（发酵工程专业论文）利用废啤酒生产啤酒醋及其澄清工艺的研究.pdf

山东轻工业学院硕上学位论文 摘要 废啤酒是啤酒生产过程中的副产物，约占啤酒产量的1 5 ，随着啤酒产量的 不断增长，废啤酒的排放量也越来越多，严重污染了环境。在当前资源短缺，环 境污染严重的现状下，对废啤酒进行开发利用，以此为原料生产啤酒醋，对减轻 废啤酒的环境污染，增加啤酒行业效益有重要的意义。本研究以废啤酒的综合利 用为目的，围绕啤酒醋的返浑现象和液体深层发酵醋的风味两个问题为核心，主 要研究了啤酒醋出现非生物混浊的原因、保持啤酒醋非生物稳定性的措施以及混 菌发酵对提高啤酒醋风味的影响。 啤酒醋出现非生物浑浊与高分子蛋白和多酚含量过高有关。啤酒醋中残余胶 体蛋白很不稳定，随着杀菌加热，蛋白质变性并凝聚沉降，也可能是在长期的存 放过程中，由于啤酒醋中大量盐类的电离作用，使蛋白质颗粒上的同性电荷被破 坏，从而使细微蛋白质颗粒互相吸附、碰撞、絮凝、凝聚而沉降。啤酒醋中的多 酚在氧、温度、光照等因素的影响下发生氧化，聚合形成沉淀。另外，当啤酒醋 中的蛋白质与多酚类物质长时间共存时，多酚类物质与蛋白质也会形成缔合物， 此缔合物在啤酒醋中的溶解度较小，将逐步从啤酒醋中析出，在析出并沉降过程 中因沉淀效应等因素引起了其他物质的共同沉淀，从而引起啤酒醋的非生物浑浊。 通过对啤酒醋非生物浑浊的研究分析，本课题从降低啤酒醋中敏感蛋白和敏 感多酚含量入手，主要对废啤酒的酶解、热处理和啤酒醋的澄清处理三个环节进 行研究，保证了啤酒醋的非生物稳定性。在废啤酒的酶解过程中，木瓜蛋白酶使 废啤酒中的高分子蛋白质分解为小分子的多肽和氨基酸等小分子物质，既可以减 少过量敏感蛋白导致的啤酒醋的非生物性浑浊，又可以增加培养基中氨基氮含量。 废啤酒的热处理及卡拉胶的添加可以使未酶解的敏感蛋白絮凝沉淀，从而将敏感 蛋白含量控制在适量范围内；在啤酒醋的澄清处理过程中，p v p p 吸附澄清效果最 佳，主要吸附啤酒醋中的敏感多酚，降低多酚含量，避免过量多酚引起啤酒醋的 非生物混浊。通过大量的实验，我们认为经过处理的啤酒醋应该符合以下三个标 准：澄清度在9 5 以上为澄清合格；所含残余酚量低于8 0 m g l 为降酚合格；蛋 白稳定性实验不出现絮凝为蛋白稳定。 液态深层醋酸发酵机械化程度高，生产周期短，原料利用率高，但相对于传 统固态发酵醋口味较差。本课题分析、比较了液态深层醋酸发酵和传统固态醋酸 发酵的优缺点，发现液态深层发酵醋口味差的原因为发酵过程菌种单一，香味物 质少。针对上述原因，采用产香酵母与醋酸菌a s l 4 1 混合发酵，增加了香味物质 的代谢途径和相应酶类，改善了产品风味，形成了以麦芽香和苹果香为主体、酸 味柔和、清澈透明的啤酒醋。 y 摘要 关键词废啤酒，啤酒醋，非生物稳定性，澄清，混菌发酵 v j a bs t r a c t t h ew a s t eb e e ri st h eb y p r o d u c td u r i n gt h eb r e w i n gp r o c e s s ，a c c o u n t i n g f o r a p p r o x i m a t e l y1 5 o ft h et o t a lb e e ro u t p u t 。n o w a d a y s ，w i t ht h eo u t p u to ft h eb e e r i n c r e a s e d ，m o r ea n dm o r ew a s t eb e e ri sd i s c h a r g e d ，w h i c hh a ss e r i o u s l yp o l l u t e dt h e e n v i r o n m e n t i ti sn e c e s s a r yt od e v e l o pa n de x p l o r et h ew a s t eb e e r i nt h i sp a p e h t h e w a s t eb e e ri su s e da sr a wm a t e r i at op r o d u c ev i n e g a r , f o rt h ea i mo fc o m p r e h e n s i v e u t i l i z a t i o no fw a s t eb e e r ，w h i c hg r e a t l yc u t sd o w nt h ew i t h d r a w a lo fw a s t eb e e r w e m a i n l yi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fe n z y m o l y s i sa n dh e a tt r e a t m e n to nt h en o n b i o l o g i c a l s t a b i l i t yo ft h et h eb e e rv i n e g a r , t h ee f f e c to fm i x e d f e r m e n t a t i o no nt h ef a v o ro ft h e b e e rv i n e g a ra n dt h ee f f e c to ft h ec l a r i f y i n ga g e n to nt h eb e e rv i n e g a r t h eb e e rv i n e g a ri sak i n d o fc o l l o i ds y s t e mw i t ha b u n d a n t n u t r i t i o na n d c o m p l i c a t e dc o m p o n e n t s t h eb a c kh a z eo fb e e rv i n e g a ri sm a i n l yb e c a u s e o fe x c e s so f t h eh ap r o t e i na n dh ap o l y p h e n 0 1 i t ss t a b i l i t ) rp o s s e s s e ss o m er e l a t i v i t y m a n y p h y s i c a la n dc h e m i c a lf a c t o r s ，s u c ha s ，t i m e ，t e m p e r a t u r ef l u c t u a t i o n ，i l l u m i n a t i o ne t c c a nd e s t r o yt h ec o l l o i db a l a n c ei ns o m ee x t e n t ，a n dt h et u r d i t ya p p e a r s a l t h o u g ht h e t u r d i t yd o e sn oh a r mt op e o p l e sh e a l t h ，a p p e a r a n c eq u a l i t yo ft h eb e e rv i n e g a rw a s g r e a t l vi n f l u e n c e d 1 1 1 ep a p e rs e l e c t e dt h ee x c e l l e n tc l a r i f i e rv i aa d o p t i n g d i f f e r e n t c l a r i f i e ra n dt h es t a b i l i t yo ft h eb e e rv i n e g a rc o u l db ei m p r o v e dg r e a t l y i no r d e rt oc l a r i f yt h eb e e rv i n e g a r ，3s t e p sa sf o l l o wa r ec a r r i e dt h r o u g h ，t h e e n z y m o l y s i so f t h ep r o t e i ni nt h ew a s t eb e e r ，t h eh e a tt r e a t m e n ta n dt h ec l a r i f i c a t i o no f t h eb e e rv i n e g a r t h eh i g hm o l e c u l a rp r o t e i ni nt h ew a s t e b e e ri sd e c o m p o s e di n t ol o w m o l e c u l a rp r o t e i nb yt h ep a p a y i n ，w h i c hn o to n l yp r e v e n th i g hm o l e c u l a rp r o t e i nf r o m t u r b i d d i n g b u ta l s oi n c r e a s et h ec o n t e n to fa m i n on i t r o g e ni nt h ec u l t u r e m e d i u m i nt h e h e a tt r e a t m e n tp r o c e s sw i t ha d d i t i o no fc a r r a g e e n a n ，t h er e m a n e n th i g hm o l e c u l a r p r o t e i nf l o c c u l a t sa n ds e d i m e n t s ，a sar e s u l t ，t h e r ei sa na p p r o p r i a t ec o n t e n to fh i g h m o l e c u l a rp r o t e i ni nt h ew a s t eb e e r i nt h ec l a r i f y i n gp r o c e s so ft h eb e e rv i n e g a r , t h e s t u d ys h o wt h a tp v p ph a s t h eb e s te f f e c to na b s o r b e n to fp o l y p h e n o l s ，m a i n l y a b s o r b i n gs e n s i t i v ep o l y p h e n o l sa n dm a d et h es e n s i t i v ep o l y p h e n o l st h ea p p r o p r i a t e c o n t e n ti nt h eb e e r l o t so fe x p e r i m e n t ss h o wt h a tt h r e ec r i t e r i af o rq u a l i f i e db e e r v i n e g a ri sa sf o l l o w , a b s o r b a n c ev a l u e ；一 9 5 ，s e n s i t i v ep o l y p h e n o l s 一 酶用量 酶解时间，酶解最佳水平为b 2 a a c s ，即酶解温度5 5 、酶解时间1 2 0 m i n 、酶用量4 0 0 0 ；综合3 种因素对废啤酒中q 一氨基氮含量的 影响结果并以此条件进行试验，确定木瓜蛋白酶水解废啤酒的最佳条件为：即酶 2 0 山东轻t 业学院硕十学位论文 解温度5 5 、酶解时间1 2 0 m i n 、酶用量4 0 0 0 u l 。 2 3 3 热处理温度对废啤酒浑浊敏感物质的影响 分别取3 0 0 m l 废啤酒置于8 个5 0 0 m l 的锥形瓶中，分别在8 0 。c ，9 0 ，1 0 0 ，1 l o ，1 2 0 热处理3 0 m i n ，每一组做两个平行，取平均值。热处理后冷却 过滤，以废啤酒高分子氮和多酚含量为实验指标，确定热处理的温度。结果如图 2 3 。 一高分子氮 - _ 丁 b 0 吕 腻 求 捏 2 0 0 1 5 0 1 0 0 5 0 2 0 0 1 5 0 1 0 0 5 0 。7 08 09 01 0 01 1 01 2 01 3 0 热处理温度 图2 3 热处理温度对浑浊敏感物质的影响 f i 9 2 3 e f f e c to ft h eh e a t i n gt e m p e 枷r eo na hi n g r e d i e n t 由图2 3 可知，不同热处理温度对废啤酒中浑浊敏感物质的影响有显著的差 别，随热处理温度的升高，高分子氮较多酚的降幅显著。在1 0 0 时，高分子氮 和多酚含量降幅都较大，高分子氮含量和多酚含量分别降为1 2 8 3 m g l 和 1 5 1 5 m g l ；在超过1 0 0 。c 时，随着热处理温度的升高，多酚含量降低缓慢，温度 为1 2 0 时，多酚含量最低，1 7 1 5 m g l ，高分子氮含量仍有所降低，1 2 0 ，降 为1 2 3 5m g l 。由此说明，热处理温度对浑浊敏感物质含量有显著影响。 2 3 4 热处理时间对废啤酒浑浊敏感物质的影响 在一定范围内，煮沸时间越长，蛋白质析出越多，但过长的煮沸时间会使已 经絮凝的蛋白质又被打碎，影响啤酒醋的澄清。在温度为1 0 0 。c 条件下，分别煮 沸2 0 m i n 、3 0 m i n 、4 0 m i n 、5 0 m i n 、6 0 m i n ，8 0 m i n ，然后冷却过滤，以高分子氮含 量和多酚含量为实验指标，确定热处理的时间。如图2 4 。 2 l 第2 章废啤酒的预处理 - 12 0 0 b o 鲁 谴1 5 0 求1 0 0 恒 5 0 02 04 06 08 01 0 0 热处理时间 2 0 0 j 1 5 0 函 g 1 0 0 熏 5 0 图2 4 煮沸时间对浑浊敏感物质的影响 f i 醇4 e f f e c to f t h eh e a t i n gt i m eo na hi n g r e d i e n t 由图2 4 得知，在热处理温度1 0 0 条件下，在4 0 m i n 内，随热处理时间的 增加，可凝固性蛋白和多酚含量降幅较为明显；在4 0 - 6 0 m i n 之间，高分子氮和多 酚含量降幅较小，热处理时间为6 0 m i n 时，高分子氮和多酚含量降至最低，分别 为1 0 1 5 m g l 和1 4 1 8 m g l ；热处理时间超过6 0 m i n 时，可凝固性蛋白和多酚含 量有所回升，其原因可能为在热处理过程中，由于液体沸腾时剧烈翻腾使已经絮 凝的蛋白质又被打碎。 2 3 5 卡拉胶对废啤酒浑浊敏感物质的影响 分别取3 0 0 m l 废啤酒于5 0 0 m l 锥形瓶中进行热处理，在废啤酒热处理2 0 m i n 时，分别加入0 5 的卡拉胶溶液1 2 m l 、1 8 m l 、2 4 m l 、3 0 m l 、3 6 m l 、4 8 m l ， 卡拉胶的添加浓度分别为2 0 m g l 、3 0 m g l 、4 0 m g l 、5 0 m g l 、6 0 m g l 、8 0 m g l 、 1 0 0 m g l ，其它试验条件为：温度，1 0 0 ，热处理时间为，5 0 m i n ，以高分子氮和 多酚含量为实验指标，考察卡拉胶添加量对浑浊敏感物质的影响，结果如图2 5 。 05 01 0 01 5 0 卡拉胶添加量m g l 1 5 0 1 0 0 图2 5 卡拉胶对浑浊敏感物质的影响 f i 醇5 e f f e c to ft h ec a r r a g e e n a no na hi n g r e d i e n t 一 b 0 吕 皿| 1 如 裔 蚺 0 0 o o o o o 2 o 8 6 4 2 18卿舡酶卅求框 山东轻工业学院硕十学位论文 幽图2 5 可知，在废啤酒热处理过程加入卡拉胶对高分子氮的降低有明显的 效果，添鸯毽量小于5 0m g l 时，随卡拉胶添如量的增加，高分子氮含量降幅较大， 添加量为5 0m g l 时降至4 5 3 m g l ，大于5 0m g l 时，随卡拉胶的增加，降幅 趋于平缓；在卡拉胶的添加过程中，多酚含量降低较小，添加量为1 0 0 m g l 时， 多酚含量降至最低，为1 2 3 7 m g l ，卡拉胶添加量继续增加，多酚变化不明显。 由此说明，卡拉胶对多酚的吸附能力较弱，对蛋白质吸附能力较强，卡拉胶的最 佳添加量为5 0 m g l 。 2 3 6 热处理工艺的确定 表2 。5 热处理工艺因素糯采平 t a b2 5f a c t o ra n dl e v e lo ft h eh e a t i n g 根据单因素试验结果确定以热处理温度，热处理时间，卡拉胶添加量三因素 三水平，采用l 9 ( 3 3 ) 表，进行歪交试验，每个实验设两个重复计算平均值，分析 9 个实验的结果，以可凝固性蛋白和多酚含量为实验指标，确定热处理的工艺条 件。结果见表2 6 。 第2 章废啤酒的预处理 表2 6 热处理工艺的研究 t a b2 6t h er e s e a c ho ft h eo p t i c a lh e a t i n gc o n d i t i o n 一 b o 吕 腻 求 幢 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 1 0 01 1 01 2 0 温度 3 04 0 5 04 05 06 0 时间卡拉胶添加量 图2 6 因素与高分子氮含量的关系 f i g2 6 t h er e l a t i o nb e t w e e nf a c t o ra n dh i g hm o l e c u l a rp r o t e i n 2 4 山东轻工业学院硕上学位论文 1 4 0 1 3 0 昌 密1 2 0 螭 11 0 1 0 01 1 0 1 2 0 温度 3 04 05 0 时间 4 05 06 0 卡拉胶添加量 图2 7 冈素与多酚含量的关系 f i g2 7t h er e l a t i o nb e t w e e nf a c t o ra n dp o l y p h e n o l s 由表2 6 可知，废啤酒的热处理条件不同，高分子氮和多酚含量变化差别较 大，影响高分子氮含量变化的主要因素是卡拉胶的添加量，其次是热处理时间， 最后是热处理温度。以可凝固性蛋白为实验指标，最佳水平为c 3 b a a l ，即卡拉胶 添加量为6 0 m g l ，热处理时间为5 0 m i n ，煮沸温度为1 0 0 ，说明卡拉胶添加量 对废啤酒中可凝固蛋白的去除效果较大；影响多酚含量变化的主要因素是热处理 时间，其次是热处理温度，最后是卡拉胶的添加量，最佳水平为b 3 a 3 c 2 ，即热处 理时间为5 0 m i n ，热处理温度为1 2 0 ，卡拉胶的添加量为5 0m g l 。由于废啤酒 热处理的主要目的为降低浑浊敏感蛋白的含量，兼顾多酚含量变化，选择最佳水 平为c a b a a i ，即卡拉胶添加量为6 0 m g l ，热处理时间为5 0 m i n ，煮沸温度为1 0 0 。 2 4 结论 由于酵母自溶，废啤酒中含有一些大分子的蛋白质，可采用酶法分解这些大 分子物质。在选用的3 种蛋白酶中，木瓜蛋白酶对废啤酒中高分子蛋白的水解效 果最好；采用该酶水解啤酒中高分子蛋白的优化条件为：酶解温度5 5 、酶解时 间1 2 0 m i n 、酶用量4 0 0 0 u g 蛋白质。该处理方法既去除了废啤酒中的混浊敏感蛋 白，提高了啤酒醋的非生物稳定性，又增加了培养基中的可溶性氮含量，可以改 善了啤酒醋的风味。 废啤酒的热处理可以沉淀其中的大部分混浊敏感蛋白和少部分多酚。其原因 是由于加热可使蛋白质变形而凝固，当蛋白质处于等电点时加热凝固最完全和最 迅速，热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由 于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态，从而使蛋白质絮凝而沉淀下来。另外， 在热处理过程多酚和蛋白质分子结合形成沉淀。卡拉胶对蛋白有较强的吸附能力， 可以提高啤酒醋非生物稳定性。由试验研究确定热处理的最佳工艺为：煮沸温度 为1 0 0 ，卡拉胶添加量为6 0 m g l ，热处理时间为5 0 m i n 。 山东轻工业学院顾士学位论文 第3 章啤酒醋混菌发酵规律的研究 3 1 引言 食醋是一种具有保健功能的调味品，随着人们生活水平的不断提高，对食醋 的需求量越来越大，对产品质量的要求越来越高。虽然我国传统酿造法生产的食 醋风味好，但产量低、周期长、劳动强度大、原料利用较低。新工艺液态深层发 酵法生产食醋产量高、生产周期短、劳动强度低、产品卫生条件好，但风味较差。 传统工艺法生产食醋的特点是边糖化边发酵，长时间发酵形成众多微生物在众多 微生物在代谢活动产生了丰富的醇、醛、酮、酸、酯等，使产品香味浓郁，酸味 柔和1 5 酬。但是液态深层发酵法具有易操作管理、规模化标准化生产，又有利于提 高原料利用率、产酸速率和酒精转酸率。液态深层发酵法生产食醋是最有效和先 进的工艺技术方法。若选用性能优良的霉菌、酵母、醋酸菌等多种微生物，进行 人工纯培养，采用液态法酿造工艺进行多种微生物共酵，可以酿出质量好、原料 利用率高的食醋。 提高液态深层发酵醋的质量( 目前多用串香法或配兑法) 【5 7 】，采用多菌种混合 发酵( 特别是在醋化阶段) 是有效途径之一，国内已有这方面的尝试。李宜丰等对 不同老陈醋酿造厂微生物活动规律的分析，发现芽饱杆菌( 主要是巨大芽饱杆菌、 凝结芽抱杆菌、坚强芽抱杆菌、环状芽抱杆菌) 在醋酸发酵阶段大量分布，而且与 醋酸细菌协同参与发酵，并对食醋酸度和风味的提高具有一定的作用【5 引。此外， 一些研究认为产香酵母菌在酿醋过程中的作用也是不可忽视的。把传统( 天然) 混 合培养技术与现代纯种培养技术相结合的方法，国外学术界叫做限定混合培养 ( d e f i n e dm i x e dc u l t u r e ) 1 5 9 1 。即使用二种或二种以上经分离纯化的微生物纯种，接 种同一经灭菌的培养基，在无污染条件下进行发酵这种培养的微生物是已知的和 确定的，国内习惯称为混菌发酵。 可见，限定混合培养( 混菌发酵) 无论在改善产品质量和风味，还是在提高发 酵产率方面，都是大有益处的。同时利用生物工程新技术选育酶活高、酶种全的 优良菌株，以充分发挥多菌种混合发酵的优点。本章拟通过对产香酵母x b 4 5 与 醋酸菌a s l 4 1 的混合发酵温度，通风量等参数的研究，确定混菌发酵生产啤酒醋 的工艺，以改善液体深层发酵醋的风味。 3 2 材料与方法 3 2 1 菌种 醋酸菌a s 1 4 1 ，山东轻工业学院啤酒中心保存 沪酿1 0 1 ，山东大学微生物菌种中心提供 l b 2 0 0 1 ，陕西蒲城县科学技术开发中心提供 2 7 第3 章啤酒醋混菌发酵规律的研究 产香酵母x j b 4 5 ，山东轻工业学院分子生物学实验室提供 3 2 2 培养基 产香酵母斜面培养基：1 0 。b x 麦芽汁固体培养基 酵母菌活化培养基：1 0 。b x 麦芽汁培养基 醋酸菌斜面培养基：葡萄糖l g ，酵母膏1 9 ，碳酸钙2 9 ，无水乙醇3 5 m l ， 琼脂2 9 加入1 0 0 m l 水中，p h 6 50 。 醋酸菌活化培养基：6 。b x 麦芽汁1 0 0 m l ，酵母膏l g ，葡萄糖l g ，k h 2 p 0 4 0 5 9 ，p h 5 5 。 醋酸菌保藏培养基：酵母膏l ，葡萄糖1 ，c a c o a0 5 ，琼脂1 8 ，灭 菌后加乙醇3 ( v v ) 。 啤酒醋发酵培养基：废啤酒，克代尔啤酒有限公司提供。 以上培养基均采用1 2 1 ，灭菌2 0 m i n 。 3 2 3 主要试剂 葡萄糖，分析纯 酵母膏，分析纯 乙醇，分析纯 蛋白胨，分析纯 琼脂粉，分析纯 氯化钠，分析纯 碳酸钙，分析纯 氢氧化钠，分析纯 磷酸氢二钾，分析纯 磷酸二氢钾，分析纯 硫酸镁，分析纯 氯化铁，分析纯 甘油，分析纯 双氧水，分析纯 3 2 4 主要仪器设备 超净工作台，济南市空气净化设备厂 振荡培养箱，江苏太仓试验设备厂 酒精计，三支组，0 1 0 0 ( v v ) ，河北省河间市黎民居仪表厂 7 2 1 分光光度计，上海第二分析仪器厂 电子分析天平，b p l1 0 s 型，s a r l o r i u 公司 p h 计，p h s 2 5 型，上海雷磁仪器厂 1 0 l 自动发酵罐，上海保兴生物设备工程有限公司 山东轻t 业学院顾十学位论文 超级恒温水浴锅，l h 5 8 6 2 型，上海精科实业有限公司 3 2 5 检测分析方法 ( 1 ) 酒精度【6 0 】 酒精计法，以蒸馏法去除样品中的不挥发物质，用酒精计法测得酒精体积的 百分数值，按温度校正，求得2 0 c 时乙醇的体积百分数( ，v v ) ，即酒精度。 ( 2 ) 总酸测定【6 1 1 ( 酸碱滴定法) 吸取样品液2 5 m l 定容至2 5 0 m l 容量瓶中，用移液管吸取滤液5 0 m l ，放入 1 0 0m l 三角瓶中，加1 酚酞2 滴，用0 1m o l ln a o h 标准溶液滴定至微红色 3 0 s 不退色为终点，记录n a o h 标准溶液的用量。同法平行操作3 次，得平均消 耗体积。按以下公式计算： 液态样品总酸( l o o m l ) = 学1 0 0 y 样 c ：氢氧化钠标准溶液浓度( t o o l l ) v ：滴定耗用氢氧化钠的量( m u k ：乙酸换算系数o 0 6 v 样：吸取样品体积( m l ) ( 3 ) 高分子氮的测定【6 2 】 单宁沉淀法加1 0 0 毫升样品( 使其内含约8 0 毫克左右氮) 于2 0 0 毫升容量 瓶中，加水到1 8 0 1 8 5 毫升，加比重1 4 硫酸4 毫升，摇匀。置容量瓶于2 0 水浴中，保温1 5 2 0 分钟，加l o 毫升单宁溶液，加水至刻度，摇匀，立即用折 叠滤纸过滤，此滤液可重复过滤，直至滤清。然后分别用凯氏定氮测单宁沉淀前 后的含氮量，两测量值之差为单宁沉淀的氮，即高分子氮含量。 ( 4 ) 啤酒醋中总酯的测定( 以乙酸乙酯计g r l ) 6 3 】 吸取酒样5 0 o m l 于2 5 0 m l 具塞锥形瓶中，加入酚酞指示液2 滴，以0 1 m o l l 氢氧化钠标准溶液中和( 切勿过量) ，记录消耗氢氧化钠标准溶液的毫升数( 也可作 为总酸含量计算) 。再准确加入o 1m o l l 氢氧化钠标准溶液2 5 0m l ，若酒样总 酯含量高时，可加入5 0 o m l ，摇匀，装上冷凝管，于沸水浴上回流半小时，取下，冷却 至室温，然后，用0 1 m o l l 硫酸标准溶液进行反滴定，使微红色刚好完全消失为其 终点，记录消耗0 1m o l l 硫酸标准溶液的体积。 总酯的含量：鱼兰兰! ：q ：! ! 兰兰2 兰竺：q 塑1 0 0 0 5 0 o c ，氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，m o l l c l ，硫酸标准溶液的摩尔浓度，m o l l v ，测定时，消耗0 1m o u l 硫酸标准溶液的体积，m l 第3 章啤酒醋混菌发酵规律的研究 o 0 8 8 ，乙酸乙酯的毫克当量( 克) ( 5 ) 酒精转酸率计算删 酒精转酸率= 西雾篓翳誉善鲁慧鐾掌嘉毒辈喜薯惹翼案 面。 3 2 6 工艺流程 预处理的废啤酒h 香味物质发酵h 醋酸发酵h 澄清过滤i - - 4 澄清啤酒醋 接种产香酵母ll 接种醋酸 3 2 7 操作要点 ( 1 ) 废啤酒的煮沸：经压虑的混浊的废啤酒，于煮沸锅内煮沸3 0 m i n ，煮沸开 始2 0 后加入澄清剂一卡拉胶。 ( 2 ) 产香酵母菌培养：1 0 。b x 麦芽汁2 0 0 m l ，接入斜面菌种，2 8 。c - 3 0 0 。c 摇床培养2 4 h ，接种。 ( 3 ) 醋酸菌培养：将1 5 0 m l 液体葡萄糖酵母膏培养基置于5 0 0 m l 三角瓶中， 高压杀菌1 5 m i n ，冷却后每瓶加入3 5 m l 无水乙醇，接入斜面培养菌种，3 0 摇 床培养，每1 2 h 用氢氧化钠滴定，当酸度升至1 8 2 0 时接种。 ( 4 ) 醋酸发酵：取1 5 0 m l 煮沸、过滤得到的预处理废啤酒置于5 0 0 m l 的三角 瓶中，8 层纱布封口，接入醋酸菌培养液，摇床发酵，每1 2 h 测一次酸度，至酸 度不再上升时，发酵结束，离心除菌体后，测酸度、酒精度。 3 3 结果与分析 3 3 1 醋酸发酵培养基理化指标 将废啤酒按上述技术要点进行处理，煮沸、添加澄清剂处理后，经过滤得澄 清啤酒液，测定其酒精度、可凝固氮，氨基氮含量，结果如表3 1 。 表3 1 废啤酒煮沸后的总理化指标 t a b3 1 p h y s i c sa n dc h e m i s t r yi n d e xo f b o i l e db e e r 3 3 2 啤酒醋发酵菌株的选择 分别使a s l 4 1 ，沪酿1 0 1 醋酸菌，l b 2 0 0 1 与产香酵母以3 ：1 的比例混合 后进行醋酸发酵实验。发酵条件为：5 0 0 m l 三角瓶，装液量1 5 0 m l ，温度3 0 ， 转速1 8 0 r m i n ，每组作两个重复，每1 2 h 测一次总酸，至酸度上升缓慢终止发酵， 3 0 山东轻工业学院硕上学位论文 a 4 善3 o 32 越 鲻1 t a b3 2 a c i d i t yc h a n g e sa n de s t e rc h a n g e so fd i f f e r e n ts t r a i nd u r i n ga c i d i f i c a t i o n 3 l 5 5 5 4 5 3 5 2 5 1 第3 章啤酒醋混菌发酵规律的研究 表3 3 不同菌种产酯量的变化 t a b 3 3t h ee s t e rc h a n g e so fd i f f e r e n ts t r a i n 由表3 2 和图3 1 看出，在1 2 h 内酸度变化较平缓，主要原因是此时期处于菌 体生长期，菌体密度小，同时存在底物抑制效应；1 2 h 后产酸速率逐渐增加，产 酸高峰在2 4 小时至7 2 小时内，不同的菌株产酸情况有所不同，但呈相同的变化 规律。从表3 2 中可看出，3 种菌种组合的产酸速度在0 0 4 , - - - 0 0 5g 1 0 0 m l h 之 间，a s l 4 1 与产香酵母的组合产酸最快，其次是沪酿1 0 1 ，产酸最慢的为l b 2 0 0 1 。 酒精转酸率在6 3 一7 4 范围内，由高到低依次是：a s l 4 1 ，沪酿1 0 1 ，l b 2 0 0 1 。 由表3 3 看出，三种菌种组合中l b 2 0 0 1 与产香酵母的组合发酵的啤酒醋含 不挥发酸最多，0 7 6 5 9 l ，其次是a s l 4 1 ，0 7 3 7 9 l ，最少的为沪酿1 0 1 ，0 6 5 3 9 l ； 三种菌种组合的产酯量稍有差别，但相差不多，产酯高峰期在发酵1 2 h 一7 2 h 之间， 在7 2 h 后产酯速度较慢。可能原因是在醋酸发酵初期酸度较低，适合酵母的生长 并产生代谢产物，在7 2 h 后，酸度均超过3 5 ，这种环境不适于产香酵母的生长 和产生代谢产物。 由以上分析得知，a s l 4 1 与产香酵母组合产酸速率最大，酒精转化率最高， 产酯量和不挥发酸虽然较少，但与其它两种菌种组合相比相差甚微，不会影响啤 酒醋的风味，所以选择a s l 4 1 与产香酵母组合。 3 3 3 菌种混合比例对发酵的影响 为了考察醋酸菌与产香酵母不同菌种量配比发酵对啤酒风味醋成分品质的影 响，进行了醋酸菌a s l 4 1 ：产香酵母为4 ：0 ，4 ：l ，4 ：2 ，4 ：3 ，4 ：4 的不同 菌种量配比的发酵实验。发酵条件为：三角瓶装液量：1 5 0 5 0 0 m l ，发酵温度3 0 ，转速1 8 0 r m i n ，每组作两个重复，取平均值，每1 2 h 测一次总酸，至酸度上 升缓慢终止发酵，计算不同菌株的产酸速率与酒精转酸率，发酵结束测产酯量， 结果如表3 4 ，表3 5 所示，绘制三种菌种组合产酸变化曲线如图3 2 。 表3 4 不同菌种配产酯量的变化 t a b 3 4t h ee s t e rc h a n g e so fd i f f e r e n tp r o p o r t i o n 3 2 山东轻t 业学院硕十学位论文 表3 5a s l 4 1 与产香酵母不同配比对啤酒风味醋品质的影响 t a b 3 5e f f e c to f d i f f e r e n tp r o p o r t i o no nt h eq u a l i t yo f b e e rv i n e g a r 5 4 5 4 3 5 名 弋 i ) 3 2 5 越。 甾 厶 1 5 1 o 5 0 o1 22 4 3 6 4 8 6 0 7 2 8 4 9 61 0 81 2 01 3 21 4 4 时间( h ) 图3 2a s l 4 1 与产香酵母不同配比对产酸的影响 f i 9 3 2 t h ee f f e c to f d i f f e r e n tp r o p o r t i o no na c i d i t a t i o n 3 3 第3 章啤酒醋混菌发酵规律的研究 由表3 5 和图3 2 可以看出，菌种混合比例不同，其产酸速度与酒精转酸率也 不同。a s l 4 1 ：产香酵母为4 ：0 时产酸速率和酒精转化率最高，菌种配比为4 ：4 时，产酸速率和酒精转化率最低，其它由高到低依次是：4 ：1 ，4 ：2 ，4 ：3 ， 可见，随着菌种中产香酵母比例的升高，产酸速率和酒精转化率逐渐下降。其原 因为菌种组合中产香酵母不产酸，仅a s l 4 1 产酸，所以产香酵母比例越小，a s l 4 1 比例越高，产酸越快；产酸速率快，可以缩短发酵周期，减少发酵过程的酒精和 醋酸的损失，从而提高了酒精的转化率。 由表3 4 可知，随着产香酵母比例的增大，产酯量逐渐增加，a s l 4 1 ：产香 酵母为4 ：4 时，产酯量最高，为1 0 8 1 9 l ，除对照组外，菌种配比为4 ：1 时产 酯量最少，为0 6 3 7g l ；另外，菌种比例小于4 ：2 时，产香酵母比例越大，产 酯就越多，但是当产香酵母比例高于4 ：2 时，其产酯量增加缓慢，且产酸量下降， 酒精转酸率下降，根据试验和实际情况，确定菌种比例为a s l 4 l ：产香酵母等于 4 ：2 。 3 3 4 接种量对啤酒醋发酵的影响 分别将1 5 0 m l 酒精度5 5 0 9 1 0 0 m l 的废啤酒液装入5 0 0 三角瓶中，按a s l 4 1 和产香酵母总量占5 ，1 0 ，1 5 的比例接种，发酵条件为，3 0 、转速1 8 0 r m i n 下摇床发酵。每1 2 h 测定一次总酸，每组试验作两个平行试验，记录并计算酸度 变化平均值、产酸速度和酒精转速率，结果如表3 6 ，表3 7 。 表3 6 不同接种量对产酯量的变化 t a b 3 6t h ee f f e c to fd i f f e r e n ti n o c u l u mo ne s t e r 由表3 7 可以看出，当接种量为1 5 时，产酸速率与酒精转酸率最大，其次 是1 0 ，最小的是5 ，随接种量的增加，产酸速率和转酸率有增加的趋势，5 接种量产酸速率偏低，说明接种量明显影响发酵周期，接种量越小，发酵周期越 长。酒精转酸率与接种量有密切的联系，接种量越大，酒精转酸率越高，接种量 为1 5 时，转酸率最高，为6 3 4 。 由表3 6 可以看出，当接种量为1 5 时，产酯量较高，其次是1 0 ，最小的 是5 ，随接种量的增加，产酯量增加。由于产香酵母的香味物质发酵主要在发 酵前期酸度较低时进行，较高的接种量有利于产香酵母的迅速增殖和代谢，从而 产酯量较高。 3 4 m 东轻in 学m i 学论 表37 小h 接种蛄醋酸发酵酸度变化 t a b3 7 a c i d i i yc h a n g e i na c i d i f i c a t i o n w i t hd i f f e r e n t i n o c u l u m 注：窄一表示术驯定 3 35 酒精度对啤酒醋发酵的影响 分别调整废啤酒液酒精度为45 、55 6 5 75 ，咀a s l4 1 为试验菌 株，在2 5 0 m l = 角瓶分别装入8 0 m l 酒液，接种量1 0 ，拒3 0 c ，1 8 0 r m i n 的 声 一5 5 0 65 0 7 0 0i22 43 6 蚰6 07 2 8 4 9 61 0 8 1 2 0 1 3 2 1 4 4 时间( h ) 幽3 3 酒精禽晕对醋酸发酵产酸的影响曲线 f i 9 33a c i d i f i c a t i o n o f d i f f e r e n t n i e n t o f a l c o h o l 一 一1ooh宕)世避 第3 章啤酒醋混菌发酵规律的研究 条件下摇床发酵，每组作两个重复，每1 2 h 测一次酸度并计算平均值、酒精转酸 率，结果如表3 8 和图3 3 所示。 表3 8 不同酒精含量醋酸发酵的酸度变化 t a b3 8 a c i d i t yc h a n g ei na c i d i f i c a t i o no fd i f f e r e n ta l c o h o lc o n t e n t 注：空白表示未测定 由表3 - 8 和图3 - 3 可以看出酒精度不同，其产酸速度与酒精转酸率也不同。酒 精含量为5 5 时，酒精转酸率和产酸速度最高，当酒精含量在5 5 以上时产酸 速度和酒精转酸率有下降的趋势。菌株在2 4 h 内酸量变化不大，增长缓慢，与初 始高酒精对菌的抑制作用有关；酒精度为4 5 时，产酸高峰在2 4 至7 2 小时内， 酒精度5 5 ，6 5 的产酸高峰在4 8 至8 4 小时内，此时发酵液酒精度在2 5 4 范围内，以后醋酸发酵趋于平缓，这与发酵后期的高酸度对醋酸菌抑制有关；随 酒精降低，酸度升高醋酸发酵强度减弱，因而醋酸发酵存在产酸高峰的最适酒精 含量范围，这与两步法分批培养生产高酸度食醋结论一致( 郭养浩，1 9 9 2 ； h i g a s h i d e ，t19 9 4 ) 。 3 3 6 发酵温度对啤酒醋发酵的影响 分别将8 0 m l 预处理的废啤酒置于2 5 0 m l 锥形瓶中，灭菌后，先后接种产香 3 6 山东轻工业学院硕上学位论文 酵母和a s l 4 1 分别于2 8 。c 、3 0 。c 、3 2 。c 振荡培养箱培养。其它条件为：初始酒 精含量为5 5 ，接种量为1 0 ，转速1 8 0 r m i n ，a s l 4 1 ：产香酵母为2 ：1 。每 1 2 h 测一次酸度并计算记录平均值，发酵结束测产酯量，以产酸速率和最终产酯 量为实验指标，研究不同发酵温度对啤酒醋酸发酵的影响。结果如表3 9 所示。 表3 9 发酵温度对产酯量的影响 t a b 3 9t h ee f f e c to fd i f f e r e n tf e r m e n t i o nt e m p e r a t u r eo ne s t e r 表3 1 0 发酵温度对啤酒醋酸度的影响 t a b 3 1 0e f f e c to f d i f f e r e n tt e m p e r a t u r eo nb e e rv i n e g a r 由表3 1 0 可知，醋酸发酵温度为3 0 * ( 2 时，平均产酸速度最快，其次是3 2 。c ， 3 7 第3 章啤酒醋混菌发酵规律的研究 产酸速度最慢的为2 8 ，其产酸速度分别为0 0 4 6 5g 1 0 0 m l h ，0 0 4 5 3 g 1 0 0 m l h ，0 0 4 4 7g 1 0 0 m l h ，即3 0 为醋酸发酵的最佳温度；当发酵温度 为3 2 。c 时，发酵6 0 h 前产酸速度较快，之后产酸速度减慢，其原因可能是温度较 高，菌种易老化。由表3 9 可知，在2 8 时产酯量最高，其次是3 0 ，产酸速度 最慢的为3 2 。c ，产酯量分别为0 9 4 1 9 l ，0 8 1 0 9 l ，0 7 3 6 9 l 。在醋酸发酵过程 中，产酸速率及产酯量与温度的关系不一致，因此，确定最佳温度，需考虑试验 情况和实际生产要求。 3 3 7 转速对啤酒醋发酵的影响 分别将8 0 m l 预处理的废啤酒置于2 5 0 m l 锥形瓶中，灭菌后，先后接种产香 酵母和a s l 4 1 分别于1 5 0 r m i n 、1 8 0 r m i n 、2 1 0 r m i n 振荡培养箱培养。其它条件 为：初始酒精含量为5 5 ，接种量为1 0 ，发酵温度为3 0 ，a s l 4 1 ：产香酵 母为2 ：l 。每1 2