液体培养基( l u r i a b e n a n i ) ：称取蛋白胨( t r y p t o n e ) 1 0 9 ，酵母提取 物( y e a s te x 舰c t ) 5 9 ，n a c l1 0 9 ，溶于8 0 0 m l 去离子水中，用n a o h 调p h 至7 5 ，加去离子水至总体积1 升，高压下蒸气灭菌2 0 分钟。 研究论文 l b 固体培养基：液体培养基中每升加1 2 琼脂粉，高压灭菌。 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ，加n p ) 母液：配成5 0 m g m l 水溶液，一2 0 保存备 用。 电泳所用试剂：( 1 ) t b e 缓冲液( 5 ) ：称取而s5 4 9 ，硼酸2 7 5 9 ，并 加入o 5 me d l a ( p h 8 o ) 2 0 m 1 ，定溶至1 0 0 0 m l ( 2 ) 上样缓冲液( 6 ) ：o 2 5 溴酚蓝，4 0 ( w v ) 蔗糖水溶液。 含l o 胎牛血清r p m l l 6 4 0 培养液：( 1 ) 、配制前2 4 小时将2 0 冷冻 保存的胎牛血清移入4 冰箱内解冻，配制当天将其移入3 7 细胞培养用 孵箱内，待血清达3 7 后将其移入预热到5 6 的水浴箱内，灭活3 0 分钟， 每隔1 0 分钟摇匀一次。( 2 ) 、将灭活后的血清冷却至3 7 后摇匀，在超净 工作台内按每9 0 m l r p 1 6 4 0 培养基加入l o m l 胎牛血清，放入4 的冰箱 备用。 细胞培养用p b s 的配制：( 1 ) 将一小袋p b s 粉剂( 可配制1o o o m lp b s 液体) 倒入盛有9 0 0 m l 室温三蒸水的量杯内，用5 0 m l 三蒸水冲洗包装内部， 清洗所有遗留粉末，搅拌溶解；( 2 ) 充分搅拌溶解并定容至l o o o m l ；( 3 ) 高 压灭菌后4 冷藏备用； 1 0 0 m g m lg 4 1 8 配制：( 1 ) 用电子天平秤取o 5 克g 4 1 8 干粉溶入盛有 4 m l 室温p b s 的小烧杯内充分搅拌溶解并定容至5 m l ；( 2 ) 在超净工作台内 用o 2 2um 一次性加压滤器过滤除菌并分装于1 5 m l 消毒过的e p 管中， 每管1 m l ，4 或一2 0 冷藏备用。 o 2 5 的胰酶( 1 ) 用电子天平秤取o 5 克t 聊s i n 干粉溶入盛有l8 0 m l 室 温p b s 的小烧杯内，充分搅拌溶解并定容至2 0 0 m l ；( 2 ) 在超净工作台内用 o 2 2um 一次性加压滤器过滤除菌并分装于l o o m l 消毒过的盐水瓶中，4 冷藏备用。 o 1 d e p c 处理水：( 1 ) 在细口瓶内装入1 l 三蒸水；( 2 ) 向其中加入 1 m l d e p c ，封好瓶口并充分震荡至完全溶解；( 3 ) 室温放置过夜后4 冷藏 备用。 2 实验方法 2 1 质粒分离、纯化、鉴定 2 1 1 菌种的培养 将含有质粒p m t n e o 4 1 b b l 的d h 5q 菌种接种于l b 固体培养基中， 研究论文 3 7 培养1 2 2 4 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5 m ll b 液体培养基 中，3 7 恒温振荡培养约1 2 小时至对数生长后期r 丌。 2 1 2 质粒d n a 提取 按照超纯质粒小提试剂盒说明书操作步骤提取： ( 1 ) 柱平衡步骤：向吸附柱c p 3 中( 吸附柱放入收集管中) 加入5 0 0 ul 的 平衡液b l ，1 2 ，0 0 0 叩m ( 1 3 ，4 0 0 g ) 离心1 分钟，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中。 ( 2 ) 取1 5 m 1 过夜培养的菌液加入离心管中，1 2 ，o o o 印m ( 1 3 ，4 0 0 曲离心1 分钟，小心吸除上清。 ( 3 ) 向留有菌体沉淀的离心管中加入5 0 0ul 溶液p 1 ，使用移液器或涡旋振 荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。 ( 4 ) 向离心管中加入5 0 0ul 溶液p 2 ，温和地上下翻转6 8 次使菌体充分 裂解。 ( 5 ) 向离心管中加入7 0 0ul 溶液p 3 ，立即温和地上下翻转6 8 次，充分 混匀，此时会出现白色絮状沉淀。1 2 ，o o o 叩m ( 1 3 ，4 0 0 g ) 离心1 0 分钟， 离心管底部形成沉淀。 ( 6 ) 将上一步收集的上清液分次加入过滤柱c s ( 过滤柱放入收集管中) ， 1 2 ，o o o 印m ( 一1 3 ，4 0 0 曲离心2 分钟，小心地将离心后收集管中得到的溶液 分次加入吸附柱c p 3 中( 吸附柱放入收集管中) 。 ( 7 ) 1 2 ，o o o 叩m ( 1 3 ，4 0 0 g ) 离心3 0 一6 0 秒。倒掉收集管中的废液，将吸附柱 c p 3 放入收集管中。 ( 8 ) 向吸附柱c p 3 中加入5 0 0 ul 去蛋白液p d ，1 2 ，0 0 0 印m ( 1 3 ，4 0 0 g ) 离 心3 0 6 0 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱c p 3 放入收集管中。 ( 9 ) 向吸附柱c p 3 中加入7 0 0 ul 漂洗液p w 1 2 ，0 0 0 叩m ( 1 3 ，4 0 0 g ) 离心 3 0 6 0 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱c p 3 放入收集管中。 ( 1 0 ) 向吸附柱c p 3 中加入5 0 0 | il 漂洗液p w ，1 2 ，o o o 印m ( 1 3 ，4 0 0 g ) 离心 3 0 6 0 秒，倒掉收集管中的废液。 ( 1 1 ) 将吸附柱c p 3 重新放回收集管中置于1 2 ，o o o 印m ( 1 3 ，4 0 0 曲离心2 分钟，目的是将吸附柱中残余的漂沈液去除。 ( 1 2 ) 将吸附柱c p 3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴 加5 0 1 0 0pl 洗脱缓冲液t b ，室温放置2 分钟，1 2 ，o o o 印m 卜1 3 ，4 0 0 g ) 研究论文 离心2 分钟将质粒溶液收集到离心管中。 2 1 3 目的d n a 片段的限制性内切酶酶切 ( 1 ) 将清洁干燥并经灭菌的e p p e n d o r f 管编号，用微量移液器分别加入质粒 d n a1ug 和相应的限制性内切酶反应体系2 0ul ( 其中包含l o n e b 缓 冲液2ul ，1 0 0 xb s a o 2ul ，n o t i 酶1ul ，x l l o i 酶lul ，最后加入三蒸 水使总体积为2 0u1 ) 。吸打混匀溶液，用瞬时离心机使溶液集中在管底。 ( 2 ) 置于3 7 水浴保温2 3 小时，使酶切反应完全。 ( 3 ) o 7 琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物正确存在。 2 2 c 细胞的培养 取出冻存于1 5 0 冰箱的c 细胞株，复苏细胞，接种于无菌培养 瓶中，用含1 0 胎牛血清的i 冲m n 6 4 0 培养基，于3 7 、5 c 0 2 条件二 氧化碳孵箱中培养，次日更换一次培养液。在显微镜下观察细胞生长状态， 如细胞生长状态良好至9 0 融合状态时可传代，2 3 天传代一次。可用无 血清i 冲m i l 6 4 0 培养基、胎牛血清、d m s o