（发酵工程专业论文）发酵改良棉粕蛋白品质生产优质小肽饲料的研究.pdf

i j 里1 摘要 棉粕分布广泛、富含蛋白营养且价格低廉，但蛋白分子量较大，不易被消化利用， 氨基酸组成不平衡，有效利用率较低，其饲料添加量与利用率较低。本研究采用固态发 酵法改良棉粕蛋白，降解不易被利用的大分子蛋白类为易于消化利用的小分子蛋白类， 提高可直接吸收利用的小肽含量，提高棉粕蛋白的消化利用率，平衡氨基酸组成，提高 其饲料利用率。 研究筛选得到改良棉粕蛋白效果较好的4 株菌株，初步鉴定为b a c i l l u ss u b t i l i s ( 2 株， 标记为b s u b t i l i sh 1 和a s u b t i l i sh 7 ) ，b a c i l l u sc e r e u s ( 1 株，标记为丑c e r e u sh 9 ) 和 a s p e r g i l l u sn i g e r ( 1 株，标记为a n i g e rp 1 ) 。对四株菌进行单菌和混菌发酵实验比较，得 到发酵效果最好的菌株组合为b s u b t i l i sh 1 和a n g e ，p 1 。混菌发酵后，棉粕小肽含量提 高至1 5 3 6 ，平均肽链长度降至5 1 6 ，棉粕蛋白的体外消化率由4 4 5 6 提高到了 7 8 6 1 ，改良棉粕蛋白的效果明显优于其他菌株单菌及混菌发酵 以小肽提高率和平均肽链长度为指标，通过单因素和正交试验对混菌发酵条件进行 优化，得到最佳的发酵条件为：装料量4 0g ，麸皮1 5 ，硫酸铵0 2 ，磷酸二氢钾o 5 ， 无菌自来水拌料( p h 6 0 6 5 ) ，含水量5 0 ，接菌比例( 彳n i g e rp 1 ：b s u b t i l i sh 1 ) 为2 ：1 ， 接种量1 5 ，温度3 0 ，发酵时间6 0h 。发酵条件优化后，小肽提高率增加了1 0 1 7 ， 平均肽链长度减小了0 9 3 ，体外消化率提高了9 9 8 ，显著提高了混菌发酵的效果。 两菌株具有很好的“协同性”，可充分利用棉粕基质协同改良棉粕蛋白。在相同的发 酵条件下比较单、混菌发酵过程的各营养指标发现：a n i g e rp 1 可分泌丰富的酸性蛋白 酶，b s u b t i l i sh 1 可分泌丰富的中、碱性蛋白酶，混菌发酵各种蛋白酶的活性显著提高， 高于单菌发酵的酶活。混菌发酵水溶性多肽中大于1 0 个氨基酸组成的多肽基本被降解 为1 3 个氨基酸组成的小肽，降解效果优于单菌发酵。 混菌发酵后，平均分子量在6 6k d 附近的棉粕蛋白基本被降解至1 4k d 以下，提高 了蛋白利用率。氨基酸组成趋于平衡，有效利用率得到提高。氨基酸总量提高了1 5 ， 丰富了棉粕蛋白营养。粗纤维较发酵前降低了3 3 6 0 ，还原糖较发酵前提高了4 3 0 ， 能量利用率得到提高。必需脂肪酸亚油酸所占的比例较发酵前提高了1 8 9 4 ，可作为 较好的脂肪饲料。产生乳酸等有机酸风味物质，可提高适口性。棉粕品质得到了很好的 改善。 关键字：棉粕，小肽，平均肽链长度，枯草芽孢杆菌，黑曲霉，混菌发酵 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ec o t t o n s e e dm e a li sr i c hi np r o t e i nb u ti t sh u s b a n d r ya p p l i c a t i o ni sr e s t r i c t e db e c a u s e o ft h el o wd i g e s t i v er a t e t os o l v et h ep r o t e i ns h o r t a g ep r o b l e m ，i ti so fs i g n i f i c a n c et o i m p r o v et h ec o t t o n s e e dm e a lp r o t e i nq u a l i t y i nt h i ss t u d y , s o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o nw a su s e d t od e g r a d em a c r o m o l e c u l a rp r o t e i nt os m a l lp e p t i d e s ，t or e d u c et h ep e p t i d el e n g t ha n db a l a n c e t h ea m i n oa c i dn u t r i t i o n f o u rs t r a i n s ，w h i c hc a ne f f i c i e n t l yi m p r o v et h ec o t t o n s e e dm e a lp r o t e i n w e r ei s o l a t e d f r o mt h es a m p l e s t h e yc o u l db ec l a s s i f i e da sb a c i l l u sc e r e u sf ，1s t r a i n , n a m e da s 丑c e r e u s h 9 ) ，b a c i l l u ss u b t i l i s ( 2s t r a i n s ，n a m e da sb s u b t i l i sh 1a n db s u b t i l i sh 7 ) a n da s p e r g i l l u s n i g e r ( 1s t r a i n ，n a m e d a sa n i g e rp 1 ) p r e l i m i n a r i l y b o t hi n d i v i d u a l a n dc o m b i n e d f e r m e n t a t i o n sw e r ec a r r i e do u t n l er e s u l t ss h o w e dt h a tu n d e rt h eo p t i m a ls t r a i n sc o m b i n e d ( b s u b t i l i sh 1a n da n i g e rp 1 ) f e r m e n t a t i o n ，t h ec o n t e n to fs m a l lp e p t i d e si n c r e a s e dt o 1 5 3 6 ，t h el e n g t ho fa v e r a g ep e p t i d ec h a i nf e l ld o w nt o5 1 6 ，a n dt h ed i g e s t i b i l i t yo fp r o t e i n i n c r e a s e df r o m4 4 5 6 t o7 8 61 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tu n d e rt h ec o m b i n e df e r m e n t a t i o n b ys t r a i n s ( b s u b t i l i sh 1a n da n i g e rp 1 ) ，t h ec o t t o n s e e dm e a lp r o t e i nc a nb ei m p r o v e d e f f e c t i v e l y w i t ht h ei n c r e a s er a t eo fs m a l lp e p t i d e sa n dt h el e n g t ho fa v e r a g ep e p t i d ec h a i nf o ri n d e x ， t h es t u d yo nt h ec o n d i t i o no fc o m b i n e df e r m e n t a t i o nw a sc a r r i e do u tb ys i n g l ef a c t o ra n d o r t h o g o n a lt e s t 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lf e m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a sa sf o l l o w s ：t h e f e r m e n t a t i o nm a t r i x4 0g ，b r a n15 ，( n i - h h s 0 40 2 ，k h 2 p 0 40 5 ，w a t e rc o n t e n t5 0 ， n a t u r ep h ，t e m p e r a t u r e3 0 ，i n o c u l a t i o nq u a n t i t y15 ，f e r m e n t a t i o nt i m e6 0ha n dt h e o p t i m u mi n o c u l a t i o n2 ：1 ( p i ：h 1 ) u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o nd e t e r m i n e dt h ei n c r e a s er a t e o fs m a l lp e p t i d e si n c r e a s e db y101 7 t h el e n g t ho f a v e r a g ep e p t i d ec h a i nd e c r e a s e db y0 9 3 a n dt h ed i g e s t i b i l i t yo f p r o t e i ni n c r e a s e db y9 9 8 t h et w os t r a i n sh a v e ”c o l l a b o r a t i o n ”a n i g e rp1c a np r o d u c er i c ha c i dp r o t e a s ew h i l e b s u b t i l i sh1c a np r o d u c er i c hn e u t r a la n da l k a l ip r o t e a s e u n d e rt h ec o m b i n e df e r m e n t a t i o n ， t h ee n z y m i ca c t i v i t ys i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d t h ep e p t i d e sc o m p o s e do fm o r et h a n10a m i n o a c i d si nt h ew a t e r - s o l u b l ep e p t i d e sw e r ea l m o s td e g r a d e dt op e p t i d e sc o m p o s e do f1 - 3a m i n o a c i d s ，w h i c hw a sb e t t e rt h a ns i n g l ef e r m e n t a t i o n a f t e rt h ec o m b i n e df e r m e n t a t i o nt h em o l e c u l a rw e i g h to fp r o t e i nd r o p p e df r o m6 6k dt o b e l o w14k d 1 1 1 eu t i l i z a t i o no fp r o t e i nw a si m p r o v e d n ec o m p o s i t i o no ft h ea m i n oa c i d t r e n d e dt ob eb a l a n c e d t h ec o n t e n to fr o u g hf i b e rd e c r e a s e db y3 3 6 0 ，m e a n w h i l et h e c o n t e n to fr e d u c i n gs u g a ri n c r e a s e db y4 3 0 o ft h ec o n t e n tb e f o r ef e m e n t a t i o n t h ee n e r g y e f f i c i e n c yw a si m p r o v e d n et o t a lc o n t e n to fa m i n oa c i di n c r e a s e db y15 ，r i c h i n gt h e p r o t e i nn u t r i t i o n n l ec o n t e n to ft h ee s s e n t i a lf a t t ya c i d l i n o l e i ca c i dh a si n c r e a s e db y18 9 4 n l eo r g a n i ca c i df l a v o rs u b s t a n c e ss u c ha st h el a c t i ca c i dw e r ep r o d u c e d ，w h i c hc a l li m p r o v e t h ep a l a t a b i l i t y t h ec o t t o n s e e dm e a lw a s i m p r o v e de f f e c t i v e l y k e yw o r d s ：c o t t o n s e e dm e a l ，s m a l lp e p t i d e s ，l e n g t ho fa v e r a g ep e p t i d ec h a i n , b s u b t i l i s ， a n i g e r , c o m b i n e df e r m e n t a t i o n 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章绪论1 1 1 我国饲料业的发展及特点1 1 2 棉粕的营养价值1 1 3 棉粕利用的限制性因素2 1 4 饲料小分子多肽的特性和营养2 1 5 小肽生产3 1 6 蛋白水解物苦味产生的机理一3 1 7 常用评价小肽饲料价值指标4 1 8 微生物发酵棉粕的研究现状4 1 8 1 固态发酵是改良棉粕品质的首选工艺4 1 8 2 棉粕固态发酵的菌种筛选4 1 9 国内外棉粕发酵的研究及应用5 1 1 0 本课题研究内容与意义6 第二章实验材料与方法7 2 1 实验材料7 2 1 1 原料7 2 1 2 实验仪器7 2 1 3 菌株7 2 1 4 主要试剂及溶液配制7 2 1 5 培养基9 2 2 实验方法9 2 2 1 菌种筛选9 2 2 2 各指标测定1 0 2 2 3 菌株初步鉴定。10 2 3 混菌发酵实验1 l 2 4 固态发酵条件优化11 2 5 单、混菌发酵效果比较研究：1 2 目录 2 5 1 单、混菌发酵过程各种蛋白酶活性变化1 2 2 5 2 单、混菌发酵前后棉粕蛋白质分子量变化1 3 2 5 3 单、混菌发酵前后棉粕水溶性多肽分子量分布1 3 2 6 混菌发酵棉粕营养价值及活性产物分析研究1 4 2 6 1 混菌发酵前后棉粕氨基酸营养变化1 4 2 6 2 混菌发酵过程棉粕还原糖含量变化。1 4 2 6 3 混菌发酵前后棉粕底物有机酸组成变化一15 2 6 4 混菌发酵前后其他营养因子及抗营养因子成分变化1 5 第三章结果与讨论17 3 1 改良棉粕蛋白菌株的选育与鉴定1 7 3 1 1 改良棉粕蛋白菌株的筛选。1 7 3 1 2 菌种初步鉴定1 8 3 1 3 混菌发酵2 0 3 1 4 混菌发酵电镜扫描图2 2 3 2 混菌发酵条件优化2 3 3 2 1 混菌发酵最佳发酵时间的确定2 3 3 2 2 麸皮对棉粕蛋白降解的影响2 4 3 2 3 无机氮源的选择2 4 3 2 4 无机盐的添加对棉粕蛋白降解的影响2 5 3 2 5 装料量对棉粕蛋白质降解的影响2 6 3 2 6 含水量对棉粕蛋白质降解的影响2 6 3 2 7 温度对棉粕蛋白质降解的影响2 7 3 2 8 不同p h 对棉粕蛋白质降解的影响2 7 3 2 9 接种量对棉粕蛋白质降解的影响2 8 3 2 1 0 接菌比例( 彳n i g e ，p 1 ：b s u b t i l i sh 1 ) 对棉粕蛋白质降解的影响2 8 3 3 混菌发酵协同改良棉粕蛋白研究3 1 3 3 1 单、混菌发酵过程各种蛋白酶活性变化。3 1 3 3 2 单、混菌发酵前后棉粕水溶性多肽分子量分布比较。3 2 3 3 3 单、混菌发酵前后棉粕游离氨基酸含量变化3 4 3 4 混菌发酵棉粕的营养价值及活性产物分析研究3 5 3 4 1 发酵前后棉粕蛋白分子量分布变化3 5 3 4 2 发酵前后棉粕总氨基酸含量变化3 5 3 4 3 混菌发酵过程棉粕还原糖含量变化3 7 3 4 4 混菌发酵对棉粕底物有机酸产生量的影响3 8 3 4 5 混菌发酵对棉粕脂肪及组成的影响3 9 目录 3 4 6 混菌发酵对棉粕其他营养成分的影响4 0 3 5 主要结论4 0 3 6 课题展望4 1 致谢4 3 参考文献4 5 附录l ：作者在攻读硕士学位期间发表的文章4 8 附录2 ：图谱4 9 i i i 第一章绪论 第一章绪论 1 1 我国饲料业的发展及特点 我国饲料业历史悠久，7 0 年代中后期到8 0 年代中后期由兴起进入飞速发展阶段； 2 0 0 5 年我国饲料产品总量超过1 亿吨，仅次于美国居世界第二【1 1 。食品、养殖等行业的发 展刺激了对优质蛋白饲料的需求，预估2 0 0 0 2 0 2 0 年的饲料( 尤其蛋白饲料) 供不应求 眩3 1 。饲料禁止添加动物骨肉粉及我国限制动物蛋白进口，致使我国的蛋白饲料更加短缺， 因此，通过生物等技术改善生物饲料的质量具有深远意义和发展空间【4 】。根据动物营养 需要的主要方面和饲料主要营养特性，美国学者l e h a r r i s ( 1 9 5 6 ) 将饲料分为八大类( 也 称为国际饲料分类法) 如表1 1 所示： 表1 1 我国主要饲料种类划分及优缺点分析 t a b1 - 1t h ed i v i s i o na n da d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so f t h em a i nf e e dv a r i e t i e si nc h i n a 饲料划分饲料类别依据 各种饲料优缺点 我国饲料特点包括：可利用能值高的能量饲料类匮乏，消化利用率低的粗饲料类数 量较大；我国主要能量饲料是玉米，但其分布不均，不足用于饲料生产，谷物油脂类价 格较高难以用作饲料【5 】，而相对的由于粮食食品业的发展使糟糠类等粗饲料数量较大【6 】； 品质高吸收利用率高的动物性蛋白饲料不足，难以消化利用的植物性蛋白饲料如棉粕等 杂粕类数量较多，原因是我国的优质动物性蛋白饲料依赖进口，价格高，而杂粕类植物 性蛋白来源广且价格低，但这些杂粕类利用率低且含抗营养因子，所以改良这些廉价多 产的蛋白质饲料品质，提高其饲料添加量与利用率具有深远意义。 1 2 棉粕的营养价值 棉粕是棉纤维和棉籽油行业的一种副产物，被广泛用作奶牛日常能源和蛋白质来 源，由于棉粕具有较高的脂肪和蛋白质含量，常被用作反刍动物的饲料，由于棉粕具有 江南大学硕士学位论文 较高的纤维消化率，对于奶牛也是一种理想的饲料，与其他饲料相比它提供了独特的蛋 白、能量和纤维的混合物，通常是奶牛一极具竞争力的脂肪和蛋白质来源，在饲喂奶牛 总的食物干物质中占1 0 1 5 。在研究棉粕蛋白方面世界科学经验得到了广泛应用，蛋 白质在棉粕中主要由贮藏蛋白组成，很容易在瘤胃内获得，含量丰富，据美国农业部统 计，2 0 0 7 年产量估计达6 5 0 万吨，足够提供7 1 亿人一年蛋白质的量【引，棉粕蛋白水解后可 得到1 7 种氨基酸，将棉粕的各营养成分1 9 和氨基酸【lo 】的组成与较优质的豆粕进行比较发 现，棉粕的干物质，粗脂肪，钙和磷等与豆粕相差不多，棉粕除蛋氨酸外，其它氨基酸 均符合f a o 标准【1 1 1 ，棉粕的b 族和e 族维生素等也较为丰富，棉粕的脂肪大部分是以不 饱和脂肪酸形式存在，亚油酸是主要的脂肪酸，棉籽油中的甘三酯瘤胃中易被利用和水 解，不饱和游离脂肪酸由瘤胃微生物生物降解【l2 1 ，所以棉粕是可以利用开发推广的重要 植物性蛋白饲料。 1 3 棉粕利用的限制性因素 棉粕在牲畜中的使用被限制的因素主要包括以下方面：棉粕蛋白的平均分子量较 大，难以消化利用；赖氨酸含量少且利用率低，氨基酸组成不平衡，加工方法等会使赖 氨酸发生美拉德反应而封闭其中的6 - n h 2 ，致使含量仅1 3 1 8 的赖氨酸有效消化利 用率更低( 仅6 2 6 6 ) 1 3 】；粗纤维含量高可利用能值低：棉粕粗纤维含量远高于豆 粕( 达1 0 2 4 ) ，能量利用率低； 表l - 2 棉粕主要抗营养因子及其不良效应 n l b1 2t h em a i na n t i n u t r i t i o n a lf a c t o r sa n da d v e r s ee f f e c t so ft h ec o t t o nm e a l 1 4 饲料小分子多肽的特性和营养 2 0 世纪6 0 年代，蛋白质以小肽( 由2 3 个氨基酸组成的寡肽) 和游离氨基酸混 合物形式被直接吸收的理论取代了完全以游离氨基酸形式吸收的观点。现代研究者认 2 第一章绪论 为，2 3 个氨基酸组成的小肽类可直接被吸收利用，大于3 个氨基酸组成的寡肽类的吸 收问题存在争议【1 6 , 1 7 j ，但普遍认为2 7 个氨基酸组成的寡肽类也具有一定的生物活性。 小肽的载体主要包括在小肠内表达的p e p t l t l 8 】( 转运2 5 个氨基酸组成的肽) 和在肾中 表达的p e p t 2 ( 重吸收小肽) ，吸收小肽的能力相当于氨基酸的总吸收能力，且不易饱 和。反刍动物主要靠非肠膜系统吸收小肽，属于被动扩散过程，可促进瘤胃微生物对营 养物质的利用及蛋白合成，从而提高动物的生产性甜1 9 测。 研究表明：饲料蛋白的寡肽释放量与有效赖氨酸及碱性氨基酸含量呈正相关，蛋白 品质越高，小肽释放量越多【2 1 1 ；胰蛋白酶、肽酶会对大于3 个氨基酸组成的寡肽进行进 一步水解，当水解物中含有较多的大于3 个氨基酸组成的寡肽类和游离氨基酸时，可诱 导肠肽酶等的分泌，水解释放出的游离氨基酸会导致吸收竞争抑制的加剧从而抑制吸收 小肽的能力，所以小肽的释放量与肽链长度呈负相关；提高小肽所占的比例可促进吸收 氨基酸的能力，但提高氨基酸所占比例并不能促进对大多数氨基酸的吸收；肽的氨基酸 残基影响吸收肽的能力，如赖氨酸位于氮端时与组氨酸构成二肽的吸收速度快于它位于 碳端时，而当赖氨酸位于碳端时与谷氨酸构成二肽的吸收速度更快。 蛋白以小肽形式直接吸收拥有很多的优点：肽之间的运转不存在竞争性和抑制性， 吸收小肽和氨基酸的机制是彼此独立，互不干扰的，且小肽含量所占比例越大越有较好 的吸收效果1 2 2 】；一些游离氨基酸以小肽形式吸收，在血液循环中直接合成蛋白质，更有 利于沉积蛋白质 2 3 1 利于动物生长速率、生产性能及吸收矿质元素能力的提高；可直接 利用小肽合成组织内的各类蛋白质，所以小肽比氨基酸更适于做氮源，“小 肽营养理论”的发展空间和应用前景是不可估量的。 1 5 小肽生产 最常用的制备小肽方法是酶解蛋白法和发酵法，酶解蛋白法是指合适的蛋白酶类在 适宜条件下将蛋白质酶解而制备小肽的过程。常用的蛋白酶类有：a l c a l a s e 、p r o t e a s ea 、 f l a v o u r z y m e 、p e p t i d a s er 和胃、胰蛋白酶等，微生物代谢产物的分离纯化和动物体内是 这些常用蛋白酶类的主要来源。该法具有目的性强的优点，但控制酶解程度较难，且会 有不利的产物生成，如生成的游离氨基酸和疏水基团等会使小肽的苦味增加，使适口性 较差，需要增加脱苦工序浪费成本，且有一些小肽类没有办法通过酶解生成【5 5 1 。 微生物发酵法包括微生物分泌产酶和酶水解蛋白两步，减少了对蛋白酶类的分离纯 化步骤，可节约成本，且对饲料营养的破坏程度较小，能使抗营养因子降解，使小肽产 品拥有发酵香味，改善其适口性；发酵过程会同时产生较多的乳酸菌、乳酸和维生素等 有益成分；可将大分子蛋白降解为利于消化吸收的小肽和游离氨基酸类；且会有较多的 菌体蛋白生成，利于增强对营养物质的吸收利用，此法是近年来发展前景较为广泛的生 产小肽的方法【5 引。 1 6 蛋白水解物苦味产生的机理 m u r r a y 等最早验证了蛋白酶解液中产生的苦味是由肽而不是游离氨基酸导致的，在 前人的研究基础上，很多学者发现苦味主要由蛋白水解过程疏水性多肽的产生所致，疏 3 江南大学硕士学位论文 水性氨基酸是苦味肽形成的必要因素，苦味肽中至少含有一个疏水性氨基酸，如亮氨酸、 缬氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸等 5 3 1 。天然蛋白质由于其疏水性基团大多分布于分子内部且 分子量较大，结构较复杂，不易与味蕾接近，因而不呈现苦味，当其经过蛋白酶的水解 后，疏水性残基逐渐在表面暴露，能和味觉细胞作用形成苦味；一般来说疏水性氨基酸 越暴露，苦味肽越多，形成的苦味越大；当疏水性氨基酸位于碳端时比其位于氮端时形 成的苦味较大，存在形式是游离氨基酸时形成的苦味最低【5 3 1 。解决其苦味的方法主要有 理化方法如分离、提取、吸附、掩盖等，化学方法如类蛋白反应等，生物方法如端肽酶 降解等【5 4 】。 1 7 常用评价小肽饲料价值指标 小肽总含量【1 5 】：常用1 0 - - - - 氯乙酸沉淀大分子蛋白后，测得酸溶蛋白含量然后扣除 其所含游离氨基酸的量，1 0 - - 氯乙酸除去了水解液中分子量较大的蛋白质，显示的结 果是分子量低于2 0 0 0d 的蛋白含量；平均肽链长度【l5 】：凯氏定氮法测得的总氮含量与甲 醛滴定法得到的q - 氮含量的比值，平均肽链长度可从总体上反映出蛋白质分子量的分布 情况，平均肽链长度值越小，则表明小肽含量所占的比值越大；特定小肽和氨基酸含量 的测定【i5 】：可用紫外吸收法，消光系数法，考马斯亮蓝等方法对含有芳香族氨基酸的肽 进行测定。 1 8 微生物发酵棉粕的研究现状 在优质蛋白饲料严重短缺的情况下，几乎在所有方向取得成就的现代科学家都在寻 找解决这一问题的方法，由于棉粕产量高营养丰富且价格低，得到人们的高度关注，然 而由于其利用率低及存在棉酚等抗营养因子，它在牲畜中的使用受到限制，所以通过生 物技术改良棉粕品质提高其饲料利用率，增加其饲料添加量具有很大的发展空间。大量 事实经验表明，改良棉粕品质最经济有效的方法是微生物发酵处理。 1 8 1 固态发酵是改良棉粕品质的首选工艺 棉粕的固态发酵具有以下特点：微生物在棉粕发酵过程中可分泌产生多种具有生物 活性的酶类，如产生多种蛋白酶类酶解棉粕中不易被消化利用的大分子蛋白质，使之降 解成易于消化利用的小分子蛋白及小肽、游离氨基酸类，提高其蛋白消化利用率；产生 非淀粉多糖酶类、淀粉酶类等可降解大分子纤维素，增加其还原糖含量，提高其能量利 用率；产生植酸酶类等抗营养因子降解酶类，充分降解棉酚、单宁、植酸等抗营养因子， 有效脱毒，提高其饲料添加量和饲料利用率。 在固态发酵过程中可使棉粕益生菌增多，使菌体蛋白含量提高，且能产生多种芳香 酸、有机酸和不饱和脂肪酸等，使棉粕营养国家成分丰富，改良其适口性，提高其饲用 价值。 微生物固态发酵棉粕过程的条件比较温和，污染毒害性小，对棉粕营养成分的破坏 较小，饲用比较安全，能量损耗及费用损耗较小，经济效益较好。 1 8 2 棉粕固态发酵的菌种筛选 4 第一章绪论 优良菌株的选育是保证成功固态发酵的关键，研究结果表明具有协同作用的菌株混 菌发酵可比单菌发酵产生更好的发酵效果【2 5 】，固态发酵棉粕所用的优良菌株需具有以下 条件：必须是安全菌株，具有较快的生长繁殖速度和稳定的遗传性状，混菌发酵所选的 菌株组合必须是彼此抑制作用小，具有协同性，可提高发酵作用效果的菌株组合。 芽孢杆菌由于存在不易致死的芽孢，发酵饲料后可抑制肠道内其他有害菌的生长， 并可在发酵过程中分泌产生多种具有较高活性的功能性酶类，用于饲料发酵的芽孢杆菌 主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粘连芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等1 2 6 ；放线菌发酵 饲料过程有抗生素产生，可使动物免疫力提高，发酵后饲料蛋白中含有较多的色氨酸和 赖氨副2 5 2 7 】；酵母菌蛋白营养丰富，本身就是菌体蛋白，可分泌产生多种具有生理活性 的酶类，发酵饲料后可提高其消化利用率，改良其适口性等，适合饲料发酵的酵母菌主 要有啤酒酵母、毕赤酵母属、白地霉、产朊及热带假丝酵母等 2 7 , 2 8 】；霉菌产酶的种类多 且有较高的菌体蛋白含量，适于饲料固态发酵的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、木霉、根 霉掣2 7 乏9 1 。 1 9 国内外棉粕发酵的研究及应用 在我国面临蛋白饲料严重短缺的情况下，固态发酵改良分布广泛产量高、营养丰富 且价格较低的棉粕逐渐成为研究热点。国内对棉粕发酵进行研究报道最早是在上世纪 7 0 年代，而当时国外除前苏联外，基本没有其他国家做过相关的研究报道；目前，国内 关于棉粕发酵的相关报道主要是在棉粕脱毒菌种的选育方面，在发酵后棉粕的毒性方面 及发酵后棉粕替代优质饲料的饲喂效果方面较多，如：1 9 8 9 年，钟英长等从发霉的棉粕 中筛选出的菌种梨孢帚霉属可降解棉酚达6 0 7 5 2 5 1 ；1 9 9 8 年，施安辉等从霉变的棉 粕中筛选到了棉酚降解率超过7 0 的四株菌g 1 、y 2 、y 3 和黄曲5 号，并发现发酵后 的棉籽饼可替代蛋鸡等的日粮，利于其成长和生产【3 u ；1 9 9 9 年，杨景芝等筛选得到脱 毒率可达6 0 左右的菌株$ 9 6 0 6 ，研究发现发酵后棉粕的氨基酸组成趋向平衡，且饲喂 对动物内脏器官没有不良影响【3 2 】；周维仁等人和牛可新等人也分别试验发现发酵脱毒后 的棉籽蛋白粉替代豆粕饲养肉猪，不会产生不良影响且可使生产成本有效降低【划；2 0 0 0 年，杨继良等筛选得到脱毒率达8 0 的酵母菌【3 3 】；2 0 0 3 年，顾赛红等用黑曲霉p e s 发酵 棉粕后，棉粕的粗蛋白、蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸含量分别提高了1 0 9 2 、1 2 7 3 、 2 2 3 9 和5 2 0 0 ，其相应的消化利用率分别提高了1 3 1 1 、2 7 0 7 、1 5 1 7 和 1 2 9 0 3 4 1 ；2 0 0 6 年，张文举等研究表明黑曲霉z d 8 和热带假丝酵母z d 3 混菌发酵棉粕 脱毒效果比单菌发酵好，脱毒率可达9 1 6 4 ，同时可使棉粕蛋白及消化率分别提高 2 7 8 3 和2 0 9 0 【3 5 1 ；2 0 0 7 年，张庆华等用植物乳杆菌、热带假丝酵母c a 6 1 和拟内孢 霉菌e 0 2 组合混菌发酵棉粕后，使总氨基酸提高了1 0 5 4 ，提高了棉粕的营养价值【3 6 】。 由国内外棉粕的研究进展来看，国内研究主要针对选育可有效降解棉粕棉酚毒性的 菌株，所以得到的菌株虽具有较好的脱毒性，但对棉粕蛋白营养品质及其消化利用率的 改良效果不显著，且研究过程中高温灭菌虽脱毒率高，但其降解的棉酚成分大部分由于 高温所致并部分与蛋白形成结合棉酚，微生物发酵降解的部分较少，且严重破坏了棉粕 的各营养成分，同时对利用菌株的协同作用进行混菌发酵改良棉粕方面的研究较少【3 7 1 。 江南大学硕士学位论文 1 1 0 本课题研究内容与意义 我国蛋白饲料短缺，优质的蛋白饲料鱼粉需要进口，豆粕价格太高，作为分布广泛 仅次于豆粕且价格较低的棉粕，蛋白营养丰富，但蛋白分子量较大利用率低，氨基酸组 成不平衡，在饲料中的应用受到限制。而目前大多研究主要针对棉粕脱毒方面及提高蛋 白含量或蛋白体外消化率方面，缺乏对棉粕发酵前后蛋白质降解规律的研究。发酵降解 棉粕不易被利用的大分子蛋白，提高可直接吸收利用的小肽含量，降低肽链长度，减小 多肽分子量，平衡氨基酸组成，提高饲料添加量与利用率，对补充蛋白资源，合理利用 资源，节约成本，促进畜牧业发展等具有深远意义。 本课题主要研究内容： ( 1 ) 改良棉粕蛋白菌株的选育与鉴定，筛选出能有效降解棉粕大分子蛋白，提高 棉粕小肽含量，降低肽链长度，提高利用率的菌株并进行菌种鉴定，比较单、 混菌发酵效果以得到最佳菌种组合； ( 2 ) 通过单因素和正交试验，以小肽提高率和平均肽链长度为指标，对混菌发酵 条件进行优化，以达到最佳的发酵效果； ( 3 ) 对混菌发酵过程两菌株的协同改良作用进行分析； ( 4 ) 对混菌发酵前后棉粕的营养价值进行比较分析。 6 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 原料 第二章实验材料与方法 棉粕( 三旺饲料) ； 麸皮、马铃薯：市售，购于无锡小三里桥粮油市场。 2 1 2 实验仪器 可见分光光度计w f j 7 2 0 0 凝胶柱s u p e r d e xp e p i d el0 3 0 0 g l 福玛摇床k y c 10 0 b p c r 仪 u v p 凝胶成像系统 超净无菌工作台 隔水式电热恒温培养箱 立式蒸汽灭菌锅 m p 5 0 0 2 电子天平 p h s 3 c 精密p h 计 a l l e g r ax 1 5 r 离心机 安捷伦液相色谱仪a g l 1 0 0 光学显微镜 u n i c 上海仪器有限公司 安法玛西亚公司 上海福玛实验设备有限公司 b i o m e t a r 公司 英国u v p 公司 苏州净化设备厂 上海跃进医疗器械厂 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 上海恒平科学仪器有限公司 上海雷磁仪器厂 b e c k m a n 公司 美国安捷公司 日本o l y m p u s 公司 2 1 3 菌株 菌种来源：五指山所采的十五份样品( 其中包括七份土样和八份木屑) ，济南棉花 地所采土样三份，实验室提供的棉粕。 2 1 4 主要试剂及溶液配制 ( 1 ) 1 0 t c a 称取三氯乙酸1 0g ，蒸馏水溶解并定容至1 0 0m l 。 ( 2 ) 缓冲液 p h3 0 的乳酸- 乳酸钠缓冲液：称取8 0 - 9 0 乳酸1 0 6g ，定容至1 0 0 0m l ，为a 液； 称取7 0 乳酸钠1 6g ，定容至1 0 0 0m l ，为b 液；取a 液8m l 和b 液lm l 混合后蒸馏水稀 释l 倍，即为0 0 5m o l l 乳酸乳酸钠缓冲液。 p h7 2 的磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠3 1 2g ，定容至1 0 0 0m l ，成0 2m o l l 的a 液； 7 江南大学硕士学位论文 取磷酸氢二钠7 1 6 3g ，定容至1 0 0 0m l ，成0 2m o l l 的b 液；取a 液2 8m l 和b 液7 2m l 混 合后蒸馏水稀释l 倍，即为0 1m o l l 的p h7 2 的磷酸盐缓冲液。 p h4 6 1 拘醋酸钠缓冲液：取醋酸钠6 7g 和冰醋酸2 6m l ，蒸馏水溶解，定容至1 0 0 0 m l ，上述缓冲液以酸度计或精密试纸校t p h 。 ( 3 ) 福林试剂 钨酸钠1 0 0g ，钼酸钠2 5g ，加到2 0 0 0m l l i 虱底烧瓶，加水7 0 0m l ，8 5 的磷酸溶液 5 0m l ，浓硫酸1 0 0m l ，文火回流1 0h ，取下冷凝器，再加入5 0g 硫酸锂和5 0m l 水，混 匀后加几滴溴水，煮沸1 5m i n ，至溶液呈黄色，冷却定容至1 0 0 0m l ，过滤，置于棕色 试剂瓶4 1 2 保存【5 8 】。 ( 4 ) 2 的酪蛋白溶液 2 的中性酪蛋白溶液：称取干酪素2g ，加入o 1m o l l 的氢氧化钠溶液1 0m l ，小 火加热煮沸使之溶解，用p h7 2 的磷酸缓冲液定容至1 0 0m l 即可，保存在4 c 冰箱中。 配制2 酸性酪蛋白溶液时，首先加入lm l 浓乳酸加速溶解，然后加入少量p h3 0 的乳酸乳酸钠缓冲液，小火加热煮沸使之溶解，厍 p h 3 o 的乳酸乳酸钠缓冲液定容后于 4 c 保存备用。 ( 5 ) d n s 试剂 精确称量6 3gd n s 置于2 6 2m l 2m o l l 氢氧化钠溶液中，加入酒石酸溶液中，再加 5g 苯酚和5g 亚硫酸钠，溶解冷却，定容军1 0 0 0m l ，贮于棕色瓶4 c 保存。 ( 6 ) 体外消化率试剂3 8 】 。 胃蛋白酶k c l h c l 溶液：将1 7 7 7 8g 胃蛋白酶( 比活力1 ：1 0 0 0 0 ) 溶于1 0 0m l p h - - 1 4 的h c i k c l 缓冲液中。 胰蛋白酶k h 2 p 0 4 - n a o h 溶液：取4m g 胰蛋白酶( 比活力1 ：2 5 0 ) 溶于1 0 0 0m lp h = 6 8 的k h 2 p 0 4 - n a o h 缓冲液中。 ( 7 ) 1 6 sr d n a 通用引物 p 1 ：5 a g a g t 丌g a t c c t g g c t c a g 一3 ， p 2 ：5 c 1 1 a c g g c t a c c t r g l l a c g a 一3 。 ( 8 ) 1 8 sr d i n a 通用引物 p 、l ：5 g c c t g a g a a a c g g c t a c c a c 3 ， p 2 ：57 g g c a g g g a c g t