（发酵工程专业论文）上面发酵小麦啤酒中4vg含量的工艺控制.pdf

r p r o 。 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名：舀拯犀 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 蠹赫罂 导师签名： 固乏塑 只期： z 垒年月二r 4 f ， l 山东轻t 业学院硕 ：学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i 第1 章绪论1 1 1 我国啤酒业现状1 1 2 啤酒酿造原料2 1 3 啤酒酵母及发酵方式概述2 1 3 1 啤酒酵母2 1 3 2 啤酒发酵方式5 1 4 啤洒生产工艺流程图6 1 5 小麦啤酒概述6 1 5 1 小麦啤酒的主要特点7 1 5 2 小麦啤酒的发酵工艺7 1 6 啤酒中4 乙烯基愈创木酚研究进展8 1 6 1 阿魏酸简介8 1 6 24 乙烯基愈创木酚简介一9 1 6 34 乙烯基愈创木酚形成途径和机理9 1 6 4 国内外小麦啤酒中4 v g 的研究历史与现状1 0 1 7 研究目的与内容一l l 1 7 1 研究目的1 1 1 7 2 研究内容1 1 第2 章p o f + 酵母检定13 2 1 引言13 2 2 材料和方法13 2 2 1 菌种l3 2 2 2 培养基13 2 2 3 主要原料和试剂1 4 2 2 4 主要仪器与设备1 4 2 3 实验方法14 2 3 1 高效液相色谱仪检测法1 4 2 3 2 平板培养法检定l7 2 4 结果和讨论一17 2 4 1 高效液相色谱法测定实验结果1 7 2 4 2 平板培养法检定的实验结果1 8 j “i 4 3 4 4 第5 章 5 1 5 2 5 4 5 5 第6 章 6 1 6 2 创新点6 6 6 3 展望6 6 参考文献6 7 致 谢7l 在学期间主要科研成果7 3 一、发表学术论文7 3 二、其它科研成果7 3 4 山东轻t q k 学院硕i ：学位论文 摘要 有些啤酒中存在一种特殊的香料或丁香类香味，在上面发酵的啤酒中尤为多 见，且容易被接受，但在下面发酵啤酒中却是无法接受的。这种特殊的香味是由 一种重要的挥发性酚类物质造成的，这就是4 乙烯基愈创木酚( 4 v g ) 。丁香类 香味是上面发酵小麦啤酒不可或缺的特殊香味。4 v g 不是啤酒原料中天然存在 的，而是在酿酒的制麦、糖化和发酵各环节中由阿魏酸发生脱羧反应产生的。4 v g 的产生存在两种途径，其一，阿魏酸可通过高温热脱羧反应产生4 v g ；其一，阿 魏酸通过酶的催化发生脱羧反应产生4 v g 。在酿酒过程中，4 v g 要在麦汁煮沸过 程中才能够达到定的浓度，高浓度的4 v g 要利用p o f + 酿酒酵母菌株在发酵过 程中才能产生。 在酿造上面发酵小麦啤酒的原料中，酵母是最重要的。酵母有p o f + 和p o f 。 之分。p o f + 菌具有编码阿魏酸脱羧酶的基因，能明显提高啤酒中4 v g 的含量。 并且，每种酵母都具有不同的酿造特性，对工艺有不同的要求。在此，对实验室 保存的三种上面酵母n o 3 0 3 ，n o 3 5 4 和n o 3 6 2 进行了p o f 特性的鉴定，并对每 种菌种的酿造特性进行了研究。 为研究酿酒过程中各因素对啤酒中4 v g 含量的影响，对糖化和发酵过程中的 原料配比、投料温度、煮沸时| 、日j 和发酵温度等工艺参数进行了研究。研究分别进 行单因素实验和萨交试验，在糖化和发酵的过程中取样，利用高效液相色谱检测 阿魏酸和4 v g 的含量，并利用s p s s 统计软件进行分析。通过单因素实验分别确 定了各凶素与啤酒中4 v g 含量的关系，通过f 交试验确定了最佳工艺参数。 经过研究发现，实验室保存的三种上面酵母中，只有n o 3 0 3 在鉴定实验中的 4 v g 产量为2 9 m g l ，大于2 5 m l ，为p o f + 酵母。上面酵母具有发酵周期短， 启发速度快，发酵度较高的特性。最佳的工艺参数为：配料比8 0 ：2 0 ，投料温度 3 7 ，煮沸时间为9 0 m i n ，发酵温度为2 0 。 关键词：4 乙烯基愈创木酚；阿魏酸；上面发酵；小麦啤酒 一 山东轻1 j 业学院顾l ：学化论义 a b s t r a c t t h e r ei sad i s t i n c t i v ec l o v e l i k ea r o m ai ns o m eb e e r s t y l e s i n m o s t b o t t o m - f e r m e n t e db e e r s ，i ti sc o n s i d e r e dt ob eu n d e s i r a b l e i ns o m et o p - f e r m e n t e d b e e r s ，h o w e v e r , t h i s f l a v o ri se s s e n t i a l a k i n d o fv o l a t i l e p h e n o l c a l l e d 4 - v i n y l g u a i a c o l ( 4 v g ) h a sb e e nr e p o r t e d t oc o n t r i b u t et ot h i sa r o m a a n dt h e c l o v e 1 i k ea r o m ai se s s e n t i a lt ot h et o p f e r m e n t e dw h e a tb e e r t h e4 v g i sn o tn a t i v et o t h er a wm a t e r i a l ，w h e r e a si to r i g i n a t e sf r o md e c a r b o x y l a t i o no ff e r u l i ca c i d f e r u l i c a c i dc a nb ed e c a r b o x y l a t e db yt h e r m a ld e c o m p o s i t i o na n ds p e c i f i ce n z y m e s d u r i n g b r e w i n g ，4 v gc a nb ed e t e c t e di n t h eb o i l e dw o r t ，a n dh i g hl e v e l s4 v gs h o u db e d e t e c t e di nt h eb e e rf e r m e n t e dw i t hp o f + y e a s t s t h ey e a s t sa r et h em o s ti m p o r t a n tm a t e r i a l ，i n c l u d i n gp o f + y e a s t sa n dp o f y e a s t s i nt h ep o f + s t r a i n s ，as i n g l ed o m i n a n tn u c l e a rg e n e ，d e s i g n a t e dp a d 1 ，e n c o d e s f o rf e r u l a t ed e c a r b o x y l a s e ，c a ni n c r e a s et h el e v e l so f4 v g e v e r yk i n do fy e a s th a sa d i s t i n c t i v eb r e w i n gc h a r a c t e ra n df i tt oas p e c i f i cb r e w i n gp r o c e s s i h et h i ss t u d y , t h r e e y e a s t si n c l u d i n gt o py e a s tn o 3 0 3 ，n o 3 5 4a n dn o 3 6 2w e r e i d e n t i f i e df o rp o f c h a r a c t e ra n ds t u d i e df o r t h eb r e w i n gc h a r a c t e r i nt h i ss t u d y , t h ei n f l u e n c eo ff o u rp a r a m e t e r si n c l u d i n gr a wm a t e r i a lm i x t u r e r a t i o ，b a t c hf e e d i n gt e m p e r a t u r e ，b o i l i n gt i m ea n df e r m e n t a t i o nt e m e p r a t u r eo nt h e l e v e lo f4 v gi nt h eb e e rw a sc a r r i e dt h r o u g hw i t hs i n g l ef a c t o rt e s ta n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s a m p l e sw a s t o o kf r o mt h eb e e rd u r i n gi t sb r e w i n gp r o c e s sa n dd e t e c t e d w i t hh p l cf o r t h ef e r u l i ca c i da n d4 v gl e v e l a 1 lt h er s u l t sw e r ec o n d u c t e dw i t ht h e s t a t i s t i cs o f t w a r eo fs p s s ，t h er e l a t i o n sb e t w e e nt h ep a r a m e t e r sa n dt h e4 v gl e v e l s w e r ef o u n do u td u et ot h es i n g l ef a c t o rt e s t a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e d b yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t i iw a sf o u n dt h a t ，o n l yt h ey e a s tn o 3 0 3i sp o f + y e a s ta m o n gt h et h r e ey e a s t s t h e4 v gl e v e lo ft h eb e e rb r e w e dw i t hy e a s tn o 3 0 3w a su pt o2 9 m g la n do u t w e i g h 2 5 m g l t h et o py e a s t sa r es h o r t e ri nf e r m e n t a t i o np e r i o d ，f a s t e ri nm e t a b o l i cr a t ea n d h i 曲i nf e r m e n t a t i o nd e g r e e t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w e d ：t h ep r o p o r t i o n o fb a r l e ym a l ta n dw h e a tm a l t8 0 ：2 0 ，b a t c hf e e d i n gt e m p e r a t u r e3 7 0c ，b o i l i n gt i m e 9 0 m i n , f e r m e n t a t i o nt e m e p r a t u r e2 0 0 c k e yw o r d s ：4 v i n y l g u a i a c o l ；f e r u l i ca c i d ；t o p - - f e r m e n t a t i o n ；w h e a tb e e r 山东轻t 业学院顾 j 学位论文 第1 章绪论 1 1 我国啤酒业现状 大约起源于9 0 0 0 年前的中东和古埃及地区【1 1 的啤酒，由于它的营养价值和保 健功能，以及它有别于非酒精饮料的独特风味和良好品质，已为广大消费者接受 和喜爱，成为长盛不衰的国际饮料。 国家标准g b 4 9 2 7 2 0 0 8 规定：啤酒是以麦芽( 包括特种麦芽) 、水为主要原 料，加啤洒花( 包括酒花制品) ，经酵母发酵酿制而成的、含有二氧化碳的、起泡 的、低洒精度的发酵酒( 2 1 。 全世界约有1 5 0 多个国家和地区均有生产，是世界上生产和消费量最大的酒 种。2 0 0 5 年，全球啤酒产量已达1 5 9 亿千升，全球平均消费鼍为3 0 升人。 我幽啤酒产量从1 9 7 8 年的4 5 万千升增至1 9 9 0 年的6 9 2 2 万千升，1 9 9 3 年我 国啤酒以1 2 2 5 力千升的产量超过德国，一跃成为世界第二啤酒生产国。至2 0 0 2 年，我圉啤酒产量再创新高，达到创纪录的2 3 8 6 8 3 万千升，超越美国成为世界 第一啤洒生产大国。2 0 0 9 年，中国啤酒产量达到4 2 3 6 3 8 万千升，较去年同比增 长1 6 3 ，已经连续九年居世界首位。据德国b a r n l h a a s 集团报道【3 1 ，2 0 0 8 年全 球啤酒产量为1 8 1 5 6 m h l ，华润啤酒、青岛啤酒和燕京啤洒继续位列世界前十强 之内，其产量和所占世界份额如表1 1 。 表1 12 0 0 8 年世界啤酒产量前十强 t a b l e l 1t o p1 0b r e w e r yg r o u p si nm ew o r l di n2 0 0 8 排名 集团名称所属国家2 0 0 8 年产鼙( m h l )世界份额( ) 1 a bi n b e v 3 ( 白威英博) 比利时3 8 8 12 1 4 2 s a b m i l i e r b英国1 7 4 49 6 3h e i n e k 饥( 喜力)荷兰 1 6 1 58 9 4 c a r l s 吨( 嘉十伯) 丹麦 1 0 9 36 0 5c h i n a r e s o u r c e ( 华润) 中国 7 3 04 0 6t s i n g t a o ( 青岛) 中国 5 4 33 0 7m o d e l o ( 莫德罗)墨两哥5 1 5 2 8 8m o l s o n c o o r s美国加拿大 5 1 12 8 9 y a n j i n g ( 燕京) 中国4 2 22 3 1 0f e m s a墨撕哥4 1 12 3 尽管我国人均啤酒消费量已接近2 2 升，但中西部地区却仅在l o 升左右，8 1 第1 章绪论 亿多人口的农村人均连5 升不到。而目的世界平均水平是3 0 升，欧美国家人均年 消费啤酒更是己超过8 0 升。因而，与世界发达国家相比，我国啤酒企业仍有很大 差距，主要表现在三个方面：一是相对于国际大公司来说，中国啤酒企业规模偏 小，劳动生产率低下，竞争能力不强，像美国的a b 公司，一年的利润就有2 0 亿美元。二是在技术经济指标方面也有差距。三是科研方面存在差距，国内在啤 酒方面的研发投入不够，致使在新型啤酒的丌发上落后于发达国家。因此，我国 的啤酒业发展还有很长的路要走。 1 2 啤酒酿造原料 我们知道，德固严格遵循其1 5 1 6 年制定的啤酒纯净酿造法，卸啤酒酿造 只允许使用水、麦芽、酒花和酵母四种原料，不允许添加任何其他辅料。除此之 外，世界上绝大多数国家生产啤酒均使用辅料( 如大米、玉米、小麦、大麦、黍 米、大豆、糖类及糖浆等) ，主要是出于经济方面的考虑，充分发掘本国、本地区 的物产资源，以降低成本。 在众多的辅料中，大米是世界啤酒工业最普遍使用的辅料，其特点是价格低 廉，蛋白质、多酚物质和脂肪含量低j 二麦芽，而淀粉含量高于麦芽【1 】；而小麦由 于富含蛋白质，能赋予啤酒丰富的泡沫和营养，并且是世界四大农作物之一，产 量大、易获得，价格低于酿造大麦，因而也广受青睐。有的甚至将小麦芽作为主 要原料，用来酿造小麦啤酒1 4 】。如果我们能用部分甚至大部分小麦替代大麦酿造 啤酒，无疑将可以充分利用我国小麦的资源优势，解决我困目前啤酒原料大麦资 源不足、短缺的问题，降低生产成本，提高啤酒企业的市场竞争力，进一步促进 啤酒技术的发展，进而为啤酒原料的罔产化打下基础。 1 3 啤酒酵母及发酵方式概述 1 3 1 啤酒酵母 ( 1 ) 酵母菌概述【5 j 用于酿造啤酒的酵母，多为酿洒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的不同品 种，其细胞形态与其它培养酵母相同，为近球形的椭圆体，与野生酵母不同。啤 酒酵母在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐。无性繁 殖以芽殖为主。能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖和蔗糖，不能发酵乳糖和蜜二糖。 丹麦c a r l s b e r g 酿造研究所的下面酵母是有名的。其它著名的啤酒酵母有德国的下 面酵母，英、同等囤的上面酵母。 酵母是真菌类的一种微生物。在啤酒酿造过程中，酵母是魔术师，它把麦芽 和大米中的糖分发酵成啤酒，产生酒精、二氧化碳和其他微量发酵产物。这些微 2 山东轻t 业学院硕l ：学位论文 量但种类繁多的发酵产物与其它那些直接来自于麦芽、酒花的风味物质一起，组 成了成品啤酒诱人而独特的感官特征。 ( 2 ) 啤洒酵母菌落形态【6 j 啤酒酵母的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落入而厚，菌落表面光滑、湿 润、粘稠，菌落质地均匀，i f 反面和边缘、中央部位的颜色都和均一，啤酒酵母 的菌落为乳白色，如图1 1 所示： 图1 1 啤酒酵母菌落形态 f i g u r e1 1c o l o n ym o r p h o l o g yo fy e a s t ( 3 ) 上面发酵酵母和下面发酵酵母【l 】 实际生产中最常用的酵母分为两大类：上面酵母和下面酵母。二者形态上存 在着明显差别。 上面发酵酵母 又叫表面酵母、顶面酵母。其母细胞和子细胞能够长时间相互连接，形成多 枝的芽簇( 见图1 2 ) 。 图1 2 上面发酵酵母 f i g 1 2t o pf e r m e n t i o ny e a s t 下面发酵酵母：又叫底面酵母、储藏酵母。其母细胞和子细胞增殖后彼此 第1 章绪论 分开，几乎都是单细胞或几个细胞连接( 见图1 3 ) 。 图1 3 下面发酵酵母 f i g i 3b o t t o mf o v n e n t i o ny e a s t 二者区别见表1 2 当然，上面酵母和下面酵母的性质也不是一成不变的，有时也会有所变化。 例如对棉籽糖的发酵，某些下面酵母也仅能发酵1 3 的棉籽糖。 表1 2 上面酵母和卜面酵母的区别 t a b 1 2t h ed i f f e r e n c eb e t t w e nt h et o py e a s ta n dt h eb o t t o my e a s t 上面酵母有p o f + 和p o f 之分 所谓的p o f 即p h e n o l i co f f - f l a v o u r ( 不利的酚味) ，对于下面发酵啤酒来说 4 山东轻t 业学院硕l ：学位论文 是一种不好的风味，但对于上面发酵啤酒来说却是其不可缺少的特有的典型香味。 1 3 2 啤酒发酵方式 啤酒发酵是在啤酒酵母体内所含的一系列酶类的作用下，以麦汁所含的可发 酵性营养物质为底物而进行的一系列生物化学反应。 传统啤酒发酵方式有上面发酵和卜面发酵二种。根据采用的酵母菌种和生产 工艺的不同，生成的啤酒风味也不一样。如f ，对两种发酵方式进行了比较分析。 ( 1 ) 上面发酵 上面发酵采用上面发酵酵母，在1 5 2 0 下进行发酵，细胞形成量较多，酵 母回收比较复杂，代数远远超过下面发酵酵母，长久没有衰退现象。主要方法有 传统的撇去法，落下法，巴顿联合法，约克夏法。上面发酵的啤酒成熟快，设备 周转快，啤酒有独特的风味，但保质期短。一般不采用后发酵期，而是加胶处理， 澄清一阶段后，采用人工充二氧化碳，使达到饱和。上面发酵酿造出的啤酒泡沫 丰富、细腻、洁白，酒香浓郁、持久，具有浓郁的麦芽香味，脂香独特，口感柔 和醇厚，苦味舒适，回味悠长。 ( 2 ) 下面发酵 下面发酵主要分为主发酵、后发酵及储藏三个时期。主发酵又分为酵母繁殖 期、起泡期、高泡期、落泡期、泡盖形成期五个阶段。酵母繁殖期，麦汁添加酵 母8 1 6 个小时以后，液面上出现二氧化碳小气泡，逐渐形成白色的，乳脂状的泡 沫，酵母繁殖2 0 小时以后立即进入主发酵槽；起泡期，还槽4 5 小时后，在麦 汁表面逐渐出现更多的泡沫，由p q 周渐渐向中间，洁白细腻，厚而紧密，如花菜 状，有二氧化碳小气泡上涌，并且带出一些析出物；高泡期，发酵后2 3 天，泡 沫增高，形成隆起，并因酒内洒花树脂和蛋白质单宁复合物开始析出而逐渐变为 棕黄色，此时为发酵旺盛期，需要人工降温，但是不能太剧烈，以免酵母过早沉 淀，影响发酵作用；落泡期，发酵5 天以后，发酵力逐渐减弱，二氧化碳气泡减 少，泡沫回缩，酒内析出物增加，泡沫变为棕褐色：泡盖形成期，发酵7 8 天后， 泡沫回缩，形成泡盖，撇去所析h 的多酚复合物，酒花树脂，酵母细胞和其他杂 质，此时应大幅度降温，使酵母沉淀。后发酵以及储藏阶段，麦汁经主发酵后的 发酵液叫嫩啤酒，此时酒的二氧化碳含量不足，双乙酰，乙醛，硫化氢等挥发性 物质没有减低到合理的程度，酒液的口感不成熟，不适合饮用。大量的悬浮酵母 和凝结析出的物质尚未沉淀下来，酒液不够澄清，一般还要几个星期的后发酵和 贮酒期，啤酒的成熟和澄清均在后发酵和贮酒期。下面发酵主要采用下面发酵酵 母，酿造出的啤酒色浅，味干，酒体适中，麦芽香味较酒花香味重。 ( 3 ) 参数比较如表1 3 第1 章绪论 表1 3 上面发酵和卜面发酵的技术参数比较 t a b 1 3t h e c o m p a r i s o no f t o p f e r m e n t a t i o na n db o t t o mf e r m e n t a t i o n 1 4 啤酒生产工艺流程图 啤酒生产i ：艺如图1 4 。 跫喜 警 耢霹 1 5 小麦啤酒概述 图1 4 啤酒生产。t j 艺流程 f i g 1 4p r o c e s sc h a r to f b e e rp r o d u c t i o n 早期酿造啤洒的原料是不统一的，有大麦、小麦，也有荞麦。直到公元8 世 纪【7 】，德国人d 把大麦和啤酒花固定为啤酒酿造原料。随着科技的发展，酿造原 理得到深入的研究，且大麦原料出现短缺现象。人们开始开发大麦以外的其他酿 造原料，如部分使用大米、玉米、荞麦等为辅助原料，生产出各种各样的啤酒， 丰富了啤酒的品种，且价格便宜。例如德国传统的白啤酒就是以小麦为主要原料 6 山东轻t 业学院硕i ：学位论文 酿制的啤酒佳品。1 9 6 0 年【8 】，经过f 式的鉴定认可，小麦啤酒先后在巴伐利亚州 的许多工厂大量生产，冲破了啤洒酿造只用大麦芽的“纯净法”【9 】的长期束缚， 成为独特新颖的风味产品。从1 9 6 0 年到1 9 8 4 年的2 0 多年的时问内，仅在巴伐利 亚州生产各种小麦啤酒的厂家，就由最初的少数几家发展到1 6 0 多家，产量从0 , 4 3 9 亿升猛增到4 3 3 6 亿升【i o , 1 1 ，并同益受到其他国家的欢迎。2 0 世纪8 0 年代初，产 量居世界榜首的美国也开始研究生产小麦啤澍1 引。此外，比利时f 1 3 】、波兰【1 4 】、保 加利亚1 1 5j 等也生产出各种类型的小麦啤酒。 小麦啤酒一般是指在大麦麦芽之外添加部分小麦麦芽或生小麦酿制的类啤 酒【1 6 】。小麦啤酒多采用上面发酣1 7 】，其产品种类多样，生产工艺要求较高。近年 来，国内市场上已出现多种品牌的小麦啤酒【l 引，但多是采用下面发酵的方式。 小麦是世界上种植最多的谷物，也是我国的主要农作物，产量很高，价格较 低，其中蛋白质含量较低的白小麦品种特别适宜小麦啤酒的酿造。丌发生产小麦 啤酒，无疑将极大地减少大麦芽的使用量，缓解我国大麦需要进口的紧张局面， 可以节约大量外汇，并能大幅度降低酿造成本，在大麦芽价格飞涨、啤酒提价很 少的今天显得更有现实意义。目前，国内酿造上面发酵小麦啤酒的厂家较少，而 下面发酵小麦啤酒无法体现出上面发酵小麦啤酒的特色，若能通过菌种筛选、工 艺调节，控制其合适的含量，丌发出香味适中的上面发酵小麦啤酒，无疑将极大 满足消费者多层次的需求，提高企业的市场竞争力。 1 5 1 小麦啤酒的主要特点 小麦啤酒具有小麦香气和酯香味，口感清爽、醇厚、柔和、杀口、苦味适宜、 爽口、二氧化碳含量高、泡沫极其丰富，深受消费喜爱i l 9 1 。 传统的小麦啤酒都是上面发酵，储酒期很短，小麦啤酒前面常冠以“白”字， 在于提示此种啤酒储存期短，易于速销。 最初生产的典型小麦啤酒足德国南部巴伐利亚所制的小麦啤酒，有时n q , j , 麦 啤酒，有时也叫白啤酒，至少掺用5 0 的小麦麦芽或小麦。德国北部生产的小麦 啤酒则叫“柏林白啤酒”，两地虽然同是生产小麦啤酒，做法上却不一样。 1 5 2 小麦啤酒的发酵工艺 德国小麦啤酒生产有两种发酵方式：一是利用上面酵母进行上面发酵；二是 利用上面酵母进行前发酵，再利用下面酵母进行后发酵，称为：“混合发酵”的 方式。 发酵工艺采用锥形罐一罐法，既上面发酵方式。 麦汁接种上面酵母后，进行浮选除去冷凝固物，同时充氧繁殖酵母，导入锥 形罐内进行发酵。 发酵液接种温度为1 6 ，上面酵母泥接种量为0 5 ，最高发酵温度2 0 2 2 。 7 第1 章绪论 2 4 h 后备压至0 1 8 m p a 。因上面酵母的同化特性，主发酵十分强烈，降糖速度较 下面发酵快得多，主发酵温度为1 6 2 2 。c ，主发酵进行3 4 d ，达最终发酵度 7 8 8 5 ，测双乙酰 寸1 0 一。 0 10 0 0 0 2 0 0 0 0 3 0 0 0 0 峰高 图2 24 - 乙烯基愈刨小酚含量标准曲线 f i g 2 2t h es t a n d a r dc u r v eo f4 v i n y l g u a i a c 0 1 样品进样 将四株酵母培养物溶液分别用0 4 5 i t m 超滤膜过滤后，放入超声波水槽中脱 1 6 山东轻t 业学院硕f ：学位论文 气1 0 2 0 m i n 。然后，依次进样测4 乙烯基愈创木酚对应峰高，根据回归方程计算 4 乙烯基愈创木酚含量。 2 3 2 平板培养法检型4 3 】 ( 1 ) 供试菌活化 鲜酵母活化： 分别将啤酒酵母n o 3 0 3 、n o 3 5 4 、n o 3 6 2 接入到装有5 m l y p d 培养基的三 支试管中，放入摇床中，在1 8 。c 、2 0 0 转分钟的条件下振动培养l 天。然后再将 其转接到装有2 0 m l y p d 培养基的三角瓶中，以同样条件振动培养2 3 天。 干酵母活化： 称取1 9 爱尔干酵母，加入到装有2 0 m l y p d 培养基的三角瓶中，放入摇床中， 以同样条件振荡培养l 小时。 ( 2 ) 制备g y n b c a i1 0 培养基平板 将灭菌的g y n b c a l1 0 培养基倒入培养皿中制成平板，每个培养皿中约5 0 m l 培养基，共需8 个培养皿，冷凝，待用。 ( 3 ) 平板涂布 在超净- 工作台中，用移液枪吸取1 0 0 肛l 活化好的酵母菌恳液，涂布于已制备 好的平板上，用三角刮刀涂匀、涂干；每个酵母涂2 个平板。 ( 4 ) 培养与观察 将涂布好的平板在2 5 c 条件下培养3 5 天，并且观察酵母菌的生长状况。 2 4 结果和讨论 2 4 1 高效液相色谱法测定实验结果 表2 3 即为用高效液相色谱法测定的四株酵母培养物中4 乙烯摹愈创木酚的 含量的实验结果 表2 3 四株酵母培养物中4 乙烯基愈创术酚的产颦 t a b 2 3t h ey i e l do f 4 - v i n y l g u a i a c o lb y4k i n d so fy e a s t 根据m c m u r r o u g h 等人f 删确定的方法可以得出的这样的结论：在培养过程中， 培养物中4 - 乙烯基愈创木酚的产生量大于2 5 m g l 的酵母菌株被确定为p o f + 菌 株。根据上表可以看出，啤酒酵母n o 3 0 3 培养物的4 乙烯基愈创木酚的产量为 1 7 第2 章p o f + 酵母榆定 2 9 3 2 8 m g l ，大于2 5 m g l ，从而可以判定啤酒酵母n o 3 0 3 为p o f + 酵母。而其 他三种酵母的4 乙烯基愈创木酚的产量均少于2 5 m g l ，所以不是p o f + 酵母。 2 4 2 平板培养法检定的实验结果 以下四幅图即为四株啤酒酵母在g y n b c a l l 0 培养基平板上的生长状况。每 一种啤酒酵母做了两个平板来进行对比观察，所有的平板都是在相同的温度条件 下培养，这样可以排除温度因素对酵母菌，长的影响。 图2 3 爱尔干酵母生长状况 f i g 2 3t h eg r o w t hs t a t u so fa l ed r yy e a s t 图2 4 啤酒酵母n o 3 5 4 生长状况 f i g 2 4t h eg r o w t hs t a t u so fb e e ry e a s tn o 3 5 4 图2 5 啤酒酵母n o 3 6 2 生长状况 f i g 2 5t h eg r o w t hs t a t u so fb e e ry e a s tn o 3 6 2 1 8 山东轻t 业学院硕l j 学位论文 图2 6 啤酒酵母n o 3 0 3 生长状况 f i g 2 6t h eg r o w t hs t a t u so f b e e ry e a s tn o 3 0 3 通过观察可以发现，只有接有啤酒酵母n o 3 0 3 的平板上长有菌落，其他i 种 酵母并没有生长。而根据结论当g y n b 培养基中肉桂酸浓度达到一定值即 1 1 0 m g l 时，p o f + 菌株生长而p o f 。菌株不生长。据此可以推断出啤酒酵母n o 3 0 3 为p o f + 酵母。 2 5 结论 根据前人的研究成果，结合自己的实验研究，可以得出如下结论： ( 1 ) 利用高效液相色谱仪( h p l c ) 检测培养物中4 乙烯基愈创木酚的产量， 如果含量超过2 5 m g l 就可以判定该酵母菌株为p o f + 酵母，否则就是p o f 酵母。 实验中，啤酒酵母n o 3 0 3 培养物的4 乙烯基愈创木酚的产量为2 9m g l ，大于 2 5 m g l ，从而可以判定啤酒酵母n o 3 0 3 为p o f + 酵母。 ( 2 ) 利用掺有肉桂酸的葡萄糖基本培养基来培养酵母，如果酵母葡生长形成 菌落就可以判定该酵母为p o f + 酵母，否则就是p o f 。酵母。实验中，四株啤酒酵 母中只有涂有n o 3 0 3 的平板长出菌落，从而可判定啤酒酵母n o 3 0 3 为p o f + 酵母。 ( 3 ) 该论文所用两种方法都可以准确判定p o f 酵母的特性，而且结果一致。 但是，利用高效液相色谱仪( h p l c ) 来判定结果更为快捷，仅为2 天；而利用 涂布肉桂酸葡萄糖培养基平板法步骤较烦琐，时间也较长一些，约为7 8 天。 1 9 i 山东轻t 业学院颁i ：学位论文 3 1 引言 第3 章上面酵母酿造特性的研究 目前，各啤酒厂采用的酿酒方法为下面发酵法，使用的酵母为下面酵母。下 面酵母的酿造特性已经有了深入的研究。而p o f + 酵母主要是上面酵母，本实验采 用的酵母也是本实验室保存的来自德国杜门斯啤酒学院的上面酵母n o 3 0 3 、 n o 3 5 4 和n o 3 6 2 。所以，在此将对上面酵母的酿造特性进行深入的分析研究。利 于研究工作的进行，也为将来的人生产积累经验。 3 2 材料与方法 3 2 1 菌种 上面酵母n o 3 0 3 ，山东轻工业学院啤酒中心保存 上面酵母n o 3 5 4 ，山东轻：i 二业学院啤酒中心保存 上面酵母n o 3 6 2 ，山东轻1 ：业学院啤酒中心保存 爱尔干酵母 3 2 2 培养基 ( 1 ) y p d 液体培养基：分别称取4 0 9 葡萄糖、2 0 9 蛋白胨、1 0 9 酵母膏，用蒸馏水 溶解，定容至u i o o o m l ，混匀，然后1 2 1 灭菌2 0 分钟，待用。 ( 2 ) y p d 圃体培养基：分别称取4 0 9 葡萄糖、2 0 9 蛋白胨、1 0 9 酵母膏，2 0 9 琼脂， 用蒸馏水溶解，定容至u i o o o m l ，混匀，然后1 2 1 灭菌2 0 分钟，待用。 ( 3 ) ll 。p 麦汁培养基：干麦芽粉加4 倍水，在5 0 6 0 。c 保温糖化3 4 小时，用碘液 试验检查至糖化完全为止，调整糖液浓度，煮沸后，过滤，调p h 为6 0 。 3 2 3 主要原料和试剂 ( 1 ) 原料：大麦芽，小麦芽，酒花，高纯水 ( 2 ) 试剂： 色谱纯：乙腈，4 乙烯基愈创木酚 分析纯： 磷酸，葡萄糖，蛋白胨，酵母膏，无水乙醇，1 邻苯二胺溶液、4 n 盐酸溶 液、消泡剂等。 3 2 4 主要仪器与设备 高效液相色谱l c 1 0 a t v p s p d 1 0 a v p 型同本岛津公司 1 0 l d , 试发酵设备g u j s 1 0b 1 型镇江东方生物工程设备技术公司 2 l 第3 章上面酵母酿造特性的研究 全自动八皿糖化仪l b 8 e l e c t r o n i c 型德国f u n k e 公司 啤酒全自动分析仪s p l 型 奥地乖l j a n t o np a a r 公司 电子分析天平b p l1 0 s 趔德网s a r l o r i u s 公司 生物显微镜x s p 2 c 型上海光学仪器厂 电热恒温真空干燥箱w m k 0 8 型山东潍坊医疗器械厂 电热恒温水浴锅l h 5 8 6 2 型上海精科实业有限公司 麦芽粉碎机u n i v e r s a l 型德幽b u h l e r 公司 超净工作台j x n 1 3 4 0 型深圳巨星净化科技有限公司 生化培养箱s p x 2 5 0 b 型 上海跃进医疗器械厂 灭菌锅y x q l s 5 0 si i 型上海精密仪器仪表有限公司 气象色谱美用p e r k i n e l m e r 公司 冰箱b c d 1 8 1 c 型青岛海尔股份有限公司 附温比重瓶1 8 6 1 a 型上海越磁电子科技有限公司 全自动微量凯氏定氮仪v a p o d e s t5 0 c 型上海杰韦弗实业有限公司 3 2 5 实验方法 ( 1 ) 外观糖度测定 直接用糖度计测定发酵液外观糖度n ( o p ) 。 ( 2 ) 真正发酵度测定f 4 5 】 取一定量发酵液，微火加热蒸发至原体积的1 3 ，以除去乙醇添加水恢复原 体积，测定糖度n ( o p ) ，则按式( 3 1 ) 计算真正发酵度： 真正发酵度( ) ：1 j - n 1 0 0( 3 1 ) 式中：p 发酵前的麦汁浓度( o p ) ； n 发酵后发酵液的实际浓度( o p ) 。 ( 3 ) 酒精度测定f 4 5 1 蒸馏： 量简称取除气发酵液1 0 0 m l 于5 0 0 m l 蒸馏瓶中，用5 0 m l 水分三次清洗量 筒，清洗液倒入蒸馏瓶中。安装好蒸馏装置( 图1 ) 开始蒸馏，待馏出液为9 6 m l 时，调节馏出液液温至2 0 。c ，补加水，使馏出液体积为1 0 0 m l ，混匀。 测定： 将附温密度瓶洗净、干燥、称重，反复操作，直到恒重r e ( g ) 。将煮沸冷却至 1 5 ( 2 的水注满恒重的密度瓶中，插上附温计的瓶塞，浸于2 0 。c 水浴中，待温度达 2 0 c 时，保持5 m i n 不变，取出。擦干，盖好小帽，直至密度瓶温度与室温平衡 山东轻丁业学院颂i ：学位论义 后，称重，z 。( g ) 。用用同样的方法测定馏出液加瓶重朋：。用式( 3 2 ) 相对密度： d 君= 堕竺 所i 一聊 ( 3 2 ) 查表町得发酵液中酒精含量( v 0 1 ) 。 ( 4 ) 双乙酰含量测定【4 5 】 蒸馏： 将双乙酰蒸馏器装好，加热蒸汽发生瓶( 瓶内放数粒小玻璃珠或瓷片) ，使水 平稳沸腾，通气预热后，置2 5 m l 容量瓶于冷凝器f 口，放入冰水浴中。取1 0 0 m l 量筒，加2 4 滴消泡剂，再注入未经处理且品温在5 左右的样品( 啤洒发酵液) 1 0 0 m l ，迅速加入已预热的蒸馏器内，用少量水冲洗带塞漏斗，盖塞后用水封口， 进行蒸馏，直至蒸馏液接近2 5 m l 时( 蒸馏需在3 m i n 内完成) ，取下容量瓶，用 水定容争刻度，摇匀。 显色： 分别准确吸取蒸馏液1 0 0 0 m l 于两支比色管中，向第一支管中加0 5 m l 邻苯 二胺溶液，将两支管充分振摇后加塞放置于暗处，2 0 3 0 m i n 后取出，向第一支试 管中加入2 m l 盐酸溶液，第二支试管中加入2 5 m l 盐酸溶液，摇匀。 测量： 于3 3 5 n m 波长下，用2 0 m l 比色管以第二支管中溶液为空白调零点，测定第 一支管中溶液的吸光度。比色测定操作须在2 0 m i n 内完成。 计算：通过式( 3 3 ) 计算。 p = a 3 3 5 1 2 ( 3 3 ) 式中： p 样品中双乙酰的质量浓度，m g l a 3 妒在3 3 5 n m 波长下，用2 0 r n m l 匕色m t n 定的吸光度； 1 2 一吸光度与双乙酰含量的换算系数。 ( 5 ) 高级醇的测定( 气相色谱法) 4 6 】 样品处理： 把发酵好的啤酒蒸馏浓缩一倍。 色谱条件： 仪器：s p 5 0 i n 气相色谱仪。 色谱柱：d n t q ) 5 x 1 0 0 0 。 检测器：氢火焰离子化检测器。 温度：柱温9 0 ，气化室1 7 0