（环境科学专业论文）石化废气脱臭微生物群落结构研究.pdf

后，得出结果表明，生物滤池的优势微生物种类较多且多半条带所代表的微 生物为不可培养菌，与纯培养分离所得到的微生物类群有很大不同。但其中 芽孢杆菌为优势菌，占3 3 3 ，说明在属的水平上s s c p 割胶测序结果与纯 培养菌株鉴定结果相一致。同时生物滤池内还存在根瘤菌，说明填料本身携 带的微生物类群在对废气的去除中也起到一定的作用。 6 、填料生物膜的显微镜和电镜镜检结果显示，填料生物膜随运行时间的延长逐 渐增厚，颜色逐渐加深，线虫和轮虫等原生动物数量较多。电镜照片中杆菌、 球菌、丝状菌等种类繁多，表明随运行时间延长填料表面微生物多样性变得 丰富。 关键词：生物滤池、生物除臭、p c r s s c p 、微生物多样性、电镜 a b s t r a c t n o w a d a y s ，w i t ht h ei m p r o v e m e n to fl i v i n gs t a n d a r d s ，p e o p l eb e c o m em o r e s e n s i t i v et oe n v i r o n m e n t a l p r o b l e m sc a u s e db yo d o r s p e t r o c h e m i c a le x h a u s ta r e t o x i c i t ya n dh a r m f u lt ob o d i e ss i n c ei tc o n t a i n e dav a r i e t yo fc o m p o u n d so fb e n z e n e ， a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，i n o r g a n i ca n do r g a n i cs u l f i d ea n da m m o n i a i tb e c o m e sm o r e a n dm o r ei m p o r t a n tt od e a lw i t ht h e me f f i c i e n t l y w i t hd e e pr e s e a r c hi nb i o - d e o d o r i z a t i o nt e c h n o l o g ya n dr e l a t e da r e a s ，b i o l o g i c a l t r e a t m e n to fo d o r si sa t t r a c t i n ga t t e n t i o nd u et oi t sb e n i g ne c 0 一f r i e n d l i n e s s e n e r g y s a v i n g sa n dl o wo p e r a t i n gc o s t s a tp r e s e n t ，b i o f i l t e ri st h em o s tp o p u l a r , e x t e n s i v e - u s i n gm e t h o di nb i o - d e o d o r i z a t i o nt e c h n o l o g i e s m i c r o o r g a n i s mc a p a b l eo f d e o d o r i z a t i o ni st h ek e yo f b i o d e o d o r i z a t i o ni nb i o f i l t e rs y s t e m m i c r o b i a l c o m m u n i t ys t r u c t u r ew i l lb ei n f l u e n c e db yt h ec h w l g e so ft h ed e v i c eo p e r a t i n g c o n d i t i o n sa n dm i c r o - e n v i r o n m e n t , a n dd e m o n s t r a t et h ed i f f e r e n tm e t a b o l i c c h a r a c t e r i s t i c s t h eg o a lo ft h i sr e s e a r c hi st os t u d yt h eo d o rt r e a t m e n te f f i e n c yo f b i o - d e o d o r i z a t i o nb i o f i l t e ri ns h a n g h a ip e t r o c h e m i c a lc o m p a n ya sw e l la st h e m i c r o o r g a n i s md i v e r s i t ya n ds t r u c t u r eo nt h eb i o f i l mi nb i o f i l t e rb yu s i n g c o n v e n t i o n a lm i c r o b i o l o g i c a lm e t h o d sa n dm o l e c u l a r b i o l o g ym e t h o d sa n ds e m t h e c o n c l u s i o n sw e r ed r a w na sf o l l o w s ： 1 t h er e m o v a lr a t eo ft h eh y d r o g e ns u l f i d ew a sm a i n t a i n e da ta r o u n d9 8 i n b i o f i l t e rd u r i n gw h o l ep r o c e s s a f t e ram o n t ho fa c c l i m a t i o n , t h ea v e r a g er e m o v a l r a t eo fa m m o n i aa n dv o c s ( v o l a t i l eo r g a n i cc o m p o u n d s ) c o u l db er e a c h e dt o 8 5 1 7 a n d8 8 5 r e s p e c t i v e l y t h eb i o f i l t c rh a ss h o c kr e s i s t a n c ea b i l i t ya g a i n s t h i g h - l o a d i n ga n dc o n c e n t r a t i o no d o r 2t h er e s u l t so fm i c r o b i o l o g i c a le x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h eh e t e r o t r o p h i cb a c t e r i a w a sp r e d o m i n a t e di nb i o f i i m ，t h en e x ti sf u n g i c o m p a r e dt h er e m o v a lr a t eo ft h e o d o rc o m p o n e n t sw i t ht h ec h a n g e so fm i c r o o r g a n i s mm o u n t ，i ti sf o u n dt h a tt h e m i c r o o r g a n i s m sa m o u n to ft h es t a l ka n dc o r t e xr e a c h e dt h em a x i m u ma f t e ra m o n t hr u n n i n g , m e a n w h i l et h er e m o v a lr a t eo fo d o r sr e a c h e dt h es t a b l es t a g e ，t h e f u n c t i o n a lm i c r o b i a la m o u n ti n c r e a s e dal o ta f t e ro n em o n t ha c c l i m a t i o nw h i c h l e a dt ot h ei m p r o v e m e n to fd e c o m p o s i t i o na n dt h er e m o v a lr a t e t h e r ew a sa na l l s l o w l yi n c r e a s e dt r e n do fa c t i n o m y c e t e sn u m b e rw h i c hp r o v e dt h a tt h eb i o f i l t e r w a sb e c o m i n gm o r em a t u r ea n ds t a b l e 3t h ei d e n t i f i c a t i o nr e s u l t so fp u r ec u l t u r em i c r o o r g a n i s m ss h o w e dt h a tt h em o s t b a c t e r i ai s o l a t e dw e r eb a c i l l u s ；f u n g ih a dm o r eg r o u p s t h e r e i n t o2 5 w a s m p e n i c i l l i u m ，a n dm e a n w h i l et h e r ee x i s t e dt r i c h o d e r m a , a s p e r g i i l u sa n do t h e r g r o u p s t h e s em i c r o o r g a n i s m sh a v eg o o da c c l i m a t i z a t i o na n da r ew i d e s p r e a di n s o i l ，w a t e ra n d # a n tt i s s u e s t h e ym a y b ep l a yi m p o r t a n tr o l ei nt r e a t i n go d o r s 4i nt h es t u d yo fb i o f i l t e r sm i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r eu s i n gs i n g l es t r a n d c o n f o r m a t i o np o l y m m o r p h i s m ( s s c p ) ，t h eo p t i m a lo p e r a t i nc o n d i t i o n sw e r ea s f o l l o w i n g s ，1 0 g e lc o n c e n t r a t i o n ( a c r y l a m i d e b i s a c r y l a m i d e 4 9 ：1 ) , a d d i n g5 u r e a , p c rp r o d u c tw a sd i g e s t e db yl a m d ae x o n n c l e a s e ，t h ed i l u t i o no ft h ep r o d u c t i s1 ：1 ，t h es a m p l eq u a n t i t yo ft h ep c r p r o d u c ta p p l i e di ne l e e t r o p h o r e s i si si o s l ， d u r i n ge l e c t r o p h o r e s i s 。t h ev o r a g ei s1 5 0 v , w i t h4 c o n s t a n tt e m p e r a t u r e , e l e c t r o p h o r e s i s1 2 h t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em i c r o b i a ld i v e r s i t ya n ds i m i l a r i t y w e r eg r a d u a l l yi n c r e a s e dw i t ht h e r u n n i n gt i m e , i l l u m i n a t e dt h em i c r o b i a l c o m m u n i t ys t r u c t u r ei nf i l t e rg r a d u a l l yb e c o m es t a b l e 5a f t e rt h eb a n d sc u t t i n go fs s c pf i n g e r p r i n t , a n dp u r i f i c a t i o n , r e - a m p l i f i c a t i o n , s e q u e n c e d , a n dc o m p a r e di nt h eg e n e b a n k , t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm o r et h a nh a l f o ft h eb a n d sr e p r e s e n tt h eu n c u l t u r e db a c t e r i a ；t h e yw e r eq u i t ed i f f e r e n tf r o mt h e p u r ec u l t u r e di s o l a t i o n s b a c i l l u si st h ed o m i n a n tb a c t e r i a , a c c o u n t sf o r3 3 3 w h i c hg i v et h es a m er e s u l t sw i t hp u r ec u l t u r em e t h o d s a tt h es a l n et i m e ，i nt h e b i o f i l t e rt h e r ee x i s t m a n yr h i z o b i u ms t r a i n s ，s u g g e s t i n g t h a tt h ei n n e r m i c r o o r g a n i s mg r o u p si nr o o tp l a y e da r o l ei nt h et r e a t m e n to fo d o r 6t h er e s u l t so fm i c r o s c o p ya n ds e mo fb i o f i i ms h o w e dt h a tb i o f i l mb e c a m e t h i c k e n i n gw i t ht h er u n n i n gt i m ee x t e n d e d ，a n dt h ec o l o rg r a d u a l l yd e e p e n e d t h e r ew e r em o r fp r o t o z o a , s u c ha sn e m a t o d e sa n dr o t i f c r sa sw e l la sb a c t e r i a , s t r e p t o c o c c u s , f i l a m e n t o u sc o u l db ed e a r l yo b s e r v e di ns e mp h o t o g r a p h s , i n d i c a t i n gt h a tt h em i c r o b i a ld i v e r s i t yo nf i l t e rs u r f a c ew e r ea b o u n d a n tw i t ht h e t i m ew e n to n k e yw o r d s ：b i o f i l t e r ，b i o d c o d o r i z a t i o n 、p c r s s c p ，m i c r o b i a ld i v e r s i t y 、s e m 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工 作及取得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表 示谢意 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留，使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文作者签名：菜爻嚏 导师签名：沁仉 导师签名“h ， 嗍：叩。卜 第一章概述 1 研究意义 中华人民共和国国家标准恶臭污染物排放标准( g b 1 4 5 5 4 9 3 ) 中这样定 义恶臭污染物：一切刺激嗅觉器官引起人们不愉快及损坏生活环境的气体物质。 该标准中确定了8 种主要恶臭污染物质，分别是氨( n h 3 ) 、三甲胺( ( c h 3 ) 3 n ) 、 硫化氢( h 2 s ) 、甲硫醇( c h 3 s h ) 、甲硫醚( ( a b ) 2 s ) 、二甲二硫( c b 3 ) 2 s 2 、 二硫化碳( c s 2 ) 、苯乙烯( a r c h = c h 2 ) 。 恶臭污染危害一般有两个方面，一是使人感到不快、恶心、头疼、食欲不振、 营养不良、喝水减少、妨碍睡眠、嗅觉失调、情绪不振、爱发脾气以及诱发哮喘 等。二是会使经济受到损害，如由于恶臭污染使工作人员工作效率降低，受到恶 臭污染的地区经济建设，商业销售额，旅游事业将受到影响，从而使经济效益受 到影响。 随着社会的发展和人们环保意识的增强，人们对大气环境质量提出了更高的 要求，对恶臭问题也更加敏感。恶臭污染已在全球内受到广泛关注，被许多国家 认为是仅次于噪声的六大公害之一。生物脱臭法因其能耗低、产生二次污染的可 能性小、脱臭装置简单、设备和运行费用低、维护管理方便等优点，已成为国内 外恶臭防治研究与应用中的主流方法。 在不同的生物处理工艺中，微生物都是臭气处理的主体，微生物群落结构会 随运行条件和装置微环境的改变而变化，并表现出不同的代谢特性。由于微生物 的代谢功能是影响污染物去除过程和装置运行性能的关键因素，所以研究脱臭装 置中微生物群落结构及其代谢特性对于揭示生物脱臭装置运行的机理、工艺参数 的选择和提高装置运行性能具有重要意义。 2 国内外文献综述 2 1 生物脱臭法及脱臭机理的研究 2 1 1 生物脱臭法 生物净化方法应用于废水处理领域，已经约有一百多年的历史，而研究利用 微生物处理废气的历史则很短。最早的利用微生物处理恶臭的报道【1 j 见1 9 5 7 年的 美国专利。进入七十年代，各国开始在这一领域开展广泛的研究，其中日本、德 国取得的成就最为显著。其研究的主要内容包括：脱臭的原理和方法，脱臭装置 及操作工艺条件，能降解臭气的微生物种群和其在填料表面形成生物膜的条件， 微生物降解动力学以及生物吸收剂的成分等。八十年代以来，已有各类微生物除 臭的装置和设备开始运用于冶金、石油、化工、畜牧业、污水处理厂等实际中， 并取得明显的效果。我国的微生物除臭研究工作起步较晚，到八十年代末、九十 年代初才开始有这方面的实验室研究，目前已有生物法处理恶臭气体的研究报道 2 - 9 1 。 根据微生物在有机废气处理过程中的存在形式，生物法净化有机废气主要分 为生物吸收法( 悬浮态) 和生物过滤法r 固着态) 两类。采用吸收法，微生物及营养物 配料存在于液体中，废气中的有机物与悬浮液接触后转移到液体中，被微生物降 解。采用过滤法，微生物附着在固体介质( 填料) 上，废气从由介质构成的固定床层 ( 填料层) 中通过时被吸附或吸收，最终被微生物降解。生物滤池( b i o f i l t e r ) 、生 物洗涤塔( b i o s c r u b b e r ) 和生物滴滤池( b i o t r i c h i n gf i l t e r ) 是3 种主要的废气生 物处理技术f l p 埘。 生物滤池是最早被研究和使用的一种处理挥发性有机污染物和除臭的生物技 术。1 9 2 3 年b a c h 就曾利用土壤过滤床去除污水处理厂散发的含硫化氢等恶臭物质 的气体1 1 4 1 。早期生物滤池主要用于减少废气的恶臭气味。到了2 0 世纪8 0 年代以 后，其应用范围已扩展到去除许多易被生物降解的挥发性有机污染物方面。c o r s i 等人利用生物滤池处理挥发性有机物【1 5 1 6 l 。 生物洗涤塔已成功用于一些产业。搪瓷厂烘炉释放出的含有乙醇、丙酮、乙 醇醚、芳香族化合物、树脂等的废气，由煅烧装置、铸造车间( 含胺、酚、甲醛、 氨气) 以及炼油厂排放的废气均可用生物洗涤塔去除f 1 刀。污水处理厂散发的臭气 也能利用生物洗涤塔处理【1 8 】。 生物滤池和生物洗涤塔还用于处理储存饲料散发的臭气和氨气。1 9 7 6 1 9 9 1 年，荷兰及德国建立了3 0 4 生物滤池，5 0 + 生物洗涤塔以去除上述物质。负荷为 2 5 0 3 8 0 m 3 ( m 3 h ) 。d e m m e r 使用生物滴滤池处理氨气，去除率可达9 0 【”1 。 2 1 2 微生物脱臭机理研究 自然界中存在着分解恶臭或经诱导能产生分解酶的微生物，微生物脱臭是由 以下三个阶段构成： 第一阶段：臭气同水接触并溶解到水中，由气相转移到液相，此过程遵循亨 利法则。亨利系数较低( h c 0 0 1 ) ，易溶于水的污染物质适于用生物洗涤塔处 理；亨利系数较高( 胁1 ) ，难溶于水的污染物质适于用生物滤池处理：溶解 性介于两者之间的污染物质( 0 0 1 h c 1 0 ，废气极难溶于水时，由于其界面传质速率低而不适于用生物方 法处理。 第二阶段：水溶液中的恶臭成分被微生物吸附、吸收，恶臭成分从水中转移 至微生物体内。 第三阶段：进入微生物细胞的恶臭成分作为营养物质为微生物分解、利用， 2 从而使污染物得以去除。 恶臭物质的氧化需各种微生物参与，同一恶臭物质不同的氧化阶段需不同的 微生物。当恶臭气体为h 2 s 时，专性的自养型硫氧化菌会在一定条件下将h 2 s 氧 化成硫酸根；当恶臭气体为有机硫如甲硫醇时，则首先需要异养型微生物将有机 硫转化成h 2 s ，然后h 2 s 再由自养型微生物氧化成硫酸根。 h 2 s + 0 2 + 自养硫化细菌+ c 0 2 _ 合成细胞物质+ s 0 4 2 一+ h 2 0 c 1 3 s h + c h 4 + h 2 s a d 2 + h 2 0 + s 0 ，一 当恶臭气体为氨时，氨先溶于水，然后在有氧条件下，经亚硝酸细菌和硝酸 细菌的硝化作用转化为硝酸，在兼性厌氧的条件下，硝酸盐还原细菌将硝酸盐还 原为氮气。 硝化 n i - 1 3 + 0 2 + 玎q 0 2 + h 2 0 h n t h + 0 2 + h n 0 3 + h 2 0 反硝化h n o p h n 0 2 - h n 0 _ n 2 0 _ + n 2 吸附、吸收在微生物体内的v o c s 一部分转化微生物所需要的营养物质，供 给微生物生长繁殖所需，另一部分有机物质被氧化分解为c 0 2 和h 2 0 等简单无机 物和部分有机产物，同时释放出大量的能量。生物脱臭的基本过程可用下式表达： 恶臭物质+ 0 2 一细胞代谢物+ c 0 2 + h 2 0 2 2 脱臭填料及脱臭微生物的研究 2 2 1 脱臭填料的选择 填料是微生物的载体，其性能的优劣直接影响微生物的生长环境，填料的选 择对处理效率及能力有决定性的影响，在应用中应当格外重视。一般认为，优良的 填料应具有如下性质：( 1 ) 有较大的比表面积，结构均匀孔隙率大；( 2 ) 吸附性好， 适于多种微生物生长；( 3 ) 表面润湿性好，有一定的持水能力；研究表明1 2 0 l ，填料 湿度在4 0 6 0 ( 湿重) 范围内时生物过滤器的性能较为稳定；对于密度较小、 多孔性的填料和亲水性恶臭气体，则最佳湿度为6 0 或更高。( 4 ) 化学稳定性好， 强度高，自身无异味；( 5 ) 廉价易得，运输方便，运行、养护简单 2 2 1 。 目前，国内外研究者对填料作了大量研究。目前有文献报道的填料有陶粒、煤 粒j 、陶瓷拉西环、硅藻土 2 4 1 、玻璃、聚丙烯鲍尔环、聚氨酯泡沫l 捌、生物活性 碳1 2 6 1 、溶岩石【2 r l 、聚氯乙烯、藻酸盐颗粒 2 8 1 等等。w o e t t z 2 5 烽对聚氨酯泡沫塑料 和珍珠岩作填料的性能进行了研究，聚氨酯泡沫塑料表面多孔有较大的表面积， 微生物多在其微孔中生长而不在填料颗粒之间生长，因此不易发生堵塞现象。而 对于珍珠岩微生物多在其填料颗粒间生长，在有机污染负荷高时会发生堵塞现象。 因而，以聚氨酯泡沫塑料为填料的生物滤池取得了更好的处理效果。郭兵兵等【4 j 3 利用抚顺石油化工研究院自行开发的生物填料，并对填料塔内微生物进行驯化培 养后，处理石化企业污水处理厂a o 曝气池逸散的废气时，在h 2 s 入口平均浓度为 4 3 4 m g m 3 、有机硫化物为6 3 3 m g m 3 、苯系物为3 0 0 0 l g m 3 的条件下，h 2 s 、有机 硫化物、苯系物的平均去除率分别为1 0 0 ，9 5 6 ，9 7 2 ，臭气的去除率为9 9 2 。 2 2 2 脱臭微生物菌群的研究 不同恶臭成分及微环境条件，微生物种群会有所区别。一般认为高湿度、p h 7 8 时，适合细菌生长；低湿度、p h 降为3 5 时，真菌、嗜酸性细菌大量繁殖。根据 被处理的污染物的成分以及微环境条件( 如温度、湿度、p h 值等) 的不同，会繁殖 出不同的微生物种群。 常规处理挥发性有机废气的生物反应器中，因为细菌生长繁殖速度较快，常 成为微生物的主体，微生物种类多以异养型细菌为主，真菌其次，酵母菌极少。 因此对于水溶性较好的有机物，去除效率较高。而对于水溶性差的有机废气，利 用真菌降解，可以提高处理效率l 捌。据报道，b r a u n 利用木片上培养的白腐真菌 处理含芳香醇的有机废气，c o x 等人采用真菌去除苯乙烯及类似物质p o 3 1 l 都取得 了较好的去除效果。试验还得出对于v o c s 真菌降解最佳p h 值为5 o 左右。当装 置处理臭气仅含无机成分时，微生物种群随之变为以c 0 2 为碳源的化能自养型菌。 细菌大部分是杆菌和内生孢子菌，假单胞菌也较常见；放线菌多为链霉菌；真菌 包括毛霉、根霉、曲霉、青霉、交链胞霉等。 随着对脱臭微生物研究的加深，为了提高恶臭生物处理效率，针对一些难降 解的人工合成的化合物，国内外陆续分离筛选出一些降解难降解有机物能力非常 强的微生物 3 2 3 6 1 。脱臭微生物菌种源多来自污水处理厂活性污泥或土壤中，菌株 多是经驯化而筛选得到的复合菌群。这些菌种包括：能降解芳香族化合物的诺卡 氏菌( n o c a r d i a ) 、能降解三氯甲烷的丝状细菌( h y p h o m i c r o b i u m 艰) 和黄色细菌 ( x a n t h o b a c t e r 够) 、能降解氯乙烯的分支杆菌( m y c o b a c t e r i u m 够) 等。目前，已 报道的具有特殊降解能力的真菌有：降解苯乙烯的e x o p h i a l a j e a n s e l m e i1 3 7 1 ；处理 b t e x ( 苯、甲苯、乙苯和二甲苯1 的p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m1 3 s ；净化甲苯废 气的s c e d o s p o r i u ma - p i o s p e r m u mt b l t 3 9 _ 币l l e x o p h i a l al e c a n i i c o r n i 。 虽然试验发现了一些对v o c s 降解能力很强的菌种，但在使用时还要考虑微生 物在特定环境中的生存能力。如p e d e r s e n 研究发现对甲苯降解能力很强的 p s e u d o m o n a s p u t i d a 由于对生物滴滤池环境的适应能力较差，在生物滴滤池开始 运行时快速减少，其数量达到稳定时对甲苯的总降解率的贡献有限。这表明专用菌 种的选择不仅要考虑降解能力，还要衡量其对生物脱臭系统中环境的适应能力。 微生物脱臭尚有许多亟待解决的问题，关注较多的研究方向为：选择适当 4 的滤料，提高滤料的表面性能，使之既有效增强生物的吸附和吸收功能，又不造 成滤料的堵塞；建立微生物降解动力学模型，选择适当的运行参数及控制参数： 筛选和驯化具特殊性能的微生物，针对性地降解生化性差的恶臭物质，提高生 物负荷；寻找菌株的最佳组合，或存活容易、适应性强及遗传性稳定的优势菌 株；加强对脱臭微生物遗传学、生化酶学和分子生物学等方面的研列4 1 1 。如果 做好这些基础研究工作，必将更大地推动生物脱臭技术的进步。 2 3 脱臭微生物群落结构分析研究 微生物群落结构多样性一直是微生物生态学和环境学科研究的重点。微生物 种群结构多样性、稳定性和种群恢复性能在维护处理系统有效性中起着重要作用， 及时监测目标微生物种群结构在不同冲击负荷下的动态变化，可以系统地优化群 落结构并对群落结构的失调给出早期预警。 从年代上来看，微生物群落结构和多样性解析技术的发展可以分为三个阶段 【4 2 矧。2 0 世纪7 0 年代以前主要依赖传统的培养分离方法，依靠形态学、培养 特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，对环境微生物群落结构及多样 性的认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。在7 0 和8 0 年代，研究人 员通过对微生物化学成分的分析总结出了一些规律性的结论，从而建立了一些微 生物分类和定量的方法即生物标记物方法，对环境微生物群落结构及多样性的认 识进入到较客观的层次上。自2 0 世纪8 0 年代中期以来，生物学研究水平逐渐向 微观深入，分子生物学技术蓬勃发展：1 6 s r d n a 扩增( 包括r a p d ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 、e r i c ( e n t e r o b c t e r i a lr e p e t i t i v ei n t e r g e n i cc o n s e n s u s ， 肠细菌基因间共有重复序列) ) ，p c r - s s c p ( s i n # e s t a n dc o n f o r m a t i o n a l p o l y m o r p h i s m ，单链构象多态性) 、d g g e ( d e n a t u r e dg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ， 变性梯度凝胶电泳) 、荧光原位杂交( f i s h ) 、r f l p ( 限制性长度多态性分析 r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o 删s m ) 及其衍生技术a f l p 等，比较精确地揭 示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。目前最常 用的是下面几种方法： 2 3 ir f l p 及其衍生技术 限制性长度多态性分析( r f l p ) 是基于以下原理：d n a 扩增产物经过酶切后 产生不同长度的片段，通过凝胶电泳分离就可以把生物个体间的差异在更深层次 水平上揭示出来。r f l p 容易对大量个体的带型模式进行筛选和解释；但由于r f l p 的检测仍然基于分子杂交，因此r f i t 分析所需时间很长；而且r f l p 所能检测 到的遗传变异性相当低。近年来，随着p c r 技术的产生和发展，r f l p 也进行了 相应的改良，相继产生了p c r r f l p 及a f l p 技术。 5 相对传统的r f l p ，p c r 技术的引入使得整个检测过程大大简化，从前繁复 的杂交过程被简单的p c r 循环所代替，因此p c r r f l p 具有简便、高效的特点。 a f l p 是揭示d n a 指纹的一种新技术，既是进行酶切位点分析又要对酶切片段进 行选择性的p c r 扩增，因此它既具备r f l p 的准确性又具备p c r 的高效性，综合 了两者的优点。鉴于上述优点a f l p 在鉴定遗传多样性和物种亲缘关系的研究中 显示出了较大的优越性m 】。 2 3 2e r i c - p c r 肠细菌基因间共有重复序列( e r i c ) 是一个长度为1 2 6 b p 并以多拷贝形式存 在于细菌基因组的非编码区的反向重复序列。e r i c p c r 方法是用基于e r i c 的引 物序列进行的p c r 扩增。其得到的d n a 条带特征能反映出细菌整个基因组结构 的差异，能清晰的区别包含有e r i c 重复序列的不同的细菌种和不同的菌株。 1 9 9 9 年e r i c - p c r 首次被应用于分析混合菌群。d i g i o v a n n i 4 5 1 用e r i c - p c r 成功分析了接种不同植物根际微生物的b i o l o g yg n 板不同点样孔种菌群组成的差 异，提示e r i c p c r 指纹图谱技术将会成为一项比较细菌群落组成的有效的方法。 目前，e r i c p c r 技术已被广泛应用于纯培养细菌的鉴别、分类、基因组多态性 和系统进化等方面的研究，同时也被应用于分析土壤、活性污泥、肠道等复杂微 生物群落结构的组成特征。 2 3 3p c r - s s c p 单链d n a 片段成复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配 对等分子内相互作用力来维持的。空间构象有差异的单链d n a 分子在聚丙烯酰胺 凝胶中受排阻力大小不同，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将 构象上有差异的分子分离开l 。 p c r s s c p ( s i n g l es t a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m ，单链构象多态性) 方 法本来是用于临床鉴定基因突变的，近年来被应用到微生物生态学的研究中。h e a d 4 7 - 5 0 l 等人通过对根系微生物的分析表明p c r s s c p 可以很好地分析微生物群落的 动态变化，并应用此方法研究了种植对土壤微生物群落的影响。s a b i n ep e t e r s 等1 5 1 l 用该法研究的演替和菌株的多样性，并同传统的方法比较指出p c r s s c p 方法避 免了传统培养的费时费力以及误差大的干扰，适合对微生物群落结构和演替的分 析。 2 3 4d ( 玲e 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r e dg r a d i e n tg e le l e e t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 最初是 l e r m a n 等人于2 0 世纪8 0 年代初期发明的，起初主要是用来检；淡i j d n a 片段中的点突 变【5 2 5 3 1 。m u y z e r 等k 在1 9 9 3 年首次将其应用于微生物群落结构研究【5 4 1 。在十多年 的时间里已被广泛应用于各种环境中微生物生态的研究，目前已发展成为研究微 6 生物群落结构的主要分子生物学方法之一【5 5 】。 双链d n a 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，其迁移行为决定于其分子大 小和电荷。不同长度的d n a 片段能够被区分开，但同样长度的d n a 片段在胶中的 迁移行为一样，因此不能被区分。d g g e 技术是在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳基 础上，加上变性剂( 尿素和甲酰胺) 梯度，把同样长度但序列不同的d n a 片段区 分开来。当某一双链d n a 序列迁移到变性凝胶的一定位置，达到其解链温度时， 即开始部分解链，部分解链的d n a 分子的迁移速度随解链程度的增大而减小，从 而使不同序列的d n a 片段滞留在凝胶的不同位置，结束电泳时形成相互分开的带 谱。理论上认为，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精 细，仅有一个碱基差异的d n a 片段都可以被分开。 这一方法还存在一些缺陷：需要与d g g e 技术相配套的电泳设备，且价格 昂贵。( 室) d g g e - - 般只能分析5 0 0 个碱基对以下的d n a 片剧删，因此得到的系统进 化相关的信息就很少。一般只有在总微生物群落中占1 以上的种群才能被检测 出来f 5 刀。在设计p c r 弓i 物扩增某些特定菌群时，由于某些菌群的序列相互之间 同源性不是很高，因此需要设计并行引物。此时，相同的微生物会有两个条带， 这会对微生物群落结构组成造成高估【堋。电泳的时间对研究微生物多样性也有 影响【5 9 1 。 2 3 5f i s h 荧光原位杂交( f i s h ) 是一项利用标记的d n a 或r n a 探针直接在染色体、 细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术【甑6 1 】。它采用特殊荧 光素标记核酸探针( 寡核苷酸探针，通常为化学合成的1 5 2 5 b p 的单链d n a 分 子) ，可在染色体、细胞和组织切片标本上进行核酸杂交，对检测细胞内d n a 或 r n a 的特定序列存在与否最为有效。分子杂交是d n a 的变性和与带有互补同源 单链退火配对形成双链结构的过程。而上述过程并不需要d n a 或r n a 的提纯、 扩增等繁琐步骤，实用性较强。荧光素的引进使i s h 灵敏度显著提高，并为利用 不同荧光素来同时定位多个靶序列提供了依据。 h s h 利用高度特异的寡居核苷酸探针杂交可以得到特定微生物在环境中的存 在、分布、丰度以及整个微生物群落的组成、结构及其多样性等全面信息。b a r k a y l 6 2 】 等应用该技术研究了汞污染土壤中抗汞细菌的种类、数量和变化趋势。j u r e t s c h k o 和s c h r a m m 等【缸删曾对硝化流化床、普通活性污泥等工艺的活性污泥中硝化细菌 的多样性采用h s h 法进行了跟踪分析，发现f 加阳印妇i m 抛驴妇为优势菌株。目 前h s h 技术在国内外已广泛的应用于微生物分子生态学研究中，并且成为诊断和 评价废水生物处理系统微生物群落结构的方法。 7 2 4p c r - s s c p ( 单链构象多态性) 技术及应用 p c r s s c p ( s i n g l es t a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m ，单链构象多态性) 技 术是p c r 技术和s s c p 技术的结合。根据要分析的基因核苷酸序列设计合成合适 的引物，用p c r 扩增特定的靶序列，然后将扩增片段变性为单链，进行聚丙烯酰 胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，d n a 单链的迁移率 除与d n a 链的长短有关外，更主要的是取决于d n a 单链所形成的构象陋】。在非 变性条件下，d n a 单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象，这种构象由 d n a 单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用( 主要为氢键) 来维持。 相同长度的d n a 单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳 迁移率也不同，因此根据变性f c r 产物在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的泳动位置 差异，就可将小至单个碱基改变的d n a 与正常d n a 序列区别开来【吲。由此可见， p c r s s c p 分析是一种检测d n a 点突变的灵敏的分析技术。作为一种新的d n a 序列变异手段，p c r - s s c p 法与传统的检测基因突变的方法相比确有独到之处： ( 1 ) 可以检测任何( 包括已知的和未知的) d n a 位点上的多态性和突变，且检 测灵敏性高，能够检测出l b p 的小缺失和点突变，这大大提高了基因突变的 检测范围。 ( 2 ) 无需事先知道待测d n a 片段的序列，只要能够根据已有的资料设计p c r 引 物即可进行p c r s s c p 分析【6 7 硎。 ( 3 ) 省去了核酸杂交等复杂的实验步骤，操作简单，不需特殊仪器，整个过程可 在一到两天内完成。 ( 4 ) 可在测序前对d n a 样本进行筛选；适合于同时对大量样品进行筛选，特别 适用于混合细胞群体中d n a 变异的检测【硎。 ( 5 ) p c r s s c p 分析对d n a 原始材料纯度要求不高，且所需量较少，为该技术在 研究和实际操作中的应用提供了极大方便i 硼。 同时，也因为p c r s s c p 技术是新近发展起来的一种分子生物学分析方法