（农产品加工及贮藏工程专业论文）灰树花液体培养富集硒的研究.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 灰树花( o r i f o l af r o n d o s a ) 是一种珍稀食药两用真菌，其在工厂化快速液 体培养过程中可将无机硒转化成对人体毒副作用小的有机硒，并可受镧等稀土元 素的影响。此种转化为开发补硒保健食品提供了新的途径，具有显著的经济意义。 在添加镧时灰树花液体培养转化硒的理论研究尚未见报道，故本研究具有一定的 学术意义。 本研究主要围绕以下几点展开： ( 1 ) 为测定灰树花菌丝体内有机硒的含量，研究了3 ，3 一二氨基联苯胺比色 法，其标准曲线的回归方程为：y = 0 0 0 9 5 x + 0 0 0 1 9 ， r 2 _ 0 9 9 8 3 。 ( 2 ) 对灰树花液体培养的培养基进行了单因素试验和正交试验。 选择培养基中碳源( 马铃薯葡萄糖) 、氮源( 麸皮) 、硒的添加量及硝酸镧的 添加量等因素，研究它们在各种水平下对灰树花液体培养( 或称发酵) 富硒的影 响。根据单因素试验的结果，对碳源( 马铃薯葡萄糖) 、氮源( 麸皮) 、s e 和l a 烈0 3 ) 3 的添加量这四个因素分别选取四水平进行l 1 6 ( 4 5 ) 正交实验，试验指标为菌丝干 重、有机硒量和硒转化率。综合考虑各指标时，得到较优的培养基组成为：在l l 培养基中含马铃薯3 0 0 9 、葡萄糖3 6 9 、麸皮3 0 9 、硒1 0 0 m g 、l a ( n 0 3 ) 3 1 5 0 m g 、k h 2 p 0 4 1 0 9 、m g s 0 4 0 5 9 、c a c l 20 1 9 、v m0 1 9 、v b 2 0 0 4 9 。试验同时表明，稀土镧元 素对有机硒量和硒转化率这两个评价指标的影响显著。 ( 3 ) 对灰树花液体培养的外部培养条件进行了单因素试验和j 下交试验。 以得到的较优培养基为基础，研究灰树花液体培养富集硒的外界条件，如p h 值、温度、接种量、摇床转速和摇瓶中装液量等，进行了单因素试验和正交试验。 由于温度和装液量可变化程度很小，确定为2 5 和1 0 摇瓶容积，故只选取p h 值、 接种量和摇床转速三因素，各因素取三水平，进行l 9 ( 3 4 ) 正交试验，试验指标 为菌丝干重、有机硒量和硒转化率。综合考虑各指标时，得到较优的培养外部条 件是温度2 5 0 、p h 值7 5 、接种量1 0 培养基体积、摇床转速1 2 0 r m i n 、摇瓶装 液量1 0 。在所得到的优化培养基上和培养外部条件下灰树花液体培养对硒的 富集量为1 3 0 4 3 2l ag 2 5 m l 培养基，对硒的有机化转化率达5 2 1 7 6 ，干菌丝量为 5 8 7 e j l 培养基。 ( 4 ) 研究了次树花液体培养富硒的代谢特性。 以菌丝生长状态、p h 值、菌丝干重、发酵液中残糖、胞内多糖、胞外多糖、 菌丝中有机硒含量及有机硒转化率等八个指标对灰树花液体培养富硒的代谢特性 江苏大学硕士学位论文 进行了描述，建立了相关的特性曲线，并初步研究了s e 浓度为1 0 0 m g l 和 l a ( n 0 3 ) 3 浓度为1 5 0 m g l 时对灰树花液体培养富硒的影响。 ( 5 ) 研究了有机硒的分布。 菌丝体中蛋白质是硒的主要结合对象，与之相结合的有机硒占7 0 5 1 ；与多 糖相结合的有机硒占8 6 9 ；其余2 0 8 0 的有机硒与体内其他大分子相结合而存 在，故提高灰树花体内蛋白质、多糖及其他含硫有机物的含量对其进行硒的有机 化转化是有利的。此外，胞内蛋白质和多糖中有机硒含量显著高于胞外。 ( 6 ) 建立了灰树花液体培养富硒的动力学模型。 对灰树花菌丝体的生长规律和灰树花富集硒的特性进行了探索，建立的菌丝 体生长速率模型为： d c x0 0 2 1 c s c x d tc s 一0 7 8 灰树花液体培养富硒速率模型为： d c p ：8 0 3 0 8 0 d c x d td t 或为： c p = 8 0 3 0 8 0 c x 一1 7 5 3 8 模型与实验数据能较好地拟合。 关键词：灰树花：硒；镧；有机硒 l i 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t g r 咖l af r o n d o s a ，i sa r a r ee d i b l ea n dm e d i c i n a lf u n g iw h i c hc a nc o n v e r ti n o r g a n i c s e l e n i u mi n t oo r g a n i cs e l e n i u mo fl e s sp o i s o n o u ss i d e - e f f e c to no u rh e a l t hd u r i n gi t s l i q u i dc u l t u r e t h ec u l t u r ei sa f f e c t e db yr a r ee a r t he l e m e n t ss u c ha sl a n t h a n u m t h i si sa n e wa p p r o a c ht od e v e l o pn e wh e a l t hf o o df o rs e c o m p l e m e n ta n dh a sp r o m i n e n t e c o n o m i cv a l u e t h et h e o r yi ss e l d o mr e p o r t e dt h a ts ei sc o n v e r t e db yg r i f o l a f r o n d o s ac u l t u e di nl i q u i dw h e nl a n t h a n u mi sa d d e di n t oc u l t u r em e d i u m t h u st h i s r e s e a r c hh a sg r e a ta c a d e m i cv a l u et os o m ee x t e n t t h i ss t u d ym a i n l yd e a l e dw i t ht h ef o l l o w i n gc o n t e n t s ： ( 1 ) t h ec o n t e n to fo r g a n i cs e l e n i u mi ng r i f o l af r o n d o s am y c e l i u mc a nb e d e t e r m i n e db y3 , 3 - d i m e t h o x y b e n z i d i n ec o l o r i m e t r ya n dt h es t a n d a r dc u r v ew a ss e tu p t h er e g r e s s e de q u a t i o nw a s y = o 0 0 9 5 x + 0 0 019 ， r 2 = 0 9 9 8 3 ( 2 ) b yt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u m c u l t u r em e d i u mw a se s t a b l i s h e d t h ei n f l u e n c eo fc a r b o nr e s o u r c e ( p o t a t o g l u c o s e ) ， n i t r o g e nr e s o u r c e ( b r a n ) ，t h ec o n t e n to fs e l e n i u ma n dn i t r i cl a n t h a n u mi nc u l t u r e m e d i u mo ns e l e n i u m a c c u m u l a t i n gf e r m e n t a t i o nw e r es t u d i e dr e s p e c t i v e l y o nt h eb a s i s o ft h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，o r t h o g o n a le x p e r i m e n t sw e r ep e r f o r m e dw i t hd r y w e i g h to fm y c e l i u m ，t h ec o n t e n to fo r g a n i cs e l e n i u ma n dt h eo r g a n i cc o n v e r t i n gr a t eo f m y c e l i u mt os e l e n i u ma sc r i t e r i o n c o n s i d e r i n ge v e r yc r i t e r i o ns y n t h e t i c a l l y , t h e o p t i m u mc u l t u r em e d i u mw e r ee s t a b l i s h e da sf o l l o w s ：p o t a t o3 0 0 9 ，g l u c o s e3 6 9 ，b r a n 3 0 9 ，s e1 0 0 m g ，n i t r i cl a n t h a n u m1 5 0 m g ，k h 2 p 0 4 1 0 9 ，m g s 0 4 0 5 9 ，c a c l 2 0 1 9 ，v b i o 1 9 ， v b 2 0 0 4 9i no n el i t e rl i q u i dc u l t u r em e d i u m a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so ft e s t s ，t h e e l e m e n to fl a n t h a n u mh a dh i g hi n f l u e n c eo nt h ec r i t e r i o no ft h ec o n t e n to fo r g a n i c s e l e n i u ma n dt h eo r g a n i cc o n v e r t i n gr a t eo fm y c e l i u mt os e l e n i u m ( 3 ) b yt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u m c u l t u r ee x t e m a lc o n d i t i o n sw e r ee s t a b l i s h e d o nb a s i so ft h ee s t a b l i s h e do p t i m u mc u l t u r em e d i u m ，t h ei n f l u e n c eo fc u l t u r e c o n d i t i o n s ，s u c ha sp h ，c u l t u r et e m p e r a t u r e ，t h ev o l u m eo fi n o c u l a t i o n ，t h er o t a t i n g s p e e do fb e d ，a n dt h ev o l u m eo fl i q u i dc u l t u r em e d i u mi nt h ec o n i c a lf l a s k ，o n s e l e n i u m a c c u m u l a t i n gf e r m e n t a t i o nw e r ea l s os t u d i e dr e s p e c t i v e l y b e c a u s ec u l t u r e t e m p e r a t u r ea n dt h ev o l u m eo fl i q u i dc u l t u r em e d i u mi nt h ec o n i c a lf l a s kh a v en a l t o w c h a n g i n gs c o p e ，o r t h o g o n a le x p e r i m e n t sw e r ep e r f o r m e d w i t h p h ， v o l u m eo f i n o c u l a t i o n ，r o t a t i n gs p e e do fb e da st e s tf a c t o r s ，a n d 埘t hd r yw e i g h to fm y c e l i u m ，t h e c o n t e n to f o r g a n i cs e l e n i u ma n d t h eo r g a n i cc o n v e r t i n gr a t eo f m y c e l i u mt os e l e n i u ma s c r i t e r i o n c o n s i d e r i n ge v e r yc r i t e r i o ns y n t h e t i c a l l y , t h eo p t i m u mc u l t u r ee x t e r n a l i i i 江苏大学硕士学位论文 c o n d i t i o n sw e r ee s t a b l i s h e da s f o l l o w s ：t e m p e r a t u r e2 5 ，p h7 5 ，t h ev o l u m eo f i n o c u l a t i o n10 ，r o t a t i o ns p e e d12 0 r m i n ，t h ev o l u m eo fl i q u i dc u l t u r em e d i u mi nt h e c o n i c a lf l a s k10 w i t ht h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n s t h e c o n t e n to fo r g a n i cs e l e n i u m ，t h eo r g a n i cc o n v e r t i n gr a t eo fm y c e l i u mt os e l e n i u ma n d t h ed r ym y c e l i u mw e i g h tr e a c h e d13 0 4 3 2l ag 2 5 m l ，5 2 17 6 a n d5 s 7 9 lr e s p e c t i v e l y ( 4 ) t h es e l e n i u m a c c u m u l a t i n gc u l t u r em e t a b o l i s mp r o p e r t i e sw e r es t u d i e d t h es e l e n i u m - a c c u m u l a t i n gc u l t u r ep r o p e r t i e sw e r ed e s c r i b e di nd e t a i l sf r o me i g h t i n d e x e si n c l u d i n gp h ，t h ed r ym y c e l i u mw e i g h t ，t h er e s i d u a l r e d u c i n gs u g a r , t h e i n t r a c e l l u l a rg r i f o l a n ，t h ee x t r a c e l l u l a rg r i f o l a n ，t h ec o n t e n to fo r g a n i cs e l e n i u m ，t h e o r g a n i cc o n v e r t i n gr a t eo fm y c e l i u mt os e l e n i u ma n ds o m er e l e v a n tp r o p e r t yc u r v e s w e r es e tu p t h ei n f l u e n c e so f10 0 m g ls e l e n i u ma n d15 0 m g ln i t r i cl a n t h a n u mo nt h e s e l e n i u m a c c u m u l a t i n gc u l t u r ew e r es t u d i e dp r e l i m i n a r i l y ( 5 ) t h ed i s t r i b u t i o no fo r g a n i cs e l e n i u mw a s s t u d i e d 砀ee x i s t i n gc o n d i t i o no fo r g a n i cs e l e n i u mi n p r o t e i na n dg r i f o l a n f r o m i n t r a c e l l u l a ra n de x t r a c e l l u l a rw a ss t u d i e d i tw a sr e v e a l e dt h a ti nm y c e l i u mt h eo r g a n i c s e l e n i u mw a sm a i n l yb o u n dt op r o t e i n 1 1 1 ep e r c e n t a g eo fo r g a n i cs e l e n i u mi np r o t e i n ， g r i f o l a n ，a n do t h e rb i gm o l e c u l a rs u b s t a n c ew e r e7 0 51 ，8 6 9 ，2 0 8 r e s p e c t i v e l y t h e r e f o r e ，i tw i l lb ev e r yh e l p f u lt os e l e n i u mb i o - c o n v e n i n gt oi m p r o v et h ec o n t e n to f p r o t e i n ，g r i f o l a na n do t h e ro r g a n i cs u b s t a n c ec o n t a i n i n gs u l f u r m o r e o v e r ，t h ec o n t e n to f o r g a n i cs e l e n i u mw a sh i g h e ri np r o t e i na n dg r i f o l a nf r o mi n t r a c e l l u l a rt h a nf r o m e x t r a c e l l u l a r ( 6 ) t h ed y n a m i cm o d e lo fs e l e n i u m - a c c u m u l a t i n gf e r m e n t a t i o nw a se s t a b l i s h e d t h r o u g hr e s e a r c h i n g t h e g r o w i n g a n ds e l e n i u m a c c u m u l a t i n gc h a r a c t e ro f m y c e l i u m ，t h ed y n a m i c m o d e l so fs e l e n i u m a c c u m u l a t i n gf e r m e n t a t i o nw e r e e s t a b l i s h e d t h em y c e l i u mg r o w i n gs p e e dm o d e li s ： d c x0 0 2 1 c s c x 一= 一 击c ，一0 7 8 t h es e l e n i u m a c c u m u l a t i n gs p e e dm o d e l i s ： 了d c p ：8 0 3 0 8 0d c ，xo r c p = 8 0 3 0 8 0 c x 1 7 5 3 8 d td t t h ea b o v em o d e l sc a l ls i m u l a t et h ee x p e r i m e n t a ld a t aw e l l k e y w o r d s ：g r i f o l af r o n d o s ；s e l e n i u m ；l a n t h a n u m ；o r g a n i cs e l e n i u m i v 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学位保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权近苏大学可以将本学位论文 的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密瓯在z 年解密后适用本授权书。 不保密口。 学位论文作者签名：h 强i 瓴 年e 口- ji se l 精教师戳：孙京 砂q r 年月r 日 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：前毪娲 日期：h 年6 月i 广日 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 引言 1 1 1 硒元素及其生物学功能 硒属于氧族元素半金属，在地质环境中的含量极少( 只有o 0 9 m g k g ) ，分布 也极不均匀【l _ 3 1 。硒多以无机态和有机态存在。常见的无机硒化合物有硒化钠、二 氧化硒、亚硒酸、硒酸钠和亚硒酸钠等。有机硒种类繁多，如成千上百种的硒蛋 白、硒核酸和硒多糖及它们的降解产物，形形色色的非蛋白质的硒氨基酸与硒肽， 各种含甾醇、黄酮和多酚类【l 7 】。它们性能各异，很有希望从中筛选出有用的化合 物。在硒有机化合物中，硒原子既可作为配位原子( 电子对供体) ，又可作为中心 原子接受电子对( 电子对受体) 。硒原子的这种性质在含硒酶的催化过程中可能发 挥重要作用【l 。 硒在生物体内一般以有机硒化合物形式存在。生物体内有机硒化合物主要为 含硒氨基酸和含硒蛋白质。最主要的硒代氨基酸是硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸， 其中硒代半胱氨酸已被誉为人体必需的第2 1 个氨基酸【7 1 。含硒蛋白质中最主要的 是g s h p x ( 谷胱甘肽过氧化物酶) 。在对抗体内有氧代谢过程中所产生过氧化氢 对细胞( 亚铁血红蛋白) 的破坏作用时，硒是必不可少的。硒最主要的生物学功 能是成为g s h p x 的活性中心，催化还原型谷胱甘肽变成氧化型谷胱甘肽，使有毒 的过氧化物变成无毒的羟基化合物1 4 ，l o 】。 硒具有多重生物学功能，是人和动物维持机体健康所必需的重要微量生命元 素。1 9 5 7 年s w a r z e 证明硒是动物的必需微量元素。1 9 7 3 年r o t r u c k 等人指出硒 是g s h p x 的一个重要组成部分。1 9 7 5 年a w a s t h i 首次明确指出，硒是人体必需的 微量元素。此后，随着分子生物学研究的发展，又相继发现硒参与构成硫氧还蛋 白还原酶( t r ) 、脱碘酶( t d ) 等酶的活性中心。多种硒蛋白特别是硒酶的发现， 进一步证明了硒与人类健康密切相关【i 刈。 ( 1 ) 硒是自由基的清除剂 硒参与合成人体内多种含硒酶和含硒蛋白，如g s h - p x 。g s h - p x 在还原型谷胱 甘肽存在下催化有毒的过氧化物还原为无毒的羟基化合物，并使有害的h z 0 ：分解， 因而可以保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的损害和干扰。硒参与构成碘化 甲状腺胺酸脱碘酶，能将甲状腺中低活性四碘甲腺原氨酸转化为三碘甲腺原氨酸。 硒和微生素e 、大蒜素、亚油酸、锗、锌等营养素之间还具有协同抗氧化的功效【9 a o 。 江苏大学硕士学位论文 ( 2 ) 硒能刺激机体免疫反应 硒能刺激机体免疫反应，可通过三种免疫方式即：细胞免疫、体液免疫、非 特异性免疫使免疫系统功能得到改善，从而增强免疫细胞的保护能力以抵抗疾病。 例如：硒能刺激免疫球蛋白及抗体的产生，促进淋巴细胞的增殖及抗体和免疫球 蛋白的合成，提高免疫反应，增强机体对疾病的抵抗力，硒对结肠癌、皮肤癌、 肝癌、乳腺癌等多种癌症具有明显的抑制和防护的作用，其在机体内的中间代谢 产物甲基烯醇具有较强的抗癌活性【9 1 0 1 。s e r f a s s 证明缺硒的大鼠嗜中性白细胞的杀 菌能力降低l l 】。 ( 3 ) 拮抗和降低某些有毒元素及物质的毒性 硒参与辅酶q 的合成，在生物体内有拮抗和减低h g 、c d 、a s 、t a 等元素的毒 性作用；硒还与钼、铬、铜、硫等元素有拮抗作用【1 1 , 1 2 】。 由于硒在地球上分布差异非常大，因而出现了富硒地区与缺硒地区。目前已 知的缺硒国家有4 0 余个，如新西兰、荷兰等。我国有2 2 个省市部分地区缺硒， 7 2 的县市是低硒和缺硒区，其中1 3 为严重缺硒区【l 】。众所周知，土壤中硒的含 量直接决定了粮食作物及其他植物性食品中硒的含量，而植物中硒的含量又直接 决定了动物性食品中硒的含量，动植物食品是人们摄取硒的最主要来源，因此硒 的地方性溃缺已直接威胁到广大人民的身体健康。人体缺硒会造成多种疾病。最 典型的是我国黑龙江克山县地方病一克山病。其它疾病，如大骨节病、癌症、心 血管疾病、白内障、胞囊纤维变性、高血压、甲状腺肿大、免疫缺失、淋巴母细 胞性贫血、视网膜斑点退化、肌营养不良、溃疡性结肠炎、关节炎，以及人体的 衰老等都与人体缺硒有着直接的联系【l 刁。 硒对人体的重要生理功能越来越为各国科学家所重视，各国根据本国自身的 情况都制定了硒营养的推荐摄入量。美国推荐成年男女硒的每日摄入量( r d i ) 分 别为7 0 微克天和5 5 微克天，而英国则为7 5 微克天和6 0 微克天。中国 营养学会推荐的成年人摄入量为5 0 一- - 2 0 0 微克天【2 , 4 , 5 , 1 0 , 8 8 , 1 3 3 】。 一般植物性食品含硒量比较低，动物性食品，尤其是动物内脏含硒量较高。 因此，贫硒或低硒地区的居民无法从植物性食品中获得足够的硒。食物硒含量是 影响人体硒营养状况的一个重要因素，而硒存在的形式是另外一个重要因素。植 物性食品中绝大部分硒以硒代蛋氨酸及其甲基化物形式存在，其活性比动物食品 中硒代半胱氨酸活性高。有机硒在生物体内停留时间较长，在人体硒营养状况良 好的情况下，有机硒可作为“候补”硒源贮存在“硒池 中，当人体硒营养摄入 不足时，“硒池中的有机硒能够自动地补充到生理代谢中，从而在硒摄入不足的 2 江苏大学硕士学位论文 情况下满足硒营养的要求【1 1 , 1 3 2 , 1 3 3 】。而无机态形式的硒，如亚硒酸盐和硒酸盐，进 入人体后，很快通过各种排泄途径排出体外，在体内停留的时间较短，因其毒性 大于有机态的硒，而活性又低于有机态硒，一般只用作药品来预防和治疗硒缺乏 疾病。因此，食品中硒的含量和存在的形式共同影响着人体硒营养的状况。所以 如何保证人摄取足够的硒无疑是科学界面临的一个重大课题 i 1 , 1 2 , 1 3 0 , 1 3 1 】。 目前，一般补硒的方法是用无机硒化合物，通常为n a 2 s e 0 3 制成的口服液。 研究结果表明，有机硒化合物毒性低且在激发免疫反应上比无机硒显著。此外食 品中有机硒( 硒蛋氨酸、硒半胱氨酸等) 无机硒( 硒酸盐、亚硒酸盐) 虽均可被 人体吸收，但对有机硒的吸收率为8 0 ，无机硒的吸收率只有5 0 。而且，有机 硒在组织中储存，并为g s x 的生物合成提供原料，而无机硒则不能储存，必 须通过生物转化为有机硒形式再被储存。因此，将无机硒通过一定的途径转化为 适当形式的有机硒，可以提供安全、高活性的含硒营养补充品。 1 1 2 稀土元素及其作用 稀土是人类发现较晚的一组金属元素的总称，国际上通常用英文字母r e 作为 代号 6 2 1 。我国稀土资源丰富，品种全，质量好，分布广，稀土储量大约3 6 0 0 万吨， 占全世界的8 0 左右。经过4 0 多年的开发研究，我国已形成了自己的科研、生产、 出口及推广应用体系，使稀土在国民经济中的作用逐步扩大。加大对稀土事业的投 入，扩大国内应用比重，提高稀土产品质量，占领国际市场，对未来高新科技发展具 有战略意义【6 2 , 1 0 6 】。 稀土元素的生物活性研究始于上世纪初。1 9 1 7 年我国钱崇澎等首次发表了钡、 锶、铯对水绵生理作用的研究成果。此后，前苏联、罗马尼亚、日本、美国等均 有稀土元素刺激植物生长的报道 6 2 , 5 5 , 8 5 , 1 0 6 】。我国稀土元素应用的研究和开发工作 始于1 9 7 2 年。8 0 年代以后，稀土在农业上的应用越来越广泛，涉及粮食作物、果 蔬、牧草及其他多种经济作物。研究结果表明，稀土对多种农作物均有增产效果， 小麦水稻等粮食作物的增产幅度为3 1 9 ，花生、大豆等油料作物的增产效率为 5 1 5 ，一些水果、蔬菜增产幅度可达1 0 - - 2 0 。稀土元素的增产作用主要表现为 增加了生物产量。在油料和糖料等经济作物上则是增加油分或糖分等。此外，稀 土元素不仅能提高产量，还能改善农产品品质，主要表现在增加作物的叶绿素含 量和增大光和速率，从而增加作物的干物质产量，提高子粒蛋白质、必需氨基酸 和果蔬维生素含量，也能提高果蔬糖酸比、果实耐贮性和油料作物的含油量。国 内外学者的大量研究表明，稀土元素对植物生长能起到一定的调节和刺激作用， 是促进植物生长的有益元素【1 眼1 0 9 , 1 1 0 1 。 江苏大学硕士学位论文 稀土元素由于其特殊的理化性质，在农业、工业、医药等行业应用广泛。稀 土元素对动植物影响的研究较多，在食用菌生产中的应用也日趋广泛【1 0 6 1 。 中南民族学院的何冬兰等人在研究镧和铈对灵芝菌丝生长的影响时发现， l a ( n 0 3 ) 3 和c e ( n 0 3 ) 3 在浓度不同时对灵芝菌丝的生长及其培养液中的残糖量的影 响不同。2 m m o l ll a 3 + 和c e ”能抑制灵芝茵丝的生长，抑制率分别为3 2 5 8 和 4 2 7 6 ；低浓度( b d a ，最优培养基组合为a 4 8 4 c l d 3 ，即在1 l 培养基中含马铃薯3 0 0 9 、 葡萄糖3 6 9 、麸皮4 0 9 、硒5 0 m g 、l a ( n 0 3 ) 3 2 0 0 m g 。 以2 5 r n l 培养基中的富硒量为评价指标，对正交实验结果进行极差分析，如表 江苏大学硕士学位论文 2 - 4 所示。 表2 - 4 对富硒量的极差分析结果 t a b l e2 - 4 r a n g ea n a l y s i so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ( c o n t e n to fc o n c e n t r a t e ds ea sc r i t e r i o n ) 由上极差分析结果可以得出，对2 5 m l 培养基中的富硒量而言，这四个因素的 影响大小顺序为：d c a b ，最优培养基组合为，a 4 8 2 c 4 d 2 ，即在1 l 培养基中 含马铃薯3 0 0 9 、葡萄糖3 6 9 、麸皮3 0 9 、硒2 0 0 m g 、l a ( n 0 3 ) 3 1 5 0 m g 。 以有机硒的转化率为评价指标，对正交实验结果进行极差分析如表2 5 所示。 表2 - 5 对有机硒转化率的极差分析结果 t a b l e2 - 5 r a n g ea n a l y s i so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ( o r g a n i cc o n v e r t i n gr a t ea sc r i t e r i o n ) 由上极差分析结果可以得出，对有机硒转化率而言，这四个因素的影响大小 顺序为d c a b ，最优培养基组合为舢b 2 c 2 d 2 ，即在1 l 培养基中含马铃薯3 0 0 9 、 葡萄糖3 6 9 、麸皮3 0 9 、硒1 0 0 m g 、l a ( n 0 3 ) a 1 5 0 m g 。 ( 3 ) 方差分析 以菌丝干重为评价指标，对正交实验结果进行方差分析，如下表2 - 6 所示。 江苏大学硕士学位论文 表2 - 6 对菌丝干重的方差分析结果 t a b l e2 - 6v a r i a n c ea n a l y s i so f o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ( d r yw e i g h to f m y c e l i u m 笛c r i t e r i o n ) f 0o l ( 3 ，3 ) 2 2 9 4 5 f o 0 5 ( 3 ，3 ) = 9 2 7 由上方差分析的结果可知，因素c ( 即培养基中硒的含量) 和b ( 即培养基中的 氮源) 对菌丝干重的影响高度显著，因素a 、b 、d 显著，影响大小顺序分别为c 、 b 、d 、a ，这与极差分析结论一致。硒作为一种微量元素，是灰树花体内某些酶活 性中心的重要组成部分，添加少量的硒能对灰树花的生长起到积极的促进作用， 但添加量过大会则对其生长产生毒害作用，对灰树花菌丝量的积累影响十分显著。 以2 5 m l 培养基中的富硒量为评价指标，对正交实验结果进行方差分析，如下 表2 7 所示。 表2 7 对富硒量的方差分析结果 t a b l e2 - 7v a r i a n c ea n a l y s i so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ( c o n t e n to fc o n c e n t r a t e ds e 鹊c r i t e r i o n ) f o o l ( 3 ，3 ) = 2 9 4 5f o 0 5 ( 3 ，3 ) 2 9 2 7 由上方差分析的结果可以得出，因素d ( 即培养基中l a ( n 0 3 ) 3 的含量) 对菌丝富 硒量的影响显著，这与极差分析结果一致。稀土具有特殊的生物学效应，能够刺 激灰树花体内多糖和蛋白质等大分子物质的合成，而这些大分子物质是富集硒的 载体，因而对富硒量有显著影响。硒虽然在少量时能刺激菌体生长，但少量的硒 使得自身被富集受到限制，而加入大量时又会抑制起生长，同样限制其被大量富 集。可能这些原因导致硒对菌丝富硒量的影响不是特别显著。 以有机硒的转化率为评价指标，对正交实验结果进行方差分析，如下表所示： 江苏大学硕士学位论文 表2 8 对有机硒转化率的方差分析结果 t a b l e2 8v a r i a n c ea n a l y s i so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ( o r g a n i cc o n v e r t i n gr a t ea sc r i t e r i o n ) f 0 o l ( 3 ，3 ) 2 2 9 4 5 f o0 5 ( 3 ，3 ) 2 9 2 7 由上方差分析的结果可以得出，因素d ( 即培养基中l a ( n 0 3 ) 3 的含量) 和因素c ( 即硒的添加量) 对有机硒的转化率影响显著，而碳源和氮源则对其无显著影响， 与极差分析结果一致，原因可能与上面一样。 ( 4 ) 验证实验 根据上面极差分析的结论，在最优培养基组合下进行正交实验的验证实验， 做三个平行最后取均值，结果如表2 - 9 所示。 表2 9 验证实验结果 t a b l e2 - 9r e s u l t so fc h e c k i n ge x p e r i m e n t 从上面验证实验结果发现，采用最优组合b 4 c l d 3 ，菌丝干重达到最大，此 时所得富硒量和对硒的有机花转化率均很小；采用最优组合b 2 c 4 d 2 ，菌丝量很 小，但富硒量达到最大，对有机硒的转化率在三者中居中；采用最优组合a 4 8 2 c ：2 d 2 ， 菌丝干重较高，富硒量也较大，而且对硒的有机化率达到最大。由于硒的价格比 较昂贵，从生产成本上考虑应该选择对硒转化率最高的培养基组合，同时虽然采 用最优组合a 4 8 2 c 4 d 2 能获得最大的富硒量，但在耗硒原料上是采用a 4 8 2 c 2 d 2 组 合的两倍，而且所得菌丝量太少。综上分析，最后采用培养基组合b 2 c 2 d 2 ( 即 在1 l 培养基中含马铃薯3 0 0 9 、葡萄糖3 6 9 、麸皮3 0 9 、硒1 0 0 m g 、l a ( n 0 3 ) 3 1 5 0 r a g ) 进行下面的实验。 2 2 6 培养条件优化的单因素实验 ( 1 ) p h 对灰树花富硒深层发酵的影响 试验结果如图2 1 6 至图2 1 8 所示。 江苏大学硕士学位论文 一 v 1 蔷 。- 鼗! 堰 0l23 4567891 0 p h 值 图2 1 6p h 对菌丝干重的影响 f i f ，2 1 6i n f l u e n c eo f p ho nd r yw e i g h to f m y c e l i u m 1 4 0 0 31 2 0 0 螽1 0 0 0 8 0 0 j v 6 0 0 豳i 4 0 0 萋2 0 0 霍 0 ol23456 7891 0 p h 值 图2 1 7p h 对菌丝富硒量的影响 f i g 2 1 7i n f l u e n c eo f p h o nc o n t e n to f c o n c e n t r a t e ds e ，、6 0 兰5 0 翳4 0 萎3 0 藿2 0 g1 0 忙0 olzj45678 9l u p h 值 图2 18p h 对菌丝有机硒转化率的影响 f i g 2 18i n f l u e n c eo fp ho no r g a n i cc o n v e r t i n gr a t e p h 值是影响微生物生长代谢的关键因素之一，也是影响发酵过程中各种酶活 的重要因素。从上面三图可以看出，在p h = 6 ，0 时灰树花菌丝干重达到最大；p h 予7 5 时灰树花对硒的富集量及对硒的有机化转化率达到最大。表明灰树花生长繁殖的 最适p h 与其富硒的最适p h 有差异，可能是因为菌丝生长的一些酶和其富硒作用 的一些酶的最适p h 不同以及p h 的变化影响到培养基中某些组分的解离和存在形 式进而影响到菌体对这些成分的吸收转化所导致。另外也能说明灰树花自身适合 微酸性环境生长。 江苏大学硕士学位论文 ( 2 ) 温度对灰树花富硒深层发酵的影响 试验结果如图2 1 9 至图2 2 l 所示。 卿 匿 缸 一 凹 v 蚓 牛 跫1 j 圈 0 0 0 0 0 0 o o o o 0 0 o o o 051 01 52 02 53 0 3 54 0 温度( 摄氏度) 图2 - 1 9 温度对菌丝干重的影响 f i g 2 - 1 9i n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r eo nd r yw e i g h to f m y c e f i u m 05l o1 52 02 5 3 03 54 0 温度( 摄氏度) 图2 - 2 0 温度对菌丝富硒量的影响 f i g 2 - 2 0i n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r eo nc o n t e n to f c o n c e n t r a t e ds e 6 0 会5 0 褥4 0 萎3 0 鼹2 0 亲1 0 0 051 01 52 02 53 03 54 0 温度( 摄氏度) 图2 - 2 1 温度对菌丝有机硒转化率的影响 f i g 2 - 21i n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r e o no r g a n i cc o n v e r t i n gr a t e 温度是影响微生物生长代谢的关键因素之一。从上面三图不难发现：当温度 为2 5 c 灰树花菌丝积累和其对硒的有机化转化作用均达到最高，而且当温度偏离 2 5 1 2 时无论是菌丝干重，还是