（细胞生物学专业论文）玉米二酯酰甘油激酶基因导入对拟南芥抗逆性的影响.pdf

l “东大学硕士学位论文 玉米二酯酰甘油激酶基因导入对拟南芥抗逆性的影响 中文摘要 磷脂酶c ( p h o s p h o l i p a s ec ，p l c ) - - 酯酰甘油激酶( d i a c y l g l y c e r o ll 【i n 硒e ， d g k ) 介导的p l c d g k 信号途径是磷酸肌醇信号途径中的重要途径。多项研究 表明该途径在植物生长发育以及对胁迫环境作出应答方面发挥重要作用。d g k 家族是p l c d g k 途径的关键酶类，它能够催化由p l c 水解磷脂酰肌醇4 ，5 二磷 酸( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 4 ，5 一b i s p h o s p h a t e ，p t d i n s ( 4 ，5 ) p 2 ) 生成的二酯酰甘油 ( d i a e y l g l y c e r o l ，d a g ) 迅速磷酸化生成磷脂酸( p h o s p h a t i d i ea c i d ，p a ) 。d a g 和p a 都是细胞内重要的信号分子，参与多种胁迫信号途径。而d g k 对维持胞 内d a g 和p a 的动态平衡具有重要作用。 本实验室从玉米中成功克隆得到三个玉米d g k 基因，分别为z m d g k l ，2 和3 。通过r e a l t i m er t - p c r 分析发现，这三个基因在不同器官中的表达模式不 同；在冷，旱和激素等胁迫处理下，不同基因对不同刺激也呈现不同的应答模式， 暗示它们可能具有不同的生理功能。 本工作将上述三个玉米d g k 基因( z ，加g k ，2 和3 ) 利用农杆菌介导的方 法转入拟南芥，对其后代进行p c r 检测以及遗传统计学分析表明，外源基因已 成功转入拟南芥并得到稳定遗传，得到了纯合的转基因拟南芥株系。另外，根据 拟南芥d g k 基因家族( a t d g k l 7 ) 序列的3 非翻译区以及非保守区序列设计 引物，利用r t p c r 的方法对各基因在拟南芥不同组织器官中的表达模式进行分 析，发现a t d g k s 在不同器官中的表达模式不同；利用荧光实时定量r t p c r 的 方法分析a t d g k s 在渗透胁迫、盐胁迫、低温胁迫以及热激处理条件下的表达模 式的变化，发现各成员对不同刺激的应答模式不同，暗示它们可能在胁迫条件下 行使不同的生物学功能。分析上述条件下a t d g k s 和z m d g k s 在相应的转基因 拟南芥植株中的表达模式的变化，结果发现外源基因在相应的转基因株系中得到 较高强度的表达，并且在不同的胁迫条件下不同基因的表达量有不同程度的提 高，暗示z m d g k s 可能在不同的条件下发挥不同的功能；与之相对应，在转 山东大学硕士学位论文 z m d g k l 基因的拟南芥中，a t d g k l 和2 的表达量与对照相比有所降低，在胁迫 条件下，这种降低幅度更为明显；在转z m d g k 2 和3 基因的转基因拟南芥中， a t d g k 5 的表达也呈现类似的变化。这说明外源基因的高效表达在一定程度上抑 制了部分内源基因的表达。通过对各转基因拟南芥幼苗的抗性分析发现，在渗透 胁迫条件下，转z m d g k l 基因拟南芥株系的种子萌发率明显高于未转基因株系； 转基因幼苗叶片的失水速率较慢；在3 0 0 m m 甘露醇条件下，转z m d g k l 基因拟 南芥幼苗的长势好于未转基因株系，萎蔫较轻，表明z m d g k l 的导入可提高拟 南芥幼苗抗旱性。同样，在盐胁迫条件下，转z m d g k 3 基因拟南芥也表现出较 高的种子萌发率和较好的生长状况，表明z m d g k 3 过表达可能在一定程度上提 高拟南芥幼苗的耐盐性。 构建z m d g k l 、2 和3 与g f p 融合表达载体，通过基因枪转化使其分别在 洋葱表皮细胞中表达，发现z m d g k l 定位在膜上，而z m d g k 2 和3 定位在胞质 中。三个基因不同的定位方式可能与其不同的生理功能相关联。 利用电子克隆和p c r 相结合的方法克隆得到玉米d g k 家族的又一新成员： z m d g k 4 ，并构建了相应的植物表达载体，为进一步了解玉米d g k 家族成员的 功能提供新信息。 关键词：z m d g k s ，转基因拟南芥，a t d g k s ，荧光实时定量r t - p c r ，表达分析， 抗逆性 2 山东大学硕士学位论文 v a r i a t i o no fs t r e s st o l e r a n c eo ft r a n s g e n i ca r a b i d o p s i st h a l i a n a w i t hz m d g k s a b s t r a c t p l c d g ks i g n a l i n gp a t h w a yi sam a j o rp a r to ft h ep h o s p h o i n s i o ls i g n a l i n g p a t h w a y i tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nav a r i e t yo fb i o l o g i c a lp r o c e s s e si n c l u d i n g g r o w t h ，d e v e l o p m e n ta n dr e p o n s e st os t r e s si np l a n t s d i a c y l g l y c e r o lk i n a s e ( d g k ) i s ap i v o t a le n z y m et h a tp h o s p h o r y l a t e sd i a c y l g l y e e r o l ( d a g ) t oy i e l dp h o s p h a t i d i ca c i d ( p a ) b o t hd a g a n dp aa r es i g n a l i n gm o l e c u l e si np l a n tc e l l sa n da r ei n v o l v e di n k i n d so fs i g n a l i n gp a t h w a n y s t h e r e f o r e ，d g ki s t h o u g h tt or e g u l a t et h eb a l a n c e b e t w e e nd a ga n dp at h r o u g hc a t a l y z i n gt h e i ri n t e r c o n v e r s i o n t h r e ed g kg e n e s ( z m d g k l ，z m d g k 2a n dz m d g k 3 ) h a v eb e e nc l o n e df r o m m a i z e t h e yh a v ed i f f e r e n te x p r e s s i o np a t t e r n si nd i f f e r e n tt i s s u e so fm a i z ea n a l y z e d b yr t - p c r u n d e rt h et r e a t m e n t so fc o l d ，d r o u g h ta n dh o r m a n e s ，t h e ya l s os h o w e d s p e c i f i ce x p r e s s i o np a r e r n s ，w h i c hi n d i c a t e dt h e ya r ep o s s i b l yi n v o l v e di nv i t a l p r o c e s s e s i nt h i st h e s i s ，z m d g k sw e r et r a n s f o r m e di n t oa r a b i d o p s i su s i n ga g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s - m e d i a t e dm e t h o d ，r e s p e c t i v e l y t h et r a n s g e n i cp l a n t sw e r ei d e n t i f i e db y p c ra n dr t - p c ra n a l y s i sa n dh o m o z y g o t i cl i n e sw e r eo b t a i n e d t oa n a l y z et h e c h a n g e so fa t d g k si nd i f f e r e n ts t r e s sc o n d i t i o n s ，w ed e s i g n e dt h ep r i m e r sf o r r t - p c ra c c o r d i n gt o3 o ru n c o n s e r v e ds e q u e n c e so fc d n a so fa t d g k g e n ef a m i l y ( a t d g k1 - 7 ) r t - p c ra n a l y s i so fe d n af r o mf i v et i s s u e so fa r a b i d o p s i si n d i c a t e d t h a ta t d g k sh a v ed i f f e r e n te x p r e s s i o np a r e r ni nd i f f e r e n tt i s s u e s t h e i re x p r e s s i o n u n d e rt r e a t m e n t so fo s m o t i cs t r e s s ，s a l t ，f r e e z i n ga n dh e a ts h o c kw e r ea n a l y z e db y r e a lt i m er t - p c r r e s u l t ss h o w e dt h a td i f f e r e n ti n d i v i d u a l sh a v ed i f f e r e n t e x p r e s s i o np a r e r n si nd i f f e r e n tc o n d i t i o n s ，w h i c hi l l u m i n a t e dt h e i rd i f f e r e n tf u n c t i o n s w ea l s oa n a l y z e dt h ee x p r e s s i o no fa t d g k sa n dz m d g k si n t r a n s g e n i c 3 山东大学硕士学位论文 a r a b i d o p s i su n d e rt h ea b o v et r e a t m e n t s r e s u l t ss h o w e dt h a tz m d g k sh a dah i g h e x p r e s s i o nl e v e li nt h ep l a n t s ，r e s p e c t i v e l y , b u tt h el e v e lw a sd i f f e r e n tf r o me a c ho t h e r i nd i f f e r e n tt r e a t m e n t s j u s tt h eo p p o s i t e ，t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fa t d g k la n d a t d g k 2i nt h ea r a b i d o p s i sw i t ho v e r - e x p r e s s i o no fz m d g k lw e r er e d u c e dc o m p a r e d w i t hw i l dt y p e ，e s p e c i a l l yi ns o m et r e a t m e n t s a t d g k 5a l s os h o w e dl o w e re x p r e s s i o n i nt h ea r a b i d o p s i sw i t h o v e r - e x p r e s s i o no fz m d g k 2a n d3 ，r e s p e c t i v e l y t h e s e i n d i c a t e dt h a th i 曲e x p r e s s i o no f z m d g k s m i g h t r e d u c et h ee x p r e s s i o nl e v e l so f s o m e u n d e rt h eo s m o t i cs t r e s s ，o v e r - e x p r e s s i o no fz m d g k li nt r a n s g e n i ea r a b i d o p s i s s e e d l i n g sd i s p l a y e da ni m p r o v e dt o l e r a n c ec o m p a r e dw i t hw i l dt y p e t h et r a n s g e n i c s e e d l i n g ss h o w e dh i g h e rg e r m i n a t i o nr a t eo fs e e d s ，l o w e rw a t e rl o s sr a t ea n db e t t e r p h e n o t y p et h a nt h o s eo fw i l dt y p e t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h ep o t e n t i a lf u n c t i o no f z m d g k lu n d e rt h eo s m o t i ct r e a t m e n t m e a n w h i l e ，o v e r - e x p r e s s i o no fz m d g k 3i n t r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sa l s od i s p l a y e db e t t e rp h e n t y p ea n dh i g h e rg e r m i n a t i o nr a t e u n d e rt h es a l tt r e a t m e n t ，w h i c hi l l u m i n a t e dt h a to v e r - e x p r e s s i o no fz m d g k 3i n t r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sm a yp l a yap o s i t i v er o l eu n d e rt h es a l ts t r e s s i na d d i t i o n ，t h ef u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o r so fz m d g k sa n d 曲w e r ec o n s t r u c t e da n d t r a n s f o m e dt oe p i d e r m a lc e l l so fo n i o nb yg e n e - g u n r e s u l t ss h o w e da n dz m d g k l l o c a t e do nt h em e m b r a n e si nt h ec e l l ，w h i l ez m d g k 2a n d3l o c a t e di nt h ec y t o p l a s m w ea l s oc l o n e dan e we d n a s e q u e n c en a m e dz m d g k 4f r o mm a i z ei ns i l i c oc l o n i n g c o m b i n e dw i t hp c r ，a n dt h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rh a db e e nc o n s t r u c t e da n d p l a n n e dt ot r a n s f o r ma r a b i d o p s i so rm a i z ef o rf u r t h e rf u n c t i o na n a l y s i s k e y w o r d s ：z m d g k s ；t r a n s g e n i ca r a b i d o p s i s ；a t d g k s ；e x p r e s s i o na n a l y s i s ；r e a l 4 t i m er t - p c r ；s t r e s st o l e r a n c e 山东大学硕士学位论文 符号说明 c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a c t a b c e t y l t r i e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ，十六烷基三甲基溴化铵 d a g d i a c y l g l y e e r o l 二酯酰甘油 d g k d i a c y l g l y c e r o lk i n 鹪e 二酯酰甘油激酶 d g p p d i a c y l g l y c e r o lp y r o p h o s p h a t e 焦磷酸二酯酰甘油 e b e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 h p t h y g r o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e ，潮霉素磷酸转移酶 i p si n o s i t o l1 , 4 ，5 t r i s p h o s p h a t e 肌醇1 ，4 ，5 - 三磷酸 i p t g i s o p r o p y l1 3 一d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 异丙基硫代b d 一半乳糖苷 m s m u r a s h i g ea n ds k o o g m s 培养基 p a p h o s p h a t i d i ca c i d 磷脂酸 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 p k c p r o t e i nk i n 嬲ec 蛋白激酶c p l c p h o s p h o l i p a s ec 磷脂酶c p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l4 , 5 - b i s p h o s p h a t e 磷脂酰肌醇4 ，5 - - 磷酸 s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 “s ir i s h y d r o x y m a t h y la m i n om e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 x - g a l 5 - b r o m o 4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l p d g a l a c t o s i d e5 一溴一4 一氯- 3 - 吲哚一p d 一半 乳糖苷 5 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：等三l 叠峦虹 日期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：恤导师签名：雄日期：牡 山东大学硕士学位论文 第一部分前言 磷脂酶c ( p h o s p h o l i p a s ec ，p l c ) 二酯酰甘油激酶( d i a c y l g l y c e r o lk i n a s e ， d g k ) 介导的p l c d g k 信号途径是磷酸肌醇信号途径中最主要的途径之一。它 在植物生长发育，激素应答，抵御各种生物和非生物胁迫方面发挥着重要作用【l ， 2 3 1 。磷脂酶c 水解磷脂酰肌醇4 ，5 二磷酸( p h o s p h a t i d y l i n o s i t 0 1 4 ，5 b i s p h o s p h a t e ， p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 ) 生成二酯酰甘油( d i a c y l g l y c e r o l ，d a g ) 和肌醇三磷酸( i n o s i t o l l ，4 ，5 - t r i s p h o s p h a t e ，i n s ( 1 ，4 ，5 ) p 3 ) 。水溶性的肌醇三磷酸可被进一步磷酸化生成一 系列的肌醇磷酸异构体，如i n s p 4 ，i n s p 5 和i n s p 6 。一系列的肌醇磷酸异构体己被 证实参与多种胁迫信号途径，如高渗，低温和a b a 等。特别是i n s p 6 可能代替 i n s p 3 行使胞内第二信使的功能，调节c a 2 + 的释放【4 1 。d a g 则可被d g k 进一步 磷酸化生成磷酯酸( p h o s p h a t i d i ca c i d ，p a ) 。p a 可被进一步磷酸化生成二酯酰 甘油焦磷酸( d i a c y l g l y c e r o lp y r o p h o s p h a t e ，d g p p ) 。d g p p 是一种新型的脂类信 号分子，在细胞中行使重要功能。 d g p p 卜 p l cd g kpld p t d l n s ( 4 ，5 ) p2 一d a g 啦p a 一p t d c h o i n s ( 1 ，4 ，5 ) p 3 叫l n s p 4 叫l n s p 5 叫l n s p 6 图1 1 部分磷酸肌醇途径示意图1 4 i 。 p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 ，磷酯酰肌醇4 ，5 二磷酸；p l c ，磷酯酶c ；d a g ，二酯酰甘油；d g k ， 二酯酰甘油激酶；p a ，磷脂酸；p a l ( ，磷酯酸磷酸酶：d g p p ，二酯酰甘油焦磷酸； p l d ，磷脂酶d ；p t d c h o ，磷酯酰胆碱；i n s ( 1 ，4 ，5 ) p 3 ，肌醇i 磷酸：l n s p 4 ，肌醇四磷 酸；h a s p 5 ，肌醇五磷酸；l n s p 6 ，肌醇六磷酸。 d a g 和p a 都是细胞内重要的信号分子并且在胞内磷脂生物合成过程中发 挥重要作用。在动物细胞中，d a g 能够激活蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 【5 一，并且调节一些与细胞生长、发育、凋亡相关蛋白的活性5 7 8 ，9 ，10 1 。p a 与细胞 骨架的组建有关，并且能够调节多种酶的活性 1 1 , 1 2 , 1 3 , 1 4 , 1 5 】。在植物细胞中，d a g 6 山东大学硕士学位论文 被证实能激活保卫细胞的离子泵和气孔开放【1 6 1 。而当植物受到低温胁迫、损伤和 病原体侵染等刺激时，胞内p a 的含量迅速升高【1 7 1 。因此，d g k 作为d a g 和 p a 互变反应的关键酶，在维持细胞内d a g 和p a 的浓度平衡发挥着重要作用。 1 1二酯酰甘油激酶( d g k ) 研究进展 d g k 是一类相当保守的蛋白家族，在酵母【18 1 、果蝇【1 9 ，2 0 2 1 1 、秀丽线虫、哺乳 动物和植物2 2 】中均发现。 1 1 1 晡乳动物d g k 研究进展 哺乳动物中已报道存在1 0 种d g k 同工酶，分别命名为d gk a 、p 、丫、6 、 、q 、0 、诩3 1 。它们都包含两个或三个典型的类似于蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s e c ，p k c ) 的c l 结构域和催化域。每个催化域都包含有一富含甘氨酸的保守序列 g l y - x g l y - x - x - g l y 。与其它蛋白激酶a t p 位点不同，该序列缺少了下游的保守 赖氨酸残基。但是实验证明当该序列的第二个甘氨酸发生突变时，会导致d g k 的酶活性丧失【2 4 1 ，由此推测其可能为d g k 的a t p 结合位点。c l 结构域富含半胱 氨酸残基和锌指结构，大约由5 0 个氨基酸组成，其中有一个由六个半胱氨酸和两 个组氨酸组成的核心结构。p k c 中的c l 结构域主要是d a g 和佛波脂2 5 】的结合位 点。而目前却还未有报道证实d g k 中的c l 同样能与d a g 和佛波脂结合。但是， 所有d g k 的c 1 结构域，在靠近催化域的区域都有一包含1 5 个氨基酸的高度保守 区。d g k 0 该区的保守氨基酸对d g k 的活性非常重要。代换其中一个保守的氨基 酸即可导致9 0 激酶活性被抑制。推测该区域可能与c 1 结构域其它基序协同作用 将d a g 送到催化结构域从而参与激酶反应。 根据所包含的结构域不同，哺乳动物的l o 种d g k 被分为五类 2 3 】( 图1 2 ) 。 第一类d g k s ( a 、1 3 和y ) 的n 末端均包含钙离子结合e f 手性结构( c a l c i u m b i n d i n g e fh a n d s ) ，并且在钙离子存在的条件下激酶表现出更高的活性【2 6 1 。第二类d g k s ( 6 、t 1 和1 c ) n 末端有p h 结构域( p l e c k s t r i nh o m o l o g yd o m a i n ) ，c 末端有s a m 结构域( s t e r i l ea l p h ad o m a i n ) 。研究表明，d g k _ i 5 的p h 结构域能与磷脂酰肌醇 结合，而s a m 结构域则与其定位到内质网有关【2 7 , 2 8 】。第三类d g k s 只有d g k e 一个成员，结构简单，无n 末端调控区。第四类d g k s ( ) 大量制备2 3 2 得到的重组质粒，并用聚乙二 醇纯化。用t e 溶解稀释至终浓度为l p l 。保存于2 0 c 备用。 参照b a r a n d i a r a n 等( 1 9 9 8 ) t 6 5 】的方法进行d n a 金粉( b i o r a d ，1 0p m ) 微 弹的制备，具体步骤如下： 山东大学硕士学位论文 ( 1 ) 称取金粉2n a g ( 可供2 0 次使用) 于1 5m le p p e n d o r f 管中。 ( 2 ) 加入1m l7 0 乙醇，涡旋振荡1 0 m i n ，于1 0 ，0 0 0 9 离心l m i n ，弃上 清，重复三次。 ( 3 ) 加入lm l 无菌水，剧烈振荡重悬金粉，室温静置l m i n 后，于1 0 ，0 0 0 9 离心5 s ，弃上清，重复三次。然后h n h0 5 肛l 无菌水，重悬金粉备用。 ( 4 ) 每管取2 0 u l 上述处理的金粉，然后加入2 9 9 质粒d n a ，混匀。 ( 5 ) 在涡旋状态下缓慢加入已经抽滤灭菌的8 9 lo 1 m 的亚精胺和2 4 p l 2 5 m 的c a c l 2 ，并充分混匀。 ( 6 ) 将混合物于4 c 静置1 0 m i n ，然后1 0 ，0 0 0 9 离心5 s ，弃上清。 ( 7 ) 分别用7 0 的乙醇和无水乙醇洗涤d n a 一金粉，1 0 ，0 0 0 9 离心5 s ， 弃上清。 ( 8 ) 用2 0 肛l 无水乙醇重悬d n a - 金粉，备用。 在轰击前4 h 将洋葱内表皮细胞均匀展开铺于含有m s 固体培养基的培养皿 ( 直径为9c m ) 中心直径不大于3e m 的范围内。用p d s1 0 0 0 h e 基因枪( b i o r a d ) 进行轰击，详细操作见仪器说明书。可裂膜压力为1 1 0 0 p s i ，可裂膜与载弹片的 间距为2 5 e m ，载弹片与阻挡网之间的间距为1 0 e m ，阻挡网与靶材料的间距( 即 轰击距离) 为4 e m 。每皿轰击1 或2 次，每种质粒2 或3 个重复。转化2 4 1 1 后， 于荧光显微镜下进行荧光观察。 2 4z m d g k 4 基因的克隆和植物表达载体的构建 2 4 1z m d g k 4 基因的克隆 2 4 1 1 植物材料 植物材料为玉米( z e am a y ) 优良自交系9 0 11 0 。5 叶期玉米黄化苗经0 8 ( w v ) n a c i 处理2 4 d 时后提取总r n a ，用于合成玉米e d n a 。 2 4 。1 2 菌株及质粒载体 用于普通遗传转化的大肠杆菌( e s c h r i c h i ac o l d 菌株为d h 5 0 t ，本实验室保 1 ii 东大学倾士学位论文 存。t a 克隆载体p g e m te a s yk i t 购自p r o m e g a 公司。实验中所用的植物表达 载体为p r o k i i 的派生载体( 含目的基因) ，由本实验室构建。 b ds m a r t t mr a c e e d n a a m p l i f i c a t i o nk i t 购自c l o n t e c h 公司。o l i g o t e x m r n ak i t 购自q i a g e n 公司。各种d n a 限制酶和d n a 修饰酶购自t a k a r a 公司， p g e m - te a s yk i t 购i 皇i p r o m e g a 公司，琼脂糖凝胶d n a 回收试剂盒购自 t i a n g e n ；引物合成和测序均由上海博尚公司完成。 2 4 1 3 实验方法 2 4 131 玉米双链e d n a 的合成 玉米叶片总r n a 的提取和m r n a 的分离见2 2 1 和2 2 2 1 。按照b ds m a r t t m r a c ec d n aa m p l i f i c a t i o nk i t 的说明合成玉米c d n a ，具体步骤如下： ( 1 ) 第一链e d n a 的合成 1 ) 在一个0 5 m l 无r n a a s e 的离，i i , 管中加入3 1 t lp o l y a + r n a ( 约l p g ) 、l g l s m a r ti vo l i g o n u c l e o t i d e 、lp lc d s i i i 3 p c rp r i m e r ，共5 p l 。 2 ) 混匀，稍微离心，7 2 。c 水浴2 m i n 。 3 ) 水浴结束后迅速置于冰上，冰浴2 m i n ，然后轻微离心。 4 ) 加入以下试剂：2 p l5 x f i r s t s t r a n db u f f e r 、l p ld t t ( 2 0 r a m ) 、l g ld n t pm i x ( 10 m m ) 、l p lp o w e r s c r i p ti ir e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( 2 0 0 u g l ) 。 5 ) 轻轻混匀，稍微离心。4 2 。c 气浴2 h 。将离心管放置于冰上终止第一链反应。 6 ) 加入l p l2 5 m mn a o h ，于6 8 。c 温浴3 0 m i n 。 7 ) 将离心管置于冰上，或置于一2 0 。c 备用。 ( 2 ) 引物延伸法合成双链e d n a 1 ) 在o 。5 m l 离心管中混合下列试剂：ll p lf i r s t s t r a n dc d n a 、7 1 1 a l 去离子水、 i o p l1 0 x a d v a n t a g e2p c rb u f f e r ，2 p l5 0 x d n t pm i x ，2 1 a l5 p c rp r i m e r 、2 p l c d s 3 p c rp r i m e r 、2 此5 0 x a d v a n t a g e2p o l y m e r a s em i x ，总体积为l o o g l 。 2 ) 轻弹离心管，短暂离心将混合物集中于管底。 2 6 l ij 东大学硕士学位论文 3 ) 将p c r 仪预热到9 5 * ( 2 ，将管置于预热的p c r 仪上并运行以下程序：9 5 0 c 2 m i n ，7 2 0 c1 0 r a i n ，9 5 0 cl m i n ，3c y c l e s - 9 5 0 c3 0 s 、6 8 0 c8 m i n 。 4 ) 反应完成后，取出5 p l 样品电泳检测，分析双链e d n a 是否合格。 2 4 1 3 2z m d g k 4 的电子克隆 ( 1 ) 数据库与软件 核酸数据库为美国国立生物信息中心( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g y i n f o r m a t i o n ，n c b i ) 的g e n b a n k 数据库( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v d a t a b a s e i n d e x h t m ) 和玉米序列数据库( h t t p ：w w w m a i z e s e q u e n c e o r g ) ；同源性分析程序 使用n c b i 网站( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v ) 的在线软件b l a s t n 、b l a s t x ； 开放阅读框( o r f ) 的寻找使用n c b i 网上的o r ff i n d e r 程序。 ( 2 ) 电子克隆技术路线 分别以实验室已经克隆得到的编码z m d g k s 的两个保守结构域d g k a 和 d g k c 的e d n a 序列为种子序列，利用n c b i 数据库的b l a s t n 搜索玉米1 1 1 库 和h p t g 库，得到一条相似性较高的新的e d n a 序列。 以该序列为种子序列在m a i z e s e q u e n c e 数据库中，利用b l a s t n 搜索玉米基 因组数据库，发现该序列与g r a m e n e 证据基因z m e v i 0 7 7 7 3 2 相对应。 下载该基因的完整的外显子序列，并利用n c b i 网上的o r ff i n d e r 程序在 线寻找完整的开放读码框。 2 4 133 引物设计和p e r 反应 根据电子克隆所得到的序列，利用p r m e r 5 0 设计引物软件设计引物： z m d g k 4 一f s ：5 g t g a c a a g c c t g g c g a a c t3 ； z m d g k 4 - f a ：5 g t g a g g g t t g c t g g a c t g g3 用基因特异性引物以上述得到的e d n a 为模板进行p c r 反应。在2 5 肛l 反 应体系中含有1 0 m m i r i s c i ，5 0 m mk c i ，1 5 r a mm g c l 2 ，2 0 0 p md n t pe a c h ，0 8 p m 引物，0 6 2 5 u 高保真d n ap o l y m e r a s e ，l 此模板，无菌去离子水补足2 5 t l 。反 2 7 lj l 东大学硕士学位论文 应程序为：9 5 0 ( 2 预变性5 m i n ；9 5 0 2 变性l m i n ，6 0 。( 2 退火l m i n ，7 2 0 ( 2 延伸2 m i n ， 循环3 5 次；7 2 0 c 延伸7 m i n 。扩增产物电泳分析。 2 4 1 3 4p c r 产物的回收、克隆及测序 采用t a k a r a 回收k i t 回收p c r 扩增产生的d n a 片段，具体操作见试剂盒说 明书。将回收片段定量，选用p g e m t e a s yv e c t o rs y s t e m sk i t ( p r o m e g a ，u s a ) 对p c r 片段进行克隆。连接反应体系为：2 x l i g a t i o nb u f f e r5 p l ；d n af r a g m e n t x l a l ；t - e a s yv e c t o rl l a l ；t 4d n al i g a s ei p l ；d d h 2 0 补足1 0 1 a l 。混匀反应物， 4 。c 连接过夜，连接混合物转化e c o l id h 5 a 感受态细胞。转化菌经l b 固体平板 ( 5 0 1 a g m la m p ；8 0 1 x g m lx g a l ；0 5 m mi p t g ) 培养，挑取白色单菌落，提取 质粒d n a ，酶切鉴定，阳性克隆送交上海博尚公司进行测序。对测序结果进行 分析。 2 4 2 植物表达载体的构建 2 4 2 1 质粒d n a 的提取和酶切 碱裂解法大量制备质粒d n a ，聚乙二醇沉淀法纯化( 参照分子克隆实验 指南i i i 2 4 _ 之8 页) 。用紫外分光光度计检测质粒d n a 的浓度和纯度 ( o d 2 6 0 o d 2 8 0 1 6 1 8 ) ，调整浓度为l p 肛l ，分装后冷冻保存备用。 质粒酶切所用缓冲液参照t a k a r a 产品说明选择。单酶切选用产品附带的缓 冲液，双酶切根据产品说明书选择最适缓冲液。一般i g g 质粒至少加l u 的酶， 3 7 0 c ( 或根据说明书上选择酶切最适温度) 温育2 h 以上。 2 4 2 2d n a 片段的回收和定量 根据t i a n g e n 琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回收d n a 片段，使用凝胶成 像系统扫描电泳图片。用s m a r t v i e w 2 0 0 1 软件中的a n a l y s i s 功能对回收d n a 片 段进行定量。 2 4 2 3d n a 片段的去磷酸化 质粒d n a 经单一限制性内切酶消化后，载体片段需经去磷酸化处理，以防 止自身环化。 2 8 l i l 东大学硕士学位论文 回收的载体d n a 片段适量；1 0 x c i a p 缓冲液5 9 l ：碱性磷酸酶c i a p ( 2 5 u l 上l ) l g l , 补足去离子水至5 0 9 l 。混匀，5 0 0 1 2 温育3 0 分钟，7 5 。c 温育 1 0 分钟灭活碱性磷酸酶。反应混合物用于下一步电泳及片段回收。 2 4 2 4 外源i ) n a 片段与载体片段的连接 载体片段1 0 0 - - - 2 0 0 n g ，外源d n a 片段与载体d n a 的p m o l 末端比为3 ：1 ， 1 0 x 连接酶缓冲液l p l ，t 4d n a 连接酶1 w e i s s 单位，p e g 4 0 0 0 ( 5 0 w v ) i o l ， 补足去离子水至1 0 i - t l 。混匀，4 。c ( 平末端连接) 或1 6 。( 2 ( 粘末端连接) 温育 1 2 1 6 小时。反应混合物可直接用于大肠杆菌的转化或冷冻保存。 2 4 2 5 大肠杆菌感受态的制备和转化 氯化钙法制备和转化感受态大肠杆菌，参照分子克隆实验指南i i i ) ) 9 6 - 9 9 页。 2 4 2 6 重组质粒的鉴定 小规模制备质粒d n a ，用限制性内切酶酶切和p c r 鉴定重组质粒( 参照分 子克隆实验指南i i i ) ) 2 4 2 8 页) 。大量制备重组质粒备用。 ：互銮：竺圭兰些鲨兰 第