（发酵工程专业论文）发酵法生产谷氨酰胺的研究.pdf

浙江工业火学硕士学位论文 目录 中文摘要一i a b s t r a c l ： 第一章文献综述1 第一节谷氨酰胺的生理作用及用途1 1 谷氨酰胺的化学结构和生物合成1 2 谷氨酰胺的代谢功能- 1 3 g l n 的营养生理功能3 3 1 作为一些生物活性物质合成的前体物4 3 2 调节酸碱平衡4 3 3 维持或修复肠道结构和功能的完整性4 3 4 维持正常的免疫功能5 4 g l n 在断奶仔猪营养中的重要作用5 第二节l 谷氨酰胺的生产方法一_ “7 1 合成法7 2 发酵法一8 2 1 用谷氨酸产生菌野生菌株生产g i n 8 2 2 酶法生产g i n ，一9 2 3 用谷氨酸产生菌的变异株生产g i n 9 第三节l - 谷氨酰胺提取工艺1 0 1 阴阳双柱离子交换法1 0 2 单根阴离子交换法1 0 3 冰析法j 1 l 4 钠滤膜分离法：1 1 第四节前景展望1 3 第二章谷氨酰胺的发酵工艺研究1 4 第一节引言1 4 浙江工业大学硕士学位论文 第二节材料与方法1 8 1 材料与仪器1 8 2 培养基及其成分1 9 3 培养方法1 9 4 分析方法2 0 4 1 纸层析法”2 0 4 2 高效液相色谱法一2 l 4 3p h 值的测定2 3 第三节结果与讨论2 4 1 氮源种类及其浓度对谷氨酰胺发酵控制的影响2 4 2 尿素与n h 4 c i 的协同作用对谷氨酰胺发酵控制的影响2 5 3 初始p h 值对谷氨酰胺发酵的影响2 5 4 不同的碳酸钙浓度对谷氨酰胺发酵的影响2 6 5 玉米浆对谷氨酰胺发酵的影响2 6 6 金属离子对谷氨酰胺发酵的影响2 7 7 摇瓶装量对谷氨酰胺发酵的影响2 8 8 接种量对谷氨酰胺发酵的影响2 8 9 摇床转速对谷氨酰胺发酵的影响2 9 1 0 正交优化实验：2 9 1 1 验证实验31 第四节小结3 2 第三章谷氨酰胺的中试发酵工艺研究3 3 第一节3 l 全自动发酵罐实验3 3 1 温度控制对发酵代谢的影响。3 3 2 p h 对发酵代谢的影响3 4 3 溶氧控制对发酵代谢的影响3 5 第二节2 0 l 液泵型发酵罐实验3 6 第三节小结3 8 第四章谷氨酰胺的分离纯化工艺研究3 9 第一节谷氨酰胺的分离纯化的理论基础3 9 浙江工业大学硕：b 学位论文 1 谷氨酰胺的基本理化性质3 9 2 谷氨酸的基本理化性质4 0 3 离子交换法分离氨基酸的理论4 0 第二节材料和方法4 2 1 材料和仪器4 2 2 分离方法4 3 3 分析方法_ 4 3 4 预处理方法4 3 第二节谷氨酰胺的分离纯化工艺研究4 6 1 基本的分离工艺路线4 6 2 粗晶溶解液的分离研究4 6 2 1 树脂转化参数的测定4 7 2 2 树脂静态容量测定一4 7 2 3 纯g l u 物系下树脂动态交换容量的测定一4 8 2 4g l u ，g i n 混合体系下的树脂静态交换容量的测定5 0 2 5d 3 3 0 对g l u ，g i n 体系下全动态交换容量的测定5 芝 2 6 离子交换柱的吸附曲线5 3 2 7 提取收率一5 5 第三节小结5 7 参考文献5 8 致 射6 l 研究生期间发表论文6 2 浙江工业大学硕士论文 发酵法生产谷氨酰胺的研究 摘要 该论文研究内容包括：1 ) 对谷氨酸棒杆菌的变异菌种s h _ 7 7 发 酵生产谷氨酰胺的生产工艺条件进行优化实验；2 ) 在小试的基础上 进行了中试研究；3 ) 对谷氨酰胺的提取分离纯化作了系统研究。 在小试实验中，主要实验了金属离子、碳酸钙的含量、p h 等因 素对谷氨酰胺发酵的影响。最后采用正交设计实验法对三种影响生产 谷氨酰胺影响较大的培养基成分浓度( 氯化铵、葡萄糖、玉米浆) 进 行了优化。最佳发酵培养基配方如下( ) ：葡萄糖1 6 ，氯化铵4 ， 玉米浆o 5 ，磷酸氢二钾o 0 5 ，磷酸二氢钾0 0 5 ，硫酸亚铁0 5 m g ， 硫酸锰2 5 m g ，硫酸锌0 5 m g ，硫酸镁0 0 5 ，尿素1 4 ( 分消) ，发 酵工艺条件为：发酵时间7 2h ；初始p h 值7 o ；温度为3 5 c ；摇床 转速为3 5 0 r p m 。 在中试实验中，研究了温度、p h 及溶氧对谷氨酰胺发酵的影响。 在2 0 l 液泵型发酵罐中的发酵最佳工艺条件为：控制温度在3 2 3 8 ，p h7 0 - 6 2 ，搅拌速度为5 0 0r p m 。在此条件下谷氨酰胺的平均 产量达到了5 2 9 l 。 论文对从发酵母液中提取分离谷氨酰胺作了系统研究，探索了离 子交换法分离发酵液中谷氨酰胺和谷氨酸的可行性。对四种弱碱性树 脂的吸附性能进行研究，并对不同p h 值下树脂的交换容量进行测定。 浙江工业大学硕士论文 最后选用了d 3 3 0 树脂，经过工艺的改进，使谷氨酰胺的总收率达到 6 0 以上，具有良好的工业应用前景。 关键词：谷氨酰胺，发酵，工艺条件，优化，离子交换 浙江工业大学硕士论文 - _ _ _ - - - - 一一 t h es t u d yo nf e r m e n t t a i v e c o n d i t i o n so f p r o d u c i n gg l u t a m i n e a b s t a c t t h er e s e a r c hw o r ki nt h i s s t u d yi n c l u d e d ：1 ) o p t i m i z i n gt h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fg l u t a m i n e p r o d u c t i o nb ym u t a n ts t r a i ns h - 7 7 ， 2 ) s t u d i e dt h ec o n t r o lc o n d i t i o n si na2 0 lf e r m e n t i o nj a r , 3 ) s e a r c h e dt h e r e c o v e r yo fg l u t a m i n ef r o mf e r m e n t a t i o nb r o t h f i r s tt h er e s e a r c hs t u d i e dt h ee f f e c to f m a n yf a c t o r so nt h eg l u t a m i n e p r o d u c t i o ns u c ha sm e t a li o n ，t h ec o n t e n to fc a c 0 3 ，p h t h r e em a i n f a c t o r si n c l u d i n gt h ec o n c e n t r a t i o no ft h en h 4 c i ，g l u c o s e ，c o r n s t e e p l i q u o r i nt h em e d i u mw a s o p t i m i z e dt h r o u g ho r t h o g o n a lm e t h o d o p t i m a lm e d i u mw a sc o m p o s e do f ( ) g l u c o s e16 ，n i - 1 4 c 1 4 ，c o r n s t e e p l i q u o r0 5 ，k 2 h p 0 40 0 5 ，k h 2 p 0 40 0 5 ，f e s 0 40 5 m g ，m n s 0 42 5 m g ， z n s 0 40 5 m g ，m g s 0 40 0 5 ，u r e a1 4 o p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s w e r ef e r m e n t a t i o nt i m e7 2h o u r s ，m e d i u mo r i g i n a lp h 7 0 ，t e m p e r a t u r e 3 5 c ，t h er o t a r ys p e e do ft h es h a k i n g b e dw a s3 50 r m i n i na2 0 lf e r m e n t i o n j a r , t e m p e r a t u r e ，p na n dt h er e v o l u t i o no fw h i s k w a ss t u d i e d t h e s t u d yi n d i c a t e dt h a tt h eb e s tc o n t r o lc o n d i t i o nw a s 浙江工业大学硕士论文 一一 t e m p e r a t u r e3 2 0 c 一3 8 0 c ，p h7 0 6 2 ，r e v o l u t i o no f w h i s k5 0 0r p m t h e a v e r a g eo u t p u t o ft h eg l u t a m i n e a c h i e v e d5 2 9 l u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s a tl a s t ，t h er e c o v e r yo fg l u t a m i n ef r o mf e r m e n t a t i o nb r o t hw a s s t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y t h ef e a s i b i l i t yo ft h ei o n e x c h a n g em e t h o dw a s a l s os t u d i e d f o u rr e s i n sw e r ec h o s e na n dt h e i re x c h a n g e c a p a b i l i t ya t d i f f e r e n tp hw a ss t u d i e d t h e i o n e x c h a n gr e s i nd 3 3 0w a ss e l e c t e d t h r o u g he x p e r i m e n t s i ns e p a r a t i n gg l u t a m i n ef r o mg l u t a m i ca c i d ，w eg o t t h eb e s tc o n d i t i o n st h o u g ht h ee x p e r i m e n t s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e d 3 3 0r e s i nh a dt h eb e s ts e p a r a t a t i o ne f f e c ta tt h ep h 3 4 f i n a l l yw eg o ta g l u t a m i n ey i e l dr a t eo fa b o v e6 0 t h i st e c h n o l o g yh a ds u c ha d v a n t a g e s a sg o o ds e p a r a t i o ne f f e c t ，l a r g ec a p a c i t ya n d e a s yc o n t r 0 1 i tw i l lh a v ea b r i g h tf u t u r ei ni n d u s t r y k e yw o r d s ：g l u t a m i n e ，f e r m e n t a t i o n ，t e c h n o l o g i c a l c o n d i t i o n s ， o p t i m i z a t i o n ，i o ne x c h a n g e 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一节谷氨酰胺的生理作用及用途 n h 2 1 f i 誉2 二9 2 薹= - c 。h n h 2 h l 一谷氨酰胺的分子量1 4 6 1 5 ，分解温度1 8 5 ，等电点5 6 5 ，在生理p h 条 件下，属中性氨基酸。它含有2 个氨基即o 氨基和一个易水解的末端酰胺基，是 各器官间氮流动的重要载体。同时，酰氨基还是体内嘧啶和嘌呤核苷酸、核酸以 及氨基糖生物合成的必须原料之一。 合成g i n 的直接前体是谷氨酸( g l u ) ，由g i n 合成酶催化形成。g l n 能通过转 氨基作用由a 一酮戊二酸形成，支链氨基酸是重要的氨基载体。在肌肉中，g l n 脱 氢酶和a m p 脱氨酶反应对g l n 合成酶催化反应所需的氨起着重要作用。虽然许多 组织能合成g i n ，但只有肺、脑、骨骼肌，可能还包括脂肪组织能释放大量g l n 到 血液流中。由于骨骼肌中g l n 的浓度高，释放到血液中的量大，所以它被认为是体 内重要的c , i n 生成场所i l 】。 2 谷氨酰胺的代谢功能 2 1 肠道 肠道中g l n 来源于机体内源代谢和外源食物，肠道是利用g l n 的主要器官， 浙江工业大学硕士学位论文 小肠上皮细胞绒毛摄取绝大多数g l n 。g l n 在肠黏膜上皮细胞内的代谢主要是靠 位于线粒体内膜上的磷依赖性g l n 酶的分解作用，此酶受饮食、糖皮质激素和胰 高血糖素调节【2 】。肠细胞摄取的g l n ，在位于线粒体内膜上的磷依赖性g l n 酶的分 解作用下，经三羧酸循环转化为酮戊二酸，氧化生成a t p 。虽然肠道也摄取大量葡 萄糖。但葡萄糖并非肠道的主要能源，g i n 才是肠道中的主要能源。 g l n 对小肠黏膜具有营养保护作用。长期使用全胃肠外营养( t p n ) ，可引起肠 黏膜萎缩、通透性升高和肠道免疫功能障碍，肠道细菌易位，甚至导致肠源性败血 症1 3 1 。动物试验发现，采用补充g l n 的t p n 可增加空肠黏膜重量，增加d n a 含量， 减少小肠黏膜绒毛萎缩1 4 j 。含g l n 的肠外营养液有保护小肠免疫组织的能力，并 为产生s i g a 的浆细胞提供能源和前体物质。传统的氨基酸营养液不含g i n ，长期 使用会引起肠黏膜萎缩、绒毛高度降低、小肠壁变薄，如含有g l n 时，可增加小肠 和结肠黏膜的细胞形成、增强肠细胞机械屏障功能、防止肠道细菌和毒素的侵入 1 5 l 。另外，k i l m b e r g 掣6 】分别在大鼠腹部辐射前和辐射后经口给予g l n ，与对照组 相比，无论是辐射前还是辐射后给予g l n ，都可增加小肠绒毛高度和数量，改善黏 膜形态，降低肠出血、肠穿孔等与辐射有关的并发症的发生，提高生存率( 1 0 0 对 4 5 ) 。 ： 2 2 骨骼肌 骨骼肌是g l n 合成和储存的主要部位。活体和离体试验都已证明骨骼肌代谢 过程中释放大量的g l n ，因此，其在骨骼肌中的代谢主要为合成代谢。当动物处于 手术、受伤、疾病等应激状态时，对g l n 的需要急剧增加，此时，骨骼肌细胞内储 存的g l n 将耗竭5 0 以上，血浆中g l n 的水平也比正常值低2 0 9 6 3 0 9 6 ，说明其他组 织摄取的g l n 增加【7 】；同时为满足需要，骨骼肌中合成的g i n 增加，其原因可能是 在应激状态下肾上腺类固醇产生和释放增加，进而刺激蛋白质的降解和g l n 的产 生。 2 3 肝 肝既含谷氨酰胺酶又含谷氨酰胺合成酶，两者的协调作用对维持血液中g l n 的浓度平衡具有重要作用。肝脏既是g l n 的消耗器官( 正常情况下) ，又是g l n 的 2 浙江工业大学硕士学位论文 生成器官( 禁食、受伤等应激状态下) 。在完整的肝腺泡中仅门脉周围的肝细胞发 现有尿素合成和g l n 酶，而g l n 合成酶位于静脉周围的细胞。h a u s s i n g e r 指出， 门脉周围的低亲和力、高的尿素合成能力系统和静脉周围高亲和力的氨脱毒系统， 对维持血液中g l n 平衡具有重要作用i s 。另外，在肝细胞中血浆膜的转运对维持 血液中g i n 平衡也具有重要作用【9 1 。酸中毒时，肝脏g l n 合成酶活性增加，成为和 骨骼肌一样的g i n 释放器官，并且门脉周围尿素合成降低，以节省碳酸氢盐，而向 静脉周围肝细胞释放的氨增加，即g i n 合成增加，以便向肾脏提供g l n 来缓冲酸的 负荷。 2 4 肾 肾中g i n 的代谢对消除氨对机体的毒副影响和维持体内酸碱平衡具有重要 作用。氨对生物体是有毒物质，肾通过合成g l n 而解除氨毒。当体内h + 浓度升 高时，肾脏可通过g l n 的产物氨与质子结合形成n 吖来消除多余的旷i l o l 。酸中 毒时，肠道中g l n 的代谢并没有发生明显的变化，此时血液中的g l n 及外源g l n 主要为肾脏摄取和利用，这是肾脏排泄尿氨的增加所需要的，也是维持酸碱平衡 的主要途径。g l n 在保护机体防止代谢性酸中毒中具有重要作用。 ： 2 5 脑 脑中g l n 的生成是脑内解氨毒的主要途径。脑组织中富含g i n 合成酶且活性 高，可通过g i n 合成反应来消除高浓度的氨，以维持脑组织中低浓度的氨【1 1 1 。此反 应是在线粒体中，氨通过谷氨酰胺合成酶以及m 矿或m n 2 + 的催化和a t p 供能条 件下与谷氨酸盐缩合成g l n 而完成的。 3 g i n 的营养生理功能 g i n 作为一种氨基酸，除供蛋白质和肽合成外，还具有许多重要的生理功能。 它可调节机体的酸碱平衡，作为嘧啶和嘌呤核苷酸以及氨基糖合成的前体物，为 快速增殖细胞优先选择的呼吸燃料，作为组织间氮的载体等。“多数氨基酸具有多 种功能，但g l n 的功能明显是最丰富的 。 3 浙江t 业大学硕士学位论文 3 1 作为一些生物活性物质合成的前体物 3 1 1 核苷酸 核苷酸是一类在代谢上极为重要的物质，同位素标记化合物实验证明，生物 体内能利用g l n 以及其它一些物质作为前体物合成嘌呤环和嘧啶环。研究发现， 在鸟嘌呤从头合成中由次黄嘌呤核苷酸合成鸟嘌呤核苷酸时，动物细胞则必须以 g l n 的酰氨基作为氨基供体。同样，在嘧啶核苷酸的合成过程中，用于形成嘧啶的 氨甲酰磷酸需由g l n 作氨基供体。同时，在尿嘧啶核苷酸转变为胞嘧啶核苷酸的 过程中动物组织也必需由g l n 的酰氨基作为氨基供体。因此，g l n 在生物体内核 苷酸合成过程中起着至关重要的作用。若g l n 缺乏或耗竭，则核苷酸生物合成将 受到抑制，进而扰乱整个代谢。 3 1 2 氨基糖 机体的结构多糖如糖蛋白、糖脂等含的杂多糖中除葡萄糖、半乳糖、甘露糖 外，还有n 一乙酰葡萄糖胺、n 一乙酰半乳糖胺等，这些糖胺的合成都需要g l n 提供 氨基。 ： 3 2 调节酸碱平衡 机体代谢过程中不断产生的固定酸如磷酸、硫酸、乳酸等，被血液中的 n a - i c 0 3 中和后，随呼吸运动以c 0 2 形式排出体外。被中和掉的n a h c 0 3 若不及 时恢复，则可能改变血液p h 值，影响机体内环境的相对稳定。g l n 在保护机体防 止代谢性酸中毒中具重要作用。肾小管上皮分泌g l n 水解产生的氨进入管腔结合 其分泌的矿形成n h 4 + ，n h 4 + 从管腔中换回n 矿，并进一步与管腔中的强酸盐的 负离子( 如c i ) 结合成酸性铵盐q i h 4 c i ) 随尿排出，这一过程是g l n 调节酸碱平衡 的主要反应。 3 3 维持或修复肠道结构和功能的完整性 研究证明，小肠上皮具有很高的g l n 摄取率和利用率，这与其粘膜细胞的高 周转代谢相一致。g l n 既能作为肠粘膜细胞能量代谢的底物，又能为其快速周转 的蛋白质和核酸提供原料。 4 浙江工业大学硕士学位论文 当机体处于手术或受伤后的分解代谢状态时，肠对g l n 的消耗增加，此时内 源合成的g l n 不能满足需要，若外源补充，则有助于肠结构的维持或修复。刘民航 和高兰兴( 1 9 9 5 ) 在2 0 b s a l l l 0 烧伤的大鼠实验中观察到，烧伤1 4 d 后，大鼠门 静脉、后腔静脉和腹主动脉血浆g l n 含量均明显降低，小肠粘膜的蛋白质、d n a 、 a t p 含量及乳糖酶活性均明显低于正常，表明烧伤应激引起机体g l n 利用增强， 而机体g i n 供应不能满足需要，导致肠道能量代谢障碍，由于能量缺乏和底物的 不足，影响细胞的生物合成：当经口补充2 或5 g i n 后，大鼠血浆g l n 水平、小 肠粘膜蛋白质、d n a 、a t p 含量以及乳糖酶活性均明显高于烧伤对照组和补充 甘氨酸组，从而表明：经口补充的g l n 可为肠道的能量和物质代谢直接提供丰富 的原料，改善机体代谢状况，有助于促进肠道继发生损伤的修复。 3 4 维持正常的免疫功能 g l n 对维持免疫细胞如淋巴细胞、m o 和胸腺细胞等的正常功能具重要作用。 研究发现，淋巴细胞中富含高活性的g l n 酶，且受到免疫刺激时，酶的活性增加。 g l n 是淋巴细胞增殖所必需的，培养基中缺乏g l n 将抑制淋巴细胞对丝裂原刺激 的应答能力。在体外培养的大鼠肠淋巴细胞中观察到缺乏g l n 的培养基中3 h 胸 腺嘧啶整合进入d n a 的速率很低，当向培养基添加l u m g l n 可使3 h 胸腺嘧啶整 合进入的速率增加4 倍，当g l n 达0 3 m m 时，速率达最大，同时，丝裂原c o n a 诱 导淋巴细胞对g l n 的利用增加约5 1 ，这表明淋巴细胞的分化和增殖需大量的 g i n 参与。杨俊涛等( 1 9 9 9 ) 的研究也发现，给创伤大鼠补充外源性g l n ，能明显减 轻免疫受抑程度和缩短免疫受抑的持续时间，也就是说伤后的大鼠给予外源性 g l n 能明显改善细胞免疫功能。 g l n 在免疫细胞中起着双重的代谢作用：氧化供能以及为细胞增殖提供c 、n 原料。g l n 也是小鼠m o 活动的重要能量来源。同时，利用g l n 合成的供分泌蛋 白转运时使用的m r n a 将协助m 中发挥其分解细菌的功能。 4 g l n 在断奶仔猪营养中的重要作用 g l n 是母猪乳中最丰富的氨基酸。w u 等( 1 9 9 4 ) 研究发现，在2 9 d 的泌乳期中， 母猪乳中的游离g l n 的浓度逐渐加。在泌乳期的第2 2 d 和第2 9 d 乳中g l n 分别达 5 浙江工业大学硕士学位论文 到1 9 m m o l l 脱脂乳和3 4 m m o l l 脱脂乳，占n e a a 总量分别为3 1 和4 3 ，远超 过其它氨基酸浓度。而仔猪早期断奶( 3 周龄) 虽可提高母猪的繁殖力，以及减少 疾病的垂直传播，但经常导致小肠形态和功能的异常，其具体机制还不甚清楚，是 否与断奶后g l n 供给不足有关。许多研究者在这方面做了大量的工作。w u ( 1 9 9 6 ) 在2 1 日龄断奶仔猪的玉米豆饼型日粮中分别添加o 0 2 、0 6 和1 o 的游离 g l n ，结果证明，添加1 0 的g l n 在断奶后第l 周可防止空肠绒毛的萎缩，第2 周 可降低料重比，即提高饲料利用率。p l u s k e ( 1 9 9 6 ) 报道，连续5 d 饲喂羊奶的断奶仔 猪其腺窝深度随g i n 的采食线性降低，上皮细胞g l n 的代谢增加。另外a y o n r i n d e 等用4 g i n 或4 g l y 强化传统的谷物基础断奶仔猪日粮，在断奶后第5 d 屠宰所 有的猪，发现饲喂外源g l n 日粮的猪其血浆g l n 浓度更高，可缓减绒毛萎缩，同时 其结肠和回肠d n a 含量和粘膜蛋白含量增加。上述研究结果暗示，向早期断奶 仔猪日粮中添加合成g l n 可能是维护断奶仔猪肠道正常结构和功能的有效途径 之一，也可得出g l n 可能是早期断奶仔猪的条件性必需氨基酸。 6 浙江工业大学硕士学位论文 第二节l 一谷氨酰胺的生产方法 目前g i n 的国际市场价格约在1 0 0 万元吨左右，生产成本约为谷氨酸的3 4 倍。如果按年产1 0 0 0 t 计算，原料药产值约为1 0 亿元人民币。消化道溃疡和脑 神经功能疾病在我国乃至世界都属多发病。药用氨基酸需求量很大，有巨大的潜 在市场。药用长期以来一直依靠进口，价格昂贵。如果加工成药剂后可创造更大 的经济效益，产品还可大量出口创汇。生产方法主要有合成法和发酵法： l - 合成法 合成法制g i n 主要有以下两种方法：第一种方法是由l - 谷氨酸甲酯经缩合、 加成、成盐、水解、经活性炭脱色、重结晶得成品。另一种方法是采用l - 谷氨 酸合成甲酯后，与水合阱反应得酰阱，再用r a n e y 镍将其还原为g l n 。 1 1l 一谷氨酸甲酯法流程 c h ，0 h h o o c c h ( n h2 ) ( c h2 ) 2 c o o h = = t - = h o o c c h ( n h 2 ) ( c h 2 ) 2 c o o c h3 h 2 s 0 4 c s2 n h l - - n h4 0 0 c c h ( n h c s s n h 4 ) ( c h 2 ) 2 c o o n h 4 | 一 n h ， h o a c h2 n o c ( c h2 ) 2 c h ( n h c s s n h 4 ) c o o n h 4 - 一h2 n o c ( c h 2 ) 2 c h ( n h 2 ) c o o h 1 2g l n 阱法流程 h o o c c h ( n h 2 ) ( c h 2 ) 2 c o 。h 静h o o c c h ( n h 2 ) ( c h 2 ) 2 c o o h 3 骂 c h 2 ) 22攀hoocch(nhhoocch(nh2)(ch c o n h n h h o o c c h h 2 ) ( c h 2 ) 2 c o n h 2二 2 ) 2 2 与。 由合成法的流程图可见各步均使用了浓硫酸作为必需的试剂且需大量二硫 化碳，条件比较苛刻不易控制。而且步骤多收率低。第二种方法虽有所改进，但 仍很复杂，而且要求使用催化剂，对工艺条件提出了新的要求工艺仍很复杂。 合成法使用了大量的化学试剂，在产品中不同程度的会有所残留g l n 作为 7 浙江- t 业大学硕士学位论文 一种口服药，其纯度有较高的要求，使用合成法就限制了产品的质量以及使用范 围。而且采用合成法会对环境造成不良的影响，增加了产品的成本。 2 发酵法 对于g i n 这类药用氨基酸国外产量十分可观：1 9 7 7 年日本用发酵法生产年 产量达1 0 0t ，1 9 7 9 年上升到5 0 0t ，1 9 9 0 年则上升到1 2 0 0t ，并有逐年递增的 趋势。用发酵法生产的发酵浓度日本为6 0 9 l ，韩国为5 0 9 l 。日本味之素公司 g i n 提取总收率为4 0 。我国自2 0 世纪8 0 年代以来也进行了发酵法工艺的研究， 但国内尚无一家企业采用发酵法生产，因此我国科技人员应加速对发酵工艺和菌 种的研究。发酵法主要有以下三种： 2 1 用谷氨酸产生菌野生菌株生产g l n 1 9 6 1 年木下一干等首先发现，在谷氨酸( g l u ) 发酵液中，除了谷氨酸以外， 还有g i n 。1 9 6 3 年，木下祝郎在谷氨酸微球菌发酵液中也发现有g i n 存在：1 9 7 9 年，中西透等人经进一步实验证实，改变发酵条件，可以使谷氨酸产生菌，从发 酵制谷氨酸转向发酵制g i n 1 2 】。 通过改变发酵条件，实现发酵转化的机理是：发酵条件的变更创造了有利于 合成氨酰胺的环境，谷氨酸产生菌内的g h a 合成酶活力增加，而催化分解为谷氨 酸的g l n 酶活力受到抑制，从而g i n 大量积累生成，谷氨酸的生成量减少。另一 方面，由于细胞外环境的影响，g i n 易从细胞中分泌出来，积累在发酵液中。而 谷氨酸渗透性减小，滞留在细胞内，从而使发酵转化得以实现。 影响谷氨酸产生菌使谷氨酸发酵转向g l n 发酵的几个因素【1 3 】： ( 1 ) 供给的n h ；必须超过用来生产谷氨酸的量。中西透等人通过实验证实， 使用硫酸铵时其浓度不能超过6 ，否则谷氨酸的生成会增多：使用氯化铵时其 浓度为4 时为最佳：至于其它铵盐的浓度超过2 时就会阻碍菌体的生长。 ( 2 ) c i 一离子和s 0 4 2 对g i n 发酵的影响。使用s 0 4 2 时副产物明显增多，谷 氨酸的产量和g i n 的产量差不多：而用c l - 时谷氨酸的量仅为g l n 量的1 6 1 1 4 1 。 ( 3 ) 为了提高产量，金属离子特别是m 矿+ ，m n 2 + 和z n 2 + 的供给是必要的。 添加任何一种金属离子都能使g i n 的生成量提高1 0 以上，其中n i 2 + 和c ，的作 8 浙江工业大学硕士学位论文 用更加明显，几乎使生成量提高2 0 以上，金属离子的这种效果有相乘效果。 m 9 2 + 、z n 2 + 、f e 2 + 组合是最佳组合1 5 1 6 1 。 ( 4 ) 发酵的p h 值，发酵全程为微酸性且分成长菌期及产胺期。发酵的p h 值，2 4 h 前维持在7 2 左右，2 4 h 后直到发酵结束控制在6 2 左右为好。 2 2 酶法生产g l n 用n h 3 及谷氨酸作原料，经合成酶催化生成g i n 时，腺三磷( a t p ) 是必需的。 然而，因为a t p 价格昂贵，难以在工业上应用；同时酶反应底物n 吖、副产品二 磷酸腺苷( a d p ) 都明显抑制g l n 的生成，反应终了时仅有微量的生成。因此此法 不具工业意义【1 7 1 。 木村光等人利用微生物发酵产生的化学能使a d p 转换成a t p ，同时控制糖 和无机磷酸的浓度，由氨及谷氨酸来合成g l n 获得成功。果糖1 ，6 二磷酸发酵 产生的化学能通过a d p a t p 反应，能连续被用于从谷氨酸合成g l n 的反应中， 因此不需再大量加入a t p ，同时因为没有副产物a d p 的生成，所以g i n 不受抑 制而能顺利积累。在上述反应条件下，氨对生成g i n 的抑制作用变得不明显。由 于具有上述优点，所以此法有可能用于工业生产。 2 3 用谷氨酸产生菌的变异株生产g l n 由于此方法具有普遍性，同时诱变剂也易得到，因此目前常用此方法获得 高产菌株。 使用发酵法反应条件温和，操作简便，产品原料丰富而且成本低，无公害， 且能完成一些化学合成难以进行的反应，产品的纯度较高，适于作为药物使用。 通过对生产方法的简介及优缺点比较，可以看出发酵法比合成法更有优势， 2 l 世纪是生物工程的时代，随着当代生物技术的发展，基因工程、细胞工程、 酶工程等新技术的引入。微生物转化的发展已经具有了高度的研究价值以及广阔 的实际应用前景。 9 浙江工业大学硕：j ：学位论文 第三节l - 谷氨酰胺提取工艺 由于发酵液中的成分复杂，谷氨酰胺与谷氨酸的性质相似，而且谷氨酰胺容 易转化为谷氨酸，所以目前的分离效率普遍不高。目前国内外分离提取谷氨酰胺 的方法主要有阴阳双柱离子交换法、单根阴离子交换法、冰析法、钠滤法。 1 阴阳双柱离子交换法 目前国内外分离提取谷氨酰胺基本上都采用阴阳双柱离子交换法，只是在树 脂的选择、阴阳离子柱的组合及具体操作方式上有所差别。 其基本工艺流程如图1 1 所示【18 】： 发酵液望丝坠上柱液( p h 3 5 ) 骂- 塑塑竺竺丝型骘洗脱液 真空浓缩g 树脂 - - 水洗0 0 5 m o l l 盐酸洗脱 洗脱液墨竺鎏竺 结晶体( 粗晶) 堕譬兰苎生结晶体( 纯品) 图卜1 阴阳双柱离子交换法1 ：艺流程图 ( b 树脂：强酸性阳离子交换树脂；g 树脂：强碱性阴离子交换树脂) 1 9 9 8 年国内报道，采用双柱法分步洗脱，实验室收率可达5 6 6 【1 9 1 。1 9 9 0 年 日本专利提到实验室中收率在7 0 以上【2 0 】。上述分离工艺由于树脂用量大，酸 碱消耗太多，造成严重的环境污染，另外谷氨酰胺在强碱和强酸环境容易转化成 谷氨酸，导致收率较低。 2 单根阴离子交换法 为解决这些传统双柱离子交换法的根本问题，刘元帅等人提出了采用单根 阴离子交换柱，从发酵液粗晶体的溶解液中提取谷氨酰胺的新工艺【2 。通过减 少操作步骤，以期达到较高的收率和分离效率。 其工艺为先将发酵液超滤，去除菌体、蛋白质和多糖，降低料液的粘度。 然后经过活性炭脱色、减压浓缩、结晶，去除大部分无机盐。再将得到的粗晶体 配成一定浓度的溶解液，其主要组成：谷氨酰胺浓度3 5 9 l ，谷氨酸浓度4 9 l ， s 0 4 2 一浓度1 2 9 l ，c i 一浓度0 8 9 l ，p h 调至4 5 之间。此溶解液通过阴离子 浙江工业大学硕士学位论文 交换柱进行分离，其操作如下： 称取6 0 9 抽干的树脂装柱( 由2 5 x 2 5 x 3 0 0 ) ，上柱液为模拟料液。将p h 值调至4 - - 5 之间，然后以2 b v h 流过树脂，通过部分收集器以6 m l 管收集流出 液。分别检测流出液的p h 值、谷氨酸和谷氨酰胺的浓度。 采用谷氨酰胺发酵液的粗晶溶解液上柱，谷氨酸和谷氨酰胺也得到很好的 分离，谷氨酰胺收率为8 3 ，谷氨酸去除率达9 0 。单柱阴离子交换法能够有 效的克服传统方法树脂用量大，酸碱消耗多的问题，并且可以达到较高的产品收 率和纯度。但该工艺的缺陷是粗晶溶解液中无机阴离子如s o ? 一等对分离结果 有很大的影响。 针对此问题，刘元帅等在后继的研究中提出了电渗析脱盐与单阴离子交换 柱相耦合提取发酵液中谷氨酰胺的分离工艺【2 2 】。 该研究报道中将发酵液p h 调节到谷氨酰胺等电点附近，通过电渗析将其 中的无机盐脱除9 5 左右时，仍然能保证谷氨酰胺收率达到7 6 ，电流效率为 8 5 。根据谷氨酰胺和谷氨酸等电点差异，电渗析脱盐后的料液再通过单根阴离 子树脂交换柱，可以去除其中的谷氨酸等杂质。该工艺大幅度地减少了树脂用量， 有效地解决了谷氨酰胺在强碱和强酸环境中的转化问题，生产成本明显降低，谷 氨酰胺的总提取收率达到6 0 左右。 3 冰析法 竹村【2 3 1 等人对g i n 的提取方法进行了研究，提出了将发酵液或其中间处理 液冷却至0 c 以下，使其析出冰结晶后再加以分离的方法。该方法不受微生物种 类、发酵液纯度及p h 值的影响，而且也不需限定冷却速度、冷却温度及冷却时 的搅拌方式，只需保证冰晶可以析出的温度即可。将发酵液冷却后，冰晶与g i n 晶体同时析出，向其中加入一定量的冷水，由于g i n 晶体的沉降速率较大，位 于下层，而冰晶位于上层，很容易使用离心机加以分离。用该方法获得的晶体与 经典的减压浓缩法获得的晶体相比，着色率显著降低，纯度和收率显著提高。 4 钠滤膜分离法 为解决目前分离工艺收率低、谷氨酰胺转化等问题，李书良等【列对发酵液 浙江工业大学硕士学位论文 中谷氨酰胺的纳滤膜分离进行了系统的研究。 纳滤膜分离是近十年来发展起来的一种新型膜分离技术，被广泛应用于食 品、医药、水处理等领域d e t z 5 1 。纳滤膜表面的分离层由聚电解质构成，其截留 分子量介于超滤膜和反渗透膜之间，约为2 0 0 - , 2 0 0 0 ，并对无机盐有一定的截留 率【2 6 1 。采用纳滤膜进行分离主要利用筛分效应以及离子与荷电膜之间的d o n n a n 效应【2 7 1 。 发酵液经离心除菌后其上清液主要含谷氨酰胺4 ，谷氨酸1 ，残糖3 ， m g s 0 40 0 5 ，l c a ，其最佳组合方案为a i b 3 c i 。 根据以上实验，谷氨酰胺代谢控制发酵的优化工艺条件为： 3 。 3 2 3 。 2 m 州 妣 弘 姗 坦 m m 屹 m m m 耽 抛 娜 伽 3 2 0 3 7 4 4 5 5 5 6 6 6 m 呱 弧 她 珐 2 3 4 5 6 7 8 9 k k b 浙江工业大学硕士学位论文 培养基配方( ) ：葡萄糖 1 6 ，氯化铵4 ， 磷酸氢二钾0 0 5 ， 磷酸 二氢钾0 0 5 ， 硫酸亚铁0 5 m g l o o m l ，硫酸锰2 s m g l o o m l ，硫酸锌 0 0 5 ，硫酸镁o 0 5 ，碳酸钙l ， 玉米浆o 5 ， 尿素1 4 ( 分消) 。 发酵工艺条件为：发酵时间7 2h ，初始p h 值7 0 ，接种量1 0 ，摇床转速 3 5 0 r p m ，转液量2 0 r a l 于5 0 0 m l 三角瓶。 1 1 验证实验 将上述试验的最佳条件，综合进行了3 批次验证试验，考察谷氨酰胺的 产量。其结果如表2 - 9 所示： 表2 - 9 验证试验结果 在摇床阶段，谷氨酰胺的产量的平均产量为4 4 8m g m l 。 3 i 浙江工业大学硕士学位论文 第四节小结 本章实验研究了谷氨酸棒杆菌的诱变菌株s h - 7 7 转向生产谷氨酰胺的最佳 发酵工艺条件，并在对检测发酵液中谷氨酰胺做了大量的尝试，得出以下几 点结论： 1 ) 在谷氨酰胺发酵培养基的组成上主要是添加高浓度的n h | + ，生物素及 各种金属离子，并研究了基本培养基成分氮碳源与添加物对谷氨酰胺发酵的 协同作用。最后得出谷氨酰胺代谢控制发酵的优化培养基配方( ) 为：葡萄糖 1 6 ，氯化铵4 ，磷酸氢二钾o 0 5 ，磷酸二氢钾0 0 5 ，硫酸亚铁0 5 m g l o o m l ， 硫酸锰2 5 m g l o o m l ，硫酸锌o 0 5 ，硫酸镁0 0 5 ，碳酸钙l ，玉米浆0 5 ， 尿素1 4 ( 分消) 。 2 ) 在摇床实验的工艺条件控制上研究了p h 、装液量、接种量、摇床转速对 谷氨酰胺代谢控制发酵的影响，最后得出的最佳条件为：发酵时间7 2h ，初始 p h 值7 o ，接种量1 0 ，摇床转速3 5 0 r p m ，装液量2 0 m