（制糖工程专业论文）壳聚糖酶解产物分子量分布的模拟及优化.pdf

摭要 摘要 壳聚糖是自然界中年产量仅次于纤维索的第二大天然高分子，也是迄今发现 魏难天然碱毪多赣。绦聚零溶穗蠢聚糖囊予买蠢撬越懿耪蠢二馒蔟帮猿特酶垒淫 活性而越来越受到关注。酶法降解箍聚糖怒制备低聚水溶性壳聚糖最有前途的一 秘方法。羞缝预测菜秘其存工韭纯藩景瓣黪耱对炎聚棼簿群豹产携分予鬣分毒并 能进行优化，则将对提高目标产物的收回率具有黧要的指导意义。本文通过计算 极模数豹方法砖忿避行磅究，懿期在镆短瓣薅闻毖取褥褒实戥孛装要缀长嚣耀才 能得到的结果，使熊及时为生产过程的优化决策提供依据。 蠢聚耱酶疑条转敷礤究是壳聚糖酶熬褥墩实施戆基旗。本文善先以徐揍後 宣、稳定性好的木瓜溢白酶作为酶解剂，研究了反应温度、p h 、酶浓度、底物浓 度、毙聚糖脱乙酝发和反应时闯等爱应条传对酶群过程的影响，确定最逡豹反成 条件；通过计算机模拟，建藏了壳聚糖脱乙酰度与g l c n a c g l c n 糖苷键相对含濑 的数举关联式；并结合实验对木艰骚自酶降解壳聚糖的特性进行了研究，发现， 木瓜鬣自酶对壳聚糖的降解机制是选择性蛾作用予g l c n a c g i c n 糖苷键。 谯了鳃本瓜蛋自酶降解嵬聚糖特性的鏊础上，根据壳聚糖分子结构特点，终 合组合数学、统计举秘m o n t e c a r l o 模拟方法，挺磁了“简化复琢”模拟思想， 对木瓜蛋白酶降解壳浆糖的产物分子量分布进行了模拟研究。结果表明，本文的 计算梳模拟方法得副耱结暴髓很好蟪反映炎聚糖降髂产秘懿分子慧分布趋势，w 作为竟聚糖降解产物分子量分布优化控制的基础。实验及模拟结果还揭示，降解 产耪分子量分布受鬻蠢聚糖脱乙酝凌移反纛过程水解度的影响，w 以将遮两个闲 素作为酶解产物分予麓分布优化的决策变擞。 本文还磷究露遗传算法辩分予麓分布滋行优健。速簧聱法是静模羧生耪程 自然界中的遗传和进化过程而形成的一种自适应全局优化概率搜索方法，它不须 求窭缀数静导数篷采确定蓑索方自，函露逶予零文豹优馥瓣逶。遗传箕法运行参 数是影响其运行效率的关键，本文采用均匀设计方法对运行参数进行优化。实例 优识绥莱表翻，逶避汝谤合瀵豹运移参数，透黄算法憨鸯效遮解决袁聚糖酶鬻产 物分子量分布的优化问题，鼠运行效率高，程序结构简单。 本文提爨戆模羧愿恕寒溪采溪瓣模接、佐纯方法能鸯效遗勰决本窳爨鑫酶骚 解壳聚糖的产物分予蹙分布的优化问题，对生产过程的优化决策舆有重鼷的指导 意义秘实骣瘦鼹徐蘧。 关键镪：夷聚糖簿解 本瓜爨垒酶；分予量分毒；诗箕瓠模羧；傥纯 华南理工大学工学博士学位论文 a b s t r a c t c h i t o s a n ，t h em o s ta b u n d a n tp o l y s a c c h a r i d eo nt h ee a r t ha f t e rc e l l u l o s e ，i st h e u n i q u e a l k a l i n e p o l y s a c c h a r i d e t h a th a db e e nf o u n di nt h en a t u r e t h ec h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sa r ei nm a n yr e s p e c t su n i q u ea m o n gg l y c a n s 。a n di t sb i o l o g i c a la n d p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e sh a v eb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e di nr e c e n ty e a r s a tt h es a m e t i m e ，t h ed e v e l o p m e n to fv i a b l ep r o c e s s e sf o rh y d r o l y s i so fc h i t o s a ni s a t t r a c t i n g g r o w i n gi n t e r e s t e n z y m a t i cp r o c e s s e s h a v ea d v a n t a g e so v e rc h e m i c a lr e a c t i o n s ，s i n c e t h eh y d r o l y s i sc o u r s ea n dp r o d u c td i s t r i b u t i o na r es u h j e c tt om o r ef a c i l ec o n t r 0 1 i t w o u l db es i g n i f i c a t i v ei np r a c t i c a lt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n ( m w d ) o f e n z y m a t i ch y d r o l y s i sp r o d u c t s c o u l db e p r e d i c t e d a n d o p t i m i z e de f f e c t i v e l y i n e x p e c t a t i o no fg e t t i n gt h ed e s i r e dr e s u l t st h a tw o u l d c o n s u m eag r e a td e a lo ft i m ei n r e a ll i f ei nr a t h e rs h o r tt i m e ，t h ep r o b l e m sw e r es t u d i e db yc o m p u t e rs i m u l a t i o n i ti s i m p o r t a n t t o s t u d y t h e e n z y m a t i ch y d r o l y s i s c o n d i t i o n sf o ri n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n t h ee f f e c t so f r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，p h ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n ，c h i t o s a n c o n c e n t r a t i o na n dd e a c e t y l a t i o nd e g r e eo nh y d r o l y s i so fc h i t o s a nb yp a p a i n ，w h i c hi s l o w c o s ta n ds t e a d y ，w e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h es u i t a b l er e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e f o u n d t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nd e g r e e o fd e a c e t y l a t i o na n dr e l a t i v ec o n t e n to f g i c n a c g i c ng l y c o s i d i cl i n k a g e so fc h i t o s a nw a so b t a i n e db yc o m p u t e rs i m u l a t i o n ， a n di tw a ss h o w nt h a t p a p a i n a c t so nt h e l i n kb e t w e e n g l u c o s a m i n e a n d n - a c e t y l g l u c o s a m i n e u n i t s a “s i m p l i f i e d r e v e r t e d s i m u l a t i o nm e t h o d w a s p r o p o s e db a s e d o nc o m b i n a t o r i c s a n ds t a t i s t i c sc o n j u n c tw i t hm o n t ec a r l om e t h o d ，a c c o r d i n gt ot h ec h a r a c t e r i s t i c so f h y d r o l y s i so fc h i t o s a na n dt h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fc h i t o s a n i tw a sf o u n d t h a tt h e m e t h o dm e n t i o n e da b o v ec a ne f f e c t i v e l yp r e d i c tt h et r e n do fm w d o ft h ee n z y m a t i c h y d r o l y s i sp r o d u c t so fc h i t o s a n ，a n dm w d i nt h ep r o d u c ti s s t r o n g l ya f f e c t e db y t h e d e g r e e s o fd e a c e t y l a t i o na n dh y d r o l y s i s ，w h i c hm a yb et h et w ok e yf a c t o r s f o r o p t i m i z i n gt h em w d i nt h ep r o d u c t t h eo p t i m i z a t i o nf o rm w dw a su n d e r t a k e nb yu s i n gt h eg e n e t i ca l g o r i t h m s a b s i i r a c l ( g a ) g a i sas e l f - a d a p t i v ep r o b a b i l i s t i cs e a r c hm e t h o df o rt h eo v e r a l lo p t i m i z a t i o n ， w h i c hs i m u l a t et h eh e r e d i t ya n de v o l u t i o no fb i o l o g yi nt h eu a t u r e 。g ai ss u i t a b l ef o r t h es t u d yb e c a u s ei tn e e d n tt h ed e r i v a t eo ft h eo b j e c t i v ef u n c t i o nt od e t e r m i n ei t s s e a r c hd i r e c t i o n t h eg ao p e r a t i n ge f f i c i e n c yi sa f f e c t e db yt h eg ap a r a m e t e r s s t r o n g l y , a n dt h eg ap a r a m e t e r sw e r ec h o s e nw i t ht h ea i do fu n i f o r md e s i g ni nt h e p a p e r t ot e s t t h ee f f e c ta n dr e l i a b i l i t yo ft h em e t h o d ，t h eg aw a sa p p l i e dt oa l l e x a m p l e ，a n d i tw a ss h o w nt h a tt h eg ac a l lb eu s e d e f f e c t i v e l yf o rt h eo p t i m i z a t i o no f e n z y m a t i ch y d r o l y s i sp r o d u c t sd i s t r i b u t i o no fc h i t o s a n i tw a ss h o w nt h a tt h es i m u l a t i v ea n d o p t i m a lm e t h o da d o p t e dc o u l de f f e c t i v e l y s o l v et h eo p t i m a lp r o b l e mm e n t i o n e da b o v e t h er e s u l t so b t a i n e di nt h i s p a p e ra r e s i g n i f i c a t i v ei np r a c t i c a l k e yw o r d s ：d e g r a d a t i o no fc h i t o s a n ；p a p a i n ；m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n ；c o m p u t e r s i m u l a t i o n ；o p t i m i z a t i o n 1 1 i 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：莲降 日期：2 。；年y 月f i 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密叼。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名：酋永奢 新躲耗钾如 日期：2 。d 0 年r 月f 争日 日期：夕。j 年岁月2 0 日 第一章绪论 第一耄绪论 1 1 甲壳素、壳聚糖的存在及其物化性质 甲壳豢( c h i t i n ) 是广泛存在于盎下、蟹和瑟虫静井壳及藻类、菌类的细臆壁 之中【1 】、年产量仅次于纤维素的篇二大天然高分子，估计每年生物合成的资源高 达1 0 0 己堍之多睇j t 氇是逡今发聪的唯一的天然碱往多耱，英纯学名两母( 1 ，4 ) - 2 一乙酰氨基- 2 一脱飘d 葡萄糖，分子量为( 1 2 ) 1 0 6 ，氮含量约为6 3 。6 7 t 3 ”。 其体纯学络梅为释l ： o 强t - t 等壳素 f i g 1 - 1c h i t i n 甲壳索是里自色或灰国色、带透明茏定形的固体。大约在2 7 0 c 分解。甲壳 素大分子瓣列有黪，呈徽终维鼹状粒嘉黢最髂锻构，嚣其结最单元中分子链排列 顺序的不同，甲壳索可分为3 种多晶型物：a 、e 、y 塑。自然界中存在的甲壳 素多为a 型，它含整最丰富也最稳定砷j 。 乙酰腋基的存在，决定了甲淹素特拜的化学性质，使其具有生物綮合性和可 吸收性。甲壳素黝毒性极小，l d s o 为1 6 9 k g 。甲壳素的分子链是成柬或以平行方 向为主的徽晶形式存在，程结晶区域内，分子闯羰基与氨基之闽存在着强燕的氢 键。甲壳素分子链的紧密瓴裹作用和结晶区内强烈的氢键使其化学反应活性很低， 胀澜性藕溶解佳蓑，只溶予浓盐酸、硫酸、磷酸、无承蜂i 酸、三氯乙酸，二氯军烷、 二甲基乙酰胺氯化锂等一系列特殊的二元或多元溶剂中，几乎不溶于常用的有机 溶剂、水、稀酸、稀或浓碱中p 鳓，这大大限制了它翦蜜际应用。 壳聚糖( c h i t s o t a n ，简称c t s ) 是甲壳素经脱乙酰他的产物，是由b 一( 1 ，4 ) ，2 一鬣基2 一簸氧，d 葡萄耱单元j 摹拜蠡一 o 羟乙基壳聚糖；。为：壳聚糖 o 羟乙基壳聚糖 o 羧甲基 壳聚糖。在非均相反应中，具有一定取代度的n 乙酰化壳聚糖比壳聚糖容易水解， 但当脱乙酰度小于3 6 时，由于壳聚糖不能溶解，而难以被水解。壳聚糖酶的最 适p h 为4 0 6 8 ”“。 不同来源的壳聚糖酶水解不同的底物。对壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖的 底物特异性进行研究表明，b a c i l l u s p u m i l u sb n 2 6 2 和s t r e p t o m y c e ss p n 1 7 4 产生 的壳聚糖酶对壳聚糖进行降解后得到寡糖的还原端含有g i c n a c 或者g l c n 基团， 非还原端只含有g i c n 基团，表明，这些壳聚糖酶切断壳聚糖的g i c n a c - g l e n 和 g l c n g i c n 糖菅键【9 0 】。f e n t o n 和e v e l e i g h 已经报道，p e n i c i l l i u mi s l a n d i u m 产生 的壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖后得到寡糖的还原端只有g l c n a c 基团， b a c i l l u ss p n o 。7 m 产生的壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖后，寡糖的还原端和非 还原端都含有g i c n 基团，说明壳聚糖酶只能特异性切断壳聚糖的g i c n g l e n 糖 苷键；而s g r i s e u sh u t 6 0 3 7 和b c i r c u l a n sm h k l 产生的壳聚糖酶不仅切断壳聚 糖的g l c n g l c n 糖苷键，而且切断g i c n g i c n a c 糖苷键，因此，寡糖还原端末端 只有g l c n 基团【8 ”。 f u k a m i z o 根据壳聚糖酶特异性切断部分乙酰化壳聚糖的信息提出以下假设， 壳聚糖酶邻近催化位点的两个亚单位之一对g l c n a c 基团亲和力很小，只能结合 g i c n 基团，然而，另一个亚单位比较灵活，能够同时识别g l c n a c 和g i c n 基团。 因为( g l c n ) 。以b 一( 1 ，4 ) 糖苷键相连而构成不同的构型( n 或b 型) ，所以， 当与壳聚糖酶作用时，( g l c n ) 。的氨基基团可以在溶液中发生构型转换而与结合 位点结合9 1 1 。 对于壳聚糖酶的降解产物构型特异性，f u k a m i z o 研究发现，从s t r e p t o m y c e s s p n 1 7 4 菌株产生的壳聚糖酶降解( g l cn ) 6 的产物都是d 型，所以，壳聚糖酶是构型 第一章绪论 转化酶【9 1 1 。b a c i l l u sp u m i l u nb n 2 6 2 的壳聚糖酶也得到同样的结果。这种特异性 依赖催化位点的精细结构，在碳水化合物酶中，催化位点的两个催化羧基在构型 保留酶中紧密相连，例如溶菌酶【9 ”，但是在转化酶中距离很远，对s t r e p t o m y c e ss p n 1 7 4 菌株的壳聚糖酶定位突变研究发现，氨基酸g l u 2 2 和a s p 一4 0 可能为催化基 团，在该酶的三维结构中，两个催化基团的羧基距离为1 3 8n m ，所以，这与壳 聚糖酶为转化酶的假设相一致。对于不同来源的壳聚糖酶在降解壳聚糖时的产物 构型特异性也可能不相同，需要对这些壳聚糖酶进行深入研究。 然而，由于壳聚糖酶价格昂贵，不易得到，因此，目前尚难实现工业化的壳 聚糖降解，而只限于科学研究中应用7 吼8 0 】：另一方面，由这些微生物酶降解壳聚 糖所得到的产物，其聚合度较低( 阼5 ) 。 1 4 1 2 溶菌酶 溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 存在于鸡蛋蛋白、人的血清及唾液中。溶菌酶的天然底物 为某些真菌细胞壁中的粘肽( p e p t i d o g l y e a n s ) 、甲壳素以及部分n 乙酰化壳聚糖。 n i s h i m u r a 等的研究发现，在3 0 时，取代度为0 8 0 的水溶性。一羧甲基- 甲 壳素( c m c h i t i n ) 很容易被鸡蛋白中的溶菌酶所降解，它的粘度在1 6h 内从6 0 d g l 下降到0 4d g l 。另一方面，高羧甲基化的壳聚糖则很难降解f 9 3 1 。h j e r d e 等 用鸡蛋白中的溶菌酶对取代度为0 6 5 1 5 、乙酰化度为0 8 5 - 0 9 5 的c m c h i t i n 在 p h 5 3 、离子强度为0 1 ( m ) 的条件下进行降解，发现，反应符合米氏方程动力 学模型。研究同时表明，降解速度随着乙酰化度( 凡) 的提高而提高，随着。一 羧甲基化程度的提高而降低。另外，3 o 位置上的羧甲基对速度的降低作用大于 6 o 位置上的羧甲基【9 4 】。 f u k a m i z o 等研究在连续流动系统中溶菌酶对甲壳低聚糖的催化水解作用。将 甲壳低聚糖溶液作为底物通入连续流动系统一一超滤设备中，并通入溶菌酶溶液， 然后将产品滤出。通过高性能凝胶过滤进行分析。发现，当以( g l c n a c ) 5 作为 底物时，产物( g l c n a c ) 1 。4 的浓度在当流出液的体积为设备内体积的6 倍时达 到稳定。在达到稳定之前，产物的分布与在封闭系统中的酶解过程有很大的差别。 相比于( g l c n a c ) 和( g l c n a c ) 2 ，( g i c n a c ) 3 5 有延时作用，而这种延时作用 在使用【a s p l 0 1 或t r p 6 2 改性溶菌酶代替天然溶菌酶时可得到缩短，因此认为， 这种延时作用是由于非生产性的联结存在于寡糖和溶菌酶分子之间。在流动的酶 促反应系统中，产物的释放受到酶和产物亲合力的强烈影响。在不同的试验条件 下产物的分布还受到转稽基作用的影响。达到稳定状态时，产物的分布和在封闭 条件下很相似。而转糖基作用很可能改变反应的过程，在研究酶的活性时要注意 这一点9 甜。 i s h i g u r o 等研究发现，以聚合度为10 0 0 以上的部分脱乙酰甲壳素作为底物， 经溶菌酶作用的水解产物的聚合度约为1 1 。迸一步研究认为，溶菌酶的亚单位d 华南理工大学工学博士学位论文 在水解过程中优先水解含有g i c n a c 的单元】。m u z z a r e l l i 研究鸡蛋白中的溶茵 酶对m e t h y lp y r r o l i d i n o n e 一壳聚糖的降解作用，得到了有关的动力学数据。其中米 氏常数为1 1 0 一m o l l 。以1 0 9 对妄作图可观察到其存在线性关系。在 1 0 5 0 r a i n 内，粘度的下降和温度呈线性关系，而不受初始底物浓度的影响。研究 证明了壳聚糖的生物适应性和可吸收性，为其作为绷带等可被人体吸收的医用材 料提供了重要的依据9 7 1 。h j e r d e 等对鸡蛋白中、人乳汁中和血清中的溶菌酶对壳 聚糖的降解作用的动力学进行了研究，对于不同乙酰化度的壳聚糖样品，其酶解 过程受p h 值的影响情况为，p h 4 5 时的降解速度比在p h 7 0 时大约高5 倍，其最 佳的p h 值在4 左右。底物特异性受p h 影响很大，而受离子强度的影响很小。同 时表明，不论是鸡蛋白中的溶菌酶，还是人体内的溶菌酶，它们有相同的底物特 异性。降解速度随着脱乙酰化度的提高而降低5 9 4 9 踮加0 。 对于鸡蛋白中的溶菌酶，有以下关系式： r 一日3 = ( 1 一d d ) ” ( 1 - 1 ) 式中，为壳聚糖在体内溶菌酶催化作用下降解的速度；r 为壳聚糖乙酰化度； d d 为壳聚糖脱乙酰化度。当n 5 5 时较难溶解， 故p h 选定在3 0 5 0 ) ，加入一定量的壳聚糖，配制成浓度为1 0g l 的壳聚糖溶 液，在壳聚糖溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，使m ( 酶) ：，l ( 底) = 2 ，在振荡条件 下反应6h ，测定还原糖的释放值，重复实验4 次，取平均值计算降解速度，结 果如图2 3 所示。 p h 值对酶分子上的氨基酸残基的解离状态有重要的影响，而酶分子侧链的不 同解离状态可能直接影响底物的结合和进步的催化反应，也可能影响到酶的空 问结构，从而影响到酶的活性。因此，酶促反应必然有一个最适的p h 值。从图 2 3 可见，在木瓜蛋白酶催化壳聚糖降解的过程中，p h 4 0 时反应速度最快，此即 为最适p h ，在高于或低于此p h 值时，木瓜蛋白酶的侧链的解离状态和空问结构 的综合作用不利于其与壳聚糖的结合。 华南理工大学工学博士学位论文 图2 2 温度对酶促反应的影响 f i g 2 - 2e f f e c to ft e m p e r a t u r e o nt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i s 图2 - 3 p h 对酶促反应的影响 f i g 2 - 3e f f e c t o f p 8 o nt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i s 2 3 3 酶量对酶促反应的影响 在4 5 c 和p h 4 0 的乙酸乙酸钠缓冲液中，加入一定量的壳聚糖，配制成浓 度为1 0g ，l 的壳聚糖溶液，在壳聚糖溶液中加入不同量的木瓜蛋白酶，使 m ( 酶) ：m ( 底) 分别为o 5 、1 o 、1 5 、2 o 、5 0 、1 0 o ，在振荡条件下反应 6h ，分别测定还原糖的释放值，重复实验4 次，取平均值计算降解速度。结果如 图2 4 所示。 第二章木瓜蛋白酶降解壳聚糖的动力学研究 m ( 酶) ：m ( 底) 图2 - 4 酶量对酶促反应的影响 f i g 2 - 4e f f e c to ft h er a t i oo fe n z y m et os u b s t r a t eo nt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i s 由图2 - 4 可见，在相同的条件下，随着酶浓度的增加，还原糖释放速率线性 的增加，表明，在实验条件范围内，壳聚糖的降解速度与木瓜蛋白酶的用量成正 比。这是因为在实验的浓度范围内，底物相对于酶量是大大过量的，当酶浓度增 加时，酶和底物碰撞的机率增加，作用的机率也随之增加，具有级反应的物征。 2 3 4 底物浓度对酶促反应的影响 在4 5 c 和p h 4 0 的乙酸乙酸钠缓冲液中，配制不同浓度的壳聚糖溶液( 因 为壳聚糖浓度大于2 5 时粘度太大，因此，在本实验壳中聚糖的浓度范围取 0 0 2 4 0g l ) ，加入一定量的木瓜蛋白酶，使m ( 酶) ：m ( 底) = 2 。在振荡条件下反 应1h ，测定还原糖的释放值，重复实验4 次，取平均值计算降解速度，结果如 图2 5 所示。 ， 二 曼 斟 制 辎 涎 搬 隧 吲 底物浓度( g l 1 ) 图2 - 5 底物浓度对酶促反应的影响 f i g 2 - 5e f f e c to fs u b s t x a t ec o n c e n t r a t i o no nt h ee n z y m a t i c h y d r o l y s i s 华南理工大学工学博士学位论文 由图2 - 5 可见，随着底物浓度的增加，还原糖释放速率也随着增加，但增加 的幅度先较大后趋于缓慢。这量由于随着底物浓度的增加，单位时间内酶和底物 碰撞结合的机率增大，但当底物浓度增大到一定程度后，酶开始被底物“饱和”， 此时底物浓度增大而引起反应速度增大的效果越来越不明显。 2 3 5 反应过程还原糖含量的变化 在4 5 。c 和p h 4 0 的乙酸- 乙酸钠缓冲液中，加入一定量的壳聚糖，配制成浓 度为1 0g l 的壳聚糖溶液，在壳聚糖溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，使 m ( 酶) ：m ( 底) = 2 ，在振荡条件下反应，并于不同的时刻分别测定体系中还原糖的 释放值，结果如图2 6 。 图2 6 反应过程还原糖释放量的变化 f i g 2 - 6c h a n g e o f r e d u c i n gs u g a r i nt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i s 从图2 - 6 可见，反应在0 6h 内，体系中还原糖含量随反应时间的增加而线 性增加，这一阶段酶促反应速度可视为恒定，即为反应初速度。随后，还原糖含 量增加趋于缓慢，这可能一方面是因为随着反应的进行，底物分子上可水解的糖 苷键不断地减少；另一方面是随着反应时间的延续，酶的活性也逐渐降低；而且， 随着反应的进行，可能有一些副反应出现，这些都将导致以上现象的出现。 2 3 6 脱乙酰度对壳聚糖降解性能的影响 将4 种不同脱乙酰度的壳聚糖样品( 1 0g l ) 与木瓜蛋白酶( 卅( 酶) ：小( 底) = 2 ) 在4 5 和p h 4 0 的乙酸乙酸钠缓冲液中充分溶解后水解ih ，分别测定其还原糖 释放值，结果如图2 7 。 图2 7 表明，壳聚糖的脱乙酰度对其降解性能有明显的影响，随着脱乙酰度 的提高，其降解速率降低。然而，这种定性规律的背后，水解速度与壳聚糖的脱 乙酰度之间是否存在一个定量的依赖关系? 下面将进行详细的研究。 第二章木瓜蛋白酶降解壳聚糖的动力学研究 脱乙酰度 图2 7 脱乙酰度对酶促反应的影晌 f i g 2 - 7e f f e c to fd e a c e t y l a t i o nd e g r e eo fc h i t o s a no nt h ee n z y m a t i c