（环境科学专业论文）微生物传感器法快速测定生化需氧量（bod）的方法研究.pdf

s t u d y o nf a s td e t e r m i n a t i o n m e t h o do f b i o c h e m i c a lo x y g e nd e m a n d ( b o d ) b ym i c r o o r g a n i s m s e n s o r a b s t r a c t b i o c h e m i c a lo x y g e nd e m a n di sam o s ti m p o r t a n tq u a l i t yi n d e x ，a n df i v e - d a y d i l u t i o na n di n o c u l a t i o ni su s e di nt h en a t i o n a ls t a n d a r dt e s t i n gm e t h o d ，w h i c h a r en o t t op r o v i d et i m e l ys c i e n t i f i cb a s i sf o rt h ee n v i r o n m e n t a lm a l l a g e m c n ta n dd e c i s i o n ， b e c a u s eo fi t sc o m p l i c a t et i m e c o n s u m i n go p e r a t i o n t h e r e f o r e ，t h ef a s td e t e r m i n a t i o n m e t h o do fb o di sb e c o m i n gt h es h i n i n gt a r g e ti nt h er e s e a r c hf i e l di nt h ed o m e s t i c a n d f o r e i g n c o u n t r i e s m a n yt y p e sf a s t d e t e r m i n a t o ro fm i c r o o r g a n i s ms e n s o ro nb o dh a v eb e e n i n v a n t e dc o n t i n u o u s l yw i t ht h en e a r l yf o d rd e c a d e se n d e a v o ra m o n g t h ed o m e s t i ca n d f o r e i g n s c i e n t i s t s t h e va r ed i f i e r e n tf r o me a c hi n s t r u m e n t s i nm i c m b i a l m e m b r a n e ，m e a s u r i n gt i m e ，c o n s t a n tt e m p e r a t u r ee q u i p m e n t ，c o m p a r i n g r e s u l t s b e t w e e nl a b o r t o f i s ，m e a s u r i n gr a n g ea n dr e s i s t - i n t e r f e r e n c e ，h o w e v e r , i tb a s i c a l l yc a n p r o v i d et h e h e r eo fc h a r a c t e r s ：( 1 ) t h er e s u l t so fb o dc a l lb er e a c h e di ns h o r t t i m e ；( 2 ) t h em e t h o di se a s ya n dw e l lo p e r a t e d ；( 3 ) i ti sc o m p a r a b l ew i t ht h en a t i o n a l s t a n d a r d t e s t i n gm e t h o d ；( 4 ) i t c a nb e a p p l i e dw i d e l y ；( 5 ) i t i se c o n o m i c a la n d f e a s i b l e ；( 6 ) i ti sn e a r t ot h ei n t e m a t i o n a la d v a n c e dt e c h n o l o g y s ow ec a nu n d e r t a k et h e r e s e a r c ho nf a s td e t e r m i n a t i o nm e t h o do f b o d b ym i c r o o r g a n i s m s e n s o r t h i sa r t i c l er e s e a r c ho nf a s td e t e r r n i n a t i o nm e t h o do fb o db ym i c r o o r g a n i s m s e n s o r i ti se s t a b l i s h e di nt h ed o m e s t i cf o rt h ef i s tt i m e t h ea s p e c t so f c o m p a r i n g r e s u l t s m e a s u r i n gr a n g ea n dr e s i s t - i n t e r f e r e n c eh a v eb e e nt e s t e di nt h ep r o c e s so f t h e r e s e a r c ha n de s t a b l i s h m e n t ，w h i c hc a np r o v et h ef a c t st h a tt h e r ei sn on e e dt oa d j u s t t h ew a t e r s a m p l e sp h 4 1 0 w i t hp h o s p h a t eb u 丘j rs o l u t i o n ；t h e r ei sn oi n f i u e n c et ot h e t e s tw i t ht h es u s p e n d i n ga r n o u n tu n d e r2 5 0 m g ，g ；t l l e r ei sl i m i t a t i o no nt h ec o n t e n to f t h eu s u a lm e n t a li o n si nt h ei n t e r f e r i n gs u b s t a n c e s t h ea s p e c t so fm e a s u r e m e n t r a n g e ，a c c u r a c ya n dd e l i c a c yh a v eb e e nt e a s e d i nr e s e a r c ho nt h et e c h n o k g i c a li n d e xo ft h ec o m p a r em e t h o d ，w h i c hh a v eb e e n c o m p a r e d i nt h ef o u rl a b o r a t o f i e si n s i d ea n do u t s i d e 。w i t ht h eu n i f o r ms a m p l e so ft h e c o n t e n t o f b o d 2 5 ，3 r a g l ；1 0 3 m l c lr e s p e c t i v e l y , t h e a n a l y s e sr e s u l t i s t h a t l a b i n s i d e r e l a t i v es t a n d a r de r r o ri s 3 0 ：2 6 r e s p e c t i v e l y , a n d t h a tl a bo u t s i d er e l a t i v e s t a n d a r de r r o ri s3 5 ：2 7 r e s p e c t i v e l y b yc o m p a r i s o ne x p e r i m e n tw i t hb o d5 - d a yd e t e r m i n a t i o nm e t h o d ，i ti s s h o w e dg o o d c o m p a r a h i l i t yb e t w e e nt h et w om e t h o d s k e y w o r d s ：b i o c h e m i c a lo x y g e nd e m a n dm o d ) m i c r o o r g a n i s m s e n s o r s t a n d a r d t e s t i n gm e t h o d 微生物传感器法快速测定生化需氧量的方法研究宣茎叁堂堡主型苎 第一章前言 水是人类与生物赖以生存和发展的重要物质，是世界上唯一不可替代的自然 资源。随着社会的发展，伴随着工农业生产的巨大进步， 生产和生活废物的数 量剧增，其中大部分以液体形式排入水体，水体污染日益严重。由于人类活动导 致的水体的污染，不但影响该地区的工农业生产，危害生态系统的生存和发展， 而且还直接威胁着人类健康甚至生存。 水污染物质的种类繁多，有学者将其分为八大类：( 1 ) 耗氧污染物，( 2 ) 致 病污染物，( 3 ) 合成有机物，( 4 ) 植物营养物，( 5 ) 无机物及矿物质，( 6 ) 沉积 物，( 7 ) 放射性物质，( 8 ) 热污染物。不难看出，水污染物质中除无机盐类等外， 还含有大量的有机物。当水体受到有机物污染后，可能产生的后果是使人、畜和 鱼类等发生中毒，甚或致畸、致突变，繁衍微生物，其中包括致病微生物，从而 传播疾病；增加水中营养物质或发展成“富营养化”，消耗水中溶解氧，使鱼类 窒息、死亡，使水体腐化、浑浊发黑、产生恶臭等。 水体所含的有机物往往是多种组分的极复杂的混合体，难以一一测定其成 分。为此，常常利用与水中有机物量相当的需氧量的测定，来间接表征水中有机 物含量的多少。生化需氧量( b o d ) 即属于这样一个指标。生化需氧量作为表 征水质有机污染的综合指标之一，是指水中有机物在好氧微生物作用下进行好氧 分解所消耗水中溶解氧的量。生化需氧量不仅能相对表示出微生物可分解的有机 物量以及水体的可生化降解的程度，而且还可作为生化处理废水工艺和动力学研 究中的一个参数。 1 9 1 3 年英国争家污水处理委员会首次提出把有机物在5 天1 8 3 x 2 进行生物 氧化所需的溶解氧量作为水质有机污染程度的一个指标以来，陆续报道了各种测 定方法，归纳起来有标准稀释法、活性污泥曝气降解法、微生物电极法、测压法、 高温法、检压式库仑计法、坪台值法、相关估算法等。目前我国颁布的标准测定 方法仍沿用美国1 9 3 6 年公布的方法，为稀释与接种法，此种方法也是国际上约 丝皇塑堡壁矍婆垡垄型塞兰些至垫墨竺查鲨旦壅 一 一堕茎查兰堡主兰堡堡兰一 定俗成的分析方法，它是将水样在2 0 。c 1 培养五天，然后分别测定水样培养 前后的溶解氧，二者之差即为b o d 值，也有的国家为了避免周末化验，采用7 同法。活性污泥曝气降解法是将温度控制为3 0 3 5 。c ，利用活性污泥强制曝气降 解样品，再分别测定降解前后的化学需氧量。二者之差即为b o d ，然后再通过 换算换算成标准的b o d 值。微生物电极法测定b o d ，是根据微生物分解有机物 造成氧电流变化，利用恒定电流与耗氧量之阳j 的定量关系计算出水中b o d 含量。 测压法则是在密闭的培养瓶中，水榉中溶解氧被微生物消耗，微生物呼吸作用产 生与耗氧量相当的c 0 2 ，当c 0 2 被吸收剂吸收后使密闭系统的压力降低，根据压 力降求出水样的b o d 值。后几种测定方法目前已很少采用。 我国是世界上水资源污染较为严重的国家之一，及时反映环境现状，了解流 域水质的变化情况，采取有效的措施予以防范和解决。是我国乃至世界迫切需要 解决的重大问题。作为表征水体有机污染综合指标之一的b o d ，国标测定方法 测定时间长，操作复杂，重复性差，受干扰因素多，且不能及时反映水体的污染 状况，从而也无法进行现场监控，尤其是在出现污染事故时不能为环境管理和决 策及时提供科学依据。因此多年来人们一直在寻求快速测定b o d 的方法。活性 污泥曝气降解法虽缩短了测定时间，但应用有一定的局限性，差压法虽然操作简 便，但不能缩短测定周期。微生物传感器法测定生化需氧量是近1 0 多年来国内 外研究发展的又种测定方法，它具有快速、相对稳定、操作简单、与五日稀释 与接种法的国标测定方法有可比性等特点，它的诞生给b o d 测定带来新的活力， 显示出广阔的应用前景，因而b o d 微生物传感器的研究也成为国内外科技工作 者竞相开发研制的课题。 生物传感器是由生物识别元件和物理换能器组成它能将被测物的浓度与可 测量的物理化学信号关联起来。被测物通过扩散进入生物敏感膜层，经分子识别， 发生生化反应后，所产生的信息被相应的物理换能器转换成与被测物浓度相关的 物理化学信号。根据生物传感器中的分子识别元件的不同可将其分为五类：酶传 2 堂圭塑堡壁堡鲨堡望型塞竺垡堕翌墨塑立鲨堕茎量堕兰兰羔坚兰羔兰垡一 感器、微生物传感器、细胞及细胞器传感器、组织传感器和免疫传感器。自1 9 6 2 年c l a r k 和l y o n s 提出第一个生物传感器至今已有4 0 多年，1 9 6 5 年u p d i k e 和 n i c k s 制出酶电极，1 9 7 6 年v e m i m m e n 提出了用氧电极接种活性污泥测定b o d 的方法，1 9 7 7 年k a r u b e 等将丝孢酵母菌用聚丙酰胺或骨胶固定在多孔纤维素膜 上，再将此微生物膜安装在氧电极的透气膜上构成了第一个快速测定b o d 的微 生物传感器，该传感器可在1 5 分钟左右测定污水的b o d 值，结果与b o d 5 一 致，但由于固定化骨胶原膜被菌酶破坏，仅l o 天传感器便失活；1 9 7 9 年h i k u m a 等改用多孔醋酸纤维素膜固定酵母菌制成的b o d 传感器，使用寿命延长歪1 7 天； 后来s t r a n d 等研制出用活性污泥富集菌的b o d 传感器，用于城市污水测定，成 功工作了2 0 多天。此外，s u z u k i 和k a r o b e 等还在1 9 8 2 年申请了以铂和铅在氢 氧化钾中构成的用于b o d 测定的原电池式生物传感器的专利。在日本，1 9 7 7 年 轻部征夫以伏安式二电极体系的氧电极为基础，在电极上覆盖一层微生物感应 膜，构成b o d 生物传感器。1 9 8 2 年铃木周一和轻部征夫等申请了一项美国专利， 是以大面积圆盘铂电极为工作电极，铅为对极，内充氢氧化钾的原电池b o d 传 感器进入上世纪8 0 年代后生物传感器的研究和开发呈现突飞猛进的发展局面， 由于它具有选择性好、速度快、灵敏度高等优点，因此在临床检验、发酵和食品 工业及环境监测等领域得到了广泛的应用。 虽然在生物传感器发展的最初1 5 年里，主要是以研制酶电极制作的生物传 感器为主，因为酶具有较高的选择性，但是由于酶的价格昂贵并不够稳定，容易 失活，因此以酶作为敏感材料的传感器的应用受到健的限制。1 9 7 7 年r e c h n i t z 等提出了直接使用微生物细胞作为分子识别元件与相应的电极组成生物传感器， 这样便免去了酶的分离和提纯的工艺，从而使微生物传感器的研制进入了新阶 段。微生物传感器克服了酶电极价格昂贵、提取困难及不稳定等弱点，此外，还 可以同时刹用微生物体内的辅酶处理复杂反应，另夕 在合适的培养纂中微生物能 再生，以补充失活的微生物，因而微生物传感器得到了更为广泛的应用。微生物 丝兰塑堡堕墨鲨堡壅型塞竺竺至墨重塑塑笙堕壅 一一堕量茎兰堡主兰垒堡兰一 传感器的选择性一般不高，生化需氧量生物传感器正足利用其这一特点制成a 从b o d 微生物传感器开始研究至今，用于构造生物膜的微生物已有很多种， 如皮状丝孢酵母、梭状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、汉逊氏酵母菌、活性污泥、大 肠埃希氏杆菌、恶臭假单孢菌、丁酸梭菌、克雷自杆菌及嗜热菌等。其选择的原 则是只要微生物在其代谢过程中允许通过电子转移系统传递电子，无论是原核生 物还是真核生物都可用于构造微生物传感器。考虑到灵敏度问题，利用原核生物 会更具有优势，因为真核生物呼吸链的电子转移系统传递电子要经过线粒体而使 传递电子到工作电极困难。但不同的菌对不同的有机物的降解能力不同，因此， 在具体选择时可根据污水的具体情况而定。由于受所固定的微生物对不同的有机 物降解能力不同的限制，与传统的b o d 5 相比，微生物传感器的应用存在着一定 的局限性。这是因为这两种方法不能完全等同，b o d 5 法中，反映的是一个微生 物菌群在5 天的各种代谢活动的综合结果，而微生物传感器则是所固定的一种 ( 或两种) 微生物在较短的时间内( 显 示，结果也可由打印机( 1 2 ) 打印。同时，可根据不同的情况，用键盘( 1 3 ) 进 行设嚣。 图中的蠕动泵( 1 ) 和气泵，提供了恒流迸液和进气，保证测量流量条件的恒 定。恒温控制器( 8 ) 能精确地控制恒温罐( 7 ) 内的温度为0 1 ，确保测量 数据的稳定可靠。恒温罐( 7 ) 内有防止误控超湿过载的断电保护装置，达到保 证被控设备( 诸如气液混合三通、气流u 管、微生物传感器和流通测量池。) 的 安全性。通常，恒温罐内的温度控制在3 1 左右。 1 3 仪器的使用 ( 1 ) 微生物膜的活化；将微生物膜放入0 0 0 5 m o l l 的磷酸盐缓冲使用液中浸 泡2 4 小时，然后将其安装在微生物传感器上。 ( 2 ) 微生物膜的安装：将已活化好的微生物膜用塑料镊子夹住边缘，小心取 出，将微生物膜的圆心位置对准电极金片中心，将菌膜扣碗的凹槽与电 极上凸点对应扣好，并拧紧流通池。 微生物传感器法快速测定生化需氧量的方法研究 南开大学硕士学位论文 ( 3 ) 开机：开启仪器，用磷酸盐缓冲使用液清洗微生物传感器至电位( 或电 流) 稳定。 ( 4 ) 条件设置 ( 4 1 ) 时间、温度和流速的设置：按【i 困键进入该界面，使用键 将光标移到相应位置，使用数字键进行设置。 ( 4 2 ) 输出方式、测量时间、清洗时间更改标准设置的设定：按i 到 圆键进入该界面，使用键将光标移到相应位置，按l j j 璐更改。 ( 4 2 1 ) 输出方式设置：可选电流型( m ) 或电压型( m v ) ，使用 键将光标移至当前位置，按圆键更改。 ( 4 2 2 ) 采样时间设置：使用键移动光标至当前位置，用数字键 设置测量时间，测定时问设置一般为8 分钟，超过8 分钟不影响测 量结果，但需相应增加清洗时间。 ( 4 2 3 ) 清洗时间设置：使用键移动光标至当前位置，用数字键 设置。当水样b o d 浓度大于2 5 m # l 时，应清洗2 0 分钟以上；当东 样b o d 浓度小于1 0 m g j l 时，可设定清洗时间为l o 分钟。 ( 4 2 4 ) 更改标准：在“更改标准”后显示n o 的状态下，可按凼 i 雅任意修改所做标准数据。如需要更改全部标准数据，则使用 键，移动光标至n o 处，按l i 互辩转换为y e s ，再次按下l j j 碉更 改全部标准数据。( 注：进行该操作将清除存储的标准及样品数据! ) ( 5 ) 标准的设定及测量 按稠键进入该界面，使用数字键输入所需b o d 标准溶液值，将取液管置 于确定的标准溶液中，按i i 碑进入测量工作状态，并进入下一界面。标准样品 序列号“n o x x ”，由仪器自动排序( 最多5 个) 非复位状态下不用更改。测 量完成后，仪器中的蜂鸣器将自动提示测量结束，所测数据自动存入标准数据中， 微生物传感器法快速测定生化 ；| 氧量的方法研究重要奎兰型主堂篁堡塞 可按匡i 百辩在标准数据菜单中查看。此时，将取液管从标准溶液中取出，用洗瓶 ( 蒸馏水) 简单冲洗后，连接到缓冲溶液桶盖的连接件上，按4 壹! 童腱将仪器洗至 稳定后进行下一步骤： 按际列键继续设定标准。 按i 本谁进行样品测量。 ( 6 ) 样品测量 ( 6 1 ) 按障品睫进入该菜单 样品稀释倍数可使用数字键输入( 职能为整数倍，最高为9 9 倍) 未经稀释，稀 释倍数为1 样品序号自动递进。 ( 6 2 ) 将进液管置于待测样品中，按目i ! 碑进入测量状态，并进入下一界面。 测量完成后。仪器中的蜂鸣器将自动提示测量结束，仪器将自动进入显示结果界 面，所测数据自动存入标准数据中，可在样品数据菜单中查看。 ( 7 ) 清洗状态：当测量标准溶液或待测水样后，按睛i 先| 键进入一下界面，清洗 达到设定时间后，仪器峰鸣器鸣响予以提示。 ( 8 ) 打印：当测量结束或需要打印数据时，按| _ 丁印睫进入以下菜单，按键将 光标移至样品序号位置，用数字键选择打印样品的序号，按隅认缝开始打印。 ( 9 ) 复位：当显示出现误码时，使用恒位睫，可使仪器恢复正常状态，同时标 准数据与样品数据仍保存于仪器中。建议用户在使用“复位”功能后，及时打印 原有数据已备查看。 ( 1 0 ) 关机：条件允许勿需关机，如果关机，再次开机后，需重新进行时间设置。 2 实验用试帮药品 实验所用试剂均为分析纯试剂，溶剂为蒸馏水，蒸馏水使用前应煮沸2 5 m i n ，放至室温后使用。 2 1 磷酸盐缓冲溶液：0 ，5 m o l l 垡圭望堡壁堡鲨堡垄! ! 塞圭堡至塑蔓堕查鎏堑茎 一壹茎查兰塑圭兰堡兰茎一 将6 8 9 磷酸二氢钾( j ( h 。p q ，和磷酸氢二钠( n a 。h p n 7 h 。o ) 溶于蒸馏 水中，稀释至1 0 0 0 m l ，备用，此溶液的p h 约为7 。 2 2 磷酸盐缓冲使用液( 清洗液) ：0 0 0 5m o l l 。 2 3 盐酸( h c l ) 溶液：0 5m o l l 。 2 4 氢氧化钠( n a o h ) 溶液：2 0 9 l 。 2 5 亚硫酸钠( n a 。s o 。) 溶液：1 5 7 4 5 9 l ，此溶液不稳定，临用前现配。 2 6 葡萄糖一谷氨酸标准溶液 称取在1 0 3 。c 下干燥l h 并冷至室温的无水葡萄糖( c 。h 。o d 和谷氨酸 ( h o o c c h ：c h ：乇h n h ：c o o h ) 各1 7 0 5 9 ，溶于2 2 中磷酸盐缓冲溶液的 使用液中，并用此溶液稀释至1 0 0 0m l ，混合均匀即得2 5 0 0 m g l 的b o d 标准 溶液。 2 7 葡萄糖谷氨酸标准使用溶液( 临用前配制) 取2 6 中标准溶液1 0 o o m l 置于2 5 0m l 容量瓶中，用0 0 0 5m o l l 磷酸 盐缓冲使用液定容至标线，摇匀此溶液浓度为l o o m g l 3 样品的贮存 在水和废水监测分析方法中对b o d 样品保存冷冻可保存一个月的提法值 得商榷，在水和废水监铡分析方法指南上册中对b o d 水样保存提出了“即测 定值将随水样贮存时间而降低。g e l l e r 分别探讨了4 c 、一2 2 c ，酸化至p h l 5 和酸化并在- 2 2 ( 2 四种条件下保存，发现没有一种措施会令人满意的。因此，总 的原则是贮存时间应尽可能短。”样品贮存时间尽可能短到什么程度是令我们关 注的。美国水和废水标准检验方法第1 5 版、第1 9 版规定了对采集的样品 2 h 之内进行分析的样品无需冷藏，采集样品2 h 后，分析样品保存在4 以下， 冷却降温至接近冰点以减少误差。当不能在6 h 内分析时，实验记录应注明保存 时间及湿度并一并报出。对贮存超过2 4 h 的样品不能分析。配制标准样品的分析 结果一定要在6 h 内完成。由中国环境监测总站负责起草的地表水和污水监测 微生物传感器法快速测定生化需氧量的方法研究 南开大学硕士学位论文 技术规范中规定b o d 样品的保存条件为o - - 4o c 觥：，保存时间为1 2 h 。根据目 前的实验条件，该标准规定，无论在任何条件下样品的贮存绝不能超过2 4 h 。 我们通过实验对上述结论进行了验证，将食品、造纸、洗涤剂、污水处理厂、 油墨等处理后的废水在o6 c 4 冷藏1 2 h 后测定。测定结果b o d 浓度降低了 2 0 4 0 。用未经煮沸的蒸馏水配制的1 0 m g l 、2 0 m g l 的标准溶液在常温存放 6 h 后b o d 含量减少2 0 左右。用煮沸过的蒸馏水配制的以上标准溶液常温存放 6 h 后b 0 9 含量减少1 0 左右。因此，样品的贮存是在分析中易被忽视和客观上难 以解决的问题，必须引起注意，应用快速测定方法来解决这一问题也正是我们的 初衷。 微生物传感罂法快速测定生化需氡量的方法研究 南开大学硕士学位论文 第三章仪器使用条件的选择 1 缓冲溶液的选择 测量中p h 值的不同将导致微生物膜传感器的响应性能不同，当改变测量中 的p h 值时，得到了五种不同微生物电极的响应性能。试验结果如图ll 所示。 可以看出使用不同微生物膜测定水样的b o d ，均是在p h 值7 左右时响应最佳， 与文献报道一致，因此，我们选择混合磷酸盐溶液作为缓冲溶液。混合磷酸盐溶 液既能在一定范围内缓冲调节溶液的p h 值以符合样品测定的要求，同时也可以 对2 些高浓度的重金属离子进行沉降。而且通过用混合磷酸盐缓冲溶液对p h 值 在4 1 0 的水样进行缓冲调节，表明水样p h 值在4 1 0 之间可以不用进行酸或 碱中和处理即能满足实验条件的要求。 1 0 0 f 一 垫 毒 兰 器 = - 奇毒 邈 墨 6 0 4 0 2 管路气、液比的调整 图1 1 p h 值对电极响应的影响 p h 微生物传感器法快速测定生化需氧量的方法研究 南开人学硕十学位论文 对于流通式仪器进样管路中的气液比是经过实验得出的经验数据，可事先调 整好，也可以在分析测试时根据实际情况进行诵整。但无论如何调整，均应保证 流通池里的样品有充足的氧，且在整个测定过程中进样总量应大于l o m ，以保 证被测样品具有较好的代表性，并保证实验所需的条件具有稳定性。对于间断式 仪器不存在气液比的调整，但本底液与分析样品的加入量应调整好，以保证每个 分析样品的加入量每次不少于1 0m l 。 3 恒温控制装置的要求 温度对电极电位有较大的影响，因此为确保测量环境和测量液的最佳温 度，减少由于温度变化的差异而引起的测量误差，b o d 快速测定仪均具有恒温控 制装置。恒温控制装置温度的控制范围应有利于使微生物产生晟大活性，使其呼 吸强度最大，并获得最大的稳定的电流强度。因此根据菌种及实验条件制作的恒 温控制装置，温度控铡精度范霭应尽量小，小于0 2 4 c 。b o d 测定温度一般控 制在3 3 左右。 4 样品测定时间 样品的测定过程包括测定和清洗两个部分，样品测定的时间是一定的，但样 品测定周期与样品中b o d 浓度成正比，也就是说b o d 浓度越高，虽然测定时间一 定，但清洗的时间就要延长，也就是电极电位达到平衡的时闻就要相对延长。 因此为了缩短测定周期，要求进样的样品b o d 含量应小于5 0 m g l ( 2 5m g l 左右 为宜) ，以保证测定周期在2 0 m i n 左右完成。如果b o d 浓度低，测定周期会相应 缩短。这样也和我们工作曲线的线性范围o 5 0 m g l 相吻合的。 5 干扰物实验： 5 1 金属元素的影响 很多重会属元素对微生物的新陈代谢有抑制作用，因此干扰物实验选择了常 见的金属离子，实验结果表明对含有c o ”：l o m g l 以下：m n ”：l o m g l 以下：z n ”： 1 0m g l 以下：f e ”：l o m g l 以下；c u ”：5 m g l 以下；h g “：4m g l ；p b ”：l o m g l 微生物传感器法快速测定生化需氧置的方法研究童互查兰堡主兰垡堡兰 以下；c d ”：l o m g l ；c r ”l m g l ；c n 0 0 5m g l 以下的水样进行b o d 测定时，对 测定结果不会产生明显干扰。但是为了保证测试的可靠性，在本标准方法中我们 把干扰离子的含量定为：c o ”5 m g l 、m n ”5 m g l 、z n ”4 m g l 、f e ”5 m g l 、c u ”2 m g l 、 h g ”2 m g l 、p b “5 m g l 、c d ”5 m g l ；c r ”0 5 m g l ；c n 一0 0 5m g l 以下，确保对本方 法测定结果基本上不受上述离子的干扰。 表5 1 1 微生物传感器快速测定法分析样品金属元素含量的限值 5 2 游离氯的干扰 经过对游离氯的干扰的实验发现分析样品中含有0 5 m g l 以下的游离氯对 测试结果不会产生明显的干扰，而且低浓度的游离氯还能对管路、流通池、菌膜 表面附着的微生物起到清洗作用。对含有高浓度的游离氯的样品可加入 1 5 7 5 m g l 的亚硫酸钠溶液使高浓度的游离氯或结合氯失效，但应避免加过量， 否则会对分析结果产生负干扰。 5 3 悬浮物的干扰 被测水样中的悬浮物对b o d 测定的干扰是令人关注的问题。为此我们做了如 下实验； 悬浮物标准物质的选取：由于六次甲基四胺在测定b o d 时会产生干扰。因此我 们选取了硅藻土作为悬浮物标准物质。 用硅藻土配制成含悬浮物5 0 m g l 、1 0 2 m g l 、2 8 0 m g l 的溶液进行实验，结 果见表5 3 1 、5 3 2 、5 3 3 。 1 8 堂生塑笪壁墨垩堡蔓塑塞兰垡壹塾量塑立塑壅塑墅奎兰堑圭堂篁堡苎 表5 。3 18 0 d 溶液为5 g l 时含不同悬浮物量的测定结果 b o d 溶液浓度m g l悬浮物含量 b o d 测定结果相对误差( ) ( m g l )( m g l ) 55 05 36 0 55 05 0o 51 0 25 00 51 0 25 24 o 52 8 05 2 4 o 52 8 04 ，92 0 表5 ，3 2b o d 溶液为2 5 m g l 对含不同悬浮物量的潞定结果 b o d 溶液浓度m g l悬浮物含量b o d 测定结果相对误差( ) ( m g l )( m g l ) 2 55 0 2 6 o4 0 2 55 02 5 5 2 0 2 51 0 2 2 5 ，72 8 2 51 0 2 2 4 61 6 2 52 8 02 6 5 6 0 2 52 8 0 2 4 42 4 表5 3 3b o d 溶液为5 0 m g l 时含不同悬浮物量的测定结果 b o d 溶液浓度m g l悬浮物含量b o d 测定结果相对误差( ) ( m g l ) ( m g l ) 5 05 0 4 9 02 o 5 05 0 5 0 91 8 5 01 0 2 5 1 53 0 5 01 0 2 5 0 2 o 4 5 02 8 05 0 ，8 1 e f 5 02 8 0 5 1 63 2 微生物传感器法快速测定生化稀氧量的方法研究 南开大学硕士学位论文 从以上表中可以看出浓度为5 m g l 、2 5 m g l 、5 0 m g l 的b o d 标准溶液中，悬 浮物含量从5 0m g l 一2 8 0m g l ，对b o d 的测定结果的相对误差分别在一2 0 6 o 、一2 4 6 o 、一2 o 3 2 之间，表明悬浮物对b o d 的测定基本上不产生 干扰。 因此在本标准方法中确定：含有悬浮物2 5 0 m g l 以下的b o d 样品，对b o d 测定结果基本上没有影响。 堡竺塑堡壁堡鲨堡垄塑塞竺堡里墨墨塑查笙堑茎 童堑查兰坚圭兰堡笙苎 第四章主要技术指标的确定 i 测定限： 测定限是定量范围的两端，分别为测定上限和测定下限。以下分别对方法的 测定上限和测定下限进行研究确定。 i i 测定上限： 方法的测定上限是指在限定误差能满足预订要求的前提下用特定方法能够 准确地定量测量物质的最大浓度或量。 吏用本法测定未知高浓度b o d 值豹样品， 存在着该测量值不在线性范围( 线性范围2 - - 5 0 m g l ) 内，而使其准确性受到质 疑，并且造成测定周期长( 清洗时间随浓度增高而延长) ，但是通过对高浓度b o d 值的样品进行适当的稀释后再进行测定能够得到满意的结果( 最好根据样品的 c o d 值推算出估计的b o d 值，并将样品稀释至b o d 浓度在2 0 一3 0 ( m g l ) 左 右进行测量) 。由于在实际测试中，样品无论浓度大小均要在一定程度上被缓冲 使用液稀释，因此测量结果均是样品经过人为稀释后得到的。显然，规定测定上 限是很困难的。也是不客观的。因此，在本方法研究中未规定方法的测定上限。 1 2 方法测定下限： 测定下限是指在测定误差能满足预定要求的前提下，用特定方法能准确地定 量待测物质的最小浓度或量。由于本方法被测样品中均应含有0 0 0 5 m o l l 的缓 冲溶液，即使待测样品b o d 值很低，也同样在测定中被缓冲液稀释，因此与方 法测定上限相类似，规定标准方法中测定下限也是不恰当的，因此，本方法研究 中未对方法测定下限进行确定。 2 方法适用范围的确定： 为了确定本方法的适用范围，我们选择了她表水、食品、造纸、污水处理厂 油墨、农药等不同行业、不同种类的水样进行了实验。结果表明，对地表水、生 活污水和不含对微生物菌种有明显毒害作用的工业废水有很好的适用性，结果与 国标方法具有良好的一致性。而对含有高浓度杀菌剂、农药类等的废水b o d 测定 微生物传感器法快速测定生化需氧量的方法研究 南开大学硕士学位论文 结果明显偏低，因为杀菌剂、高浓度游离氯或结合氯、农药类、氰化物等对微生 物膜中的菌种易造成伤害，使其活性降低甚至死亡。因此，本方法不适宜测定上 述几种含对微生物菌种具有一定毒害作用的废水的b o d 的测定。 3 方法的精密度和准确度 由四个实验室对b o d 含量为2 5 3 m g l 、1 0 3m g l 的统一样品分别进行测定， 平行测定6 次，实验结果见表3 1 。 堂皇塑堡壁登鲨堡婆型塞兰兰茎墨里塑銮鲨堕壅 空墅盔兰堡主兰壁堕塞 表3 1 统一样品测定结果 相对标相对 样品实验室测定 测定值平均值标准 准偏差误差 浓度编号次数 ( m g l )( m g l ) 偏差 ( )( ) l2 3 7 22 4 6 32 5 0 l2 5 4 1 24 60 4 42 6 2 52 6 o 62 6 8 l2 4 9 22 5 7 32 6 1 22 6 0o 72 62 8 42 6 2 52 6 5 2 5 362 6 8 m g l 12 4 3 22 4 7 32 4 7 32 4 80 31 42 0 42 4 6 52 5 0 62 5 3 12 4 7 22 4 9 32 4 9 42 5 1o 52 o一0 8 42 4 6 52 5 9 62 5 5 壁皇塑堡壁堂生堡婆塑塞竺些曼墨墨盟查堡竺壅堕墅茎兰竺坠蔓兰些堕墨一 样品实验室 测定溅定值平均值 禄睦褐对标相对 浓度编号次数m g l m g l 偏差准偏差误差 11 0 4 一 2l o ，1 _ 31 0 4 1 l o 70 44 03 9 41 0 9 。_ _ 51 1 2 61 1 0 11 0 2 21 0 6 310 6 21 0 60 22 12 9 4 1 0 7 51 0 8 1 0 3610 8 _ _ _ m g l 11 0 3 21 0 3 31 0 5 31 0 40 21 51 0 41 0 。6 5l o 5 6l o 2 ll o 。3 21 0 1 31 0 4 41 0 40 21 61 0 41 0 6 510 4 61o 3 由上述实验结果可以看出本方法具有良好的精密度和准确度，统计结果见表 3 2 ： 微生物传感嚣法快速铡定生化需氧量的方法研究南开大学硕士学位论文 表3 2 方法的精密度和准确度 精密度 准确度 统一样品值重现性相对标准再现性相对标准 相对误差 偏差偏差 i 2 5 3 m g l 3 o3 5 o 1 1 0 3m g l2 62 7 2 2 堂竺塑堡壁塑鲨堡望型塞生些苎璺星箜查鎏堕壅 塑茎查兰堡兰兰堡堡兰一 第五章结果的对照与比较 1 与五日稀释与接种法的对照实验 由于国际通用的b o d 测定方法为稀释与接种法，因此有必要将本方法与其进 行一定的比较，我们选择了四个实验室分别对五种不同种类的水样进行了方法的 对比实验，结果见表5 1 。 表5 1 方法对照实验测定结果 仪器法测定结果五日法测定结果 样品种类实验室编号相对误差 m g lm g l 11 1 41 1 7- 2 6 21 0 91 1 22 7 造纸厂 31 1 41 0 85 6 41 1 4l0 76 5 l4 4 33 8 51 5 1 24 3 74 2 62 6 地表水 34 。3 84 0 67 9 44 3 93 9 31 1 7 11 1 91 2 4- 4 0 21 1 41 1 6 - 1 7 污水处理厂 31 2 01 2 4 3 2 41 1 11 1 4 - 2 6 17 136539 2 27 4 s7 18 3 8 食品厂 37 8 47 2 7 7 8 47 7 56 6 3 1 6 9 l2 3 82 0 615 5 21 9 51 9 0 2 6 油墨厂 32 0 42 0 3 0 5 42 1 62 0 2 6 9 微生物传感器法快速捌定生化需氧量的方法研究 南开人学硕士学位论文 由上述实验可以看出仪器法与五只法之间具有良好的一致性，相对误差绝对 值在0 5 、1 69 之间。 2 与国外现行同类相关标准的比较 我们研究制定的标准方法“水质生化需氧量( b o b ) 的测定微生物传感器 快速测定法”在国内为首次制定，国辨也无微生物传感器b o d 快速测定的标准方 法。日本曾在1 9 9 0 年制定了日本工业标准j i sk3 6 0 2 1 9 9 0 微生物电极测定 生化需氧量( b o d ，) 的测定仪，但此标准是针对b o d 快速测定仪制定的，在本 标准的编制过程中参照了闩本仪器标准。并做了如下比较： 2 1 方法的适用范围 日本的工业标准中利用微生物电极快速测定水中b o d 的方法适用范围为工 业废水和生活污水。对含低浓度b o d 的水群不能准确测定，且不适于对地表水中 b o d 的测定。 本标准方法的适用范围为地表水、生活污水和工业废水。对水中含2 m g l 的b o d 值也可以较准确的测定。 2 z 方法的检测范围 本标准方法与f i 本工业标准中均未对方法的测定上限和测定下限做出规定。 这主要是因为方法本身的限制，因而无法确定其方法的测定上、下限。为此我们 给出了b o d 线性测量范围为2 - f i o m g l 。 2 3 测量时间 日本工业标准中对b o d 的测量时间( 单个样品 在3 0 分钟以上，本标准方 法对b o b 的测量时间( 单个样品) 可控制在2 0 分钟左右。 2 4 工作曲线 同本工业标准中给出了两种( 方式l 和方式2 ) 方式计算b o d 工作曲线。由 于微生物膜中微生物是动态的，微生物存在从生长到死亡的过程中，虽然在短时 阍内其呼吸强度相对稳定，但变化是绝对的。在比较稳定的环境下( 室内温度、 微生物传感器法快速测定生化需氧置的方法研究 南开大学硕士学位论文 气压等) 一条工作曲线使用期也较短。并且日本标准方法中的曲线制作需要较长 时间，方式l 需要1 5 3 小时，方式2 需要3 6 小时。 本标准方法绘制的b o d 工作曲线既可由仪器本身进行数据处理给出结果，也 可通过人工计算得出。在本论文中列举出了凡条工作曲线测定的结果。( 见表 2 4 1 ) 表2 4 1 工作曲线的测定值 标准溶液浓度测定值( m g l )线性回归结果 ( m g l )第组第二组第三组第一组 ooo0r = o 9 9 9 3b = 1 0 2 4 6 54 9 34 9 44 8 98 = 一0 3 8 5 5 15 1 4 9 15 7 1 4 9第二组 3 02 9 ，12 9 32 9 4 r = o 9 9 9 4b = 1 0 1 9 6 5 05 1 、65 1 45 1 2 a = 一0 1 2 4 7 第三组 r = o 9 9 9 7b ：1 0 1 9 5 a = 一o 3 1 1 7 由测定结果可以看出，b o d 浓度在o 5 0 m g l 之间线性回归结果是令人满意 的，相关系数均能达到o 9 9