（环境科学专业论文）无机汞毒理蛋白组学研究以海洋青鳉鱼为例.pdf

目录 目录 摘要一i a b s t r a c t i i i 缩略词表v 第一章前言l 1 1 汞及其污染1 1 1 1 汞污染历史与现状1 1 1 2 环境中汞污染的来源和分布4 1 2 汞的毒性效应及致毒机制5 1 2 1 汞的神经毒性6 1 2 2 汞的肝脏和肾脏毒性8 1 2 3 汞的免疫毒性和生殖毒性8 1 3 水生模式生物青鳊鱼及其在毒理学研究中的应用9 1 4 蛋白质组学及其在毒理学中研究中应用1 0 1 5 本文研究目标和内容l l 1 5 1 研究目的及意义11 1 5 2 研究内容11 1 5 3 技术路线1 2 第二章材料与方法1 3 2 1 海洋青鲔鱼培养13 2 2 无机汞毒理实验1 3 2 2 1 急性暴露实验1 3 2 2 2 慢性暴露实验13 2 3 汞含量测定1 4 2 4 组织超微结构观察1 4 2 4 1 固定液配制1 4 目录 2 4 2 组织处理和电镜观察15 2 5 汞急性暴露下青鳞鱼蛋白质组研究1 5 2 5 1 蛋白提取一15 2 5 2 蛋白定量15 2 5 3 蛋白双向电泳1 6 2 5 4 凝胶染色17 2 5 5 图像扫描和分析17 2 5 6 蛋白质酶解18 2 5 7 质谱鉴定1 8 2 5 8 数据检索18 2 6 汞慢性暴露下青鲔鱼蛋白质组研究1 9 2 6 1 蛋白提取1 9 2 6 2 蛋白定量一19 、 2 6 3 双向荧光差异凝胶电泳( 2 d d i g e ) 分析1 9 2 6 4 图像扫描及分析2 0 2 6 5 银染2 1 2 6 6 银染图像扫描和分析2 2 2 6 7 蛋白酶解2 2 2 6 8 质谱分析2 2 2 6 9 数据库搜索2 2 2 7 实验耗材与仪器2 3 2 7 1 试剂2 3 2 7 2 仪器2 3 第三章汞急性暴露下海洋青鳊鱼肝脏和脑蛋白质组学研究2 4 3 1 结果2 4 3 1 1 汞急性暴露下海洋青鲻鱼肝脏和脑汞含量测定2 4 3 1 2 汞急性暴露下海洋青鲻鱼肝脏蛋白质组差异表达2 4 3 1 3 汞急性暴露下海洋青鳊鱼脑蛋白质组差异表达2 5 3 1 4 肝脏中差异表达蛋白鉴定及功能分类2 8 0 1 5 脑中差异表达蛋白鉴定及功能分类2 8 3 2 讨论2 9 3 3 小结3 4 第四章汞慢性暴露下海洋青鳝鱼肝脏毒理蛋白质组学研究3 6 4 1 结果3 6 4 1 1 汞慢性暴露下海洋青鲻鱼肝脏汞含量3 6 1 2 汞慢性暴露下海洋青鲻鱼肝脏组织超微结构变化3 6 4 1 3 汞慢性暴露下海洋青鲻鱼肝脏蛋白质组差异表达3 7 0 1 4 差异表达蛋白鉴定及功能分类3 9 4 。2 讨论4 2 4 3 小结4 5 第五章汞慢性暴露下海洋青鳙鱼脑毒理蛋白质组学研究4 7 5 1 结果4 7 5 1 1 汞慢性暴露下海洋青鲻鱼脑组织中汞含量4 7 5 1 2 汞慢性暴露下海洋青鲻鱼脑组织超微结构变化4 7 5 1 3 汞慢性暴露下海洋青鲻鱼脑蛋白质组差异表达4 8 5 1 4 差异表达蛋白鉴定及功能分类51 5 2 讨论5l 5 3 小结5 5 第六章结论与展望5 7 6 1 结论5 7 6 2 创新点5 7 6 3 不足及展望5 8 参考文献5 9 附录i 差异蛋白质谱鉴定结果一7 6 附录在读期间发表文章8 8 致谢：8 9 c o n t e n t s 摘要 c o n t e n t s a b s t r a c t i i i a b b r e v i a t i o n s v c h a p t e r1i n t r o d u c t i o n 1 1 1m e r c u r ya n di t sp o l l u t i o n 1 1 1 1t h e h i s t o r y a n d t h e p r e s e n ts i t u a t i o n 1 1 1 2p o l l u t i o ns o u r c e sa n dd i s t r i b u t i o n 4 1 2t o x i c i t yo fm e r c u r y 5 1 2 1n e u r o t o x i c i t y 6 1 2 2l i v e ra n dk i d n e y t o x i c i t y 1 2 3i m m u n ea n dr e p r o d u c t i v et o x i c i t y 8 1 3m a r i n em e d a k aa n di t sa p p l i c a t i o ni nt o x i c o l o g y 9 1 4p r o t e o m i sa n di t sa p p l i c a t i o ni nt o x i c o l o g y 1 0 1 5c o n t e n t sa n do b j e c t i v e so ft h i st h e s i s 11 1 5 1 o b j e c t i v e s 11 1 5 2c o n t e n t s 1 1 1 5 3t e c h n i c a lr o u t e 1 2 c h a p t e r2m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 13 2 1f i s hc u l t i v a t i o n 1 ：； 2 2e x p e r i m e n t a ld e s i g n 13 2 2 1t h ea c u t ee x p e r i m e n t 1 3 2 2 2t h ec h r o n i ce x p e r i m e n t 1 3 2 3a n a l y s i so ft o t a lm e r c u r yc o n t e n t 1 4 2 4u l t r a s t r u c t u r a la n a l y s i s 1 4 ：! 4 1p r e p a r a t i o no f t h ef i x e dl i q u i d 1 4 2 4 2o r g a n i s mp r e t r e a t m e n ta n du l t r a s t r u c t u r a lo b s e r v a t i o n 15 c o m e n s 2 5p r o t e o m i ca n a l y s i so ff i s ht i s s u e sa f t e ra c u t ee x p o s u e ro fh g c l 2 15 2 5 1p r o t e i ne x t r a c t i o n 15 2 5 2p r o t e i nq u a n t i f i c a t i o n 15 2 5 32 - d ea n a l y s i s 1 6 2 5 4g e ls t a i n i n g 17 2 5 5i m a g ea n a l y s i s 17 2 5 6e n z y m a t i cd i g e s t i o n 18 2 5 7m a s ss p e c t r o m e t r i ci d e n t i f i c a t i o n 18 2 5 8d a t a b a s es e a r c h 18 2 6p r o t e o m i ca n a l y s i so ff i s ht i s s u e sa f t e rc h r o n i ce x p o s u e ro fh g c l 2 19 2 6 1p r o t e i ne x t r a c t i o n 19 2 6 2p r o t e i nq u a n t i f i c a t i o n 19 2 6 32 d d i g ea n a l y s i s 1 9 2 6 4i m a g es c a n n i n ga n d a n a l y s i s 。2 0 2 6 5g e ls t a i n i n g 21 2 6 6s i l v e rs t a i n i n gg e li m a g es c a n n i n ga n da n a l y s i s 2 2 2 6 7e n z y m a t i cd i g e s t i o n 2 2 2 6 8m a s ss p e c t r o m e t r i ci d e n t i f i c a t i o n 2 2 2 6 9d a t a b a s es e a r c h 2 2 2 7r e a g e n t sa n di n s t r u m e n t s 2 3 2 7 1r e a g e n t s 2 3 ：! 7 2i n s t r u m e n t s 2 3 c h a p t e r 3p r o t e o m i c so fm e d a k al i v e ra n db r a i ne x p e r i m e n t a l l y e x p o s e dt oa c u t ei n o r g a n i cm e r c u r y 2 4 3 ir e s u l t s 2 4 3 i 1m e r c u r yc o n c e n t r a t i o ni nf i s ht i s s u e s 2 4 3 1 2p r o t e i ne x p r e s s i o np r o f i l e so f m e d a k al i v e re x p o s e dt oh g c l 2 2 4 3 1 3p r o t e i ne x p r e s s i o np r o f i l e so f m e d a k ab r a i ne x p o s e dt oh g c l 2 2 5 3 1 4p r o t e i ni d e n t i f i c a t i o na n df u n c t i o n a lc l a s s i f i c a t i o no f l i v e r 2 8 c o n t e n t s 3 1 5p r o t e i ni d e n t i f i c a t i o na n df u n c t i o n a lc l a s s i f i c a t i o no f b r a i n 2 8 3 ：! d i s c u s s i o n 2 9 3 3s u m m a r y 3 4 c h a p t e r4p r o t e o m i c so fm e d a k al i v e re x p e r i m e n t a l l ye x p o s e dt o c h r o n i ci n o r g a n i cm e r c u r y ，3 6 4 1r e s u l t s 3 6 4 。1 1m e r c u r yc o n c e n t r a t i o ni nf i s ht i s s u e s 3 6 4 1 2u l t r a s t r u c t u r a la n a l y s i s 3 6 4 i 。3p r o t e i ne x p r e s s i o np r o f i l e so f m e d a k al i v e re x p o s e dt oh g c l 2 3 7 4 1 4p r o t e i ni d e n t i f i c a t i o na n df u n c t i o n a lc l a s s i f i c a t i o no fl i v e r 3 9 4 2d i s c u s s i o n 4 2 4 3 s u m m a r y 4 5 c h a p t e r 5p r o t e o m i c so fm e k a d ab r a i ne x p e r i m e n t a l l ye x p o s e d 、t o c h r o n i ci n o r g a n i cm e r c u r y ，4 7 5 1r e s u l t s 4 7 5 1 1m e r c u r yc o n c e n t r a t i o ni nf i s ht i s s u e s 4 7 5 1 2u l t r a s t r u c t u r a la n a l y s i s 4 7 5 1 3p r o t e i ne x p r e s s i o np r o f i l e so f m e d a k ab r a i ne x p o s e dt oh g c l 2 4 8 5 1 4p r o t e i ni d e n t i f i c a t i o na n df u n c t i o n a lc l a s s i f i c a t i o no fb r a i n 51 5 ：! d i s c u s s i o n 5i 5 3s u m m a r y 5 5 c h a p t e r 6s u m m a r ya n d p r o s p e c t ，5 7 6 1s u m m a r y 5 7 6 2c r e a t i v i t y 。，。5 7 6 3p r o s p e c t 5 8 r e f e r e n c e s 5 9 a p p e n d i xi ：t h ei d e n t i f i c a t i o no ft h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d c o n t e n t s p r o t e i n s 7 6 a p p e n d i x ：p u b l i c a t i o n s 8 8 a c k n o w l e d g e s 8 9 摘要 摘要 汞( h g ) 是一种广泛分布的持久性污染物，在淡水和海洋生态系统中以各 种形式出现。由于汞在环境中无处不在，因此不可避免对环境造成污染和对生物 体产生毒性作用。许多研究都致力于汞在各种水生生物中的毒性，但主要集中在 有机汞( 如甲基汞) 毒性，对无机汞毒性了解较少。 本论文运用蛋白质组学技术研究了无机汞急性和慢性毒性暴露下，海洋青鲜 鱼( m e d a k a ，o r y z i a sm e l a s t i g m a ) 脑和肝脏蛋白质组的差异表达，运用生物质谱 技术对差异表达蛋白进行了鉴定，对其功能进行了分析，并分析了肝脏和脑中总 汞含量及其超微结构变化。主要研究结果如下： 1 无机汞急性和慢性暴露下海洋青鲻鱼肝脏和脑组织中均能累积大量汞。 无机汞急性暴露下，脑中总汞含量高于肝脏；无机汞慢性暴露下，脑中总汞含量 明显低于肝脏。研究表明，脑和肝脏都是无机汞毒性作用重要靶器官； 2 无机汞慢性暴露引起海洋青鲻鱼肝脏和脑超微结构明显变化，导致上述 器官的病理性损伤。经过6 0 天氯化汞慢性暴露后，青蝣鱼肝脏细胞质中粗面内 质网明显肿大，并附着很多肿大呈疱状的囊泡，在1 0 g l 氯化汞暴露组中尤为 明显；脑组织细胞质中线粒体明显肿胀并伴随着嵴消失等形态变化，有髓神经纤 维结构也发生改变：连接神经纤维的郎飞氏结断开导致神经纤维排列结构变得松 散和紊乱。表明无机汞对青鲻鱼会产生肝脏毒性和神经毒性； 3 蛋白质组学研究表明，相对于对照组，氯化汞暴露组有多个蛋白表达量 发生明显变化。这些差异表达蛋白主要参与氧化应激、细胞骨架、蛋白修饰、信 号传导、代谢作用以及其它相关生物学过程( 如免疫反应、离子调节和运输) ， 表明无机汞在生物体内的毒理效应和作用机理复杂且多样。另外，本研究发现的 差异表达蛋白与已有文献中报道的有机汞暴露导致的差异表达蛋白并不相同，表 明无机汞和有机汞的毒理作用机制不同； 本论文首次从蛋白质组学角度研究无机汞对海洋青锵鱼的毒理效应，发现和 鉴定了一批重要功能蛋白，为我们了解无机汞对水生生物毒性的分子机制提供了 科学依据，也为我们提供了用于水环境无机汞监测的潜在的蛋白生物标志物。 摘要 关键词：无机汞；海洋青鲻鱼；毒性效应；蛋白质组学；荧光差异凝胶电泳 a b s t r a c t a b s t r a c t m e r c u r yi saw i d e s p r e a dp e r s i s t e n tp o l l u t a n to c c u r r i n gi nav a r i e t yo ff o r m si n f r e s h w a t e ra n dm a r i n ee c o s y s t e m s s i n c em e r c u r yi su b i q u i t o u si nt h ee n v i r o n m e n t ，i t i sa l m o s ti m p o s s i b l ef o rm o s th u m a n sa n da n i m a l st oa v o i de x p o s u r et om e r c u r y m a n ys t u d i e sh a v eb e e nd e v o t e dt o t h et o x i c i t yo fm e r c u r yi nv a r i o u sa q u a t i c o r g a n i s m s ，h o w e v e r ，m o s t o ft h e ma r ef o c u s e do n o r g a n i cm e r c u r y ( e g m e t h y l m e r c u r y ) t o x i c i t y ，l i t t l ei sk n o w na b o u ti n o r g a n i cm e r c u r yt o x i c i t y t h i ss t u d yi n v e s t i g a t e dt h e p r o t e i np r o f i l e so fm a r i n em e d a k a ( o r y z i a s m e l a s t i g m a ) a c u t e l yo rc h r o n i c l ye x p o s e dt oi n o r g a n i cm e r c u r yu s i n gp r o t e o m i c a p p r o a c h ，i d e n t i f i e dd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n su s i n gm a l d i t o f - t o fm a s s s p e c t r o m e t e r ，t o t a lm e r c u r yc o n t e n ta n dc e l l u l a ru l t r a s t r u c t u r eo ff i s hb r a i na n dl i v e r w e r ea l s oe x a m i n e d t h em a i ni e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 b o t ha c u t ea n dc h r o n i ce x p o s u r eo fi n o r g a n i cm e r c u r ye n h a n c e dt h em e t a l a c c u m u l a t i o ni nl i v e ra n db r a i n ，w i t ha h i g h e rc o n t e n to fm e r c u r yi nt h eb r a i na f t e r a c u t ee x p o s u r eo fi n o r g a n i cm e r c u r ya n dah i g h e rc o n t e n to fm e r c u r yi nt h el i v e ra f t e r c h r o n i ce x p o s u r eo fi n o r g a n i cm e r c u r y ，i n d i c a t i n gt h a tb o t hl i v e ra n db r a i na r et h e m a j o rt a r g e to fi n o r g a n i cm e r c u r yi nt h ef i s h 2 c h r o n i ce x p o s u r eo fi n o r g a n i cm e r c u r yl e dt oa p p a r e n t l yp a t h o l o g e i c a l d a m a g eo ft h el i v e ra n db a r i n a f t e r6 0de x p o s u r e ，aw i d e s p r e a ds w e l l i n gw a s o b s e r v e di nt h er o u g h e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ( e r ) ，w i t ht h e d i l a t i o no re v e n v e s i c u l a t i o no fc i s t e r n a e ，e s p e c i a l l yi nt h em e d a k al i v e re x p o s e dt o10i ，t g lm e r c u r y c h l o r i d e i nt h eb r a i n ，r i d g ed i s a p p e a r a n c ea n ds w e l l i n go ft h em i t o c h o n d r i aw e r ea l s o o b s e r v e d m o r e o v e r ，t h ea r r a n g e m e n to ft h em y e l i n a t e dn e r v et e ri nt h e m e r c u r y - e x p o s e dm e d a k ab r a i nb e c a m el o o s ea n dal a r g en u m b e ro fs e p a r a t e dn o d e s o fr a n v i e rd i r e c t l yi n d u c e dd i s c o n t i n u eo ft h en e r v ef i b e r s t a k e nt o g e t h e r ，t h i ss t u d y d e m o n s t r a t e dt h a tt h ee x p o s u r eo fi n o r g a n i cm e r c u r yr e s u l t e di nt h en e u r o t o x i c i t ya n d h e p a t o t o x i c i t yi nm e d a k a a b s t r a c t 3 p r o t e o m i ca n a l y s i sp r e s e n t e ds i g n i f i c a n tp r o t e o m i cr e s p o n s e si nb o t ht h e l i v e ra n db r a i no fm e r c u r y e x p o s e dm e d a k a t h ei d e n t i f i e dp r o t e i n sw e r ei n v o l v e di n o x i d a t i v es t r e s s ，c y t o s k e l e t o n a la s s e m b l y ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，p r o t e i nm o d i f i c a t i o n ， m e t a b o l i s ma n do t h e rr e l a t e db i o l o g i c a lp r o c e s s ( e g i m m u n er e s p o n s e ，i o nr e g u l a t i o n a n dt r a n s p o r t i n g ) ，h i g h l i g h t i n gt h ef a c tt h a ti n o r g a n i cm e r c u r yt o x i c i t yi nf i s hs e e m s t ob ec o m p l e xa n dd i v e r s e h o w e v e r ，t h ea l t e r e dp r o t e i n si n t h i ss t u d yd i s t i n c t i v e l y d i f f e r e df r o mt h o s ep r o t e i n si nf i s hb r a i n se x p o s e dt oo r g a n i cm e r c u r y ，i n d i c a t i n gt h a t t h et o x i c i t yo fi n o r g a n i cm e r c u r yi sd i f f e r e n tf r o mt h a to fo r g a n i cm e r c u r y t h i ss t u d y ，f o rt h ef i r s tt i m e ，i n v e s t i g a t e dt o x i c i t yo fi n o r g a n i cm e r c u r yt o m e d a k af i s ha tt h ep r o t e o m i cl e v e l ，w h i c hp r o v i d e db a s i ci n f o r m a t i o nt oa i do u r u n d e r s t a n d i n go ft h ep o s s i b l em o l e c u l a rm e c h a n i s m so fi n o r g a n i cm e r c u r yt o x i c i t yi n a q u a t i co r g a n i s m s ，a sw e l la sp o t e n t i a lp r o t e i nb i o m a r k e rc a n d i d a t e sf o ra q u a t i c e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n go f i n o r g a n i cm e r c u r y k e yw o r d s ：i n o r g a n i cm e r c u r y ；m a r i n em e d a k a ；t o x i ce f f e c t s ；p r o t e o m i c s ； t w o - d i m e n s i o n a ld i f f e r e n c eg e le l e c t r o p h o r e s i s v 缩略词表 缩略词表 缩略词英文名称中文名称 2 d - d i g et w od i e m n t i o n a ld i f f e r e n c eg e le l e c t r o p h o r e s i s 荧光差异凝胶双向 2 d e a b a p s a t p b s a c i c h a p s d n a d t t e d t a g s h i p g k e g g t w od i m e n t i o n a le l e c t r o p h o r e s i s a c r y l a m i d e b i ss o l u t i o n a m m o n i u mp e r s u l f a t e a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e b o v i n es e r u ma l b u m i n s c o n f i d e n c ei n t e r v a l 3 - ( 3 一c h o l a m i d o p r o p y l ) d i m e t h y l a m m o n i o p r o p a n e s u l f o n i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d i t h i o t h r e i t o l e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d g l u t a t h i o n e i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t s k y o t oe n c y c l o p e d i ao fg e n e sa n dg e n o m e s m a l d im a t r i xa s s i s t e dl a s e rd e s o r p t