（发酵工程专业论文）l谷氨酰胺产生菌选育及其代谢调控的初步研究.pdf

摘要 摘要 l 谷氨酰胺( l g l u t a m i n e ) 是l 谷氨酸y 羧基酰胺化的一种氨基酸，具有许多特殊的 功能，被归类为条件必需氨基酸。目前国内外临床上主要将它应用于治疗精神萎靡、酒 精中毒及胃和十二指肠溃疡等疾病。另外它还具有增进神经机能，改善脑出血后的记忆 障碍，促进智力不佳儿童的智力发展，防止癫痫发作等功能，是一种极有发展前途的新 药。本文主要从l 谷氨酰胺产生菌的选育和发酵条件优化，育种的代谢流分析，以及谷 氨酰胺合成酶调节四方面入手进行了研究。 首先，根据代谢控制育种的原理，系统地研究了l 谷氨酰胺产生菌的选育。以实验 室保藏菌株嗜乙酰乙酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ma c e t o a c i d o p h i l u m ) y l 0 1 2 ( m s o r ) 为出发 菌株，采用u v 和n t g 诱变处理，采用磺胺胍、硫酸铵和氟化纳三种药物平板，及以琥 珀酸为唯一碳源的平板进行定向筛选，最后获得一株l 谷氨酰胺产生菌l c h a 0 8 2 ( m s o r , s g r , ( n h 4 ) 2 8 0 4 r ，s a g ，n a f r ) 。在未经优化的条件下发酵液中可积累l 谷氨酰胺 3 5 8g l ，比出发菌株产量提高了9 4g l 。 其次，对诱变后菌株l c h a 0 8 2 的发酵培养基进行了优化以及对其发酵条件的研究， 最后得出了发酵培养基的最佳组成：葡萄糖1 3 0 2 ，硫酸铵5 8 7 ，玉米浆2 7 8 ，碳酸钙 2 5 ，k h e p 0 41 2 5 ，m g s 0 4 7 h 2 00 6 ，m n s 0 4 4 h 2 00 0 0 3 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 5 ，z n s 0 4 。7 h 2 0 0 0 0 6 ；最佳培养条件为：发酵液培养基初始p h 为7 5 ，接种量为8 ，装液量为2 5 0 m l 三 角瓶装1 5m l 发酵培养基，3 0 ，1 0 0r m i n ，7 2h 。产酸稳定在4 0 7d e ，最高产量4 2 4d e ， 比未经优化提高了5 9g m 。 第三，对出发菌株y l 0 1 2 和突变株l c h a 0 8 2 进行了代谢流量分析，建立并完善了嗜 乙酰乙酸棒杆菌y l o l 2 及其突变株l c h a 0 8 2 合成l 谷氨酰胺的中心代谢网络，代谢分析 发现流入谷氨酸节点的流量由2 9 1 9 8 上升到4 4 8 5 4 ，提高到原来的1 5 倍左右，其中流入 目的产物谷氨酰胺的流量由1 8 1 3 8 上升至3 1 0 6 5 最为明显：并且通过各个节点的代谢流 量对比，为下一步的育种设计提供了参考。 最后，通过氮饥饿的方法对谷氨酰胺合成酶( g s ) 进行调节，并对原位氮饥饿梯度补 氮的方法进行了初步的研究。确定了原位氮饥饿的条件为：氮饥饿初氮为尿素2 0d e ， 补料氮源为( n h 4 ) 2 s 0 4 ( 2 0 ) ，氮饥饿时间为1 5h ，补氮方式为：梯度补加四次。四次补 料浓度分别为：5g l ，1 0g m ，2 5g l 和1 5g l 。氮饥饿后，氮饥饿后的4 8h 发酵产量为3 6 2 l ，谷氨酰胺占谷氨酸和谷氨酰胺总量的比例可达到7 5 6 。对氮饥饿- 梯度补氮进行 了代谢流分析，证明氮饥饿梯度补氮对谷氨酰胺合成酶活的调节有确实作用，并从酶 活调节与代谢流量分配方面分析了氮饥饿的利与弊。 关键词：l 谷氨酰胺；育种；条件优化；代谢流分析；氮饥饿；谷氨酰胺合成酶； 梯度补氮 a b s t r a c t a b s t r a c t l g l u t a m i n e ( l - g i n ) i sa l la m i n oa c i dw h i c hh a sm a n ys p e c i a lf e a t u r e s i ti sc l a s s i f i e da s c o n d i t i o n a l l ye s s e n t i a la l d _ j n oa c i d a tp r e s e n t ，m a i n l yo i lt h ec u r r e n tc l i n i c a lt r e a t m e n t ，i ti s a p p l i e dt oc u r ed e p r e s s i o n ，a l c o h o l i s ma n dd i s e a s e ss u c ha ss t o m a c ha n dd u o d e n a lu l c e r a d d i t i o n a l l y , i ta l s oc a l le n h a n c en e r v ef u n c t i o n ，i m p r o v em e m o r ya f t e rb r a i nh e m o r r h a g e b a r r i e r s ，p r o m o t ep o o ri n t e l l e c t u a ld e v e l o p m e n to fc h i l d r e na n dp r e v e n te p i l e p t i cs e i z u r e sa n d a l s om a n yo t h e rf u n c t i o n s i ti sa ne x t r e m e l yp r o m i s i n gn e w d r u g i nt h i sp a p e r , t h r e ea s p e c t s s u c ha st h eb r e e d i n go fl - g i n t a m i n ep r o d u c i n gs t r a i n , t h eo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sa n dm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ，a sw e l la st h er e g u l a t i o no fg l u t a m i n es y n t h e t a s ew e r e s t u d i e d f i r s t l y ，t h eb r e e d i n go fl g l u t a m i n ep r o d u c i n gs t r a i nw a ss t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y t h e o r i g i n a ls t r a i nc o r y n e b a c t e r i u ma c e t o a c i d o p h i l u m y l o12 ( m s o bw a sm u t a t e d b y t h e m e t h o d so fu va n dn t gt r e a t m e n t s ，a n dt h e ni tw a ss c r e e n e db yt h r e er e s i s t a n td r u g s ： s u l f a g u a n i d i n e ( s g ) ，h i g hc o n c e n t r a t i o n ( n i - h h s 0 4a n ds o d i u mf l u o r i d e ( n a f ) ，m e a n w h i l e s u c c i n a t ea ss o l ec a r b o ns o u r c ew a sa l s ou s e d f i n a l l yo n el - g l u t a m i n e p r o d u c i n gs t r a i n l c h a 0 8 2 ( m s o r ，s g r ，( n h 4 ) 2 s 0 4 r ，s a g ，n a f r ) w a so b t a i n e d w i t h o u to p t i m i z a t i o nt h e r e w a sa nl - g l u t a m i n ea c c u m u l a t i o no f3 5 8e g l ，9 4e d lh i g h e rt h a nt h eo r i g i n a ls t r a i n s e c o n d l y , m e d i u mc o m p o n e n ta n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fm u t a n ts t r a i nl c h a 0 8 2 w e r eo p t i m i z e d t h ec o m p o s i t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i u m ，a sw e ua st h eb e s tc o n d i t i o n sw e r e a sf o l l o w s ( g l ) ：g l u c o s e13 0 2 ，( n h 4 ) 2 s 0 45 8 7 ，c o r ns t e e pl i q u o r2 7 8 ，k h 2 p 0 41 2 5 ， m g s 0 4 7 h 2 00 6 ，m n s 0 4 。4 h 2 0o 0 0 3 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 0 5 ，z n s 0 4 7 h 2 00 0 0 6 ，c a c 0 33 0 ； 15 m l 2 5 0 m l ，o r i g i n a lp h7 5 ，s e e dv o l u m e8 ，a t3 0 cw i t hs h a k i n ga t1 0 0r m i nf o r7 2h 。 l - g i nf o r m a t i o nw a ss t a b l ea t4 0 7g l ，t h em a x i m u mo u t p u tw a s4 2 4g l ，w h i c hw a s5 9g l i m p r o v e da f t e ro p t i m i z a t i o n t h i r d l y , t h ec e n t e rm e t a b o l i cn e t w o r k o fc o r y n e b a c t e r i u ma c e t o a c i d o p h i l u my l 012a n d i t sm u t a n tl c h a 0 0 8 2w e r ee s t a b l i s h e da n dm o d i f i e d t h ef l o wt on o d eo fg l u t a m a t ei n c r e a s e d f r o m2 9 1 9 8m m o l l ht o4 4 8 5 4m m o l l 1 la b o u t1 5t i m e so ft h eo r i g i n a l ；t h ef l o wt ol - g l u t a m i n e s y n t h e s i sc h a n g e df r o m18 13 8m m o l l ht o31 0 6 5m m o l l kt h ea n a l y s i sm a yp l a ya i l i m p o r t a n tr o l ei nh e l p i n gu st or a t i o n a l l yr e - d e s i g nm e t a b o l i s mf o rf u n l l e ri m p r o v e m e n to f f e r m e n t a t i o np r o c e s s f i n a l l y , e n z y m ea c t i v i t yr e g u l a t i o no fg l u t a m i n es y n t h e t a s e ( g s ) w a sc a r r i e do u tb yw a y o fn i t r o g e ns t a r v a t i o n n i t r o g e ng r a d i e n tf e dm e t h o d t h ec o n d i t i o n so fn i t r o g e ns t a r v a t i o n w e r ea sf o l l o w s ：t h eb e g i n n i n gn i t r o g e nw a su r e ao f2 0p a l l ，( n h 4 ) 2 8 0 4 ( 2 0 ) w a sf e d n i t r o g e n a n dt h eb e s tn i t r o g e ns t a r v a t i o nt i m ew a s15h ；f e dm e t h o d ：a d dg r a d i e n tf o u rt i m e s ， f o u rf e dc o n c e n t r a t i o n sw e r e ：5e g l ，10g l ，2 5e g la n d15g l p r o d u c t i o nc o u l db e3 6 2g l a f t e r4 8hf e r m e n t a t i o n , l g i n sn l a s sr a t i oo f 也et o t a lc o u l dr e a c h7 5 6 m e t a b o l i cf l u x a n a l y s i so fn i t r o g e ns t a r v a t i o nw a sc a r r i e do u tt op r o v et h a tt h en i t r o g e ns t a r v a t i o np l a y e da s p e c i f i cr o l eo nn i t r o g e nr e g u l a t i o no fg l u t a m i n es y n t h e t a s ea c t i v i t y k e y w o r d s ：l g l u t a m i n e ；b r e e d i n g ；o p t i m i z a t i o n ；m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ；n i t r o g e ns t a r v a t i o n ； g l u t a m i n es y n t h e t a s e ( g s ) ；g r a d i e n tf e dn i t r o g e n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苓人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外；论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包舍苯人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 苤! l 蠡耋军 导师签名： e l期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 l 谷氨酰胺是l 谷氨酸y 羧基酰胺化的一种氨基酸，作为2 0 种构成蛋白质的基本 氨基酸之一，在生物体代谢中起着举足轻重的作用，具有许多特殊的功能，被归类为条 件必需氨基酸 卜3 1 。目前国外临床上主要将它应用于治疗精神萎靡、酒精中毒及胃和十 二指肠溃疡等疾病。另外它还具有增进神经机能，改善脑出血后的记忆障碍，促进智力 不佳儿童的智力发展，防止癫痫发作等功能，是一种极有发展前途的新药【4 刊。 1 2l 谷氨酰胺的理化性质 l 谷氨酰胺化学名2 ，5 二氨基5 氧代戊酸，英文名：l g l u t a m i n e ，缩写：l g i n ， 分子量1 4 6 1 5 ，分子式为c 5 h l o n 2 0 3 【7 ，鲫，结构式如下： h2 n0 h 性状：l 谷氨酰胺是一种白色斜方晶系晶体或结晶性粉末，无臭无毒，有微甜香味； 熔点：1 8 5 1 8 6 ，结晶状态下稳定，遇酸、碱或热水不稳定，可水解成l 谷氨酸；溶于 水( 4 2 5 、1 0 0m l ，2 5 下) ，难溶于甲醇、乙醇、乙醚、苯、丙酮、醋酸乙酯和氯仿 等有机溶剂；解离常数p k ( - - c o o h ) = 2 1 7 ，p k ( 一n h 3 + ) = 9 1 3 ，等电点p i = 5 6 5 ，比旋光 度 a 】d 2 9 = + 6 1 ( c - 2 ，6m o l lh c l ) 。 1 3l 谷氨酰胺的生理特性 l 谷氨酰胺是哺乳动物血浆中含量最丰富的一种游离氨基酸，是肾脏中氨合成和肝 脏中尿素合成的氮的载体。在许多细胞中l 谷氨酰胺的浓度也相对较高，是细胞内氨的 清除剂和生物合成许多重要物质如核酸、氨基糖和氨基酸的供体。 许多研究表明，l 谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸，在剧烈运动、受伤、感染等应 激条件下，l 谷氨酰胺的需要量大大超过了机体合成l 谷氨酰胺的能力，这时，体内 l 谷氨酰胺含量降低，蛋白质合成量减少，出现小肠粘膜萎缩与免疫功能低下现象。l 一 谷氨酰胺还可为多种快速分裂细胞如肠粘膜上皮细胞和活化的淋巴细胞等提供能源，在 促进受损肠道的修复以及维持正常的局部免疫功能中发挥着其它氨基酸不可替代的重 要作用。近年来，l 谷氨酰胺因其独特且复杂的生理功能逐渐成为营养学、生理学、免 疫学等学科领域的研究热剧引。 l 谷氨酰胺的代谢主要受谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶的调节。前者催化谷氨酸和 氨合成谷氨酰胺，主要存在于骨骼肌和脑组织；后者催化l 一谷氨酰胺水解为谷氨酸和氨， 江南大学硕士学位论文 主要存在于一些快速增殖、分化的细胞中，如粘膜细胞、淋巴细胞和内皮细胞等。 骨骼肌是谷氨酰胺合成及储存的主要组织。谷氨酰胺是骨骼肌细胞自由氨基代谢池 中最丰富的氨基酸，约占整个氨基酸总量的6 1 ，浓度大约为血浆中谷氨酰胺浓度的3 0 倍，此浓度梯度有利于l 谷氨酰胺由骨骼肌进入血液循环，进而被转运至小肠和肝等器 官进行代谢。在骨骼肌细胞内，在l 谷氨酰胺合成酶的催化下，并有m 9 2 + 和a t p 参与， 谷氨酸和氨结合生成l 谷氨酰胺。 肾脏和肠粘膜淋巴细胞也可利用部分l 谷氨酰胺【l 们。肾脏中l 谷氨酰胺的代谢主要 是生成氨，对调节机体酸碱平衡具有重要作用，l 谷氨酰胺在肠粘膜淋巴细胞的代谢主 要是作为其能量来源和核酸、蛋白质等合成的供体。肝脏既含l 谷氨酰胺酶又含l 谷氨 酰胺合成酶，两者的协调作用对维持血液中l 谷氨酰胺的浓度平衡具有重要作用。 小肠是利用l 谷氨酰胺的主要器官。动脉中的l 谷氨酰胺进入肠粘膜细胞后，在线 粒体l 谷氨酰胺的作用下水解生成谷氨酸和氨。生成的氨大部分进人门脉系统，后被肝 摄取转化成尿素。 l 谷氨酰胺在维持小肠代谢、结构和功能上起重要的作用，是淋巴细胞增殖所必需 的。研究发现，l 谷氨酰胺在整个宿主防御机制中有重要作用，l 谷氨酰胺的耗竭将导 致整个机体的免疫抑制。 1 4l 谷氨酰胺的应用 l 谷氨酰胺为人体条件性必需氨基酸，其作用主要是增强或提高人体免疫功能，维 持酸碱平衡增加肌肉细胞蛋白质合成；l 谷氨酰胺对肠道粘膜有积极的营养和保护作 用，可作为单一的氨基酸营养物质发挥作用，促进溃疡愈合；可大量用于高强度劳动和 运动后的疲劳恢复；维持肾脏、胰腺、胆囊和肝脏的正常功能【9 d l 】；l 谷氨酰胺还有增 进脑神经机能的作用，对预防和治疗神经衰弱有一定的作用，可以改善脑出血后遗留的 记忆障碍，还能促进智力不足儿童的智力发育，防止癫痫病发作。同时，谷氨酰胺还是 一中很好的饲料添加剂。 1 4 1l 谷氨酰胺的营养作用 谷氨酰胺对胃肠道、免疫和胰脏组织都有很好的营养作用，如表1 1 所示1 1 2 - 1 4 j 。 表1 1 谷氨酰胺对肠道、免疫组织以及胰脏组织的营养作用 ! 苎! ! ! ! ：! ! 丝翌坚垡巫2 翌垒! 巴! 12 1g ! 坚! 塑i 堡2 呈坐呈g 些i 翌翌坚翌21 2 巫! 坐! 坚磐垒巳垫呈! ! 箜2 婆型垄 营养部位作用机理 肠道 免疫组织 胰脏组织 肠粘膜细胞能量代谢的底物；蛋白质和核酸提供原料；增加了肠道绒 毛长度和氮含量；小肠上皮细胞谷氨酸胺的利用率相当高才能确保细 胞分化和粘膜细胞的更新。 免疫刺激时增加酶的活性；淋巴细胞增殖所必需；增加了肠道免疫功 能；l 一谷氨酰胺的耗竭将导致整个机体的免疫抑制。 支持胰脏生长；促使胰腺泡增生刺激胰高血糖素分泌，从而降低门脉 胰岛素与胰高血糖素比例，增加肝脏脂类的输出，预防脂肪肝。 2 第一章绪论 1 4 2l 谷氨酰胺在食品上的的应用 谷氨酰胺在食品增香方面具有独具的特色，见表1 - 2 0 5 1 。 表1 1 2 谷氨酰胺和葡萄糖混合( 1 ：1 ) 加热时产生的香味 ! 些! ! ! ：；i ! 曼翌12 11 些墨i 茎坐! 呈2 1 垒翌巴2 型! 兰i 璺磐垒量! 旦2 1 曼( ! j121 兰型! 皇 氨基酸 s 廿e c k 。震中生成 1 0 0 香型 1 8 0 1 4 3l 谷氨酰胺在运动上的的应用 在体育界，血浆l 谷氨酰胺水平作为评价过度训练的一个指标倍受关注。测定血液 中的l 谷氨酰胺含量可作为过度训练的检测、评价指标。健美爱好者及竞技运动员口服 l 谷氨酰胺能使生长激素的水平提高4 倍，并使胰岛素和睾酮分泌增加，促进肌肉的生 长和身体的增高、增强【1 6 】。因此l 谷氨酰胺常作为运动食品添加剂，用于加强肌肉功能 和运动能力。谷氨酰胺的人体用量如表1 3 1 0 l 。 表1 3 谷氨酰胺的人体用量 ! 呈! ! 呈! ：鱼! 业垫呈垒2 1 呈垫皇坚竺1 2 垒z 适宜人群l 一谷氨酰胺的用量 运动员及健美爱好者 亚健康摄入的总蛋白 应激状态 1 0 w d ( 高强度) 6 - - 8g d ( 低强度) 1 2 4 0 2 o 5g k g 1 4 4l 谷氨酰胺在临床医药上的的应用 作为临床药物，l 谷氨酰胺用于治疗胃部溃疡、克罗恩氏病、肠炎和溃疡性淋巴管 炎，广泛用于维持大脑机能，治疗弱智、癫痫症、帕金森氏综合症、肌肉萎缩症和酒精 中毒等【1 7 】。 胃肠道方面【1 8 】，禁食状态下肠粘膜细胞无法直接获取l 一谷氨酰胺，主要从血液中摄 取机体储存的l 谷氨酰胺，消耗机体大量氮源。补充外源性l 一谷氨酰胺，可增加受损肠 道的血流量，直接提供代谢能源；促进胃粘膜粘液和前列腺素的分泌，促进肠道粘膜细 胞修复，维护粘膜结构完整，防止肠道萎缩；增加局部肠道s i g a 分泌；稳定肠道通透 性，减少细菌移位，防止炎性反应综合征( a r d s ) 。 肝脏方面，l 谷氨酰胺也是肝脏合成抗氧化物还原性谷胱甘肽( g s h ) 中谷氨酸的主 要来源【1 9 1 ，因此如果l 谷氨酰胺缺乏会进一步加重肝功能损伤。谷氨酰胺还可以促进 肝脏脂质代谢，防治脂肪肝。 免疫应答方面 2 0 】，谷氨酰胺是抗原刺激下淋巴细胞增殖的必需物质。l - 谷氨酰胺在 代谢过程中产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( n a d p h ) ，从而发挥其促进各种免疫 细胞增殖和分泌的功能。研究证实低水平l 谷氨酰胺将发生免疫抑制。 此外，l 谷氨酰胺作为肿瘤代谢的营养物质，外源性谷氨酰胺能否刺激肿瘤生长一 江南大学硕士学位论文 直受入关注；l 一谷氨酰胺作为快分裂( r a p i dr e p l i c a t i o n ) 的肠上皮细胞和免疫细胞的主要能 量来源与蛋白合成的中间物，机体对l 谷氨酰胺的需求有明显增加。如果不能及时得到 外源性补充，会大大增加发生m o d s ( m u l t i p l eo r g a n d y s ft m e t i o ns y n d r i m e ) 多脏器功能失 常的危险。 1 4 5l 谷氨酰胺在饲料上的的应用 含l 谷氨酰胺的饲料可以增加动物肠道对l 谷氨酰胺的摄取，激活谷氨酰胺转运 载体，刺激肠粘膜细胞谷氨酰胺酶的活力。饲料中补充谷氨酰胺可以明显改善由于幼仔 断奶应激所造成的损害，防止肠绒毛的萎缩，维持肠道正常的形态和结构，改善幼仔的 生长发育，在促进受损肠道的修复及维持正常的局部免疫功能中发挥重要作用，从而能 有效缓解断奶应激，具有其他氨基酸不可替代的作用【2 l 】。 1 5l 谷氨酰胺的国内外市场及生产情况 微生物发酵法是l 谷氨酰胺的主要生产方法，生产国主要是日本，韩国也有少量生 产。1 9 7 7 年日本用发酵法生产l 谷氨酰胺的年产量达1 0 0t ，1 9 7 9 年上升至0 5 0 0t ，1 9 9 0 年 则上升至f j12 0 0t ，并有逐年递增的趋势。全世界l 谷氨酰胺生产量逐年递增，在19 8 6 年 为9 0 0t ，1 9 9 0 年为1 8 0 0t ，目前年产量约为1 0 0 0 0t 。我国已有不少企业研究l 谷氨酰胺 发酵生产，国内5 年前已大规模生产l 谷氨酰胺，现年产量约2 0 0 0t ，大部分出i ：3 2 2 1 。 1 6l 谷氨酰胺的生产方法 由于l 谷氨酰胺具有广泛的用途，促使其生产得以迅速发展。目前主要的生产方法 有化学酰化法、酶法和直接发酵法【2 3 1 。 1 6 1 化学酰化法 化学酰化法是采用发酵法制得l 谷氨酸进行酰化制取l 谷氨酰胺【2 4 1 。但是化学酰 化法生产l 谷氨酰胺成本比较高，从而限制了l 谷氨酰胺的使用。 1 6 2 酶法生产l 谷氨酰胺 酶法是用n f h + 和谷氨酸作原料，经谷氨酰胺合成酶催化生产l 谷氨酰胺，其转化 机理如图1 1 所示。 a t pa d p l - g l u +m + g i n 合成酶 l - g h l 图1 - 1l 一谷氨酰胺酶法合或反应式 f i g 1 - 1e n z y m ee q u a t i o no fs y n t h e s i z i n gl - g l u t a m i n e 与化学酰化法合成l 谷氨酰胺相比，酶法具有一定的优点，如反应步骤简单、副反 应少、易分离、容易实现自动化等。但是从图1 1 可以看出，酶法合成l 谷氨酰胺需要 解决两个问题：即谷氨酰胺合成酶和底物a t p 的来源。由于此法合成l 谷氨酰胺的产 量较低( 据陈群英报道产量为2 2g l ) ，且a t p 价格昂贵，难以在工业上应用，因而酶 4 第一章绪论 法生产l 谷氨酰胺还有待于进一步深入研究【2 引。 1 6 3 直接发酵法生产l 谷氨酰胺 用发酵法生产l 谷氨酰胺是选择合适的菌种，控制培养基成分及配比，给微生物以 最佳的环境条件，利用微生物的新陈代谢，可以大幅度提高l 谷氨酰胺的产量【2 争列j 。1 9 6 3 年木下一干等首先发现在谷氨酸发酵液中，除了谷氨酸以外，还有l 一谷氨酰胺。1 9 6 3 年，木下祝郎在谷氨酸微球菌发酵液中也发现有谷氨酰胺存在。1 9 7 9 年，中西透等人经 进一步实验证实，改变发酵条件，可以使谷氨酸产生菌从谷氨酸发酵转向l 谷氨酰胺发 酵。8 0 年代后，我国也进行谷氨酰胺发酵，现在工业生产多采用这种方式。 1 7 发酵法生产l 谷氨酰胺的国内外研究现状 1 7 1 菌种选育方面 l 谷氨酰胺产生菌主要来自谷氨酸生产菌，如棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) 2 9 - 3 1 、短 杆菌( b r e v i b a c t e r i u ms p ) 【3 2 1 、微球菌( m i c r o c o c c u ss p ) 【3 3 1 。此外，还有非谷氨酸生产菌， 如产黄菌( f l a v o b a c t e r i u mr i g e r i s e ) 的一些变异菌种。 目前，l 谷氨酰胺产生菌的选育主要采用传统的随机诱变结合定向筛选的方法，随 机诱变包括化学诱变、物理诱变和物理化学复合诱变等，常用的诱变剂和诱变因素有硫 酸二乙酯、亚硝基胍、1 ，射线、紫外线等；定向筛选包括对氨基苯甲酸的结构类似物磺 胺胍的抗性突变筛选、l 谷氨酰胺结构类似物抗性突变筛选、高n h 4 + 浓度抗性突变筛选 等。此外，随着人们对l 谷氨酰胺生产菌株遗传特性的研究，通过基因工程的手段改造 生产菌种提高l 谷氨酰胺的生产能力，有可能从根本上解决l 谷氨酰胺生产能力低的难 题。 y a m a d a 等【3 4 】以非谷氨酸生产菌产黄菌( f l a v o b a c t e r i u mr i g e n s e ) f e r m pn o 3 5 5 6 为 起始菌种，通过紫外诱变获得了一株青霉素抗性突变株f e r m pn o 3 6 2 8 ，l 谷氨酰胺生 产能力由1 0e r e 提高到2 5g l 。 湖北工业大学吴思方等【3 5 】采用丫射线硫酸二乙酯吖射线进行复合诱变，磺胺胍抗 性筛选得到一株高产菌株s h 7 7 ，l 谷氨酰胺平均生产能力由8 2g l 提高到5 5 3g l 。 孙智杰等【3 6 1 在谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ) a t c c l 4 0 6 7 中表达增强 摄氧的透明颤菌血红蛋白基因( v i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i ng e n e ，v g b ) ，以此提高细胞的摄氧能 力及能量的供给水平，结果在溶氧浓度只有5 的条件下，重组菌比野生菌细胞干重提 高了1 2 倍，达到了5 4 1g l ，谷氨酸的生产能力提高了6 5 倍，达到了9 5 6g l ，l - 谷氨酰 胺的生产能力提高了1 4 倍，达到了5 5 1g l 。 u s d i n 等 3 7 】从丙酮丁醇梭杆菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) p 2 6 2 克隆l 谷氨酰胺合 成酶的编码基因，构建p h z 2 0 0 重组质粒，导入e c o l ie t 8 0 5 1 中进行克隆表达，并研究了 l 谷氨酰胺合成酶的表达调控，结果发现l 谷氨酰胺合成酶不受腺嘌呤共价修饰调控， 重组菌的生长速度是野生菌的1 7 倍。 y a m a m o t o 等【3 8 】从腐臭假单胞菌( n p “面m d ，z 鲫t a e t r o l e n s ) 中克隆谷氨酰胺合成酶基 江南大学硕士学位论文 因y - 3 0 ，导入大肠杆菌中进行克隆表达，其表达量是p s e u d o m o n a st a e t r o l e n s 中的3 0 倍。 上述基础工作，为构建工程菌大规模工业化生产l 谷氨酰胺奠定了一定基础。 1 7 2 培养基优化方面 n a b e 等p 9 j 研究t n h 4 + 浓度和延胡索酸对产黄菌属( f l a v o b a c t e r i u mr i g e n s e ) 生产l 谷 氨酰胺的影响，结果发现高浓度n h 4 + 为( o 9 1 6 ) 有利于l 谷氨酰胺的生产，但是当 n h 4 + 浓度大于1 8 时又会抑制l 谷氨酰胺的生产；延胡索酸也是l 谷氨酰胺生产的关键 影响因素。 a n d e r s o n 等【4 0 j 考察t n a c l 对金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 生产l 谷氨酰 胺的影响，结果发现添加5 8 的n a c l ，l 谷氨酰胺的含量提高了2 8 0 0 ，达到1 6 1 8 2 n m o l m g 干细胞；添加1 0 n a c l ，l 谷氨酰胺的含量提高了3 4 0 0 ，达至1 j 1 9 5 7 1n m o l m g 干细胞。 湖北工业大学吴思方等【3 5 】研究了氮源种类和浓度、金属离子、c a c 0 3 等对l 谷氨酰 胺生产的影响，结果使菌株s h 7 7 的l 谷氨酰胺生产能力平均达5 3 0g l ，最高达5 6 2g l ， 这是目前文献报道的最高产量。 1 7 3 关键酶谷氨酰胺合成酶酶活调节方面 t e s c h 等 4 1 1 在谷氨酸棒杆菌中研究了n h 4 + 浓度对谷氨酰胺合成酶( g l u t 锄i n es y n t h a s e ， g s ) 、谷氨酸脱氢酶( g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ，g d h ) 和谷氨酸合成酶( g l u t a m a t es y n t h a s e ， g o g a t ) 活性的影响，结果发现n h 4 + 浓度从1m m o l l 增加至9 0m m o l l 时，g d h 活性维 持在1 3u m g 蛋白，没有发生变化，但当n h 4 + 浓度大于1 0m r r o l l 时，g s 、g o g a t 活性 小于1m m o l l 的1 0 ，即分别低于1 1 0u m g 蛋白、4 2u m g 蛋白；并且发现谷氨酸脱氢 酶酶促反应是谷氨酸棒杆菌摄取n i - h + 的第一步反应。此研究结果为梯度补氮生产l 谷氨 酰胺提供了理论基础。 陈奎发等【4 z j 为了解决高浓度铵盐阻遏g s 表达与l 谷氨酰胺合成需要过量铵之间的 矛盾，在谷氨酸棒杆菌突变株n s 6 1 中利用g s 酶的表达特性，设计了在线氮饥饿处理的 发酵过程；在限制初始氮源浓度的条件下，菌体在生长后期自然进入氮饥饿状态，g s 表达量增加，此后再提供充足的铵盐，提高l 谷氨酰胺的合成能力，结果使l 谷氨酰 胺的产量提高了6 9 ，达到1 1 5g l ，菌体内谷氨酰胺合成酶活性提高了2 倍以上。李春 等【4 3 】提出了原位氮饥饿与铵盐梯度补加协同调控策略，提高了谷氨酰胺的产量，最高产 量可达2 1 9 ，比原位氮饥饿工艺提高了近7 2 ，比未经过氮饥饿处理的旧工艺提高了 近2 0 0 ，达到1 9 7e d l 。 1 7 4 代谢调控偶联方面 w a k i s a k a 等【删研究了a t p 产生与l 谷氨酰胺生物合成的藕联调控策略，通过酵母细 胞发酵产生a t p ，为l 谷氨酰胺合成酶( g s ) 反应合成l 谷氨酰胺提供过量a t p ，使l 谷 氨酰胺产量由1 9g l 提高到5 4g l 。 6 第一章绪论 1 7 5 代谢分析方面 代谢流量分析( m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ，m f a ) 是代谢工程中用以指导遗传操作的重要 工作，是代谢网络分析的基本方法。本课题采用代谢流分析的方法知道代谢育种和为以 后的设计育种提供参考。代谢分析的方法国内外应用代谢流分析的方法十分广泛，多使 用电脑模拟代谢网络模型。 j o u n g m i nl e e 4 5 】等采用电脑模拟的丁醇梭菌a t c c 8 2 4 代谢网络模型进行全基因组 代谢流分析，检验单基因敲除对丁醇产生的影响，利用代谢流分析的方法指导基因操作。 r m o n t a n e z 4 6 1 等使用电脑模型进行精氨酸分解的代谢通量控制分析，通过模拟改变 精氨酸浓度和其它控制参数，用以分析转运载体和相关酶系在不同参数条件下对精氨酸 分解产生n o 和多胺产生中的作用变化。 国内代谢流分析主要还是应用于氨基酸代谢调控分析和有机酸代谢的分析中。杨艳 等【4 7 】利用代谢流分析的方法分析氮饥饿对谷氨酰胺产生菌n $ 6 1 1 的影响，证实氮饥饿对 谷氨酰胺合成酶活性提高有作用。 天津科技大学的杜军等【4 8 】利用代谢流分析的方法分析和指导发酵过程优化，显著提 高了谷氨酸的产率；黄佳良等【4 9 】基于p e t r i 网理论构建生物代谢网络模型，提出一种新的 采用不等式的代谢流分析方法，新分析方法在前提假设和分析性能两方面均比采用方程 式的传统方法明显优越：允许数据有一定误差，还可以进行代谢流分裂比分析、敏感性 分析，使代谢流分析应用更为深入。 1 8 研究意义 l 谷氨酰胺作为人体中含量最多的一种氨基酸，在调节人体蛋白质的合成、抑制蛋 白质的降解、刺激细胞生长、激活免疫系统、提高生长激素水平等方面起着重要作用。 因其独特的代谢功能和营养特性，已逐渐成为营养学、生理学、免疫学等学科领域的应 用热点。 目前，消化道溃疡和脑神经功能疾病在我国乃至世界都属多发病，因为药用l - 谷氨 酰胺需求量很大，有巨大的潜在市场。因此l 谷氨酰胺的研究开发对我国氨基酸工业及 医疗保健事业将是一个很大的贡献，具有明显的社会效益。随着全球经济的发展，医疗 保健水平的进步和人们对l 谷氨酰胺认识的不断增加，以l 谷氨酰胺为原料的营养强 化产品市场将会更加广阔。 由于发酵法生产l 谷氨酰胺国外仅日本等几个国家生产，所以国际市场对我国l 一谷 氨酰胺出口需求迫切，预计年出口量将迅速达到几千吨。对于我们这样一个1 3 亿人口的 大国，l 谷氨酰胺等药用氨基酸需求量很大，有巨大的潜在市场，目前我国药用l - 谷氨 酰胺依靠进口且价格昂贵。预计国内l 谷氨酰胺需求可达3 0 0 - 5 0 0t a ，现在国际市场上 l 谷氨酰胺价格大约8 1 0 万元左右t 。因此，发酵法大规模生产l - 谷氨酰胺将满足国内 的市场需求，推动我国氨基酸发酵工业的发展，同时，重要的是产品还可出口创汇进入 国际市场【2 2 1 。 7 江南大学硕士学位论文 1 9 本论文的研究内容 本文首先以嗜乙酰乙酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ma c e t o a c i d o p h i l u m ) y l 0 1 2 为出发菌 株，选育得一株l 谷氨酰胺产生菌l c h a 0 8 2 ( m s o r ，s g r ，( n h 4 ) 2 s 0 4 r ，s a g , n a f r ) ，对影响 该菌株代谢的发酵培养基组成及摇瓶发酵条件进行优化，具体研究的主要内容如下： ( 1 ) l 谷氨酰胺产生菌的选育：以微生物遗传育种学为理论基础，采用氨基酸结 构类似物定向育种技术，选育遗传性状稳定、培养条件粗放的l 谷氨酰胺产生菌。 ( 2 ) l 谷氨酰胺摇瓶发酵条件的研究：在摇瓶发酵条件下发酵培养基及培养条件 进行优化。 ( 3 ) 对出发菌株y l 0 1 2 和突变株l c h a 0 8 2 进行了代谢流量分析，建立并完善了 嗜乙酰乙酸棒杆菌y l 0 1 2 及其突变株l c h a 0 8 2 合成l 谷氨酰胺的中心代谢网络；分析 诱变结果，为下一步的育种设计提供参考。 ( 4 ) 通过氮饥饿的方法对谷氨酰胺合成酶( g s ) 进行调节，并对原位氮饥饿- 梯度补 氮发酵的方法进行了初步的研究。确定原位氮饥饿梯度补氮的条件，并使用代谢流的 方法对氮饥饿的优点和缺点进行分析。 8 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 茵种 嗜乙酰乙酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ma c e t o a c i d o p h i l u m ) y l 0 1 2 ，本实验室保藏。 2 1 2 试剂与原材料 葡萄糖 玉米浆 蛋白胨 牛肉膏 亚硝基胍 硫酸二乙酯 磺胺胍( s g ) 琥珀酸 l 谷氨酸钠 c a c 0 3 ( 轻质) n a 2 s 2 0 3 ( n h 4 h s 0 4 k h 2 p 0 4 m g s 0 4 7 h 2 0 m n s 0 4 4 h 2 0 f e s 0 4 7 h 2 0 z n s 0 4 7 h 2 0 生物素 硫胺素 丙酮 甲醇 l 异亮氨酸 l 缬氨酸 l 异亮氨酸 l 精氨酸 l 甘氨酸 l 谷氨酸 l 酪氨酸 食品级 工业级 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 工业级 分析纯 工业级 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 色谱纯 色谱纯 色谱纯 色谱纯 色谱纯 色谱纯 色谱纯 色谱纯 色谱纯 9 山东西王生化科技有限公司 无锡酶制剂厂提供 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 瑞士f l u k a 公司 上海试剂厂 美国s i g m a 公司 上海试剂厂 湖州生物化学厂 鹰潭生物化学制品厂 中国医药集团上海化学试剂公司 鹰潭生物化学制品厂 鹰潭生物化学制品厂 鹰潭生