（发酵工程专业论文）酿酒酵母转化法生产2苯乙醇的研究.pdf

摘要 摘要 2 苯乙醇是一种具有淡雅细腻玫瑰香味的芳香醇，在食品、药品、化妆品、烟草和 日化用品中有着广泛的应用，它不仅是所有玫瑰香型香气的基本组分，而且具有协合及 增效作用，是多种香型配方所需的组分。随着天然2 苯乙醇市场需求量的不断增加，利 用微生物转化生产天然2 苯乙醇具有广阔的市场前景和应用价值。 本论文对酵母细胞转化l 苯丙氨酸生成2 苯乙醇进行了研究，主要研究内容包括： 对产生菌株进行紫外诱变育种；建立酵母菌体转化法制备2 苯乙醇并对转化培养基进行 优化；在油酸水两相体系中酵母转化生成2 苯乙醇进行研究；固定化酿酒酵母与大孔 树脂吸附产物相结合，进行边转化边吸附。 对s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ec l c i m y 0 0 8 6 ( t ) 、k l u y v e r m y c e ss i n e n s i sa s 2 15 3 5 和 k l u y v e r m y c e sm a r x i a n u s a s 2 1 4 4 0 进行了2 苯乙醇耐受性和产量的比较，选择优于其它 两株菌的酿酒酵母作为出发菌株进紫外诱变，筛选得到一株产量为2 4 1 9 l 的突变株， 命名为s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ec i c i m y 0 0 8 6 1 6 ，遗传稳定性良好。考察了乙醇和2 苯乙醇对酵母生长的抑制作用，发现在2 苯乙醇单独存在下，浓度大于4 9 l 时几乎完 全抑制了酵母的生长；低浓度乙醇( l p h e n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，实验所得最佳培养基组合为：a 3 8 3 c 3 d 2 ( 见表3 - 3 ) 。补做 该组合培养基转化实验，2 苯乙醇的平均得率为3 4 1 9 l ，大于正交组合中的最大产率值。 但是考虑到当浓度在8 9 l 以上时，l 苯丙氨酸的量对2 苯乙醇产量的影响已较小，并 兼顾前体的节约，我们选用组合a 3 8 1 c 3 d 2 为转化发酵培养基。该组合在正交实验中已 存在，其2 苯乙醇产量为3 3 5 9 l ，与组合a 3 8 3 c 3 d 2 相差不大。 因此，优化后的菌体转化培养基配方为：葡萄糖5 5 9 l ，l - p h e8 9 l ，y n b2 7 9 l ， n a 2 肿0 4 1 2 h 2 00 6 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 0o 7 9 l 。 3 3 3 茵体量与发酵终止时间的确定 向转化培养基中加入的酵母菌体量的不同，会使2 苯乙醇合成速率有所不同，转化 结束时间会有很大区别，所得到的2 苯乙醇产量也会有很大差异。因此，有必要对不同 酵母菌体量在上述优化后发酵培养基中的转化过程进行考察。向每摇瓶加入菌体量( 湿 菌体) 分别为0 2 9 、o 5 9 、o 8 9 和1 1 9 的转化过程如图3 - 1 3 所示。 由图3 1 3 可见，酵母菌体一经接入发酵培养基，便以较高的速率转化生成2 苯乙 醇，菌体浓度较大的转化速率也较大。1 1 9 5 0 m l 实验组虽然在起始阶段转化速率最高， 但因菌体浓度太大，营养物质消耗过快，在3 h 后转化速率便开始下降。加入菌体浓度 为0 8 9 5 0 m l 的实验组在6 h 的2 苯乙醇浓度便超过1 1 9 5 0 m l 实验组，达到2 5 1 9 l 。 2 8 h 结束发酵时，以菌体浓度由低到高为顺序，2 苯乙醇产量分别为：3 0 3 9 l ，3 2 5g l ， 第三章结果与讨论 3 8g l 和3 5 3g l 。因此，我们选择菌体转化转化过程中的酵母菌体浓度为0 s g 5 0 m l ， 发酵终止时间1 5 h ，此时，发酵液中2 - 苯乙醇浓度为3 6 7 9 l 。 04 8 1 2 1 8 2 02 4 2 8 时间( h ) 图3 一1 3 不同菌体浓度下的转化过程 f i g 3 - 13b i o c o n v e r s i o n su n d e rd i f f e r e n tb i o m a s s 所确立的菌体转化过程与常规发酵的过程曲线对比图见图3 1 4 。由图3 1 4 可见， 菌体转化法的2 苯乙醇生成速率大大高于常规发酵法，产物终浓度比常规法高出 1 2 7 9 l ，提高了5 2 9 ，发酵周期则从4 8 h 缩短到1 5 h ，l 苯丙氨酸摩尔转化率由7 0 提高到8 5 。 图3 1 4 菌体转化过程与常规发酵过程的比较 f i g 3 - 1 4b i o c o n v c r s i o n sb yb i o m a s sa n dt r a d i t i o n a lm e t h o d 3 3 4 两相体系转化中油1 0 3 1 2 一苯乙醇的萃取效果 2 苯乙醇对微生物有很大的毒性，这是生物转化法生产中导致产物浓度低下的关键 原因。近几年国内外关于解除2 苯乙醇抑制的研究取得了一定的进展。e t s c h m a n n 等【3 4 】 利用马克斯克鲁维酵母以聚丙二醇作为萃取相，使2 一苯乙醇产量达到1 0 2 9 l 。s t a r k 等 2 7 1 利用酿酒酵母，以油酸为上相，在补料分批培养条件下，使2 苯乙醇的终浓席达到 o 5 o 5 o 5 o 5 o 3 3 2 2 1 1 o o (1嚣v毯蛏筮 江南大学硕士学位论文 1 2 6 9 l 。王成涛等瞄】采用油酸和聚丙二醇原位产物转移发酵技术，2 苯乙醇的产量为 2 2 1 9 l ，并指出萃取相影响了发酵液的溶氧，限制了酵母的生长和转化的进行。陆军等 【2 2 j 用酵酒酵母在水油酸两相体系中进行转化，产生2 苯乙醇的浓度为3 9 l 。 选择合适的有机溶剂是在两相体系中成功进行生物转化的关键之一。陆军【3 5 研究证 明，油酸具有合适的底物和产物的分配，而且生物相容性好，毒性低，是边发酵边萃取 制备2 一苯乙醇过程中合适的有机溶剂。因此，本研究选择油酸作为有机萃取剂。 以油酸为有机萃取相，进行常规的有机溶剂水两相体系发酵2 苯乙醇的效果见图 3 】5 。 ( c ) 图3 - 1 5 油酸对2 苯乙醇的萃取效果图 ( a ) 单一水相常规发酵结束时发酵液色谱图；( b ) 油酸一水两相体系常规发酵下层水相色谱图； ( c ) 油酸一水两相体系发酵上层油酸相色谱图 f i g 。3 1 5e f f e c to f e x t r a c t i o no f o l e i ca c i do np e a ( a ) c h r o m a t o g r a mo ft r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i v es a m p l e ；c o ) c h r o m a t o g r a mo fa q u e o u sp h a s eo fb i p h a s i c s y s t e m ；( c ) c h r o m a t o g r a mo fo l e i ea c i dp h a s eo f b i p h a s i cs y s t e m 由图3 1 5 可见，油酸一水两相发酵体系中转化产生的2 一苯乙醇大部分都被萃取到上 层油酸相中了，水相发酵液中的2 一苯乙醇浓度直至发酵结束都非常低，已不足以对酵母 细胞产生抑制。但前体l 一苯丙氨酸和发酵产生的其它物质则几乎全部留在水相中，油酸 对发酵液中2 一苯乙醇的选择性很高，这将非常有利于产品的后续提取和纯化工作。 第三章结果与讨论 遗憾的是，虽然油酸显示了良好的萃取效果并成功解除了产物的抑制作用，但其最 终2 一苯乙醇的产量却并不高，仅能达到或稍高于单一水相中常规发酵法的2 一苯乙醇产 量。这可能是因为油酸的加入对酵母的生长和转化活性产生了负面的影响。 3 3 5 双水相茵4 奉, - 转4 b 法及其条件优化 有机溶剂油酸的加入对酵母细胞的生活环境造成了很大的改变。它虽然萃取了发酵 液中的2 苯乙醇，但也影响了发酵液的溶氧等条件，给酵母细胞的生长带来了负面的影 响。为此，作者将菌体转化法与两相体系转化法相结合，即双水相菌体转化法，以期 减弱油酸的加入给细胞生长带来的不利。 ( 1 ) 培养条件 对双水相菌体转化的培养条件进行考察，发现培养温度和摇床转速最佳值分别为 3 0 和1 0 0 r m i n ，与单水相发酵条件一致。 ( 2 ) 油酸相与水相体积比 两相体积比值影响产物在两相中的分配和传质的快慢。油酸过少则不能及时有效的 转移出产物2 苯乙醇，近而影响生物转化的速率。油酸过多则加大了其对细胞的毒性， 并降低了油酸相中2 苯乙醇浓度，给后续的产物分离纯化工作增加了困难。 维持油酸相与水相的总体积为5 0 r a l 不变，改变两相的体积比值，研究其对2 苯乙 醇产率( 单位体积发酵液产生2 苯乙醇的量) 的影响，结果见图3 1 6 。 2 ：3 1 ：1 3 ：2 v 油i t ：v 发秫 4 3 蔫 辟 忆 ： 荽 图3 1 6 不同油酸发酵液体积比下发酵结果 f i g3 1 6r e s u l t so f b i o t r a n s f o r m a t i o nu n d e rd i f f e r e n tv o l u m er a t i o 产塞：鱼丝! 兰鱼! 塑鲨! 墨! 垒壁堕塑兰竺! 墅! 垄壁塑型望 。 喔酵液( 三) 由图3 1 6 的结果表明，随着油酸所占比例的加大，其中2 苯乙醇的浓度不断降低， 发酵液的2 苯乙醇产率不断提高并在油酸：水= 1 ：1 处取得最大，继续加大油酸的比例， 产率明显下降。本研究以获取最大2 苯乙醇产率为目的，选择加入油酸的比例为1 ：1 ， 工业上为了得到较高的产物浓度，经过成本估算，或可适当降低油酸比例。 8 b 4 2 o 一18一越滏高山子晕铤景 江南大学硕士学位论文 ( 3 ) 油酸加入的时间对转化的影响 菌体接入转化培养基后需要一定的时间适应新的环境，起始阶段就有油酸的存在可 能会延长这段时间，并影响菌体的转化活性，因此适当的推迟油酸的加入时间可能会有 助于茵体活性的提高和缩短活性恢复所需时间，并最终提高苯乙醇的产量。 5 o 4 5 均 。4 。0 卿 扎 山3 5 3 o 2 5 03691 21 5 油酸加入的时间( h ) 图3 - 1 7 油酸力口入时间对2 一苯乙醇产率的影响 f i g 3 - 1 7i n f l u e n c eo f o l e i ca c i do np e ay i e l d 研究表明，随着油酸加入时间的推迟，2 苯乙醇产量得到很大提高，并在9 h 处达 到最大值，再往后推迟加油酸的时间，2 苯乙醇产量有所下降。这也可从图3 1 4 中得到 印证，在9 h 单水相菌体转化的速率已下降，此时加入油酸对产物2 苯乙醇进行萃取可 使转化得以继续进行。过早的加入油酸则浪费了单水相中9 h 以前的高转化速率，过迟 的加入则不能及时的解除2 苯乙醇的抑制，造成细胞的活性下降。因此，在菌体在水相 中转化进行到9 h 时加入油酸最有利于转化的进行，该条件下2 苯乙醇产量为4 4 7 9 l ( 见 图3 - 1 7 ) 。 ( 4 ) 接入菌体量及转化终止时间的确定 接入的菌体量不同会使产醇速率有所不同，转化结束时间也会有很大区别。接入茵 体量( 湿菌体) 分别为o 2 9 瓶、o 4 瓶、o 6 9 瓶和0 8 9 瓶的转化过程如图3 一1 8 所示。 在0 h 9 h ，不同接种量的各瓶均有较高的转化速率，2 苯乙醇快速生成并达到较高 水平，接种量较大的2 苯乙醇浓度也会较高。在加入油酸后，各接种量下的转化速率都 明显降低，这可能是油酸对菌体的毒性和对体系环境的重大改变( 如转化液体积、溶氧 和p h 等) 所导致的。经过6 h 的调整和适应后，菌体转化活性再次提高，继续较快生成 2 苯乙醇，酵母接入量越大的生成速率也越高。菌体量为0 8 2 5 r n l 和0 6 9 2 5 m l 的最 终2 苯乙醇产量较高，前者的转化终了时间为2 4 h ，后者为2 7 h ，因其转化时间和最终 产率相差不大，选用0 6 9 2 5 m l 的接入量转化2 7 h 作为最佳转化条件，此条件下转化终 止时2 苯乙醇产量为4 5 5 9 l ，转化率为9 2 。 2 6 第三章结果与讨论 o 、_ 一 蜊 疑 矗 厶 061 21 82 43 03 64 24 8 5 4 时间( h ) 图3 1 8 不同菌体浓度下的转化过程曲线 f i g 3 18b i o c o n v e r s i o n su n d e rd i f f e r e n tb i o m a s s 3 4 固定化酵母转化 酵母菌体转化法显示了良好的效果，2 苯乙醇转化速率和最终产量都得到了很大的 提高。但是该方法需要培养大量的酵母菌体，消耗大量的种子培养基，增加了成本。为 此，对酿酒酵母菌体进行固定化，以期重复用于从l 苯丙氨酸向2 苯乙醇的转化过程。 在固定化转化过程中，为了解除或降低产物抑制，我们用大孔树脂吸附法代替有机溶剂 萃取法，进行过发酵边吸附的产物原位转移发酵工艺。 迄今为止，研究和应用的固定化方法可以归纳为吸附法、包埋法、共价结合法和交 联法等几大类【3 o 】。其中吸附法操作简单，对酶活性影响不大，但酶与载体的结合较弱， 易于脱落。共价结合法和交联法酶与载体的结合较强，但涉及到共价键及功能团的作用， 往往会造成酶活下降。包埋法是将酶或细胞包埋于凝胶或其它聚合体格子内，这种结构 可以防止酶渗出，但小分子底物和产物能渗入或渗出凝胶膜，生物转化发生在凝胶格子 内。由于包埋法具有回收酶活较高、包埋容量大、工艺简便、通用性强等诸多优点，而 且适用于这一方法的酶和聚合体载体也较多，被认为是目前较为理想、应用较多的固定 化方法。适用于包埋法制备固定化酶的常用载体材料包括有机载体和无机载体等。其中 用于包埋酶或细胞的高分子载体材料一般分为两大类：天然高分子材料和人工合成高分 子材料。包埋法一般适合作用于小分子底物和产物的酶或细胞，因为只有小分子可以通 过高分子凝胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还会部分导致固定化酶或细胞动力学改 变，降低酶活力或细胞转化能力。固定化细胞不需要把酶从细胞中提取出来，也不需要 加以纯化，酶活力损失少，因此固定化细胞技术正超越固定化酶技术的应用。本研究选 用海藻酸钙包理法对酿酒酵母进行固定化。 3 4 1 海藻酸钙固定化酵母条件 ( 1 ) 固定化小球的粒径 5 o 5 o 5 0 5 0 5 o 5 o 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 江南大学硕士学位论文 在用注射器将3 海藻酸钠菌体悬液点滴滴入0 5 m o l l 氯化钙溶液成球过程中，考 察了使用7 撑针头和不使用针头两种滴入形式，经接入发酵液转化4 8 h 发现，大颗粒固定 化酵母2 苯乙醇产量高于小颗粒。所以，以下实验中都采用不带针头注射器滴入的方法。 ( 2 ) 海藻酸钠浓度和菌体浓度 海藻酸钠的加入量和所包埋的菌体量是影响固定化效果的重要因素。从催化剂的量 来分析，菌体的浓度越高越好，有利于转化，但菌体浓度过高容易导致包埋不完全，而 且容易产生泄漏。海藻酸钠浓度过低，反应生成的海藻酸钙凝胶量太少，会造成不完全 包埋和固定化强度低，导致菌体的漏出甚至固定化小球的垮散；海藻酸钠浓度高，虽然 增加了凝胶的机械强度，但也容易增大传质阻力，不利于底物与细胞的接触，同时影响 产物的释放。为了得到较好的固定化和转化效果，将酵母菌体浓度固定为2 0 9 l ，在氯 化钙浓度0 5 m o l l 、固定化时间2 h 的条件下，对1 、2 、3 、4 和5 的海藻酸钠 溶液进行实验，考察其固定化强度。 234 海藻酸钠浓度( g l ) 图3 - 1 9 海藻酸钠浓度对固定化强度的影响 f i g 3 1 9e f f e c to f a l g i no i li n t e n s i t yo f t h ei m m o b i l i z e dc e l l s 由图3 1 9 可见，在一定范围内海藻酸钠浓度越高，固定化强度越大，高于3 的海 藻酸钠已不能对固定化细胞的强度产生很大的改善。考虑到传质阻力的影响，选择3 作为固定化中海藻酸钠浓度。 ( 3 ) 氯化钙浓度和固定化时间 c e + 浓度将影响固定化细胞的硬化程度和硬化速度。文献 3 5 , 2 9 , 4 1 1 t ：和用所氯化钙浓度 一般较低( o 0 5 0 1 m o l l ) ，所需硬化时间也较长。实验发现在氯化钙溶液中放置时间过 长会导致酵母菌体的活性一定程度的下降，影响2 苯乙醇的产量。为此，本实验加大溶 液中c a 2 十浓度，尽量缩短硬化时间。对在0 0 5 m o l l 氯化钙溶液中放置过夜和在0 5 m o l l 氯化钙溶液中硬化2 h 两种方法进行比较发现，两者固定化强度相差不大，但后者2 苯 乙醇产量明显高于前者( 分别为2 1 3 9 l 和2 4 5 9 l ) 。为进一步确定氯化钙浓度，在包 埋固定化操作时，控制硬化时间为2 h ，考察提高c a 2 + 浓度对固定化颗粒强度的影响。 结果表明，固定化细胞在1 0 m o l l 的c a c l 2 中硬化2 h 效果良好，进一步提高c e + 浓度 对固定化颗粒强度影响不大( 见图3 - 2 0 ) 。 5 4 3 2 1 o 一6 庭莒饕臻 第三章结果与讨论 0 6 0 8 1 o 氯化钙浓度( m o l l ) 图3 2 0c a ：+ 浓度对固定化强度的影响 f i g 3 2 0e f f e c to fc a 2 + o ni n t e n s i t yo ft h ei m m o b i l i z e dc e l l s 3 4 2 固定化酵母反复分批转化 称取固定化颗粒2 0 9 和湿酵母菌体0 2 9 ( 所含菌体量相当) ，分别接入发酵培养基 进行2 苯乙醇转化，每隔一定时间取样检测其中l 苯丙氨酸和2 苯乙醇含量，考察其 变化过程。发酵结束后，对固定化组直接更换新鲜发酵培养基，进行第二轮发酵；对游 离菌体组在5 c 、4 0 0 0 r m i n 下离心5 m i n ，所得菌体全部接入新鲜培养基，进行第二轮 发酵。两批发酵过程曲线见图3 2 1 。 。 ，实验结果表明，第一批次发酵中，固定化细胞转化生成的2 苯乙醇含量低于游离细 胞转化。在4 h 时固定化转化发酵液中检测不到2 苯乙醇的存在，可能是酵母细胞正在 恢复活性，所转化生成的少量2 苯乙醇保留在固定化颗粒内，还没有释放到发酵液中。 在加入固定化酵母后，发酵液中的l 苯丙氨酸有一个明显的下降，这可能是部分l 苯 丙氨酸被海藻酸钙凝胶吸附的结果( 见图3 - 2 1 ( a ) ) 。在第二批次发酵中，固定化酵母转 化速率和产量明显优于游离组( 见图3 2 l ( b ) ) 。 051 01 52 53 0箱4 0 转化时间( h ) ( a ) 5 5 4 3 2 1 o e 重翟鐾缝 8 6 4 2 o j一心q疑i，iii 江南大学硕士学位论文 b ，、 毫e 、一 魁 矮 盏4 t 耋 2 0 051 01 52 02 53 0 转化时间( h ) ( b ) 图3 2 1 固定化酵母和游离酵母转化过程曲线 ( a ) 第一批( b ) 第二批 f i g 3 - 21t r a n s f o r m a t i o nc u r v e so fi m m o b i l i z e dc e i l sa n df r e ec e l l s ( a ) c u r v e so f t h ef i r s tb a t c h ( b ) c u r v e so f t h es e c o n db a t c h 利用固定化细胞和游离细胞进行反复分批转化，结果见图3 2 2 。随着批次的增加， 游离酵母的活性明显降低，而固定化酵母在第二、第三和第四批取得最大产量后，活性 开始缓慢下降，但直至第九批2 苯乙醇产量仍在3 9 l 以上。固定化酵母的转化率略低 于游离细胞的首批转化率，为8 0 左右。总之，虽然固定化细胞在第一批转化中生成 2 苯乙醇产量低于游离细胞，但在以后的反复转化中优势明显。 转化批次 1 0 图3 2 2 固定化酵母乖游离酵母多批次转化 f i g 3 2 2p e ay i e l d so f r e p e t i t i o u st r a n s f o r m a t i o nb yi m m o b i l i z e dc e l l sa n df r e ec e l l s 3 4 3h 1 0 3 树脂吸附乖解吸特性 大孔吸附树脂是2 0 世纪6 0 年代发展起来的有机高聚物吸附剂，具有很好的大孔网 状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物。大孔吸 3 0 o 5 0 5 o 5 0 5 o 4 3 3 2 2 1 1 o o r18一咖k盏山 第三章结果与讨论 附树脂已在环保、食品、医药领域得到了广泛的应用，近年来，在药学领域尤其天然药 物中的应用普遍受到重视，用吸附树脂提取其中的有效成分是非常安全的。 作为边转化边吸附工艺中使用的大孔树脂，必须对产物具有较大的吸附量而对底物 的吸附量要尽可能小。本研究采用文献 6 - 1 所报道效果较好的h 1 0 3 树脂，根据2 2 8 所述 的方法，吸附后溶液中2 苯乙醇和l 苯丙氨酸的浓度分别为1 6 0 7 2 9 l 和3 4 6 4 5 9 l ， 由公式计算得h 1 0 3 树脂对2 苯乙醇和l 苯丙氨酸的吸附率分别为1 1 9 6 4 m g g 和 2 6 7 7 5 m g g ，两者相差很大，h 1 0 3 树脂对2 苯乙醇吸附选择性良好。等体积乙醇解吸 液中2 苯乙醇含量为1 6 9 2 5 9 l ，解吸率为7 0 7 3 。 3 4 4 酵母固定化产物吸附转化法 酵母固定化产物吸附转化法发酵液和树脂解吸液液相色谱图见图3 2 3 。 ( a ) ( b ) 图3 2 3 发酵液和解吸液色谱图 ( a ) 发酵液( b ) 树脂解吸液 f i g 3 - 2 3c h r o m a t o g r a m so ff e r m e n t a t i v es o l u t i o na n dd e s o r p t i o ns o l u t i o n ( a ) f e r m e n t a t i v es o l u t i o nc o ) d e s o r p t i o ns o l u t i o n 由图3 2 3 可见，发酵液中2 苯乙醇含量很低( 不到1 9 l ) ，大部分产物被树脂吸 附，已经不能给酵母造成很大的抑制。树脂的解吸液中绝大部分为2 苯乙醇，只含有极 其少量的杂质。其中发酵液中2 - 苯乙醇浓度为0 7 1 5 3 9 l ，解吸液中浓度为4 3 0 1 2 9 l 。 因注意到在2 4 h 时l - 苯丙氨酸已消耗殆尽( o 6 5 6 5 9 l ) ，于18 h 时补加l 一苯丙氨酸，使其 浓度提高4 9 l ，转化结束时发酵液中2 一苯乙醇浓度为0 9 2 6 7 9 l ，解吸液中浓度为 5 4 3 2 6 9 l 。 本解吸方法解吸率不够理想，这也导致了边转化边吸附工艺中l 苯丙氨酸消耗已尽 但解吸液中2 苯乙醇浓度不高的结果。对吸附树脂采用动态洗脱法或可提高解吸率，有 待进一步的工作。 江南大学硕士学位论文 3 5 主要结论 ( 1 ) 对s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ec i c i m y 0 0 8 6 ( t ) 、k l u y v e r m y c e ss i n e n s i sa s 2 15 3 5 和k l u y v e r m y c e sm a r x i a n u sa s 2 1 4 4 0 三株酵母进行2 苯乙醇耐受性和产量的考察表明， s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ec i c i m y 0 0 8 6 ( t ) 的2 苯乙醇耐受性和产量均优于后两者。对乙 醇和2 苯乙醇对酵母生长的抑制和联合抑制作用进行了考察，发现随着2 苯乙醇浓度的 增大，对酵母菌体的生长抑制越明显，浓度大于4 9 l 时几乎完全抑制了酵母的生长； 低浓度乙醇( 5 0 m l l ) 的存在虽不能单独对酵母的生长产生太大的抑制，但加强了2 苯 乙醇的毒性，增加了细胞对2 苯乙醇的敏感性，两者联合毒性得到加强。对s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ec i c i m y 0 0 8 6 ( t ) 进行紫外诱变，筛选获得一株2 苯乙醇高产菌株，命名为 c i c i m y 0 0 8 6 1 6 ，该突变株转化生产2 苯乙醇的产量达到2 4 1 9 l ，较出发菌株提高了 2 2 9 ，转化率为7 0 ，并且遗传稳定性良好。 ( 2 ) 对2 苯乙醇的生成与酵母菌体生长的关系进行了考察，发现在菌体生长的稳 定期也能够进行2 苯乙醇的转化生成。为了提高2 苯乙醇转化速率和产量，进行酵母菌 体转化实验。通过单因素实验和正交设计实验，确立了菌体转化的最佳发酵培养基为： 葡萄糖5 5 9 l ，l p h e8 9 l ，y n b2 t g l ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0o 6 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 00 7 9 l a 以0 8 9 5 0 m l 的菌体浓度向上述培养基中加入酿酒酵母湿菌体，转化1 5 h ，2 苯乙醇产 量达3 6 7 9 l 。该方法将发酵周期缩短了3 3 h ，2 苯乙醇产量提高了5 2 3 ，转化率由7 0 提高到8 5 。 为了解除或降低产物的抑制作用，采用油酸水两相体系的产物原位转移技术进行 2 苯乙醇的转化，结果表明，油酸对发酵液中2 苯乙醇有着良好的萃取性能，向2 5 m l 菌体转化培养基中加入o 6 9 酵母湿菌体，置摇床转化9 h 后向体系中加入2 5 m l 油酸， 2 7 h 达到转化终点，2 苯乙醇产量达到4 5 5 9 l ，转化率为9 2 。 ( 3 ) 菌体转化法需要大量的酵母菌体，为了对菌体进行重复利用以降低成本，用 海藻酸钙包埋法对酿酒酵母进行固定化。所确定的海藻酸钙包埋法固定化酿酒酵母的条 件为：海藻酵母钠浓度3 ，氯化钙浓度1 m o l l ，酵母菌体浓度2 0 9 l ，使用无针头注 射器滴形，硬化时间2 h 。对固定化酵母进行反复分批转化的研究表明，固定化酵母在第 二、三、四批达到3 4 5 9 l 左右的2 苯乙醇高产出水平，随后产量缓慢的下降，但直至 第九批产量仍高于3 9 l ，其转化活性的保持明显优于游离酵母，转化率保持在8 0 左右。 ( 4 ) 在固定化细胞转化的基础上，尝试使用h 1 0 3 大孔树脂进行吸附所产生的2 - 苯乙醇，进行边转化边吸附的产物原位转移技术，使得发酵液中2 苯乙醇浓度始终低于 l g l ，较好的解除了产物对酿酒酵母的抑制作用，乙醇解吸液中2 苯乙醇浓度为4 3 9 l ， 1 8 h 时补加l 苯丙氨酸，所得解吸液中2 苯乙醇含量为5 4 9 l 。 3 2 致谢 致谢 本论文是在导师张伟国教授的悉心指导下完成的。从论文选题、实验的开展到论文 的撰写无不凝聚着导师的智慧和汗水。导师渊博的知识、深邃的智慧启迪了我的成长， 实事求是、一丝不苟的治学态度给我留下了深刻的印象，对我们诚实正直、严谨认真的 教诲将使我受益终生。在此，谨向导师表示崇高的敬意和最衷心的感谢! 本课题得到本研究室师兄陆军的无私帮助，感谢陆师兄对分析检测的指导和对实验 思路的建议和启发。 感谢葛向阳师兄的耐心指导，作者研究过程中所遇到的许多困难的解决都得益于葛 师兄的建议和帮助。 感谢本研究室的师兄师姐、师弟师妹的帮助。对朱进伟、卢彦梅、王帅、王霞、左 翠、赵建云、林芳、刘春辉、殷树昌、秦海斌、陈银芳、刘焕民、康传利、袁丹丹、柴 进凯在生活和实验上给予的关心和支持一并表示感谢。在这个和睦团结和充满学术氛围 的集体中学习和生活令人愉快。 感谢啤酒研究室的李涛和金昭给予的帮助。 感谢钟学敏、王俊、李克朗、王长城、方熹君等好友，和他们在一起渡过了美好的 业余时光。 谨以此文献给养育教导我的父母，感谢我的哥哥姐姐对我的支持，感谢我的亲人多 年来对我的关爱! 特别感谢我的女友李云所给予的支持和鼓励! 最后，再次对所有关心、支持和帮助过我的老师、同学、亲人和朋友们表示深深的 谢意。 3 3 刘国 2 0 0 9 年4 月于江南大学 参考文献 参考文献 1 m m w e t s c h m a n n ，d s e l l & j ，s c h r a d e r b i o t e c h n o l o g i c a lp r o d u c t i o no f2 - p h e n y l e t h a n o l 叨a p p l m i c r o b i 0 1 b i o t e c h n o l ，2 0 0 2 ，5 9 ：1 8 2 孙宝国食用调香术 m 北京：化学工业出版社，2 0 0 3 3 f a b r ec e ，b l a n c pj ，g o m ag 2 - p h e n y la l c o h o l ：a l la r o m ap r o f i l e 。p e r f u m f l a v o r 19 9 8 ， 2 3 ：4 3 4 5 4 u sf o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n c o d eo ff e d e r a lr e g u l a t i o n so f21c f r l 01 2 2 2 0 0 1 5 b a u e rk ，g a r b ed s u r b u r gh ( 2 0 0 1 ) c o m m o nf l a g r a n c ea n df l a v o rm a t e r i a l s p r e p a r a t i o n ， p r o p e r t i e sa n du s e s w i l e y v c h ，w e i n h e i m 6 刘东亚微生物转化发酵法生产天然香料1 3 一苯乙醇的研究 d ： 硕士学位论文 无锡： 江南大学食品科学与工程学院，2 0 0 6 7 f a b r ec e ，d u v i a uv j ，b l a n cp j ，g o m ag i d e n t i f i c a t i o no fv o l a t i l ef l a v o u rc o m p o u n d s o b t a i n e di nc u l t u r eo f k l u y v e r o m y c e sm a r x i a n u s b i o t e c h n o ll e t t ，1 9 9 5 ，1 7 ：1 2 0 7 1 2 1 2 8 c h u n g j rh u a n g ，s h i o w - l i n gl e e ，c h e n g c h u nc h o u p r o d u c t i o no f2 - p h e n y l e t h a n o l ，a f l a v o ri n g r e d i e n t ，b yp i c h i af e r m e n t e n sl 一5u n d e rv a r i o u sc u l t u r e c o n d i t i o n s j f o o d r e s e a r c hi n t e r n a t i o n a l ，2 0 01 ，3 4 ：2 7 7 9 m m w e t s c h m a n n ，d 。s e l l & j s c h r a d e r s c r e e n i n go fy e a s t sf o rt h ep r o d u c t i o no ft h e a r o m ac o m p o u n d2 - p h e n y l e t h a n o li nam o l a s s e s b a s e dm e d i u m j b i o t e c h n o l o g yl e t t e r s ， 2 0 0 3 ，2 5 ：5 3 1 10 l o m a s c o l oa ，l e s a g e m e e s s e nl ，h a o nm ，n a v a r r od ，a n t o n ac ，f a u l d sc ，m a r c e l a e v a l u a t i o no ft h ep o t e n t i a lo fa s p e r g i l l u sn i g e rs p e c i e sf o rt h eb i o c o n v e r s i o no f l p h e n y l a l a n i n ei n t o2 - p h e n y l e t h a n 0 1 w o r l djm i c r o b i o lb i o t e c h n o l ，2 0 0 1 ，1 7 ：9 户1 0 2 1 1 k e g c 工p h e