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罗非鱼下脚料制取胶原肽研究 摘要 广西是罗非鱼养殖及加工出口主要基地。罗非鱼加工过程中产生的大 量鱼骨、鱼鳞、鱼皮等下脚料，目前都未能得到很好的利用。本文以罗非 鱼加工下脚料为原料，在制备胶原肽的同时将鱼骨鱼鳞中的钙转化为活性 钙，同时获得两个高附加值产品，具有良好的经济价值和社会效益。 论文研究了有机酸脱除鱼骨鱼鳞钙的酸化条件及钙回收条件，结果表 明，乳酸比柠檬酸具有更强的溶解鱼骨鱼鳞钙的能力。采用2 0 乳酸，以 1 ：9 固液比3 5 。c 下酸解骨鳞原料1 0 h ，鱼骨磷中钙的溶出率为8 8 1 2 。浸 酸清液经真空浓缩至6 2 - 6 7 浓缩比后，将浓缩液循序降温至50 c 并保持 3 h ，使乳酸钙结晶析出。经固液分离、精制、干燥后，得到纯度为9 8 3 乳酸钙晶体。 研究了酶法制备胶原肽工艺。以蛋白质水解度为评价指标，比较动物 蛋白酶、风味酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和a l c a l a s e 酶的酶解效率，确定 a l c a l a s e 酶和胰蛋白酶为最佳酶。采用正交试验研究单酶水解最佳作用条件 并比较多酶水解方式对酶解效率的影响。结果表明：下脚料首先加入 3 0 0 0 u g 的a l c a l a s e 酶，在5 5 。c 、p h7 5 下酶解4 h ，再加入3 5 0 0 u g 的胰 蛋白酶，在5 0 。c 、p h 8 0 下酶解4 h ，这种双酶分步水解方式，胶原蛋白水 解度最终达到4 1 2 1 。 研究了罗非鱼下脚料酶解液的脱腥脱色工艺。以活性炭为吸附剂，以 t 感官评价值和蛋白质损失率为评价指标。在水解液中添加1 o 的活性炭， 温度4 0 。c 保温搅拌3 5 m i n 后，腥味显著减弱，与此同时，蛋白质损失7 0 6 ， 脱色率达到4 2 7 ，表面疏水性指数s o 为2 6 9 。最终经过真空浓缩，干燥 后，可制成得率为2 5 9 7 的粗肽。 采用t r i c i n e s d s p a g e 电泳法测定罗非鱼下脚料胶原水解物的相对分 子质量，结果显示，水解物主要由三部分组成，它们的相对分子质量为 3 9 4 k d a 、6 3 k d a 和2 7 9 k d a 。 采用截留分子量分别为1 0 k d a 、5 k d a 的超滤膜分离胶原水解物，将胶 原水解物分离为三个组分：t h b u - i ( m 1 0 k d a ) 、t h b u i i ( m - 5 1 0 k d a ) 、 t 皿u - i i i ( m 5 k d a ) 。这三个组分分别占水解物的1 0 8 3 、1 7 4 9 、7 1 6 5 。 说明罗非鱼胶原水解物以小分子胶原肽为主，其中8 9 的水解产物平均相 对分子质量小于1 0k d a 。 比较经超滤膜分离后的三个胶原肽组分对d p p h 自由基、努自由基 ( o h ) 、超氧阴离子自由基( 0 2 。) 、h 2 0 2 的抑制作用及抗脂质过氧化作用， 结果显示，三个组分均具备一定得抗氧化活性，同时随着胶原肽相对分子 质量越小，其抗氧化活性越高。其中t h b u i i i ( m 5 k d a ) 对清除o h 、h 2 0 2 的能力和抗脂质体抗氧化活能力与v c 十分接近。 关键词：罗非鱼下脚料钙酶解胶原肽抗氧化 i i s t u d i e s0 ne x t r a c t d 寸gc o l l a g e nf r o mt i l a p i a b y p r o d u c t a bs t r a c t g u a n g x ii st h em a i nc u l t u r ea n de x p o r t p r c e s s i n gb a s ef o rt i l a p i a d u r i n g t h ep r o c e s s i n g ，l a r g en u m b e ro fb y p r o d u c ts u c ha sf i s hb o n e s ，f i s hs c a l e s ，f i s h s k i nw e r ep r o d u c e d h o w e v e r , m o s to ft h e mw e r en o tu t i l i z e dp r o p e r l y i nt h i s t h e s i s ，p r e p a r a t i o no fc o l l a g e np e p t i d ef r o mt i l a p i ab y p r o d u c t ( t b e ) w a ss t u d i e d a n dt r a n s f o r m a t i o nc a l c i u mo ff i s hb o n e sa n df i s hs c a l e si n t oa c t i v a t e dc a l c i u m o b t a i n e dt w oh i 曲a d d i t i o n a lv a l u ep r o d u c t i o n ss y n c h r o n o u s l ya n dh a sg o o d e c o n o m i cv a l u ea n ds o c i a lb e n e f i t t h ed e c a l c i f i c a t i o na b i l i t yo fc i t r i ca c i da n dl a c t i ca c i do nc a l c i u mo f f i s h b o n ea n ds c a l eo ft i l a p i aw e r ec o m p a r e d l a c t i ca c i dw a su s e df o r d e c a l c i f i c a t i o ni nt h ep r o c e s s i n go ft i l a p i ac o l l a g e np e p t i d e f o ri t h i g h c o n v e r s i o na n dt h e nc a l c i u ml a c t a t ew a sp u r i f i e da n dr e c y c l e d 8 8 1 2 o f c a l c i u mi nb o n ea n ds c a l eo ft i l a p i ad i s s o l v e di nw a t e rw h e nf i s h b o n ep n ds c a l e w a ss o a k e di n2 0 l a c t i ca c i ds o l u t i o nu n d e r35 f o r10h o u r s ，w h i l et h e r a t i oo ff e e dt ol i q u i dw a s1 ：9 t h ec l a r i f i e dc a l c i u ml a c t a t es o l u t i o nw a s c o n c e n t r a t e dt o6 2 - 6 7t i m e su n d e r0 1 m p av a c u u ma n dt h e nw a sc o o l e d i i i g r a d u a l l yt o50 ca n dk e e pf o r3h o u r sf o rf o r m i n go fc r y s t a lo fc a l c i u ml a c t a t e a n ds e p a r a t i n gi tf r o ma c i ds o l u t i o n t h r o u g hs o l i d li q u i ds e p a r a t i o n ，r e f i n i n g a n dd r y i n g ，9 8 3 o fp u r i t yc r y s t a lo fc a l c i u ml a c t a t ew a sg o t t h et e c h n o l o g yo fp r o d u c t e dc o l l a g e nh y d r o l y s a t e sb ye n z y m o l y s i sw a s s t u d i e da n de v a l u a t e dw i t hh y d r o l y s i sd e g r e e t h ee n z y m o l y s i se f f i c i e n c yo f a n i m a lp r o t e i n a s e ，f l a v o re n z y m e ，a l k a l i n i t yp r o t e i n a s e ，t r y p s i na n dt h ea l c a l a s e e n z y m ew e r ec o m p a r e da n dt h e nt h ea l c a l a s ee n z y m ea n dt r y p s i nw e r es e l e c t e d f o rf u r t h e rr e s e a r c h t h eo p t i m u mh y d r o l y s i sc o n d i t i o nw a ss t u d i e db yu s i n g o r t h o g o n a le x p e r i m e n t a tf i r s tc o l l a g e nw a s h e a t e dd i r e c t l yf o r4 ha tp h7 5a n d 55 cb ya d d e da l c a l a s ee n z y m e30 0 0 u go fc o l l a g e n ( s o li dt ol i q u i dw a s1 ：4 ) a n dt h e nc o l l a g e nw a sh e a t e dd i r e c t l yf o r4 ha tp h 8 0a n d5 0 。cb ya d d e d t r y p s i n3 50 0 u go fc o l l a g e n ( s o l i dt ol i q u i dw a s1 ：4 ) a tl a s t ，i tw a ss h o w e dt h a t h y d r o l y s i sd e g r e eo fp e p t i d ew a s 41 21 h y d r o l y s i sd e g r e eo f p e p t i d ew a ss t i l l 4 0 0 2 w h e n8t i m e so ft r e a t m e n t t h et e c h n o l o g yo fr e m o v i n gf i s h ya n dd e c o l o r a t i o nf o rt h ee n z y m i c h y d r o l y s a t e so ft i l a p i ab y p r o d u c tw a ss t u d i e d a c t i v a t e dc a r b o na st h ea d s o r b e n t a n dt h er a t eo fp r o t e i nl o s ta n ds e n s o r ye v a l u a t i o na st h ee v a l u a t i o nc r i t e r i o n t h ef i s h ys m e l lw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h e nt h er a t eo fp r o t e i nl o s tw a s7 0 6 ， d e c o l o r a t i o nr a t ew a s4 2 7 a n ds u r f a c eh y d r o p h o b i c i t yw a s2 6 9w h e nt r e a t e d b y1 o o fa c t i v a t e dc h a r c o a la n du n d e r4 0 。cf o r35 m i n a n df i n a l l y , t h r o u g h t h ep r o c e s so fv a c u u mc o n c e n t r a t i n ga n dd r y i n g ，2 5 9 7 o fc r u d ep e p t i d e sy i e l d w a sg o t t h em o l e c u l a rm a s sw e i g h to ft i l a p i ab y p r o d u c tw h i c hw a se n z y m o l y s i s e d w a sa c c u r a t e l yd e t e r m i n e db yt r i c i n e s d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i s t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h eh y d r o l y s a t e sm a i n l yc o m p o s e db yt h r e ec o m p o n e n t s a n dt h e i r r e l a t i v em o l e c u l a rm a s sw a s3 9 4 k d a ，6 3 2 k d aa n d2 7 8 7 k d a u l t r a f i l t r a t i o nt e c h n i q u e sw e r ep e r f o r m e dt op u r i f yc o l l a g e nh y d r o l y s a t e so f t b ea n dt h e yw e r ec u to f fi n t o3p a r t sb yu l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n e sw i t h10 k d a m w c o ( m o l e c u l a rw e i g h tc u t o f f ) ，5 k d am w c or e s p e c t i v e l y ：t h b u i ， t h b u i ia n dt h b u i i i t h e i rc o n t e n t sw e r e1 0 8 3 ，1 7 4 9 a n d7 1 6 5 r e s p e c t i v e l yo fh y d r o l y s a t e s s oc o l l a g e nh y d r o l y s a t e so ft b ew e r em a i n l y c o m p o s e db ys m a l lm o l e c u l a rc o l l a g e np e p t i d e s a n d8 9 o f a v e r a g em o l e c u l a r w e i g h tw a ss m a l l e r t h a n10 k d a t h ei n h i b i t o r ye f f e c t so fd p p hr a d i c a l ，+ o hr a d i c a l ，i - i ：0 2a n da n t i l i p i d p e r o x i d a t i o ne f f e c t f o rc o l l a g e np e p t i d e sa f t e ru l t r a f i l t r a t i o n s e p a r a t i o nw e r e c o m p a r e d t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h et h r e e c o m p o s i t i o n s a l lh a dc e r t a i n a n t i o x i d a n ta c t i v i t y a n dt h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t yw a ss t r o n g e rw h e nt h e m o l e c u l a rw e i g h to fc o l l a g e np e p t i d e sw a ss m a l l e r t h e 。o hs c a v e n g i n ga c t i c i t y , h 2 0 2s c a v e n g i n ga c t i c i t ya n da n t i l i p i dp e r o x i d a t i o na c t i c i t yo ft h b u - 1 1 1w e r e v e r yc l o s e dt ov c k e yw o r d s ：t i l a p i a ；b y p r o d u c t ；c a l c i u m ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；c o l l a g e n p e p t i d e ；a n t i o x i d a n ta c t i v i t y v 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得 的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名 单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人 已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对 本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均己在论文中明确说明并致 谢。 论文作者签名：目彳 j 哆年月谚日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 函| 】时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：商净导师签名：。i t i 羚少哆年二月) 日 广西大掌硕士学位论文 罗j e 鱼下脚料制取胶原肽研究 1 1 胶原蛋白 1 1 1 胶原蛋白的概念 第一章绪论 胶原蛋白( 也称胶原) 是细胞外基质( e c m ) 的主要成分，英文名“c o l l a g e n ”是由希腊文 演化而来，意为“生成胶的物质”。胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质。 分子含糖及大量甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，是很多脊椎动物和无脊椎动物体内含量最 丰富的蛋白质，属于结构蛋白质，主要存在于动物的皮肤、骨、软骨、牙齿、肌键、韧 带、血管中及其他结缔组织中，是结缔组织重要的结构蛋白质。也是哺乳动物体内含量 最丰富、分布最广的一种蛋白质，约占哺乳动物总蛋白的1 3 ，起着支撑器官、保护机 体的作用。从动物中提取不同组织中不同类型的胶原蛋白，其功能和作用也不同【1 1 。 随着生物化学的发展，人们对胶原蛋白的认识逐渐提高，现在已经肯定胶原蛋白和 免疫球蛋白一样，富有多样性和组织分布的特异性，是与各组织、器官机能有关的功能 性蛋白【2 】。 1 1 2 胶原蛋白的结构 胶原蛋白的结构为三条多肽链螺旋组成，并且每条肽链都是左手螺旋构型，三条 左手螺旋a 链彼此间相互缠绕，形成右手螺旋结构。每条q 肽链由多达3 0 0 个以上的 g l y x y 三联体重复构成，两端连接具有不同结构的其它小片段。组成胶原蛋白的氨基 酸残基均为a 氨基酸，其中x ，y 是g l y 之外的任何氨基酸残基，但x 通常是p r o ，胶 原螺旋中g l y p r o x 占全数g l y x y 三肽总和的三分之一，y 通常是不由d n a 碱基密 码子编码的羟脯氨酸( h y p ) ，它是在蛋白质一级结构序列形成之后由特定的酶一脯氨酸 4 羟化酶作用于序列中的p r o 形成的，h y p 羟基通过分子间氢键对稳定胶原螺旋结构 起着非常重要的作用1 3 州；另外，还含有一定量的羟赖氨酸( h y l ) ，它具有与i ! y p 相类似 的作用。由于p r o 和h y p 的侧链是环形的，它们的a 碳和酰胺氮之间的键不能旋转， 因此高含量的这些氨基酸残基促进了a 肽链螺旋结构的形成和稳定。由于三重螺旋结 构是一种错位的结构，来自三条肽链的g l y 残基沿着螺旋的中心轴堆积。在三维空间 上，一条链上的g l y 处于和其它两条链的x 和y 残基相邻的位置，因此，每个g l y 残 基的n h 就与相邻的x 残基上的c = o 形成氢键。由于h y p 残基的羟基也参与链间氢 键的形成，三重螺旋结构得到了稳定和增强。 迄今，人们已发现了2 0 余种不同类型的胶原，至少有1 2 种胶原得到证实。生物 体内最常见的是i 型、i i 型和i i i 型胶原蛋白，这三种类型约占其总胶原蛋白的8 0 0 0 , - - 9 0 ， 广西大学硕士掌位论文罗非鱼下脚料制取胶原肽研究 它们都显示出或长或短的三股螺旋结构。其中以i 型胶原蛋白的含量最多，也是应用研 究中最感兴趣的胶原，主要存在于皮肤及骨组织中。i 型胶原蛋白由两条0 【( i ) 链，一 条a ( i i ) 链组成的螺旋肽链形成的胶原分子。每条链都含有1 0 5 2 个氨基酸残基。0 【( i ) 链和“i i ) 链只是在氨基酸顺序上有微小差异。其分子结构呈圆棒状，电镜下测量直径 约为1 5 n m ，长约3 0 0 n m 。 1 1 3 胶原蛋白的应用 1 1 3 1 胶原蛋白在医药品及药物材料的应用 d g o p i n a t h 等s l 研究认为，胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞 的迁移、分化和增殖，使骨健、软骨和皮肤具有一定的机械强度。又因其弱的抗原性和 良好的生物相容性，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、硬组织修复、创伤止血等医药 卫生领域用途广泛 6 1 。李国英、沈洪兴等报道认为，i 型胶原蛋白的主要功能是维持皮肤 和组织器官的形态和结构，也是修复各类损伤组织的重要组织材料，例如，在骨损伤修 复中起直接作用的主要是i 型胶原蛋白【7 1 ，对成骨细胞的粘附和分化起促进作用。 胶原蛋白的医学应用包括：胶原蛋白海绵、丝线和薄膜( 用于外科止血，如心脏 血管、神经、口腔、骨科、皮肤、妇产手术等) ；伤口敷料和人工皮肤( 用于伤口愈 合，如烧伤及慢性溃疡等) ；血管和心瓣膜( 用于心脏外科手术) ；胶原蛋白膜( 用 于口腔外科、促进牙周腱膜再生和口腔吸收性覆料) ；注射式胶原蛋白( 用于整形外 科去除皱纹、软组织丰满填充、治疗尿失禁与尿液回流以及骨科组织再生填料) ；人 工骨( 骨生长因子混合胶原蛋白膜、组织与骨修复用胶原蛋白、整形外科用胶原蛋白和 骨骼修复剂) 】。 1 1 3 2 胶原蛋白在化妆品中的应用 胶原蛋白是真皮皮层成分中重要的组成物质，它能够与弹性蛋白构成使人类皮肤具 有弹性和硬度的胶原纤维网状结构；并且胶原蛋白能够为皮肤表皮层提供水分和营养。 胶原蛋白与人体皮肤胶原的结构相似，分子中富含大量氨基酸和亲水基，具有一定的表 面活性和很好的相容性。 目前，胶原蛋白已经成为生产化妆用品的原料，它对皮肤有很好的护理作用。胶原 蛋白在欧美日韩等许多国家已经作为高档次化妆品的添加剂得到广泛的使用。水解胶原 蛋白以动物胶原蛋白为原料经过净化提纯、酶解、过滤、浓缩、喷雾干燥等处理而制成 的粉末状产品。水解胶原蛋白可以给人体提供合成胶原蛋白的氨基酸原料，尤其是胶原 蛋白中含有特殊的氨基酸，如羟脯氨酸和脯氨酸，人体皮肤中含有的胶原蛋白流失如果 能得到适时的补充，这将大大有利子人体皮肤胶原蛋白网状结构的形成，为皮肤提供必 需的营养成分，从而达到改善皮肤水分、皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢， 2 广西大掌硕士学位论文罗z l l z 鱼- - i r 脚料制取胶原肽研究 延缓皮肤衰老，对皮肤产生良好的滋润保湿、消皱美容作用【9 1 。 根据研究显示，使用胶原蛋白膏体涂布皮肤能改善表皮和真皮结构，并且使皮肤中 胶原蛋白合成得到很好的促进，真皮组织也得到了活化。同时大量亲水基团分布在胶原 蛋白的分子中，这些亲水基团能使胶原蛋白可以具备很好的保湿功能。当化妆品中胶原 蛋白含量为0 0 1 时，就可以供给人类皮肤平时所需的全部水分。正是由于胶原蛋白具 有乳化、稳定泡沫和p h 值的作用，所以化妆品需要添加它。并且胶原蛋白作为功能成分， 它可以大大降低碱、酸以及表面活性剂等物质对人类毛发与皮肤的损害【l 叭。与未经水解 的大分子胶原蛋白质相比，水解胶原蛋白在消化吸收、营养、功能特性等方面都具有显 著的优越性。 由于胶原蛋白类化妆品性能温和、功能多、安全性高，符合当代化妆品的潮流，近 几年来发展很快，正逐渐成为市场的新宠。 1 1 3 3 胶原蛋白在食品中的应用 胶原蛋白的独特品质，使它在许多食品中作为功能物质和营养成分，具有其它替代 材料无可比拟的优越性。 胶原蛋白是人体骨组织的重要组成物质。骨胶原蛋白是i 型胶原蛋白，由于它的分 子间彼此交联，最终形成的结构是纤维网状。骨中钙存在的形式大都以羟基磷灰石沉积。 在骨组织中其中有机物质占1 3 ，无机物质占2 3 ，其中胶原蛋白占人体骨组织有机物质 的8 0 以上，所以胶原蛋自对骨生物力学特性和维持骨结构的完整具有不可替代的作 用。所以每当骨胶原蛋白不正常代谢时，人体骨组织中的钙将没有办法得到沉积，最终 流失，这样往往就会导致各种骨骼疾病。只有摄入充足的胶原蛋白后，这样才能够使骨 胶原代谢得到促进，骨胶原的网状结构得到稳定，骨钙流失得到降低，达到防止各种骨 骼疾病的目的【1 0 1 。蒋挺大【l i 】经过大量研究，指出只有当人体摄入足够多的胶原蛋白时， 才会就大大提高摄取所需钙的能力，所以人体在补钙之前，首先应该补的是胶原蛋白。 香港大学预防疾病研究所王凯教授指出，如果缺少胶原蛋白，用补钙来防治骨质疏松， 再多的钙也无法改善。通过做小鼠试验，李彦春【l2 j 等指出，当胶原蛋白结合钙以后能够 使小鼠骨密度得到加强，并且能够很好的促进小鼠生长，骨质疏松的症状得到明显的好 转，证明了胶原在帮助钙吸收方面的重要作用。现在市场上已经出现了胶原蛋白与钙结 合骨骼保健类健康食品，可以预计，像这类的保健食品在以后的若干年内必将会成为市 场上的一个开发热点l lo j 。 日本等发达国家很重视新型高级调味品的开发与利用。日本以动物胶原蛋白为原料 经胶原蛋白水解酶水解，调制开发出新型调味品，这种调味品因其含有丰富的呈味氨基 酸，具有很好的呈味性能，同时还能补充部分氨基酬1 3 】。据有关专家估计，这些复合调 味料将取代味精，成为调味品工业的主要支柱。由于现今生活节奏的加快和现代化工作 的需要，人们对方便食品的需求量f i 益增大。近年来日本和台湾人均占有方便面数量逐 渐增加，体现自然风味和高品质的方便食品受到人们普遍欢迎，提高方便食品品质的一 g - 西大掌硕士掣啦论文罗非鱼下脚料制取胶原肽研究 个重要方面就是使用天然风味调味品，它能更好地体现食品的自然风味 1 4 1 。在国外，水 解蛋白作为新型食品添加剂问世己有十余年。在发达国家，高档调味品和汤料均使用了 植物水解蛋白和动物水解蛋白，国内部分独资和合资方便面生产企业也使用了进口的动 物水解蛋白作为调味剂，提高了产品档次，占领了很大的市场份额。 同时胶原蛋白作为食品材料的利用开发。胶原材料具有良好的皮膜形成能力和亲水 性，其紧密的螺旋结构和存在的结晶区，还赋予其一定的热稳定性，这些性能使胶原蛋 白在食品有着其它材料不可替代的优越性，胶原蛋白在食品材料中的应用主要有以下方 面：香肠、火腿肠衣和冻肉、熏鸡肉、油炸肉等包装膜胶原蛋白用作制造肠衣等食品 包装材料时，胶原膜具有阻氧、阻油、阻水，可携带抗氧化剂及抗菌载体，保香等功能 【l5 j ；另外，在热处理过程中，随着水分和油脂的蒸发和熔化，胶原几乎与肉食的收缩率 一致【l6 j 。食品添加剂胶原蛋白作食品添加剂，口感柔和，味道清淡，易消化，有强亲 水性能，是丰富的蛋白质营养源。据研究，通过改变胶原多肽原料和分解条件，还可使 之具有美容保健等功效。 1 1 4 水生动物胶原蛋白国内外研究现状 长期以来，人们都是使用猪、牛的皮和骨提取胶原蛋白和明胶。但因疯牛病、口蹄 疫等疾病的爆发，人们对牲畜胶原制品安全性产生疑虑，使哺乳动物胶原蛋白在功能性 食品、化妆品及药用产品的应用受到限制。另外，由于宗教和习俗等原因，有些地区也 不能使用牲畜胶原蛋白制品。近十几年来，许多的科学研究者开始关注起从水生资源中 提取明胶，并且先后也已经有了相应的研究。 有关鱼类胶原的最早研究，可追溯至2 0 世纪5 0 年代，日本学者高桥璺雄首先报道了 鱼皮中的胶原蛋白同陆生动物皮的胶原蛋白的差异。其后，陆续有学者开展了对海洋鱼 类胶原的研究，涉及的鱼种有鲶鱼、四班鳞鲆、鲽鱼、鲈鱼、香鱼、波罗的海鳕鱼等， 涉及的鱼体部位有鱼皮、鱼鳍、鱼鳞、鱼骨、鱼肉结缔组织等。但是，研究鱼皮胶原的 组成和特性的文章很少。有关淡水鱼胶原的研究则更少，仅涉及鲤鱼和鲫鱼。有关水产 动物胶原蛋白的研究表明，与猪、牛等陆生动物胶原蛋白相比，两者在多肽链组成、溶 解性、热稳定性等方面都存在显著不同。尤其是分布于鱼类真皮、肌肉等软组织中的胶 原蛋白，它们即使在低温下也易溶于中性盐溶液或稀酸，比较易于调制可溶性胶原溶液。 国； - b e n j a k u l 研究了牙鳕的废弃物的利用，将其废弃物( 包括鱼头、皮、骨、内脏和 肌肉组织) 绞碎，分别用中性和碱性蛋白酶水解，选择了最优酶和最佳水解条件，所得 产物蛋白质含量高，氨基酸组成与鱼肌肉十分相近。 t a k e s h in a g a i 等【l 。7 1 ，从鲣鱼( k a t s u w o n u sp e l a m i s ) 、日本真鲈( l a t e o l a b r a xi , - p o n i c u s ) 等鱼加工的废弃物鱼皮、鱼骨及鱼鳍中提取胶原蛋；t o s h i y u k i l k o m a 等 1 8 , 1 9 研究了从 海水鱼真鲷( p a g r u sm a j o r ) 和淡水鱼尼罗罗非鱼( o r e o c h r o m i sn i l o t i c u s ) 鱼鳞提取的i 型胶 4 广西大掌硕士掌位论文罗j 鱼下脚料制取胶原肽研究 原蛋白；a k k a s i t j o n g j a r e o n r a k 等 2 0 利用红鳍鳃和大眼鳄鱼皮明胶制备可食膜的研究： s h o s h im i z u t a 掣2 1 坝0 定了红鳍东方纯( t a k i m g ur u b r i p e s ) i 型胶原蛋白生物化学和免疫化 学特性；c 硒g o 等【2 2 】对墨鱼( s e p i ao f f i c i n a l i s ) 软骨胶原蛋白的进行了电泳及免疫实验，证 实墨鱼软骨中存在着各种类型的胶原蛋白。g u s t a v o 等使用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和真 菌蛋白酶对巴西龙虾加工废物中的蛋白质进行水解回收，所获得水解物无苦味、异味， 具有良好的乳化性以及极佳的溶解性和吸湿性。g u e r a r d 等以碱性蛋白酶为催化手段，研 究了黄鳍金枪鱼的加工下脚料的蛋白水解影响因素，并提出可供水解键的浓度是决定水 解速度的关键因素，同时证实了其水解物可作为微生物培养的氮源。 在国内，杨萍等用胰蛋白酶、风味蛋白酶单酶以及二者组合对青鳞鱼蛋白进行水解， 确定出最佳的水解条件。赵玉红等以鲢鱼副产物中的蛋白质为酶解底物，采用二次正交 回归设计研究了工艺参数对蛋白质回收率的影响，得出最优的水解条件。傅燕凤等f 2 3 】 利用淡水鱼链鱼、鳙鱼、草鱼鱼皮提取胶原蛋白。陈申如等【2 4 1 对多种鱼皮胶原蛋白进行 了纯化及酶解性质研究。陈胜军掣2 5 】对罗非鱼鱼皮酶解液降血压活性进行了研究：刘庆 慧等1 2 6 】研究了鱼鳞胶原蛋白对动物的有关生理功能，实验结果表明其提取的鱼鳞胶原蛋 白能有效防止实验性高胆固醇症的形成，并且具有明显的抗衰老作用。王长云探讨了低 酶水解法提取无苦味鳗鱼水解蛋白的方法。 1 2 本课题的立题背景、研究意义和主要研究内容 1 2 1 立题背景、研究意义 罗非鱼( t i l a p i a ) ，属于硬骨鱼类纲，鲈形目，丽鱼科，罗非鱼属。该属有六百多种， 目前被养殖的有十五种。罗非鱼原产非洲，因此俗名非洲鲫鱼。1 9 5 7 年从越南引进到我 国内地，又名“越南鱼”。目前我国养殖的主要有尼罗罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、奥利亚 罗非鱼。由于罗非鱼具有生长快、产量高、食性杂、适应性强、病害少、肉质洁白、营 养丰富、味道鲜美等特点，为不同国家、不同文化和宗教信仰的人们所接受。被作为联 合国粮农组织推荐的人类6 大主食之一。罗非鱼过去就是普通家庭的大众食品，现在受 到发达国家富裕阶层的欢迎，因此有“2 1 世纪水产品”之称。据最新的f a o 统计，预计到 2 0 1 0 年，全球各种罗非鱼产量可达2 5 0 万吨，总产值将达到3 0 亿美元【2 7 1 。 罗非鱼是我国淡水养殖产量提高较快的品种。中国是全球最大的罗非鱼生产国，约 占全球总产量的4 9 ，接近全球五成。2 0 0 7 年中国的罗非鱼产量达1 2 1 万吨，南方的广 东、海南、广西、福建成为最主要的4 大养殖区。产品出口逐年上升，已被国际市场接 受。鉴于广西在气候条件、群众养殖基础以及有适宜罗非鱼养殖的低洼地、低产f f l 和水 面等较多的优势，目前国家农业部已经把罗非鱼生产确定为广西的优势产业，广西2 0 0 6 年罗非鱼产量1 8 万吨，占全国总产量的1 6 2 。广西政府还出台了发展罗非鱼产业化开 广西大学硕士学位论文 罗a e 鱼下脚料制取胶原肽研究 发的相关鼓励政策，至1 j 2 0 0 7 年，广西罗非鱼养殖产量超过2 0 万吨，占全国总产量的2 0 ， 以出口基地带动的罗非鱼养殖初步形成产业化发展格局，产生了明显的社会和经济效 益。 目前，与发达国家及我国其它农产品加工现状相比，我国在水产品加工比例、加工 程度等方面都存在很大差距，罗非鱼的加工主要以冷冻鱼肉片出口为主【2 8 】。罗非鱼加工 产生了大量的加工下脚料，包括鱼皮、鱼骨、鱼鳞、内脏、碎肉等，约占全鱼重的6 0 - , 7 0 ， 这些下脚料含有大量蛋白质、氨基酸和微量元素，但是目前这些下脚料并没有得到有效 的利用，大多数工厂将之低价卖给粗放的饲料厂，进行简单的干燥后加工成为饲料，这 不仅造成资源的极大浪费，更严重的是直接导致环境的污染，而且也无形中增加了水产 加工企业的成本，并对环境污染产生一定压力。若能利用这些价格较低的蛋白质资源制 成各种精深加工产品，不仅能缓解我国蛋白质资源紧缺的局面，还能提高产品的附加值， 促进罗非鱼养殖加工产业良性发展，具有重要的经济价值和现实意义。 罗非鱼鱼体中鱼鳞、鱼皮、鱼骨都是具有利用价值的资源，其中鱼鳞和鱼骨中，钙 的含量达2 4 3 1 ，最主要的是羟磷灰石晶体和无定型磷酸氢钙。这是一种良好的钙源， 适于加工成钙剂。采用适宜的有机酸将羟鳞灰石钙转变为生物利用率高的有机钙，是有 效利用这种钙源的重要方法。 罗非鱼鱼体含有胶原的组织不仅存在于可食的肌肉、内脏器官中，且存在于覆盖体 表的鱼鳞、真皮及内部骨骼和软骨中。其中鱼鳞、鱼皮和鱼骨中含有大量的胶原蛋白。 利用罗非鱼肉片加工的主要副产物鱼骨、鱼鳞、鱼皮为原料用酶进行水解、再经过离心 分离纯化得到高纯度、具有生物活性的低分子量胶原肽，不仅解决了鱼罗非鱼加工的综 合利用问题，也可以满足特定人群的特殊需要，具有重大社会意义和经济价值。 1 2 2 研究内容 ( 1 ) 实现鱼骨、鱼鳞、鱼皮同时制备胶原肽的可能，解决不同组织来源原料( 主要 指鱼骨、鱼鳞) 预处理脱矿物质的问题。采用有机酸处理含有无机钙的鱼鳞和鱼骨，并 研究酸处理的条件，及钙回收的条件，以实现胶原肽生产的除杂目的，同时回收骨鳞钙， 获得生物利用率较高的生物钙产品。 ( 2 ) 为获得一定活性的胶原肽，优化酶水解工艺，使胶原降解的程度最大比。以蛋 白质水解度为指标，进行商品酶制剂的筛选及酶作用条件的优化，及酶处理方式的优化， 以高蛋白质水解度，确定酶水解制备胶原肽的最佳工艺及主要工艺参数。 ( 3 ) 解决下脚料水解得制备胶原肽，水解液色泽深及腥味明显的问题，选择合适的 吸附剂及脱腥脱色条件，获得好的产品感官品质。 ( 4 ) 分析罗非鱼下脚料水解产物( 胶原肽) 的相对分子质量，并比较胶原肽的活性( 抗 氧化活性) 与胶原肽相对分子量( 分子大小) 的关系。 6 罗j 仁鱼- i r 脚料制取胶原肽研究 2 1 前言 第二章罗非鱼胶原肽制备中钙回收工艺的研究 钙是维持生命和健康不可缺少的物质，在生命活动中扮演重要角色。现代医学表明， 钙作为体内信使物质在人体活动中传递信息，起到调节新陈代谢、神经系统、内分泌系 统和心脏活动等作用，几乎参与了人体所有正常的生理活动。目前市场上用于食品强化 及钙源的主要有两大类：无机钙盐及有机钙盐。 无机钙盐主要有：碳酸钙和磷酸钙。它们钙含量相对高且价格低廉，但它们不能直 接为机体所吸收或吸收很少。这些无机钙盐溶解度小，大多是强碱弱酸盐，食用后对胃 肠道有刺激强烈。同时，它们各自还存在不足，比如碳酸钙会产生皂或柠檬酸味，使用 后会消耗大量胃酸；磷酸钙中所含的磷会使钙磷比失调，不利于钙的吸收利用。 有机钙盐主要有：柠檬酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙等。有机钙盐有较高溶解度、生 物利用率高和接近自然风味等优点。其中，乳酸钙是我国传统的钙补充剂，因其易于溶 解成为非常理想的饮料和液体产品的钙源。比较各种钙盐溶解度：乳酸钙5 4 、葡萄 糖酸钙3 9 、柠檬酸钙0 0 9 6 ，可以看出乳酸钙比其他的钙盐更易溶解于水【2 9 1 。同时， 乳酸钙吸收率与其它有机钙盐相对较高。 鱼鳞和鱼骨中，钙的含量达2 4 31 ；主要是羟基磷灰石晶体和无定型磷酸氢钙【3 0 】。 在酶法制备胶原肽过程中，鱼鳞和鱼骨中钙的脱除是重要环节，对最后制得的胶原肽的 质量和产率有着重要的影响。同时鱼鳞和鱼骨中的钙又是一种良好的钙源，可以被人体 直接吸收，适于加工成钙剂，作为良好的食品添加剂的a n - r - 原料。采用适宜的有机酸将 羟鳞灰石钙转变为生物利用率高的有机钙，是有效利用这种钙源的重要方法【3 。不仅使 罗非鱼下脚料在制备胶原蛋白中进行了脱钙，有利于胶原肽制备，同时还使脱下来的钙 得到回收利用。 目前，从动物骨头、贝壳、蛋壳中提取钙制剂常用的方法是采用煅烧法【3 2 1 ，主要产 品是碳酸钙，高温锻烧能耗大，成本高，在锻烧过程中会产生大量的c 0 2 和粉尘污染。 b o u r g o i n 等人证明常用的牡蛎壳制剂中铝和铅污染明显，在煅烧过程铝的化学结构发生 变化，而氧化铝是不能被生物利用的，铅含量也偏高【3 3 1 。并且碳酸钙制剂吸收率低，大 量中和胃酸，影响胃肠道消化，碱性强，对胃肠道刺激大 3 4 1 。为此，本论文探索性采用 有机酸来酸解鱼骨和鱼鳞中的钙，并通过降低其溶解度的方法使有机酸钙结晶析出回 收。 7 广西大掌硕士掌位论文罗j # 鱼下脚料制取胶原肽研究 2 2 实验材料与仪器 2 2 1 主要原料与试剂 实验原料：罗非鱼加工的下脚料鱼骨和鱼鳞由南宁百洋食品有限公司提供冷冻 保存。 乳酸、柠檬酸、盐酸、乙二胺基四乙酸二钠( e d t a ) 、铬黑t ，三乙醇胺、盐酸、 氯化钙，氨水、乙醚等均为分析纯。 2 2 2 主要仪器设备 h h s 型电热恒温温水浴锅 h h 4 型数显恒温水浴锅 d h g 914 6 a 型电热恒温鼓风干燥机 i 也5 2 a a 型旋转蒸发仪 p l 2 0 0 2 型电子天平 d 4 0 2 f 型电动搅拌机 t g l 1 6 g a 低速离心机 p h s 2 9 a 数显酸度计 2 3 实验方法 2 3 1 钙含量的测定【3 5 】 江苏南通县通海农业仪器厂 国华电器有限公司 上海精密实验设备有限公司 上海亚荣生化仪器厂 梅特勒托利多仪器上海有限公司 杭州仪表电机厂 湖南星科科学仪器有限公司 上海虹益仪表仪器有限公司 c a 标准溶液的配制：准确称取1 1 1 1 5 9 c a c l 2 ，稀释定容至1 0 0 m l ，配成0 1 m 的 c a c l 2 溶液，此时钙离子的浓度为4 m m l 。 钙标准曲线的测定：分别取1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0 m l 的c a c l 2 标准溶 液于5 0 m l 的三角瓶中，每个瓶中准确补水至1 0 m l 。分别在待测的溶液中加入3 m l 的 三乙醇胺溶液，5 m lp h 为l o 的氨性溶液和两滴铬黑t 指示剂，然后以e d t a 标准溶液 滴定到溶液由紫红色变成蓝色。以e d t a 滴定体