（发酵工程专业论文）地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究.pdf

摘要 摘要 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 是芽孢杆菌中最具应用潜力的菌种之一，被 广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业。地衣芽孢杆菌野 生菌株的性能通常不能满足生产需要，因此需要对其进行遗传改造。将外源d n a 片段成 功导入地衣芽孢杆菌细胞是对宿主进行分子操作和遗传研究的前提和基础，而原生质体 转化方法是芽孢杆菌遗传转化的主要手段之一。由于不同地衣芽孢杆菌菌株的原生质体 形成、再生、转化差异较大，因此需要对其影响因素进行优化。地衣芽孢杆菌及 l i c h e n i f o 朋括3 0 3 是一株优良的地衣芽孢杆菌宿主菌。本论文以丑l i c h e n i f o r m i s3 0 3 为宿 主，系统考察了影响该菌原生质体形成、再生的因素，初步优化了最l i c h e n i f o r m i s3 0 3 原生质体转化方法，为进一步的分子操作奠定了基础。 本文研究了丑l i c h e n i f o 删捃3 0 3 菌体生长状态、溶菌酶使用浓度和作用时间、渗透 压稳定剂和再生培养基等因素对最l i c h e n i f o r m i s3 0 3 原生质体制备及再生的影响，优化 了原生质体的制备和再生条件。结果表明：以转接培养至对数生长后期即8h 的菌体， p h6 5 的s m m p 作为渗透压稳定剂，溶菌酶浓度为1 0 0m g m l ，酶解温度为3 7 ，摇 床转速为1 0 0r m i n ，酶解时间为4 0m i n 时，可获得最高原生质体制备率为8 0 1 0 9 个n l l ； 当再生培养基d m 3 中添加1m o l l 琥珀酸钠时，原生质体再生率可达到1 7 。 在此基础上，本文对影响丑l i c h e n i f o r m i s3 0 3 原生质体转化效率的主要因素进行了 研究，考察了原生质体浓度、质粒浓度、m 矿+ 浓度、后培养方式等因素对转化率的影响。 结果表明：以2p , g 甲基化质粒p h y - p 4 3 s e c q ，4 0 p e g 6 0 0 0 + 2 0m m o l lm 9 2 + 为融合剂， 原生质体浓度为3 1 0 9 个m l ，处理5m i n ，后培养方式为3 0 ，1 0 0r m i n 培养1 5 0m i n ， 平均转化率为l5c f u i t gd n a 。 关键词：地衣芽孢杆菌，原生质体，制备，再生，转化 a b s t r a c t a b s t r a c t b a c i t l u sl i c h e n i f o r m i si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts t r a i n sf o ri n d u s t r i a lb i o t e e h n o l o g j t c a l p r o c e s s e s ，a n dw i d e l yu s e di nf i e l d ss u c ha sm e d i c i n e ，p l a n td i s e a s e s ，f o o d , f e e d ，a n d e n v i r o n m e n t 们1 ep e r f o r m a n c eo fb 1 i c h e n i f o r m i sw i d et y p es t r a i ng e n e r a l l yc a nn o tm e e tt h e p r o d u c t i o nn e e d ，t h e r e f o r e ，g e n e t i cm o d i f i c a t i o ni sn e e d e d t h et r a n s f e ro fa l i e nd n ai n t o 丑 l i c h e n i f o r m i si st h ep r e m i s ea n df o u n d a t i o nf o rm o l e c u l a ro p e r a t i o na n dg e n e t i cs t u d yt oh o s t ， w h i l ep r o t o p l a s tt r a n s f o r m a t i o ni so n eo ft h em a j o rm e a n so fg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ni n b a c i l l u s f o rt h e r ei s g r e a td i f f e r e n c ei np r o t o p l a s tf o r m a t i o n 、 r e g e n e r a t i o na n d t r a n s f o r m a t i o no f 丑l i c h e n i f o r m i ss t r a i n s i t sn e e dt oc a r r yo nt h eo p t i m i z e da n a l y s i st oi t s i n f l u e n t i a lf a c t o r s 丑l i c h e n i f o r m i s3 0 3i sa 1 1e x c e l l e n th o s ts t r a i no fb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s i n t h i sp a p e r , b 1 i c h e n i f o r m i s3 0 3w a ss e r v e da sah o s ts t r a i n , s y s t e m a t i ci n v e s t i g a t i o nw a s c a r r i e do u to nf a c t o r s a f f e c t i n gf o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t , p r e l i m i a r i a r i l y o p t i m i z e dp r o t o p l a s tt r a n s f o r m a t i o no f 丑l i c h e n i f o ，珑捃3 0 3 ，a n dl a i dt h ef o u n d a t i o n sf o r f u r t h e rm o l e c u l a ro p e r a t i o n f i r s t l y , s o m ep a r a m e t e r si n v o l v e di np r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o ni n c l u d i n gg r o w t h p h a s e ，l y s o z y m ec o n c e n t r a t i o n ，e e l lt r e a t m e n t ，o s m o t i cs t a b i l i z e ra n dm e d i u mc o m p o s i t i o n w e r eo p t i m i z e d ，n l er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a ly i e l do f 丑l i c h e n i f o r m i sp r o t o p l a s tw a s o b t a i n e d 、析t h8 x10 y m lw h e nt h el a t el o g a r i t h m i c p h a s ec u l t u r e so f8hw e r ed i g e s t e dw i t h 10 0m g m ll y s o z y m ea t3 7 晰t l lg e n t l es h a k i n g ( 10 0r m i n ) f o r4 0m i n , a n ds m m p ( a d j u s t i n gp ht o6 5 ) w a su s e da so s m o t i cp r e s s u r es t a b i l i z e r f o rt h er e g e n e r a t i o no f p r o t o p l a s t ，t h ed m 3m e d i u mc o n t a i n i n g1m o l ls o d i u ms u c c i n a t ew a sm o r ee m c i e n t t h e p e a l ( o fr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yi s17 b a s e do nt h e s er e s u l t s ，m a i nf a c t o r si n f l u e n c i n gp r o t o p l a s tt r a n s f o r m a t i o nw e r es t u d i e d ， i n c l u d i n gp r o t o p l a s tc o n c e n t r a t i o n , p l a s m i dc o n c e n t r a t i o n ，m 9 2 + c o n c e n t r a t i o na n d p o s t - c u l t u r e dw a y s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lt r a n s f o r m a t i o nc o n d i t i o u sw a s o b t a i n e du n d e rc o n d i t i o n so fa d d i n ga m o u n to fm e t h y l a t e dp h y - p 4 3 - s e c q2l x g ，t a k i n g4 0 p e g 6 0 0 0 + 2 0m m o l lm 十f o rf l u x i n ga g e n t ，c o n c e n t r a t i o no fp r o t o p l a s t3xlo g m l ， t r e a t m e n tt i m e5m i n ，a n di n c u b a t e da t3 0 w i t hg e n t l es h a k i n g ( 10 0r m i n ) f o r15 0m i n ，t h e a v e r a g et r a n s f o r m a t i o nr a t ew a s15c f u i 卫gd n a k e y w o r d s ：b a c i l l u sl i c h e n i f o r m s ，p r o t o p l a s t ，p r e p a r a t i o n , r e g e n e r a t i o n , t r a n s f o r m a t i o n l l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：日 期： 上翠l 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日 期： v v ，矽v 1 x l v 第一章前言 第一章前言 1 1 地衣芽孢杆茵 1 1 1 地衣芽孢杆菌的一般生物学特性 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 属于厚壁菌门( f i r m i c u t e s ) 的芽孢杆菌属 ( b a c i l l u s ) ，是一种常见的革兰氏阳性细菌，广泛分布在土壤、空气和腐败有机物上。 杆长2 5 3 5 岬；杆宽o 8 1 5p m ，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。细胞形态 和排列呈杆状、单生。细胞染色均匀，很少成链。无荚膜，无鞭毛，能运动。细胞内无 聚p 羟基丁酸盐( p h b ) 颗粒。最佳生长温度为3 5 士1 ；p h 为7 0 左右。在肉汁培养 基上的菌落为扁平、边缘不整齐、污白色或微黄色、表面粗糙不透明，2 4h 后菌落直径 约为31 1 1 1 1 1 | 在液体培养基中生长时，常形成皱醭。地衣芽孢杆菌可产生乙酰甲基甲醇 ( v - p 反应阳性) ，p n5 4 ；接触酶阳性，卵磷脂阳性，还原硝酸盐；在7 n a c i 和p n5 - 7 肉汤中生长良好，兼营性厌氧生活；可分解葡萄糖、木糖和甘露醇产酸，但不能分解阿 拉伯糖产酸；石蕊牛奶呈还原胨化反应，能分解淀粉和酪素，能利用柠檬酸盐。工业上 主要用来生产淀粉酶及蛋白酶。 1 1 2 地衣芽孢杆菌的主要应用 地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一。它在自然界分布非常广泛， 是土壤和植物微生态中的优势种群之一。它可产生多种抗生素，包括脂肽类、肽类、磷 脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类物质，对多种动、植物及人类病原菌起到很好的抑制 作用，而且地衣芽孢杆菌还具有很强的蛋白酶、淀粉酶活性。因此，地衣芽孢杆菌被广 泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业。近年来，国内外对 于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多，在医药、饲料加工、农药等行业，取得了 较好的研究成果。根据文献显示，关于地衣芽孢杆菌的专利有：用地衣芽孢杆菌生产生 物农药的方法；地衣芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂；地衣芽孢杆菌t i 菌株的构建及其 粗酶提取物的发酵生产；利用基因突变技术改良地衣芽孢杆菌n c i b 8 0 6 1a 淀粉酶的耐 温性和耐酸性的性质等【l j 。 1 1 2 1 地衣芽孢杆菌用于医药研究 据报道，地衣芽孢杆菌做为医药商品是以地衣芽孢杆菌无毒活体菌株制成的胶囊及 i = 1 服液等，主要用于治疗一些肠道疾病。翟少华【2 】将双歧杆菌和地衣芽孢杆菌的肠生态 制剂，联合应用于患有荷h 2 2 腹水癌小鼠，进行了一系列的实验。在研究中发现，对荷 h 2 2 腹水癌小鼠进行化疗后，此种联合的肠生态制剂与化疗药物同时使用，不仅对h 2 2 腹 水癌细胞具有杀伤和促进凋亡作用，并可延长荷瘤小鼠生存天数，提高化疗的效果。由 此证实了双歧杆菌和地衣芽孢杆菌的肠生态制剂的协同作用，并为将来的临床实验奠定 了基础。 江南大学硕士学位论文 1 1 2 2 地衣芽孢杆菌用于农业病害研究 地衣芽孢杆菌能产生多种抗菌物质，对一些植物病原菌有较好的抑制作用。因此， 将其抗菌物质开发为生物农药已成为研究的热点。地衣芽孢杆菌所产生的抗菌物质主要 是一些蛋白类抗菌物质( 几丁质酶、抗菌蛋白、多肽类) 1 3 1 。国外还有报道指出，地衣 芽孢杆菌可产生苯乙酸一类的抗菌物质【4 】。抗菌物质抑制植物病原菌的途径有：作用于 病原菌的细胞壁、细胞膜；与膜相关的受体蛋白相互作用，作用于能量代谢系统；提高 植物的抗病力。从2 0 世纪8 0 年代开始，将地衣芽孢杆菌应用于植物病害防治的研究已经 起步。目前，国内外关于地衣芽孢杆菌应用于植物病害防治的报道比较多。地衣芽孢杆 菌对植物的真菌性病害有较好的抑制效果。方敦煌等【5 】分离出对黑胫病菌有较好抑制效 果的地衣芽孢杆菌g p l 3 ，对该菌进行了生物测定和田间小区试验，并通过大田试验示范 表明，地衣芽孢杆菌g p l 3 的防效稳定保持在5 0 6 0 。s i d 等【6 】通过实验发现，地衣芽 孢杆菌可增强角素( s i g m a ) 抑制辣椒根腐病的活性。由此表明，地衣芽孢杆菌对某些 药剂具有一定增效作用，但是具体起增效作用的物质及其机理还有待进一步研究。 1 1 2 3 地衣芽孢杆菌用于饲料加工研究 地衣芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在。孢子进入动物肠道后，在肠道上部能 迅速复活并分泌活性很强的蛋白酶和淀粉酶，有助于降解植物性饲料中某些复杂的碳水 化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多种物质；同时通过生物夺氧消耗肠道内的氧气造 成厌氧环境，肠道原籍优势菌大多属厌氧菌，而有害菌和外来菌多为需氧菌，从而有利 于维持肠道生态平衡。牛天贵等1 7 1 通过实验发现，地衣芽孢杆菌的发酵上清液能降低蛋 黄中的胆固醇含量，且胆固醇随着发酵液添加量的增加而减少。卜祥斌等f 8 】通过在肉鸡 日粮中添加沸石粉、低聚木糖和地衣芽孢杆菌实验，发现此配方能提高肉鸡生产性能， 且效果优于沸石粉、低聚木糖单独添加或二者联合添加。地衣芽孢杆菌有望成为鸡饲料 的良好添加剂。还有报道指出，地衣芽孢杆菌能分泌高活性的胞外酶系，可将水体中的 有机残余物迅速降解为无机物，有效地促进养殖水体的生态良性循环f 9 】。因此，将地衣 芽孢杆菌作为鱼饲料添加剂，不仅可以促进鱼体生长，而且益于养殖水体的保护。 1 1 2 4 地衣芽孢杆菌用于环境污染防治研究 丁海涛等f l o l 在拟除虫菊酯类农药残留降解菌筛选实验中，筛选出地衣芽孢杆菌q w 5 所产生的特异性酶可与氰戊菊酯羧酸酯键断裂的相应产物发生作用，加速其分解。田间 实验结果表明，q w 5 菌对于田间拟除虫菊酯残留，5 天内的去除率可达9 0 以上，效果优 于实验室摇瓶培养降解拟除虫菊酯的效果。周鸣【l l 】研究采用地衣芽孢杆菌死菌体吸附水 中的c ，其研究结果与报道的同类研究相比较，地衣芽孢杆菌死菌体对c ，具有更好 的吸附效果，在优化条件下，即温度为5 0 c ，摇床转速1 4 0r m i n ，溶液p h 值2 5 ，吸附 时间2h ，菌体浓度1g l ，c ，起始浓度3 0 0m g l ，菌体对c ，有最大吸附量6 0 5m g g 。 1 2 原生质体转化技术概述 1 2 1 原生质体 2 第一章前言 原生质体研究始于1 9 世纪末，直到2 0 世纪五六十年代才开始采用酶法大量制备植物 和微生物原生质体。w r e i b u l l 等 1 2 】于1 9 5 3 年首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌( b a c i l l u s m e g a t e r i u m ) 细胞获得原生质体，并首先提出原生质体概念。细胞壁被酶水解剥离，剩 下由原生质膜包围着的原生质部分称为原生质体。其形状随不同菌类而异，革兰氏阴性 菌经酶水解后尚有残余部分，细胞具刚性，保持球形，称为原生质球或球质体；革兰氏 阳性菌细胞壁去除彻底，失去刚性，原生质体类似于球体。不论原生质体或原生质球都 基本保持原细胞结构、活性和功能，只是它们去掉了细胞壁，对渗透压特别敏感。 m c q u i l l e n 【l 驯- 于1 9 5 5 年首次发现巨大芽孢杆菌原生质体的再生方法，使之恢复成正常细胞 并能继续生长繁殖。 与正常细胞相比，原生质体具有一些新的特性，由于去除了细胞壁，对外界环境影 响更加敏感，对诱变剂的诱变效应也更为强烈；破壁后细胞表面的受体和噬菌体的结合 部位相应不再存在，失去对噬菌体的敏感性；由于解除了遗传物质交流的最大屏障 细胞壁，也不受感受态的影响，可进行原生质体转化和融合等基因重组。 1 2 2 原生质体转化技术 原生质体转化技术是2 0 世纪6 0 年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，是将细 胞通过酶解破壁( 动物细胞除外) ，使之成为球状的原生质体，然后与d n a 混合于高渗 缓冲液中，在聚乙二醇( p e g ) 介导下，使原生质体d n a 发生相互凝聚，进行遗传转 化，然后在适宜的条件下再生细胞壁，获得转化子的过程。原生质体转化开辟了育种工 作的新途径。 常规的微生物筛选和育种方法，工作量大、盲目性较强，在连续多次处理达到饱和 之后就不易进一步提高。除此之外，一些菌株采用常规方法，效果不是很明显【川。相比 而言，应用原生质体转化技术进行微生物选育研究具有以下优点：( 1 ) 酶解去壁，去 除了细胞与外源d n a 相互接触和交流的天然屏障结构紧密结实的细胞壁，提供了发 生遗传转化的有利条件；( 2 ) 可以打破微生物的种属界限，实现远源菌株间的基因重 组；( 3 ) 遗传信息量大，遗传物质的传递更为完整，有利于提高育种速度； ( 4 ) 有助 于建立工业微生物转化体系；( 5 ) 转化工作要求设备条件不高，一般实验室都能进行。 原生质体转化技术是目前原生质体育种技术中应用较广的一种。原生质体转化技术 主要步骤如下：( 1 ) 原生质体制备；( 2 ) 原生质体转化；( 3 ) 原生质体再生；( 4 ) 转化子验证。其简单程序如图1 1 所示： 江南大学硕士学位论文 完整的细胞壁 上去壁( 高渗下) 原生质体质粒d n a 原生质体转化 上 原生质体再生 j 筛选转化子 图1 - 1 原生质体转化过程示意图 f i g 1 - 1t h ep r o c e s so fp r o t o p l a s tt r a n s f o r m a t i o n 1 2 3 影响原生质体转化效率的主要因素 原生质体转化技术的关键是需要对细胞壁进行消化，形成大量的原生质体，并使原 生质体能高频率地再生细胞壁，回复到正常细胞状态。在原生质体形成和细胞再生过程 中，实验条件和技术的微小变化可显著地影响原生质体的再生和转化效率。 1 2 3 1 影响原生质体制备的因素 ( 1 ) 去壁方式 原生质体是指去掉整个细胞壁的球状体，带有残壁的球状体称为原生质球。制备原 生质体，是原生质体转化技术的前提和基础，但是不同微生物的细胞壁组成各不相同， 所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。人们曾探索使用研磨等机械方法和 超声波等物理方法来制备原生质体，效果都不理想。目前，制备原生质体大都是利用酶 解法脱去细胞壁。但由于各种微生物细胞壁组成的差异，制备原生质体的条件也各不相 同。表1 1 列出了各种微生物的细胞壁主要成分和脱壁方法。 酶解去壁得到的原生质体应具有再生能力，即能重建细胞壁，恢复细胞完整形态并 能生长、分裂，这是原生质体转化的必须条件。原生质体的活性和再生能力与原生质体 化的条件密切相关，影响原生质体形成的因素往往也影响原生质体再生，进而影响原生 质体的转化效率。 4 第一章前言 表1 1 不同微生物的脱壁方法1 1 5 】 t a b 1 - 1m e t h o d so fc e l lw a l lr e m o v a lo fm i c r o o r g a n i s m s ( 2 ) 菌龄 微生物生理状态是原生质体化的重要影响因素之一。菌龄过长，菌体细胞壁老化增 厚，不易于释放原生质体；过短则菌体容易破裂，释放原生质体数量较少。大多数研究 表明，对数生长期的细胞生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感，由这些细胞分 离原生质体其形成率和再生率都较高。研究证明，从指数期到稳定期的转折期间，细胞 对酶的抗性迅速增加，衰老期的细胞由于代谢水平与活力下降，对酶的反应迟钝，难以 原生质体化与再生。不同菌种间也有差异。放线菌以对数期到稳定期的转换期比较合适， 制备量多，细胞壁再生能力也比较强【1 6 】。孙传宝等【1 7 1 研究发现，产黄青霉原生质体的菌 体最佳培养基是在对数期，但也有报道产黄青霉原生质体释放的第二个高峰是在生长进 入稳定期，认为这期间有内源溶菌酶作用的可能。 ( 3 ) 酶浓度 在制备原生质体时，各种微生物不仅所需酶的种类不同，而且所需酶量也存在着差 异。适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素，酶中往往含有对原生质体有害的酶 类如过氧化物酶、核糖核酸酶等，杂酶的浓度会随着酶量的增加而增加，当达到一定浓 度时，易使菌体凝集，难于原生质体化。另外，酶浓度过大，细胞脱壁太彻底，必然降 低原生质体的活力【1 8 】。 ( 4 ) 酶解时间 不同微生物的最适酶解时间差异很大。如果酶解时间过短，原生质体的制备率就会 降低；如果超过最佳酶解时间，原生质体得率并不会继续增加。这是由于酶解时间过长， 5 江南大学硕士学位论文 对于一些早期释放的细胞膜有破坏作用，影响了细胞膜的稳定性，导致原生质体破碎， 即使不破碎也会使其活力下降，导致再生率降低。 ( 5 ) 酶解温度 酶解温度对原生质体的制备有一定的影响，根据酶反应动力学原理，酶解温度直接 影响酶促反应的速度，一般而言，最适酶解温度高于菌体的生长温度。细菌的酶解温度 多采用3 5 3 7 c 或4 2 ，放线菌的最适酶解温度为2 8 3 7 ，真菌的最适酶解温度 为3 0 3 5 。在低于最适酶解温度时，随着温度的升高，原生质体制备率不断提高； 高于最适酶解温度时，原生质体的产量明显减少【l 9 。 ( 6 ) 渗透压稳定剂 渗透压稳定剂作为酶的作用环境及原生质体的存在环境，对于原生质体的制备至关 重要。渗透压稳定剂的性质、浓度及其p h 是维持和控制原生质体数量的主要因素。合 适的渗透压稳定剂，一方面可以使原生质体内外的渗透压维持平衡，对生成的原生质体 有一定的稳定和保护作用；另一方面对酶的活性也有一定的促进作用，从而影响原生质 体的产量。通常，酵母菌用糖或醇做稳定剂较好，而细菌多采用蔗糖或k c l 。在使用渗 透压稳定剂时，不仅要考虑维持渗透压平衡，同时还应该注意使用的稳定剂浓度是否会 加重原生质体的损害或者抑制细胞壁的合成。渗透压稳定剂的浓度过大或过小都会影响 原生质体的产量。浓度较高，不利于原生质体的释放，且形成的原生质体较小；浓度较 低，形成的原生质体较大，容易破裂【捌。另外，渗透压稳定剂的p h 值对原生质体的制 备也有一定影响，它不仅影响酶的活力和底物的特性，改变溶壁效果，而且会影响已脱 壁释放的原生质体的稳定性，主要是影响膜的电性状态。p h 值略偏碱性有利于革兰氏 阴性细菌细胞壁外膜的去除，使溶菌酶可以更好地作用于葡聚糖上的1 3 - 0 ，4 ) 糖苷键，促 使菌体脱壁。我国学者在制备地衣芽孢杆菌原生质体时也观察到p h5 8 7 7 范围内对原 生质体的释放无明显影响1 2 ，但缓冲液的离子强度是有一定影响的，一般原则是酶浓度 增加时，浓度应予减少。 1 2 3 2 影响原生质体再生的因素 原生质体再形成有生活能力的菌体称为再生。原生质体再生，重建细胞壁、恢复完 整的形态，是原生质体遗传转化的必要条件。在微生物原生质体转化技术中，原生质体 再生出细胞壁，进而在普通的培养基上生长繁殖是一个十分关键的环节。不同微生物的 原生质体最适再生条件存在着一定的差异，影响因素较多，主要与菌株本身的特性、原 生质体制备条件、再生培养基成分等条件有关。 ( 1 ) 菌龄 由于菌体生理状态和菌体部位的不同可能会造成形成的原生质体大小不一。生长早 期的菌体产生的原生质体较小，其细胞营养成分不完全，相对于大原生质体来说较为脆 弱。菌龄过短的菌体释放的原生质体再生率低，其原因可能与其对酶的耐受力低有关。 因为经酶解破壁形成原生质体后，小原生质体有的细胞器不完全，营养供给不足，所以 再生能力较低。菌龄长的菌体制备的原生质体再生时间短，再生率高，可能是含有细胞 核和其他细胞物质数量多的缘故。t a k a s h i 等【2 2 】报道，菌龄对再生率的影响比较大，菌龄 6 第一章前言 长的原生质体再生率高，且其原生质体再生时间远比菌龄短的原生质体再生时间短。 ( 2 ) 渗透压稳定剂 渗透压稳定剂可能会影响原生质体的稳定性，进而影响到再生率。j i m i c h i 等【2 3 】曾报 道，就形成率而言，无机盐作渗透压稳定剂有利于原生质体的形成，糖及糖醇类效果不 如无机盐类。就再生率而言，情况正好与上述相反，无机盐类在促进原生质体再生方面 不及糖和糖醇。此外，渗透压稳定剂的酸碱度也会对原生质体的再生率产生影响。 ( 3 ) 酶解参数 多数研究表明，若原生质体的细胞壁酶解不彻底，则有助于细胞壁的再生，残留的 细胞壁犹如结晶的晶种一样可加速细胞壁的形成 2 4 1 ，所以选择合适的酶解参数至关重 要。尤其是原生质体制备时酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大。酶解时间与 原生质体形成率成正比，但与再生率成反比。酶解时间越短，细胞壁脱壁越不完全，较 易再生出细胞壁；但是酶解时间过长，脱壁越完全，细胞膜易被酶液破坏，再生较困难。 酶浓度的高低又影响原生质体的再生率，因为用过高浓度的酶制备原生质体时细胞受损 伤较大，失去了重新建成原来细胞所必要的因子1 2 5 1 。 ( 4 ) 原生质体的贮存条件 原生质体比较脆弱，通常要求适当保存。但原生质体在各种高渗缓冲液和不同温度 下长时间保存，其再生能力普遍都会下降。原生质体回复率的高低直接取决于原生质体 活性，而原生质体的活性又与其贮存条件息息相关。一般在低温条件下贮存原生质体比 在常温下或高温下更易保持其原生质体的新鲜度和活性。原生质体的低温贮存方式有两 种，一种是在o 4 的冰箱中，不做任何处理，这种方式有效贮存期较短，一般只能 贮存几天；另一种是超低温贮存，它可以明显延长贮存期。刘伊强等【2 6 】研究芽孢杆菌原 生质体的形成、再生及种间融合时发现，随着贮存时间的延长，原生质体的再生率明显 下降，贮存3d 后，原生质体再生率下降8 3 1 。另外，用于保存菌种的渗透压稳定剂种 类和浓度，对原生质体的回复也具有明显影响。 1 2 3 3 影响原生质体转化的因素 原生质体制备和再生的最终目的是用于d n a 转化。原生质体的转化过程复杂，影响 转化的未知因素多。在保证原生质体质量的条件下，d n a 与原生质体是否充分接触对原 生质体转化效率有至关重要的影响。除此以外，原生质体的转化效率还与原生质体浓度、 质粒浓度、质粒处理方式、后培养方式等因素有关。 ( 1 ) 原生质体浓度 原生质体浓度是影响原生质体转化的重要因素之一。在整个转化体系中，原生质体 数必须维持在一定范围内，原生质体数过低或过高均会显著影响转化率。同时，用原生 质体浓度代替细胞浓度进行转化效率的研究，消除了菌体浓度的差别所带来的原生质体 形成率、再生率及转化效率上的差异，又能较准确、合理地反映菌体浓度对转化效率的 影响。 ( 2 ) 质粒浓度 在参与转化处理的原生质体数目不变的前提下，转化子数目通常随d n a j j h 入量的增 7 江南大学硕士学位论文 加而增加，但在质粒d n a i j i 入过多( 不同菌的转化均不同) 时，以每微克d n a 计所得 转化子的转化率会有所下降。 ( 3 ) p e g 相对分子质量及其质量浓度 在原生质体和质粒d n a 的混合液中加入p e g 可提高原生质体的转化效率。p e g 的相 对分子质量和浓度高低对转化都有较大影响。p e g 的相对分子量从1 0 0 0 - - - 6 0 0 0 不等，因 菌种不同而定。放线菌一般用1 0 0 0 - 6 0 0 0 ，细菌一般用1 5 0 0 - 6 0 0 0 ，真菌常用4 0 0 0 - - 6 0 0 0 。 p e g 的浓度一般为1 0 5 0 ，浓度过高会导致原生质体皱缩甚至中毒，过低导致原生质 体破裂。对于芽孢杆菌的原生质体转化，最初使用p e g 的分子量为6 0 0 0 ，浓度为4 0 t 2 7 】。 ( 4 ) p e g 处理时间 p e g 对原生质体具有毒性，所以p e g 处理应在尽量短时间内完成。s c h a e f f e r 掣2 8 】认 为在细菌原生质体转化过程中，p e g 处理的时间应该很短。但c o r i n n e 等【2 9 】认为，尽管在 加入p e g 的溶液中，原生质体d n a 间的聚合立即发生，但有效的基因重组转化仍还需 要一段时间。g a b o r 等f 3 0 j 的研究也说明了这一结果。 ( 5 ) 无机离子 原生质体转化过程中需要一定量的c a 2 + 7 f ：1 1 m 9 2 + 可提高转化效率，而k + 和n a + 会显著 降低转化率，研究表明，在转化时加入c a 2 + 的最佳浓度为0 0 1m o l l 、加入m 矿的最佳 浓度为0 0 2m o l l ，但各菌种间略有差异。c a 2 + 、m 孑+ 的主要作用在于它们是原生质体 与d n a 的联系者，不仅可以促进原生质体d n a 的粘合，而且可使这种粘合作用更为稳 定，从而更好地促进转化的发生，另外它还起着维持原生质体的稳定性作用，防止它们 破裂。a t t e 等1 3 l j 发现，在s t r e p t o c o c c u sl a c t i s 原生质体转化时，力n a c a 2 + 比m 矿+ 转化效率 高1 0 倍以上，而d a r r e l l 等 3 2 1 在b a c i l l u s p o l y m y x a 上得到相反结果，因菌种不同而异。 1 2 4 原生质体转化技术的研究进展 自1 9 5 3 年w e i b u l l t l 2 j 首次用溶菌酶酶解分离巨大芽孢杆菌的原生质体，1 9 7 9 年c h a n g 等【3 3 】创立了原生质体转化技术后，它很快应用在微生物中，并得到了证实，成功地实现 了酵母菌、霉菌和细菌等微生物的转化。d a ss 等【3 4 】通过原生质体转化技术建立了克鲁 氏乳酸酵母的高频转化体系。i t 0h 等【3 5 】系统考察了碱金属离子对酿酒酵母d 1 3 1 a 原生 质体转化的影响。李梅，杨谦等【3 6 l 采用p e g 介导的原生质体转化法研究了含有多菌灵抗 性基因的质粒p r b l 2 9 转化球毛壳菌的的影响因素。s o n i a 等f 3 。7 】建立了农杆菌介导红曲菌 原生质体的转化系统，其效果比较理想。孙枫【3 8 】利用原生质体转化技术对球形芽孢杆菌 的质粒转化进行了研究。t a d a y u k i 等【3 9 】通过原生质体转化法将) 贡；i 宣p u b l1 0 、p t b l 9 、 p t b 9 0 成功转入b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s 。1 9 8 1 年，j a i l d o v a 脚】成功的将质粒p u b l1 0 转 化到了枯草芽孢杆菌中。1 9 8 4 年，b a k h i e t 等【4 1 】通过原生质体转化技术对b a c i l l u s l a r v a e 、 b a c i l l u ss u b h l 括、b a c i l l u sp o p i l l i a e 的转化效率进行了比较。1 9 9 5 年，吴承龙【4 2 】对枯草芽 孢杆菌原生质体转化条件进行了初步研究。 目前，对地衣芽孢杆菌原生质体转化技术报道较少。p r a g a i 等【4 3 】对不同地衣芽孢杆 菌菌株的原生质体转化效率进行了比较。b i a n c a 等1 4 4 分别敲除t b 1 i c h e n i f o 朋西d s m l 3 两套限制性酶切系统上的加积位点，获得突变菌株最l i c h e n i f o r m i sd s m l 3 ( a h s d r l ) 、 8 第一章前言 丑l i c h e n i f c i r m i sd s m l 3 ( ah s d r 2 ) 、最l i c h e n i f o r m i sd s m l 3 ( a h s d r l 、ah s d r 2 ) ，并 以3 株突变菌株为转化宿主，对各个宿主菌的转化率进行了比较。但由于地衣芽孢杆菌 自身存在的特殊生理、遗传性状，如：无感受态形成系统【4 5 1 ，原生质体再生困难1 4 6 1 ，特 殊的限制修饰系统【47 】等，地衣芽孢杆菌不同菌株的再生率和转化率相对较低。 1 3 本论文的立题依据和研究内容 地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中最具应用潜力的菌种之一，被广泛应用于医药、农药、 食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业。地衣芽孢杆菌野生菌株的性能通常不能满 足生产需要，因此需要对其进行遗传改造。但其自身存在的特殊生理、遗传性状，给菌 种改良带来较大的难度。因此，建立一种高效的地衣芽孢杆菌遗传转化方法是对该菌株 进行分子水平改良的基础，特别对于一些应用于工业生产的菌株而言，尤为重要。 目前地衣芽孢杆菌的转化方法主要有：电转化法【4 8 】和原生质体转化法。与电转化法 相比，原生质体转化法条件温和，不需相应的转化设备，获得阳性转化子的几率较大， 并且一些研究者已经利用p e g 介导原生质体转化技术应用于地衣芽孢杆菌染色体d n a 片段的删除和修复 4 9 , 5 0 | 。然而，这些方法均是参考枯草杆菌的原生质体转化技术的【3 3 1 。 目前，还少见有针对野生型地衣芽孢杆菌进行原生质体遗传转化研究的报道。同时，我 们的前期研究发现两者的原生质体转化条件还是有显著差异的。 本文研究的主要内容： 1 通过考察bl i c h e n i f o r m i s3 0 3 菌体生长状态、溶菌酶浓度、酶解时间、酶解温度、 渗透压稳定剂及其p h 等因素，获得丑l i c h e n i f o r m i s3 0 3 原生质体制备的较优条件； 2 通过考察酶解时间、再生培养基成分、渗透压稳定剂、原生质体贮存时间等因素 对原生质体再生的影响，获得丑l i c h e n i f o r m i s3 0 3 原生质体再生的较优条件； 3 通过研究原生质体浓度、质粒浓度、p e g 分子质量及浓度、后培养方式、质粒大 小等因素，优化丑l i c h e n i f o r m i s3 0 3 原生质体的转化条件。 9 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌株与质粒 最l i c h e n i f o 册括3 0 3 由江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心 ( h t t p ：c i c i m c u ji a n g n a n e d u c n ) 提供。 质粒p h y 3 0 0 p l k 、p h y p 4 3 、p h y - p 4 3 一s e c q 、p h y - x i ：d i f g m 、p d g l 4 8 s t u i 由本 实验室保藏。 2 1 2 主要生化与分子生物学试剂 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n , a m p ) 上海生工生物工程技术服务有限公司 卡那霉素( k a n a m y c i n ，k a n ) 上海博大泰克生物工程有限公司 四环素( t e t r a c y c l i n e ，t e t ) 北京拜尔迪生物工程有限公司 r n a s e 深圳晶美生物工程有限公司 鲑鱼精北京博大泰克生物基因技术有限公司 琼脂糖b i o w e s ta g a r o s e西班牙进口分装产品 l y s o z y m e s i g m a 公司产品 山梨醇上海生工生物工程技术服务有限公司 甘露醇上海生工生物工程技术服务有限公司 p e g 上海生工生物工程技术服务有限公司 十二烷基硫酸钠( s d s )上海生工生物工程技术服务有限公司 质粒d n a 小量制备试剂盒上海生工生物工程技术服务有限公司 牛血清清蛋白上海生工生物工程技术服务有限公司 牛肉膏德国o x o i o 公司 酵母提取物德国o x o i o 公司 胰蛋白胨德国o x o i o 公司 琼脂粉德国o x o i o 公司 d n a 限制性内切酶e c o r i 、b a m h i 均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品； 其它试剂药品皆为国产的分析纯和生化试剂。 2 1 3 培养基与试剂 2 1 3 1 试剂 ( 1 ) r n a s e 溶液 r n a s e5m g ，于1m l 生理盐水中充分溶解，沸水浴1 0m i n ，缓慢冷却后分装，2 0 保藏。 ( 2 ) 溶液i 江南大学硕士学位论文 5 0m m o l l 葡萄糖，2 5m m o l lt r i s h c l ( p h8 0 ) ，1 0m m o l le d t a 。 ( 3 ) 溶液i i o 2m o l ln a o h ，1 s d s 。 ( 4 ) 溶液i i i 5m o l l 乙酸钾6 0m l ，冰乙酸1 1 5m l ，水2 8 5m l ，混匀。 ( 5 ) t e 2m m o l lt r i s h c i ，1m m o l le d t a ，p h8 0 。 ( 6 ) 鲑鱼精( 2 5m g m l ) 沸水煮2 0 分钟变性，立即冰浴冷却，2 0 分装保存。 ( 7 ) 2 x s m m 0 0 5m o l l 山梨醇，o 0 2m o l l 顺丁烯二酸，o 0 2m o l lm g c l 2 ，p h6 5 。 ( 8 ) 溶菌酶 各称取l y s o z y m eo 0 5g 、0 1g 、0 1 5g 、0 2g 、o 2 5g ，子lm l2 x s m m 中充分溶