（遗传学专业论文）真核生物多顺反子mrna翻译起始研究.pdf

硕士学位论文 中文摘要 摘要 真核生物与原核生物一个很重要的区别就在于真核生物m r n a 是 单顺反子结构，而原核生物m r n a 是多顺反子结构。自从k o z a k 等提 出了扫描机制模型后，这种起始方式就成为了真核生物m r n a 翻译过 程中最重要的机制之一。是否存在其他翻译的起始方式，真核生物中 是否存在多顺反子m r n a ，这些问题对于更清楚的了解真核生物的翻 译过程以及目前对于真核生物中基因的认识和研究都有着十分重要 的作用。为了对真核生物m r n a 的翻译起始方式进行更全面的探讨， 我们以g f p 基因的开放阅读框为基础，利用p c r 的方法对其进行改造， 得到一系列处于不同阅读顺序和相同阅读顺序下的多顺反子结构，进 而构建得到了一系列重组表达载体。将这些重组表达载体转染人肝癌 b e l - 7 4 0 2 细胞后，通过荧光显微镜观察、w e s t e r nb o l t 、流式细胞 仪检测等多种方式，证明了在不同阅读顺序下，间隔很近的两个起始 密码子都可以起始相应阅读框的翻译，而在同一阅读顺序下，多个间 隔较远的起始密码子中只有第一个密码子能够起始相应阅读框的翻 译。从而表明真核细胞中多顺反子m r n a 在一定条件下可以同时翻译， 其翻译的起始方式可能有别于经典的扫描机制模型。并提出了在真核 生物m r n a 翻译过程中，一部分起始前复合物能够通过第一个起始密 码子，继续向3 端扫描并识别下游的a u g 密码子，但a u g 密码子对 起始前复合物具有一定的促降解作用，起始前复合物在越过a u g 密码 子后的扫描是一个逐步降解过程的假设，为今后更全面的研究真核生 物翻译起始机制提供了参考。 关键词翻译起始，扫描机制模型，多顺反子m r n a ，g f p 硕士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t e u k a r y o t i cm o n o c i s t r o nm r n aa n dp r o k a r y o t i cb i c i s t r o n i cm r n a i sa l l i m p o r t a n td i f f e r e n c eb e t w e e ne u k a r y o t ea n dp r o k a r y o t e t h e s c a n n i n gm o d e lp r o p o s e db yk o z a ke ta lh a sa l w a y sb e e nt h o u g h tt ob e t h em o s ti m p o r t a n tm e c h a n i s mi nt h et r a n s l a t i o np r o c e s so fe u k a r y o t i c m r n a a n i m p o r t a n tp r o b l e mw h i c hp l a yar o l ei nt r a n s l a t i o n m e c h a n i s mo fe u k a r y o t ea n dt h ec o g n i t i o na n dr e s e a r c ho fe u k a r y o t i c g e n ei sw h e t h e re x i s to t h e ri n i t i a t i o nm e c h a n i s ma n dw h e t h e re x i s tt h e b i c i s t r o n i cm r n ai ne u k a r y o t e i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h et r a n s l a t i o n i n i t i a t i o nm e c h a n i s m ，w eu s e dp c rt og e n e r a t eas e r i e so fb i c i s t r o n i c s e q u e n c e sb a s e do ng f po r f , a n dt h e nw ec o n s t r u c t e das e r i e so f r e c o m b i n a t i o nv e c t o r sa n dt r a n s f e r r e di n t oh e p a t o m ac a r c i n o m ac e l l s b e l - 7 4 0 2 e x p r e s s i o no ft h e b i c i s t r o n i cm r n a sw e r ed e t e c t e db y f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，f l o wc y t o m e t r ya n dw e s t e r nb l o t t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h er e a d i n gf r a m e sw h i c hi nd i f f e r e n tr e a d i n go r d e ra n d i n i t i a t e db yt w oa u gc o d o n ss e p a r a t e dc l o s e l yc o u l dc o e x p r e s si nc e l l s a n dt h ef r a m e sw h i c hi nt h es a m eo r d e ra n dt h ea u gc o d o n ss e p a r a t e d f a re x p r e s s e dt h eo p e nr e a d i n gf r a m eo n l y t h e s er e s u l t sw e r ed i f f e r e n t f o r ms c a n n i n gm o d e la n dw ep r o p o s ea h y p o t h e s i st h a t a p a r t o f p r e i n i t i a t i o nc o m p l e x e sc o u l dp a s st h ea u gc o d o na n di n i t i a tt h e d o w n s t r e a ma u g c o d o n ，b u tt h ep r e i n i t i a t i o nc o m p l e x e sw i l ld e g r a d a t e 硕士学位论文 a b s t r a c t g r a d u a l l yi n t h i sp r o c e s sb e c a u s et h ea u gc o d o nm a yh a s t e nt h e d e g r a d a t i o no fp r e i n i t i a t i o nc o m p l e x t h o s er e s u l t sm a y b ep l a y a n i m p o r t a n tr o l e i nf u r t h e rc o g n i t i o no ft h ee u k a r y o t eg e n et r a n s l a t i o n m e c h a n i s m k e yw o r d st r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n ，s c a n n i n gm e c h a n i s mm o d e l ， b i c i s t r o n i cm r n a ，g f p h i 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：日期： 年月一日 学位论文版权使用授权书 本人了解冲南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：导师签名日期： 年一月一日 硕士学位论文 - 厶- - 一 刖看 蛋白质的翻译是指核糖体将m r n a 中遗传密码子所携带的信息转换成为蛋 白质氨基酸序列的过程。在原核生物中一条m r n a 般编码功能相关的几种蛋 白质，而在真核生物中，一个m r n a 分子往往只带有一种蛋白质的编码信息， 蛋白质的翻译从起始密码子开始直到终止密码子，这段序列即为编码区。如果这 一段密码子序列编码一条有功能活性的多肽链，这一段密码子就称为一个开放阅 读框( o p e nr e a d i n gf l a m e ，o r f ) 。o r f 之外的核苷酸序列实际上并不组成密码 子，称为非翻译区( u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，u t r ) 。在原核生物和真核生物蛋白质 翻译的所有步骤里，翻译的起始是其中一个根本的不同之处。这不仅是因为原核 生物和真核生物中r r n a m r n a 之间的相互作用机制不同，同时也表现在其他 些方面，如在真菌中仅需三种起始因子蛋白质( 聚合体的大小约为1 2 5 k d a ) ， 而在哺乳动物细胞中至少需要2 8 种不同的多肽( 聚合体大小大于1 6 0 0 k d a ) ， 这表明真核生物蛋白质的翻译机制要复杂的多f 1 】。 核糖体是肽链合成的场所，也是翻译起始的重要元件之一。核糖体是由 r r n a 与蛋白质组成的复合物，分大小两个亚基。当核糖体大小亚基缔合时，其 间形成腔，像隧道一样贯穿整个核糖体，是翻译过程中m r n a 结合t r n a 的空 穴，分别称为受位( 又称a 位) 和给位( 又称p 位) 。a 位是氨酰t r n a 进入核 糖体后占据的位置，p 位是肽酰t r n a 占据的位置。由于核糖体与t r n a 结合是 非特异的，所以核糖体能结合各种氨基酰t r n a 。 核糖体在蛋白质生物合成中具有以下作用： 1 )有容纳m r n a 的通道； 2 )能够结合起始因子，延长因子及终止因子等多种参与蛋白质生物合成 的因子； 3 1具有结合氨酰一t r n a 的部位( a 位和p 位) ； 4 )具有转肽酶活性，催化肽键形成； 5 )大亚基上具有延长因子依赖的g t p 酶活性，它可能为转肽提供能量。 t r n a 既能识别m r n a 分子上的遗传密码，又能与相应的氨基酸结合，按 m r n a 序列的指示，将氨基酸逐个携带进入核糖体，以合成多肽链。因此，在 蛋白质生物合成过程中t r n a 起接合器的作用。在每个t r n a 的反密码环上有1 个特异的反密码子，通过反密码子与m r n a 上相应密码子的特异性识别，t r n a 携带着各自的氨基酸进入m r n a 一核糖体复合物，准确地在m r n a 分子上“对号 入座，按照m r n a 分子中遗传密码子的顺序合成多肽链。t r n a 携带氨基酸， 硕士学位论文前言 实际上是一种酶促化合反应，生成的产物是氨基酰t r n a ，催化这一反应的酶是 氨基酰t r n a 合成酶。m r n a 的密码子与t r n a 的反密码子通过碱基互补原则配 对识别。 上世纪六十年代，当遗传密码子刚被破译时，原核生物和真核生物的蛋白质 翻译过程一度被认为是相似的，因为两个系统都利用a u g 作为起始密码子，并 且都利用m e t t r n a 作为起始因子。而到了七十年代中期，通过对r r n a s 末端 的测序研究表明，虽然原核生物的1 6 sr r n a 和真核生物的1 8 sr r n a 在3 端都 非常相似，但原核生物1 6 sr r n a 中作为r r n a m r n a 相互作用核心的c c u c c 基序，在所有真核生物1 8 sr r n a 中都被精确的删除了。此外，研究人员还发现 了七种不同的真核生物起始因子( e 礤s ) ，这初步的表明了真核生物翻译起始与 原核生物是有很大区别的 2 1 。1 9 7 6 年，研究人员通过对核酸酶处理的家兔网状细 胞胞溶产物的分析研究了外源性m r n a 的翻译后发现，在一般情况下，不管外 源m r n a 是来源于酵母、昆虫、植物或者哺乳动物细胞，真核生物细胞都会精 确和高效的翻译所有的真核m r n a ，这一研究结果表明所有的真核生物都拥有 着相同的起始机n t 3 1 。进一步的研究发现，真核生物m r n a s5 端的帽结构在翻 译的起始阶段具有重要的作用。因为不管是m g p p p 帽结构还是g p p p 末端的 m r n a s 都能够在体外被合成，而通过对两种结构的m r n a 的翻译结果进行分析发 现，两者都编码了相同的蛋白质，但前者的翻译效率比后者高出很多，这说明 m r n a 的5 端是在特定的阶段里参与翻译过程的 4 1 。之后的实验表明，当个大 约6 0 n t 的r n a 被环化以后，真核生物核糖体就不能够结合到r n a 上或者不能 起始翻译【5 】，这进一步证实了5 端在翻译过程中的作用。这些研究结果证明了核 糖体是从5 端开始进行蛋白质翻译过程的。 1 9 8 1 年k o z a k 等提出了真核生物蛋白质翻译的扫描机制模型，根据这个模 型真核生物蛋白质在翻译之前，4 0 s 核糖体小亚基在m r n a 的5 端帽结构区与 一些起始因子包括e i f 2 g t p m e t t r n a 等组成4 3 s 的起始前复合物，此复合物 的形成分为二步：首先g t p 和e i f 一2 结合，以增加此因子与m e t t r n a 结合的效 率，然后再与4 0 s 核糖体小亚基结合。形成的复合体沿m r n a 的5 端向3 端线 形的扫描非翻译区，直到m e t t r n a 上的反义密码子以碱基互补配对原则识别了 第一个a u g 三联密码子后，将其作为起始密码子并停止扫描，g t p 水解释放出 e i f 2 一g d p ，最后与6 0 s 核糖体大亚基装配成8 0 s 的核糖体并释放其他的起始因 子，从而完成翻译的起始过程开始蛋白质的合成 6 - 8 1 。 除了扫描机制模型，另一种猜测是4 0 s 核糖体亚基在一些m r n a 中可以直 接结合至a u g 起始密码子处起始翻译。虽然这种说明并没有直接的证据，但这 种可能并不能被排除。而绝大多数真核生物细胞的m r n a s 的翻译都遵从这种扫 2 硕士学位论文 前言 描机制模型。 此模型首先涉及到位置效应和序列背景两个因素的影响。扫描模型预言在理 想的序列背景下，靠近5 端的程度决定了哪个a u g 作为实际的起始密码子，而 如果在上游合适位置引入一个a u g 密码子，翻译的起始将移动到上游的位点。 为了更好的证实位置效应，研究人员构建了一个含有四个串联的独立胰岛素原前 体核糖体结合位点的质粒并对其翻译情况进行了检测，结果发现只有第一个位点 被唯一的利用了，这有力的证明了扫描模型【9 1 。同时位置效应的一个简单证据就 是有9 0 一9 5 的脊椎动物m r n a 都遵从“第一个a u g 起始规则”o o 。而对于 二些m r n a s 的起始并非唯一的从5 端临近的第一个a u g 密码子开始的现象提 示了最初的模型应该存在一些辅助的修订。例如a u g 密码子被扫描的核糖体识 别的效率也会受其所在序列背景的影响。如果5 端临近的a u g 处于一个不理想 的序列背景下，一些扫描的核糖体将会越过该a u g 而在第二个或后面的a u g 处起始翻译【l ，或者如果5 端临近的起始位点位于一个小的o r f 之后( ： 弋肌一射枞：肌删 ：三；! 三：_ 二) 。二： 划；= ”。2 。， 一 ， 一t ； 垂 b 括 + 隐 q 1 r ：一= = ：j j ，一i ：t 1 必八剜l 小肭胁 ；：二二r ：1 ：一f 一_ ：! 一；一i f 二。二lf ：二：二二= 二i ；：二j 一： i j = ；：孑i ；二ej = ；拿：；兰 2 1 够呼谬谚 o 6 7 i ，1 5 ，pli，i， ，9 6 4 ， 硕士学位论文第一章 c d e f 1 0 1b 荤 i 一，j r 。e 一二一一：一：t 一一二：7 - ：一：一：二：一：一： v ：二一三：= 一：曩二芒二t ，；。- 、一一一八从删蝴m 门 l2 -：一：三：三二：s ：3 二二 三三二：2 - ，； ：* y - - ：i 二 一：i ：；! ；：ji ：；：； 可丌i i i j ：习 ，；二：二：二二二：一， 一 圭 弓 h 淹 v ；：3 二一j ：= 一：i ；：吐二! i ；3 ；_ 川肌赫蝴蛐删。 二：3二二：二三：二二三 ：ij ：二二j ： ：并：! ：二，一：，i t ：- t ；：孑5 ；：e ；：；： 可可了五瓦习 q 之- 二z ：二 奠- c ； ，下五i _ 专耋# 蔓蔓鼍毒量专彗l 叁 j j i 1 r ；：二一三：= 一：三；：量c 二j 二，壬： 幽彩。 口 ；二二：二：二i j ? ? 一i ； x - ；一= ；f 一 蕊 睡 ：誓薯d - ：= ： - b ：芋孑：；墨；：= ；： 图卜5 重组载体测序结果 a ，p c 3 卜g f p i ；b ，p c 3 卜g f p 2 ；c ，p c 3 1 - g f p 3 ； d ，p c 3 1 一s c t g f p i ：e ，p c 3 1 一s c t - g f p 2 ；f ，p c 3 i - s c t - g f p 3 硕士学位论文 第一章 由图l 一5 可见，所构建的六个重组载体已成功克隆入各片段，并且序列结构 与设计一致。 1 3 3b e | - 7 4 0 2 细胞中g f p 的荧光表达 将构建的六个重组表达载体转染b e l 7 4 0 2 细胞后进行荧光观察，结果如图 1 6 所示。 图卜6 重组表达载体转染b e l - 7 4 0 2 细胞后g f p 的表达 a ，p c 3 1 6 f p l ；b ，p c 3 1 g f p 2 ；c ，p c 3 1 g f p 3 ； d ，p c 3 1 一s c t - g f p l ；e ，p c 3 1 一s c t - g f p 2 ；f ，p c 3 1 一s c t g f p 3 由荧光显微镜结果可见，p c 3 1 g f p 系列三个载体转染的细胞中都有g f p 绿 色荧光蛋白的表达。从目测的表达g f p 细胞数量以及荧光强度上判断，转染了 p c 3 1 - g f p l 对照载体的g f p 表达效果最好，而g f p 作为多顺反子m r n a 中下 游阅读框的p c 3 1 - g f p 2 和p c 3 1 - g f p 3 载体，在b e l 7 4 0 2 细胞中仍有表达，其强 度依次减弱。 同时，利用p c d n a 3 1 s c t 重组表达载体的三个片断也能都观察到绿色荧光 蛋白的表达，但即使是阳性对照的p c 3 1 s c t - g f p l 也只能看到很少量的荧光， 其他两个多顺反子表达载体p c 3 1 s c t - g f p 2 和p c 3 1 s c t - g f p 3 与p c 3 1 g f p 系 列载体的结果一致，也有g f p 的表达，但表达量同样很低，目测与阳性对照无 明显差异，多次重复实验未见g f p 表达有明显升高。 硕士学位论文 第一章 1 3 4 流式细胞仪检测g f p 的表达效率 以未转染质粒的b c 一7 4 0 2 细胞作为空白对照，对转染了p c 3 1 一g f p 系列载体 以及p c d n a 3 1 s c t - g f p 系列的共六个重组载体的细胞进行处理后上流式细胞 仪检测，以分析各载体g f p 表达效率差异。结果如图1 7 、图1 8 所示。 a b c d e x 融搬拥1 e 觚r jg f p ( l o g ) m a r k e rl e t t , r i g h te v e n t s g a t e d t o t a l a l l 1 ，9 9 1 0 3 5 2 91 0 0 d o9 3 8 8 m 1 1 。2 5 3 6 2 49 9 8 69 3 7 5 m 2 2 5 。9 9 1 050 1 40 1 3 m a r k e r 茂f u g h te v e n t s g a t e d t o t a l a l l 1 ，9 9 1 0 4 7 6 41 0 0 0 09 5 。2 8 m 1 1 2 5 1 9 0 43 9 9 73 8 0 8 陇2 5 , 9 9 1 0 2 8 6 5 6 0 1 4 5 7 3 0 m a r k e rl e f t r i g h te v e n t s g a t e d t o t a l a | i1 ，1 04 5 3 81 0 0 0 09 0 7 6 m 1 1 。2 5 2 9 7 86 5 6 25 9 5 6 l 娩2 5 。9 9 1 0 1 5 6 2 3 4 。4 23 1 2 4 m a r k e rl e f t r 嘧撤e v e n t s g a t e d t o t a l a l l 1 ，9 9 1 0 4 6 9 01 0 0 0 09 3 ，8 0 m 1 1 ，2 5 3 2 7 66 9 8 56 5 ，5 2 m 22 5 。9 9 1 01 4 1 7 3 0 2 1筠3 4 m a r k e rl e f t , r i g h te v e n t s g a i t e d t o t a l a # 1 。9 9 1 0 5 0 0 01 0 0 0 01 0 0 0 0 m 1 1 。1 4 4 5 1 99 0 3 89 0 3 8 i _ 21 4 9 9 1 04 8 49 鲳9 ，6 8 芏：o u 镰c ，o u 硕士学位论文第一童 f g xp a r a m e t e r ：f l lg f p ( l o g ) t o t a e v e n t s ：5 0 0 0 塑! 堕鲤：曼婆鍪曼堡塑兰垒壁璺! 塾! 哟! a h 1 9 9 1 05 。0 0 1 0 0 0 01 0 0 0 0 m 11 1 44 6 2 79 2 5 49 2 s 4 1 4 。9 9 1 03 7 47 。4 87 4 8 xp a r a m e t e r ：f l lg f p ( l o g ) t o t a le v e n t s ：s 0 0 0 m a r k e rl e f t ，r 硷嫩e v e n t s c , 磁 - t e d t o t a l a “1 9 9 1 05 0 0 01 0 0 o ot 0 0 o o m 11 1 44 9 2 29 8 4 49 8 4 4 m 21 4 9 9 1 07 91 5 8。5 8 图1 - 7 流式细胞仪检测g f p 表达效率 a ，c o n t r o l ；b ，p c 3 1 一g f p l ；c ，p c 3 1 一g f p 2 ；d ，p c 3 1 一g f p 3 ； e ，p c 3 1 一s c t g f p l ：f ，p c 3 1 一s c t g f p 2 ；g ，p c 3 1 一s c t - g f p 3 1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 组别 口p c 3 1 一g f p i 口p c 3 1 一g f p 2 囵p c 3 1 一g f p 3 圈p c 3 1 一s c t - g f p i 口p c 3 1 一s c t - g f p 2 口p c 3 1 一s c t - g f p 3 图1 - 8 重组载体g f p 表达效率分析图 由流式细胞仪检测结果可见，p c 3 1 g f p 系列三个载体的g f p 表达效率整体 上显著高于p c 3 1 s c t - g f p 系列。p c 3 1 s c t - g f p 系列的三个重组载体中s c t 元 件的加入并没有达到预期的增强表达的目的，反而使基因的表达效率受到了明显 的抑制。 在p c 3 i - g f p 系列的三个重组载体中，p c 3 1 一g f p l 的对照载体g f p 表达效 率达到了6 0 1 4 ，而p c 3 1 一g f p 2 为3 4 4 2 ，p c 3 1 一g f p 3 为3 0 2 1 ，后两种载 聃- c ：o u 哦鼍3 0 u 瓮斛裂趟惟臣。 硕士学位论文第一章 体与对照相比g f p 效率下降了约5 0 ，说明即使位于起始顺序的下游，g f po r f 仍能得到表达，但可见引入的a u g 起始密码子及其对应的阅读框可明显抑制下 游阅读框的表达。 在p c 3 1 一s c t - g f p 系列的三个重组载体中也可见都有g f p 的表达，但由于 s c t 的加入明显的抑制了编码序列的表达效率，所以其趋势不便用于翻译起始情 况的分析。 1 4 讨论 自真核生物蛋白质翻译过程的扫描机制模型提出以来，众多的实验研究结果 都支持了这种翻译的起始方式。对于一些m r n a 的翻译未能从第一个a u g 起始 密码子处起始的情况，l e a k ys c a n n i n g 模型对这种扫描模型中存在的不足进行了 很好的补充，二者共同对真核生物中翻译的起始机制作出了很好的解释。但是， 一些实验研究的发现仍对这两种起始机制提出了质疑，这说明真核生物m r n a 的翻译过程是一个非常复杂的工程，对于翻译的起始机制仍需要进一步的完善。 在本章的研究中，我们通过多顺反子m r n a 的表达情况研究了在不同阅读 顺序下，当第一个a u g 密码子处于理想的翻译起始序列背景下时，下游的第二 个a u g 密码子在理想和不理想两种序列背景下能否也得到起始前复合物的识别 并起始相应阅读框表达的问题。 根据扫描机制模型，起始前复合物在扫描过程中如果遇到处于理想序列背景 下的第一个a u g 密码时即停止扫描并开始蛋白质的翻译，那么如果按照这种扫 描模型，我们设计产生的g f p 2 和g f p 3 序列转录所得的多顺反子m r n a 在进行 翻译时，起始前复合物将在第一个引入的a u g 起始密码子处停止并开始翻译而 不会继续进行扫描，那么下游的第二个g f po r f 的a u g 密码子就不会被识别， g f p 蛋白就不能被表达。但是通过转染细胞的荧光显微镜观察以及流式细胞仪的 检测，p c 3 1 g f p 2 和p c 3 1 - - g f p 3 载体都存在着g f p 绿色荧光蛋白的表达，说明 即便第一个a u g 密码子处于理想的序列背景下，在间隔距离很短的情况下( 1 至2 b p ) ，不管下游的a u g 密码子所处的序列背景是否理想，起始前复合物都能 认别该a u g 密码子并起始对应阅读框的翻译。这与经典的扫描机制模型并不完 全相符。 本章的实验结果表明，在真核生物的蛋白质翻译过程中，4 0 s 核糖体小亚基 组成的起始前复合体在结合至m r n a5 端帽结构区以后开始向下游扫描，即使 其所遇到的第一个a u g 起始密码子处于序列背景理想的k o z a k 序列中，起始前 复合物仍能继续向下扫描一段距离，在间隔距离较短的情况下，起始前复合物能 硕士学位论文第一章 够识别下游的a u g 密码子，不管其是否处于理想的序列背景下，起始前复合体 都能起始其对应的蛋白质翻译。 通过流式细胞仪的检测结果发现，在p c 3 1 g f p 2 和p c 3 1 g f p 3 载体的多顺 反子结构中，处于下游的g f po r f 与p c 3 1 一g f p l 载体中正常g f po r f 的相比， g f p 蛋白的表达效率降低了约5 0 ，说明在这种起始情况下，下游a u g 密码子 的起始作用被抑制了。 但以上的实验未能证明起始前复合物在识别起始多顺反子m r n a 下游a u g 密码子的同时，是否也识别并起始翻译了上游的a u g 密码子。因为根据本章的 实验设计，上游a u g 起始密码子编码的蛋白质是未知和不可检测的。这就无法 说明起始前复合物是完全没有遵从扫描机制，全部从第一个a u g 处越过并起始 第二个a u g 密码子，还是部分遵从扫描机制，起始第一个a u g 相应的蛋白质 翻译的同时，还联合利用了l e a k ys c a n n i n g 模型，有一部分核糖体起始第二个 a u g 密码子的翻译。 此外，将p c 3 1 s c t 系列的三个载体转染细胞后发现，即使阳性对照也很少 能观察到g f p 的表达，流式细胞仪检测表明该系列表达载体的g f p 表达效率较 p c 3 1 g f p 显著降低。这与我室王丽娜硕士后来进行的转录调控元件选择实验的 结果一致，分析其原因可能是在s v 4 0 和c m v 两个增强子上形成的蛋白质与蛋白 质、蛋白质与d n a 相互作用的网络中，与它们相互作用的转录因子之间可能发 生了干扰作用，两个增强子对转录的上调作用不能简单的叠加。所以p c 3 1 - s c t 系列三个载体的实验结果对多顺反子m r n a 翻译起始的研究意义不大。 1 5 结论 1 ) 成功构建了p c 3 1 一g f p l 、p c 3 1 - g f p 2 、p c 3 1 一g f p 3 和p c 3 1 s c t - g f p l 、 p c 3 1 s c t - g f p 2 、p c 3 1 s c t - g f p 3 六个重组表达载体； 2 ) 通过我们构建的重组载体转录的多顺反子i n r n a ，其翻译的起始方式不同于 经典的扫描机制模型，提示我们可能存在其他的起始方式； 3 ) 证明了s c t 转录调控元件不能增强基因的表达，两个增强子之间的作用不能 简单叠加。 硕士学位论文 第二章 第二章多顺反子m r n a 中重叠阅读框的翻译起始研究 通过第一章的研究发现，在真核生物m r n a 中，如果第二个a u g 密码子与 第一个a u g 起始密码子的间距很短( 1 b p 或2 b p ) ，即使第一个a u g 密码子处 于序列背景理想的k o z a k 序列中，不管第二个a u g 密码子的序列背景是否理想， 起始前复合物都可以识别下游的a u g 并起始它所对应的蛋白质翻译过程。同时 针对第一章实验中未能说明的问题，我们在本章的研究中利用了 p c d n a 3 1 m y c h i s ( ) b 这样一个携带蛋白质标签的真核表达载体来对第一章中 的实验结果进行迸一步的研究。 在本章的研究中，我们仍然使用正常g f p 的o r f 作为骨架，利用p c r 的 方法对其进行改造，以产生多顺反子m r n a 结构。在第一章研究的基础上，我 们分两种情况对多顺反子的m r n a 中重叠阅读框的翻译起始进行了研究：第一， 根据第一章实验结果，选取第一个a u g 起始密码子处于k o z a k 序列中而下游 a u g 密码子处于不理想的序列中这种按照扫描机制不利于下游a u g 起始的情 况继续进行研究，在g f po r f 上游引入a u g 起始密码子的同时，在其下游也 插入一定数量的碱基，使引入的a u g 起始密码子能与p c d n a 3 1 m y c h i s ( 一) b 表 达载体上m y c h i s 表位的t g a 终止密码子相呼应，形成一个融合阅读框，从而 通过m y c h i s 表位编码的蛋白标签来检测第一个a u g 密码子所编码的蛋白质是 否得到了翻译。同时，继续通过g f p 的荧光观察来检测下游a u g 密码子所对应 的阅读框的起始翻译情况；第二，通过对g f po r f 的序列分析发现，除了第一 位的a u g 之外，在同一阅读顺序下还存在着其他五个a u g 密码子与g f po r f 最末位的终止密码子相对应。为研究这些处在下游的且与第一个a u g 密码子在 相同阅读顺序下的a u g 密码子是否也能被起始前复合物识别并起始翻译，我们 利用p c r 的方法突变g f po r f 的终止密码子，并调整碱基数目，使g f po r f 的起始密码子以及其他五个a u g 密码子能够继续与m y c h i s 表位的终止密码子 t g a 相对应，利用这种方法可以通过m y c h i s 表位编码的蛋白标签来检测有几 种不同大小的蛋白质被翻译出来，从而阐明下游的五个a u g 密码子是否发挥了 起始密码子的作用。 硕士学位论文第二章 本章实验技术路线如下： 硕士学位论文第二章 d n am a r k e r 普通琼脂糖 普通t a q 酶 m 娜噜m i x t u r e 氯仿 苯酚 胰蛋白胨 t a k a r a g i b c o 疋l k a r a t a k a r a 湖南师范大学化学试剂厂 湖南师范大学化学试剂厂 s i g m a 硕士学位论文 第二章 酵母提取物 无水乙醇 k c l k h 2 p 0 4 n a 2 h p 0 4 r p m i1 6 4 0 培养基 小牛血清 l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 胰酶 2 5 c m 2 细胞培养瓶 6 孔细胞培养板 t i p s 微量离心管 甲醇 冰醋酸 s d s 甘氨酸 a p s 双丙烯酰胺 丙烯酰胺 a n t i - m y c 藕联辣根过氧化物酶的山羊抗鼠 p v d f 膜 x - f i l m 显影粉，定影粉 s i g m a 湖南师范大学化学试剂厂 湖南化学试剂一厂 河南焦作市化工三厂 天津市化学试剂六厂 g i b c o 杭州四季青公司 i n v i t o r g e n g i b c o f a l c o n f a l c o n a x y g e n a x y g e n 上海陆都化学试剂厂 中国医药集团上海化学试剂公司 b i o m o l b i o m o l s i g m a b i o - r a d b i o - r a d 本室自制 s i g m a a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 上海爱克发感光器材有限公司 上海经济区思路实业有限公司 2 1 3 主要试剂配制 2 1 3 1w e s t e r nb l o t 试剂配制： ( 1 ) a 液：丙烯酰胺储存液，1 0 0 m l 。3 0 ( w v ) 丙烯酰胺，o 8 ( w v ) 双 丙烯酰胺。注意：未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒素，操作 时必须戴手套，在通风柜操作。2 9 2 9 丙烯酰胺，0 8 9 双丙烯酰胺，加去 3 l 硕士学位论文 第二章 离子水至1 0 0 m l ，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，并用石蜡膜封口， 可在4 存放数月。 ( 2 ) b 液：4 分离胶缓冲液，1 0 0 m l 。可在4 存放数月。 2 m 髓s h c l ( p h 8 8 ) 7 5 m i 1 5 m l o s d s4 m l0 4 去离子水 2 1 m l ( 3 ) c 液：4 堆积胶缓冲液，1 0 0 m l 。可在4 存放数月。 1 mt r i s - - h c l ( p h 6 8 )5 0 m l0 5 m 1 0 s d s4 m l0 4 二蒸去离子水4 6 m l ( 4 ) ( 5 ) 1 0 x p b s 的配制( 1 0 0 0n 1 1 ) ：8 0 9n a c l ，2 9k c l ，1 1 5 9n a 2 h p 0 4 7 h 2 0 ，2 9 k h 2 p 0 4 ， 加去离子水至1 0 0 0 m l ，p h 值约为7 5 。 电泳缓冲液，1 0 0 0 m l 。在室温下长期保存。 t r i s 碱 3 9 2 5 m m 苷氨酸 1 4 4 9 1 9 2 m m s d s l g 0 1 加去离子水至1 0 0 0 m l ，p h 应该在8 3 左右，也可制成l o x 储存液。 ( 6 ) 1 0 x 转膜液的配制( 1 0 0 0 m 1 ) ：称取。9 0 9 苷氨酸( 进口) ，1 9 3 9 t f i s 碱， 加去离子水至1 0 0 0 m l ，p h 值8 3 8 4 ，一般不需要调p n 值。 ( 7 ) 1 0 0 6 0 过硫酸铵( a p s ) ，5 m l 。o 5 9 过硫酸铵，5 m l 去离子水。用e p 管分 装好，一2 0 冻存，每一礼拜取一管，用后弃去。 ( 8 ) 5 变性l o a d i n g ，1 0 m l 。可在4 c 保存数周，或在一2 0 c 保存数月。 1 m t r i s - - h c l ( p h 6 8 ) 0 6 m l 6 0 r a m 5 0 甘油5 m l2 5 l o s d s2 m l 2 2 二巯基乙醇0 5 m l 1 4 4 m m l溴酚蓝lml 0 1 去离子水0 9 m l ( 9 ) 考马斯亮蓝染液( 1 0 0 0 m 1 ) ：1 o g 考马斯亮蓝r 2 5 0 ，甲醇4 5 0 m l ，去离子 水4 5 0 m l ，冰醋酸1 0 0 m l ( 用过滤器除去染料渣后，方可染色用) 。 ( 1 0 ) 考马斯亮蓝凝胶脱色液( 1 0 0 0 m 1 ) ：甲醇l o o m l ，冰醋酸l o o m l ，去离子水 8 0 | d m l 。 硕士学位论文 第二章 2 2 方法 2 2 1 表达载体的设计 本章中的多顺反子m r n a 仍以g f p l 为骨架。在g f p l 起始密码子上游引入 x h oi 的酶切位点和必序列，在g f p l 终止密码子下游引入一个g 碱基和 b a m hi 酶切位点，。以使引入的a t g 起始密码子能与p c d n a 3 1 m y c h i s ( 旧载 体上m y c h i s 表位的t g a 终止密码子相对应，构成一个包含了g f p io r f 在内 的融合阅读框，该融合阅读框起始密码子位于g f p i 起始密码子上游且和g f p i 的o r f 不在同一阅读顺序下，这个多顺反子序列命名为g f p 4 。 同时，经过对g f p 序列的分析，发现其o r f 除了+ 1 的a t g 之外，同一阅 读顺序下还存在2 3 5 位、2 6 5 位、4 6 0 位、6 5 5 位和7 0 0 位的a t g 密码子。为了 研究在同一阅读顺序下不同a u g 密码子的起始作用，突变g f po r f 的t 从密 码子后用x h oi 和b a m hi 位点克隆入p c d n a 3 1 m y c h i s ( ) b 载体，以使这六个 a t g 能与载体表位上的t g a 密码子构成多重阅读框，利用m y c 标签来检测各个 阅读框的表达情况。该多顺反子编码结构命名为g f p 5 。 g f p 4 和g f p 5 多顺反子编码序列结构如表2 1 所示： 表2 - i 多顺反子序列g f p 4 和g f p 5 结构图 序列名称序列结构 g f i ) 4 g f p 5 xh丌oi i k o z a k 序列 b a m h i a t c a 聪堑a m y c - h i s3 端 k o z a k 序列 k o z a k 序列k o z a k 序列 ll l c t c g a g a t q g t g a g c l j ：；f 鼢g c c , 5 t o g a t c a t q g 。母一t g g c a t q g 一鹕写 a t c a t t g a k o z a k 序列b a m hi m y c - h i s3 端 注：点状下划线表示正常g f po r f 的起始终止密码子； 斜体、波浪下划线表示引入的起始密码子； 斜体、双波浪下划线表示p c d n a 3 1 m y c - h i s ( - ) b 载体上m y c - h i s 表位的终止密码子 3 3 硕士学位论文 第二：章 将g f p