（发酵工程专业论文）青霉TS67抗菌物质的制剂化研究.pdf

中文摘要 本研究拟将本实验室自己分离的生防菌株t s 6 7 开发为一种高效、广谱、廉价的生物 杀菌剂，为此对青霉t s 6 7 的液体发酵工艺、防病促生效果及制剂化工艺进行了初步研究。 以玉蜀黍平脐蠕孢菌( b i p o l a r i sm a y d i s ) 和大豆尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 为 指示菌株，验证1 1 株渤海海洋霉菌的抑菌活性。结果表明，菌株t s 6 7 对两种病原菌均有 很强的抑制作用，1 0 0 i - t l 发酵上清液对eo x y s p o r u m 和b m a y d i s 的抑菌圈直径分别达到了 2 0 3 r a m 和1 3 6 m m 。采用正交试验实验方法，研究了青霉t s 6 7 菌株的最佳发酵培养基， 结果表明蛋白胨、n a c i 和葡萄糖各因素对青霉t s 6 7 抗生素产量的影响依次减弱。发酵培 养基的最佳配方为葡萄糖1 、蛋白胨o 2 、n a c l 2 5 9 1 、吐温8 0o 1 。单因素实验证实 菌株t s 6 7 的最佳发酵条件为2 8 c ，1 7 0 r m i n ，8 的接种量，接种时间4 5 h ，上液量7 5 m l ， 起始p h 值为6 ，发酵培养9 6 h 。同时发现降低稳定期摇床转速能明显增加抗菌物质的产量。 在3 0 l 发酵罐中培养t s 6 7 菌株，在8 接种量，4 0 上液量，1 ：0 9 通气量，2 8 c1 5 0 r m i n 的条件下发酵培养至p h 4 8 ，所得发酵液对大豆根腐病效价为3 0 2 9 u m g ，发酵液对玉米小 斑病效价为2 7 3 5 u m g 。3 0 l 发酵罐最佳发酵条件为转速2 0 0 r m i n ，通气量1 ：0 9 v v m 。 采用盆栽试验的方法，通过病情指数和防治效率等指标研究青霉t s 6 7 菌株的发酵液、 发酵上清液和菌体对大豆根腐病及玉米小斑病的影响。实验结果的s p s s 统计分析表明， 青霉t s 6 7 的所有处理均能显著( p o 0 1 ) 抑制大豆根腐病及玉米小斑病的发生。而且用 青霉t s 6 7 进行大豆拌种能有效促进大豆幼苗生长。 采用6 0 8 0 饱和度硫酸铵对青霉t s 6 7 发酵液进行盐析，获得抗菌物质粗制品，并 以其为原药，通过表面活性剂的筛选和配伍，确定了3 种t s 6 7 微乳剂配方。 通过正交实验获得t s 6 7 最佳产孢培养基的配方为：蔗糖0 9 4 9 9 ，硝酸钠0 1 8 4 7 ，酵 母膏0 1 ，人工海水6 0 ，琼脂2 ，蒸馏水4 0 ，p h 6 。利用该培养基培养青霉t s 6 7 获得 分生孢子粉，并与载体油a n 成油剂，实验结果表明，当孢子粉含水量5 时，以孢子萌 发率为指标，该油剂可以在4 c 低温黑暗条件下贮存1 8 0 天。将贮存后的菌株t s 6 7 发酵培养， 其发酵液对大豆根腐病效价31 4 6 u r a g ，对玉米小斑病效价为2 6 4 5 u m g ，保持了新鲜t s 6 7 菌株7 6 的抑菌活力。 关键词：玉蜀黍平脐蠕孢菌；大豆尖孢镰刀菌；抑菌作用；盆栽试验；微乳剂；油剂 a b s t r a c t i no r d e rt o d e v e l o p e p e n i c i l l i u m s p t s 6 7 a sa ne f f i c i e n tb i o l o g i c a l g e r m i c i d e ，t h e f e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y , d i s e a s e - c o n t r o le f f e c ta n df o r m u l a t i o np r o c e s so fp e n i c i l l i u ms p t s 6 7 w e r em a i n l ys t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w ： f u s a r i u mo x y s p o r u ma n db i p o l a r i sm a y d i sa r eu s e da si n d i c a t i v es t r a i n s ，t h ea n t i f u n g a l a c t i v i t yo ff e r m e n t e dl i q u i df r o m11a n t a g o n i s t i cs t r a i n sw a sd e t e r m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t s t r a i n6 7c o u l di n h i b i tt h eg r o w t ho ft w op a t h o g e n i cf u n g i e sa n dt h ei n h i b i t i n gz o n ed i a m e t e ro f 1 0 0ulf e r m e n t a t i o nl i q u i do fs t r a i nt s 6 7t ob m a y d w a s1 3 6 m ma n dt oe o x y s p o r u mw a s 2 0 3 r a m t h eb e s tm e d i u mf o rs t r a i nt s 6 7f e r m e n t a t i o ng a i n e df r o mo r t h o g o n a le x p e r i m e n ti s g l u c o s e1 ，p r o t e i np e p t o n eo 2 ，n a c i2 5 a n dt w e e n 一8 0o 1 t h ee f f e c t so fp r o t e i n p e p t o n e ，n a c la n dg l u c o s eo na n t i f u n g a lm a t e r i a lo u t p u tw e a k e n e dg r a d u a l l y t h er e s u l to f s i n g l ef a c t o rt e s ti n d i c a t e st h a tt h eo p t i m u mf e r m e n t a i o nc o n d i t i o na r e2 8 ，t h ei n i t i a lp h6 0 ， v o l u m e7 5 m l 2 5 0 m l ，r o t a t i o ns p e e d17 0 r m i n ，i n o c u l a t i o na m o u n t8 ，i n o c u l a t i o nt i m e4 5 h ， c u l t u r et i m e9 6 h t h eo u t p u to fa n t i f u n g a lm a t e r i a lw a se n h a n c e dr e d u c i n gt h er o t a t i o ns p e e di n s t a b i l i z a t i o np e r i o d s t r a i nt s 6 7w a sg r o w ni na3 0 lf e r m e n t e r , t h ea n t i f u n g a lt i t r eo f10 0 u l t s 6 7f e r m e n t a t i o nl i q u i dt ob m a y d i sw a s2 7 3 5 u m ga n dt oe o x y s p o r u mw a s 3 0 2 9 u m g ，a t 17 0 r m i n 1 ，2 8 ，8 o fi n o c u l a t i o na m o u n t ，4 0 o fl i q u i dv o l u m ea n d1 ：o 9o fv e n t i l a t i o n v o l u m e t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no f3 0 lf e r m e n t e ri so f2 0 0 r r a i nr o t a t i o ns p e e da n d v e n t i l a t i o nq u a n t i t y1 ：0 9 t h r o u g hp o te x p e r i m e n t s ，t h ed i s e a s ei n d e xa n dc o n t r o le f f i c i e n c yo fc e l l ，t h ef e r m e n t a t i o n l i q u i dt h es u p e r n a t a n tf r o ms t r a i nt s 6 7s e p e r a t e l yt oe o x y s p o r u ma n db m a y d i sw a sd e t e c t e d e x p e r i m e n tr e s u l t sa n a l y s i sw i t hs p s ss t a t i s t i c a la n a l y s i ss o f t w a r ei n d i c a t e da l lt r e a t m e n t so f s t r a i nt s 6 7c o u l di n h i b i tb o t ho fs o y b e a nr o o tr o td i s e a s ea n dc o ms o u t h e r nl e a fb l i g h t ( p 0 01 ) f u r t h e r m o r e ，e x p e r i m e n tr e s u l t si n d i c a t e dt h a td r e s s i n gs e e d i n gw i t hs t r a i nt s 6 7o ns o y b e a n s e e dp r o m o t e ds o y b e a ns e e d i n gg r o w t h t h em u l t i p e p t i d ea n t i b i o t i cm a t e r i a le x t r a c t e df r o mt h ef e r m e n t a t i o nl i q u i do fs t r a i nt s 6 7 w a sc o n c e n t r a t e dw i t h6 0 一8 0 a m m o n i u ms u l f a t e s a t u r a t i o n u s i n gt h e c o n c e n t r a t e d f e r m e n t a t i o nl i q u i do fs t r a i nt s 6 7a sl a wm e d i c i n e ，t h r e ek i n d so ft s 6 7m i c r o e m u l s i o n f o r m u l a t i o nw a sd e t e r m i n e d t h r o u g hs u r f a c t a n t ss c r e e n i n g t h eo p t i m u ms p o r u l a t i o nm e d i u mi ss u c r o s e0 9 4 9 9 ，s o d i u mn i t r a t e0 18 4 7 ，y e a s t e x t r a c to 1 ，a r t i f i c i a ls e aw a t e r6 0 ，a g a r2 ，d i s t i l l e dw a t e r 4 0 ，p h6 0 t h es t o r a g ep e r i o d e x p e r i m e n to ft s 6 7f i n i s ho f ao i li n d i c a t e dt h a tt h es t o r a g ep e r i o dw a s18 0d a y sa t4 ci nd a r k e n v i r o m e n t ，u s i n gc o n i d i a lg e r m i n a t i o na sa l li n d i c a t i v ei n d e x t h er e s u l to fa n t i f u n g a lt i t r e e x p e r i m e n to fs t r a i nt s 6 7f i n i s h e ss t o r i n g18 0d a y sa t4 cs h o w e dt h a ti tr e t a i n e d31 4 6 u m gt o b m a y d i sa n d2 6 4 5 u m gt oe o x y s p o r u ma n di ti sa b o u t7 6 a n t i f u n g a la c t i v i t yo ff r e s ht s 6 7 s t r a i n k e yw o r d s ：f u s a r i u mo x y s p o r u m ；b i p o l a r i sm a y d i s ；a n t i f u n g a la c t i v i t y ；p o te x p e r i m e n t s ； m i c r o e m u l s i o n ；f i n i s h e s 科研情况说明以及学位论文使用授权声明 科研情况说明以及学位论文使用授权声明 论文发表情况 1 渤海海域霉菌对植物病原真菌抗性作用的研究( 河南农业科学2 0 0 7 8 ) 2 生防青霉t s 6 7 对大豆根腐病和玉米小斑病的防治效果评价( 微生物学通 报2 0 0 8 8 待发表) 二、参与课题情况 研究生期间参与天津市高校科技发展基金重点研究项目( 编号：2 0 0 4 z d 2 0 ) “渤海海洋微生物多样性及其活性代谢产物的研究 。 学位论文使用授权声明 学位论文作者同意授权天津商业大学将学位论文的全部内容或部分内容 编入有关数据库检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅 或借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 5 7 互- 霞 i m t 5 第一章前言 1 1 植物病虫害 “民以食为天”，因此农业生产是人类赖以生存的物质基础。然而，触目惊心 的事实是，每年病、虫、草害使全世界粮食减产3 5 5 0 ，其中植物病害占 1 0 - 1 5 心。 植物病害是严重威胁农业生产的自然灾害之一。病害发生严重时，可以造成 农作物严重减产和农产品品质变劣，影响国民经济和人民生活。带有危险性病害 的农产品不能出口，影响外贸，少数带病的农产品，人畜食用后会引起中毒。例 如1 9 4 2 1 9 4 3 年孟加拉国因大面积水稻遭受胡麻斑病的侵害，造成2 0 0 多万人饥 饿死亡；1 8 4 5 年爱尔兰因马铃薯晚疫病，造成数十万人死亡和1 5 0 万人外出逃 荒而移居到美洲。我国1 9 5 0 年，小麦条锈病大流行，损失小麦约1 2 0 亿斤。1 9 8 5 年甘肃省陇东地区小麦条锈病流行，减产7 亿斤。1 9 9 3 年的统计资料表明病虫 草害粮食减产1 0 4 【3 1 ，棉花少收5 2 2 。 1 1 1 玉米小斑病 半知菌亚门的玉蜀黍平脐蠕孢菌( b i p o l a r i sm a y d i s ) 主要危害玉米、粟、金 狗尾草、印度白茅等。它侵染玉米形成的玉米小斑病又称玉米斑点病、玉米南方 叶枯病，是玉米种植过程中普遍发生的真菌性病害之一。 玉米在整个生育期均可受到b m a y d i s 感染而发病，但以抽雄、灌浆期发病 较多。主要为害叶片，有时也可为害叶鞘、苞叶和果穗( 见图1 - 1 ) 。苗期染病 初在叶面上产生小病斑，周围或两端具褐色水浸状区域，病斑多时融合在一起， 叶片迅速死亡。在感病品种上，病斑为椭圆形或纺锤形，较大，不受叶脉限制， 灰色至黄褐色，病斑边缘褐色或边缘不明显，后期略有轮纹。在抗病品种上，出 现黄褐色坏死小斑点，有黄色晕圈，表面霉层很少。在一般品种上，多在叶脉间 产生椭圆形或近长方形斑，黄褐色，边缘有紫色或红色晕纹圈。有时病斑上有 2 3 个同一t l , 轮纹。多数病斑连片，病叶变黄枯死。叶鞘和苞叶染病病斑较大，纺 锤形，黄褐色，边缘紫色不明显，病部长有灰黑色霉层，即病原菌分生孢子梗和 分生孢子。果穗染病部着生不规则的灰黑色霉区，严重的果穗腐烂，种子发黑霉 变。玉米小斑病的病原真菌，借风雨、气流传播其分生孢子而直接侵入或从气孔 侵入玉米，并以休眠菌丝体和分生孢子在病残体上越冬进行再侵染。 第一章前言 早在1 9 2 5 年病原苗定名前后，世界各国就有不同程度玉米小斑病的发生。 1 9 7 0 年美国由于推广t 型细胞质雄性不育系配制的杂交种，造成玉米小斑病大 流行，当年损失玉米1 6 5 亿公斤、产值约1 0 亿美元，因超过1 8 4 0 年欧洲马铃薯 晚疫病大流行造成的损失而震动全球。此病在我国江苏早有发现，但一般发生在 多雨年份且多在玉米生长后期流行，很少造成严重损失。后来由于大面积推广感 病杂交种，小斑病的危害日趋严重，成为玉米重要的叶部病害。如2 0 世纪6 0 年代中期，河北石家庄和湖北宜昌由于小斑病的广泛流行，一般造成2 0 以上的 减产，严重者造成8 0 的减产，甚至毁种绝收。2 0 世纪7 0 年代后，随着抗病品 种的推广，小斑病的发生和危害基本得到控制，但由于抗病品种的大面积单一化 种植和全球气候的变暖，我国某些玉米产区小斑病仍时有严重发生，损失惨重。 图1 一l 玉米小班病田间症状( 左)叶部症状( 右) f i gi - 1s y m p t o m so f c o r ns o h e ml e a f b l i g h ti nf i e l d ( 1 e f t ) l e a f s y m p t o m s ( r i g h t ) 1 12 大豆根腐病 大豆根腐病首先在美国于1 9 4 8 年发现，随后在世界大豆主产区呈扩大蔓延 趋势。因其危害面积大，毁灭性强，在美国中北部大豆产区有4 1 6 7 的大豆 田被大豆疫霉根腐病菌侵染“。因此从二十世纪5 0 年代起，国外尤其是美国对 该病进行了系统深入的研究。发现该病害由镰刀菌( f u s a r i u ms p p ) 、立枯丝核菌 ( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 和腐霉菌 e y t h i u ms p p ) 等多种病原真菌引起，主要在苗 期发生，不同病菌引起的病害症状不近相同，但其共同点是根部腐烂，这些病菌 第一章前言 均以休眠菌丝或菌核度过不良环境，可以存活1 5 年以上。其中镰刀菌( f u s a r i u m s p p ) 侵染的植株引起的根腐病主要特征为：病株生育不良矮小，地上部萎蔫， 叶片逐渐变黄，以致全株枯黄萎蔫。后期靠地面的茎基部出现暗褐色乃至黑褐 色斑，其上生有粉红色霉状物。天气潮湿时可产生白色棉絮状菌丝体。植株萎 蔫，病株基部有粉红色霉层，茎维管束变褐。 大豆根腐病分布于世界各国的大豆主产区，我国多见于北方春大豆和南方 黄淮夏大豆生产区，其中尤以黑龙江东北部地区发生严重。特别是近年来，随着 黑龙江省大豆种植的面积扩大，重迎茬比例增加，使大豆根腐病的危害逐年加 重，对产量的影响越来越大，一般减产5 1 0 ，严重的可达5 0 9 0 ，甚至 绝产。 1 2 化学农药防治及其危害 玉米小斑病和大豆根腐病一直是玉米、大豆高产稳产的主要障碍。多年来主 要通过栽培抗病品种和化学药剂防治。虽然抗病品种在生产上对病害有一定的控 制和缓解，但是种质资源的狭窄没有得到根本解决；生产上品种的单一化以及玉 米小斑病、大豆根腐病病原菌生理小种的分化倾向仍令人担忧，因此一些品种很 容易失去抗病性，所以完全通过抗病品种实现病害防治有一定的难度吲。化学 药剂防治主要是施用多福合剂或多菌灵进行大豆拌种，多菌灵、代森锰锌、百菌 清等化学药剂进行玉米叶面喷施，但长期使用不仅对非靶标生物造成直接毒害， 产生环境污染，而且导致病原菌产生抗药性，使得防效下降。因此生产上只有加 大药量和施用次数，使农药用量大大提高，形成恶性循环，严重影响了人类的健 康和环境嘶】。 目前大面积使用的化学农药种类很多，主要是有机磷农药、氨基甲酸酯类农 药和金属有机物农药【刀。 有机磷农药是继有机氯农药问世之后于2 0 世纪4 0 年代出现的，主要是磷酸 酯类、硫代磷酸酯类，二硫化酸酯类化合物，如敌敌畏、1 6 0 5 、马拉硫磷和稻瘟 净等。该类农药一般在空气、有机溶剂和阳光下，性能稳定，但中心磷原子非常 亲电子，是显示生物作用的关键。它能吸附虫体内的胆硷酯酶，妨碍其正常功能， 引起昆虫的过激活动，发抖，痉挛和麻痹，直至死亡。它对病虫害的杀伤力是有 机氯农药的一二百倍，因此，它是高效的，同时，它在环境中和大多数生物体内 第一章前言 可因水解及氧化作用而分解为基本无危害的磷酸及其衍生物，为植物吸收利用， 不在环境中积累，也不通过食物链在人体内积累。但它对人畜是高毒的，它能抑 制人体中的乙酰胆硷酯酶、脂肪族脂酶及丝氨酸蛋白酶，使正常的神经功能被扰 乱，引起体内生物化学过程失调，出现呕吐、腹泻、大便失禁和血压高升病状， 最终导致死亡。因此，在使用时，必须采取戴橡胶手套、防毒眼睛、口罩和穿防 护衣等方法，避免吸入或与皮肤接触，造成急性中毒。 氨基甲酸酯类农药是2 0 世纪6 0 年代出现的一种高效、低毒和低残留的新型 农药，如西维因、巴沙等，该类农药的分解产物一般是无毒低残留的二氧化碳、 胺类、酚类和醇类，是一种比较安全的农药。但如果进入人体内，可干扰神经系 统使人出现头痛、腹痛、呕吐、血压升高和视觉模糊等症状，影响人体健康。 金属有机农药包括有机锌、铜、锡、汞和锰等有机化合物，如代森锌、代森 锰、赛力散和西力生。它们广泛地用于农作物和蔬菜的杀虫灭菌，但对环境及人 类易造成伤害，尤其是有机汞化合物极易在环境中积累，并随水在各处食品通过 食物链进入人体内，它与人体内酶上的s h 基团发生作用，使酶失去生理活性， 引起慢性中毒，直至死亡，现已禁止使用。拟除虫菊酯类杀虫剂也是我国目前使 用的高效低毒和低残留农药之一，它是蚊香的主要成分，也是防治蔬菜、谷物、 茶树和烟草草害的良好制剂，对人类、牲畜毒性极低，使用安全，但该农药可使 许多害虫迅速产生抗药性，大大限制了它的研究开发。 综上所述，目前植物病害的控制主要依赖化学杀菌剂，果蔬采后的防病处理 也以化学杀菌剂为主。但从2 0 世纪6 0 年代开始，政府和公众开始关注化学农药 所带来的危害，并开始寻找控制害虫的更为安全有效的方法。 进入2 1 世纪后，化学农药残留的危害已经引起了人们的高度重视，为适应 可持续发展战略的要求，恢复不断遭到破坏的生态环境，许多化学农药的使用受 到限制，许多高毒农药都已被强制停产，开发新型的、无残留的、无污染的农药 提上日程。在这种背景下，生物农药以其广谱、高效、安全、环境相容性好、选 择性强、害虫难以产生抗药性等特性脱颖而出，被誉为“绿色农药”，成为2 1 世纪农药发展的热点之一 8 】。 1 3 生物防治 第一章前言 生物防治是利用有益的活体生物本身或者是生物体代谢产物( 如捕食性或寄 生性昆虫、蜗类及其它动物、线虫、病原菌、病毒及其它微生物) 来防治农业有 害生物的方法 9 , 1 0 】。与传统化学防治相比，生物防治通常是控制而不是消灭病虫， 具有延迟效应，更具有选择性。是毒性低、选择性强、高效、低残留、不易产生 抗药性的病虫害控制方法，可为农产品优质安全生产提供技术和物质保障。 1 3 1 农用抗生素的发展与应用 抗生素是微生物的次生代谢产物，有效低浓度时，可通过生物化学作用对另 一种微生物的生长和代谢起抑制或杀灭作用。早在1 9 世纪人们就已经注意到微 生物间的拮抗现象。1 8 7 6 年，廷德尔发现青霉属的菌株能使试管中的细菌死亡； 1 8 8 5 年，巴贝斯在固体培养基上观察到葡萄球菌抑制其他葡萄球菌和炭疽杆菌 生长的现象【l l 】；1 8 9 4 年，梅契尼科夫研究了绿脓杆菌对霍乱弧菌的抑制，并注 意到空气和水中的细菌也有抑菌作用【1 2 1 。直到1 9 2 9 年，弗莱明发现在污染的青 霉菌落周围，葡萄球菌有被溶解的现象，并把青霉产生的杀死葡萄球菌的物质命 名为青霉素，抗生素才逐渐被引起人们重视。并于1 9 4 1 年获得提纯制品，次年 用于临床，治疗细菌感染的疾病，这是第一个用于医疗的抗生素。美国科学家 w a l k s m a n 在继弗莱明之后，首次将由放线菌产生的链霉素作为抗菌药物用于治 疗结核病和细菌感染的疾病并取得良好的效果3 】。1 9 3 9 年o x f o r da e 发现的第 一个抗真菌抗生素一灰黄霉素，1 9 4 7 年发现的的第一个广谱抗生素一氯霉素， 1 9 4 8 年d u g g e r 发现的第一个可供口服的抗生素一金霉素等，随着抗生素生产工 艺的成熟，抗生素进入了快速发展的阶段。 抗生素在防治人类疾病取得的成就推动了农用抗生素的发展，美、英、日等 国先后将链霉素、四环素等用于农作物病害防治。4 0 年代初日本就以水稻稻瘟 病为对象，开展新农用抗生素筛选的研究。1 9 5 8 年日本s e t s u o 等人研制成功杀 稻瘟素s ( b l a s t i c i d i n s ) ，并于1 9 6 1 年大面积用于田间防治稻瘟病并取得良好效 果。此后农用抗生素的发展进入了高潮，相继发现了防治水稻白叶枯病的灭孢素 ( c e l l o e i d i n ，1 9 6 0 ) ，抗稻瘟病的春日霉素( k a s u g a m y c i n ，1 9 6 4 ) ，抗水稻纹枯 病、梨黑斑病等的多氧霉素( p o l y o x i n ) ，抗水稻纹枯病有特效的有效霉素 ( v a l i d a m y c i n ，1 9 6 8 ) 以及对多种植物的白粉病有高效的灭粉霉素( m i l d i o m y c i n ， 1 9 7 1 ) 等。此外，在研究和应用抗生素杀菌剂的同时，人们开始有目的地筛选以 第一章前言 杀虫和除草为目的的新抗生素，相继筛选到了紫莱霉素( p o r f i r o m y c i n ) 、密旋霉素 ( p a c t a m y c i n ) 、普拉星隆( p r a s i n o m ) 、四活菌素( ( t e t r a n a e t i n ) 等杀虫活性物质及 b i a l a p h o s 、除璜霉素等除草抗生素，这些农用抗生素在实际应用中已充分地显示 出其高效、低毒、无公害的优越性。 我国的农用抗生素研究起步于二十世纪五十年代。尹萃耘先生1 9 5 3 年从陕 西泾阳分离到对棉花黄萎病有一定作用的“5 4 0 6 菌株，揭开了我国农用抗生素 研究的序幕。此后发展迅速，其中上海农药研究所开发的井冈霉素以它的高效、 安全、经济性代替了有机砷制剂，成为防治水稻纹枯病的首选药剂，至9 0 年代 的年产量稳定在3 0 0 0 4 0 0 0 t ( 以原药计) ，在防治对象上也有进展，除水稻纹枯病 外，近年来，已在水稻稻曲病、小麦纹枯病，及玉米纹枯病的防治中取得了很好 的效果。此外还开发和应用了春雷霉素、农抗1 2 0 、公主岭霉素、多效霉素等高 效农用杀菌抗生素。进入2 0 世纪八、九十年代，抗生素的研究开发进入一个新 的研究发展高潮，中生菌素、武夷霉素、宁南霉素等一大批抗菌素得到开发，其 中杀螨抗生素一浏阳霉素己在山东和湖南生物农药厂投入生产。9 0 年代初开发 的7 0 5 1 杀虫素不但能高效地防治抗性小菜蛾、菜青虫，尚且对多种蜗害、斑潜 蝇、梨木虱等多种害虫有效，年生产能力可达数十吨，而其用量仅为 3 0 0 m g 6 6 7 m 2 。经过几十年的研究探索，我国对新农用抗生素的筛选方法有较大 程度的改进和提高，己筛选出不少农用抗生素新品种，如井冈霉素、中生菌素、 灭瘟素、多抗霉素等，并己批量生产。 1 3 2 玉米小斑病和大豆根腐病的生物防治 对玉米小斑病的生物防治方面也有一些研究报道，主要的报道有：吸水链 霉菌应城变种( s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u sv a r y i n g c h e n g e n s i s ) 能产生抗生素对玉 米小斑病和棉花枯萎病等重要农作物的真菌病害有良好的防治效果n 钔；肠杆菌 属的产气肠杆菌的一个变种能够产生几丁质酶对玉米小斑病菌的细胞壁有分解 作用，因此对玉米小斑病原菌菌丝生长有抑制作用1 ；采用平板测定方法，发 现一株淡紫拟青霉菌株对玉米小斑病有抑制作用f1 6 谌晓曦等从b a c i l l u sc p 比淞 3 5 7 细菌中提取了只能在固体培养的条件下分泌的拮抗物质，该拮抗物质为非蛋 白类的脂溶性物质，它对玉米小斑病菌的生长有很强的抑制作用1 加。 对大豆根腐病的生物防治方面也有一些研究报道，如李春杰等报道从大豆根 第一章前言 际土壤中筛选到大豆尖孢镰刀秸抗菌1 8 b r r 2 2 ，其盆栽和大田防效分别达 4 5 9 和6 5 r i b 。王光华等报道从大豆根际土壤分离到一株生防细菌b r f 1 ，不 仅可有效抑制由尖孢镰刀菌引起大豆根腐病的发生，而且还具有促进幼苗生长的 作用粥。仝赞华和王学士报道，以我国大豆根腐病的主要致病菌镰刀菌为目标 进行了拮抗菌的室内筛选及温室测定，获得两株秸抗菌株，其温室防效分别达 7 7 0 和8 1 4 ，还发现这两株菌剂对豆苗的株高、鲜株重、根长、根重均表现 出良好的促进作用2 。 综上所述，玉米小斑病和大豆根腐病的生物防治基本上处于研究试验阶段， 还没有应用于田间或者是商品化的产品。主要原因是微生物制剂的防治效果较为 缓慢，易受到环境因素的制约和干扰，产品有效期短、质量稳定性较差。因此， 开发可替代或部分替代化学农药的新型生物农药，减少由化学农药的大量使用而 造成的危害，不仅具有一定的理论意义，而且具有重大的应用价值。 1 4 生防菌制剂 1 4 1 生防菌制剂概述 生防菌和化学农药有着本质的区别：微生物为活的生物体，而不是一种单一 具体的化合物，这些活体微生物既不溶于水，也不溶于“油 ，因此不能用传统 的农药加工工艺进行制剂加工。此外，微生物制剂d n - r 还必须考虑和解决两个问 题：一是在储存期内必须维持微生物的生命力，即保持其活性：二是施用后微生 物容易侵染寄主生物( 昆虫或植物) 。 对于生防菌大量生产和应用，极其重要的问题之一是要解决好剂型问题，因 剂型的优劣是能否在生物农药市场竞争中获胜的关键。真菌制剂必须具备两个特 点，一是使用方便，二是能稳定贮存。白僵菌制剂是国内外开发成功的生防制剂， 当真菌为拮抗菌时，其制剂化研究可以参考技术较为成熟的白僵菌生防制剂。 白僵菌是我国迄今生产最多、应用面积最大的一种杀虫真菌制剂，白僵菌的 侵染体有分生孢子、芽生孢子、菌丝体三种形式。其中，分生孢子是最常见的侵 染体，被加工成多种剂型，并依赖一定的施用技术( 喷雾法、喷粉法、撒施法) 引 入靶标环境，通过不同应用方式( 杀虫剂式放菌、引种定殖、接种式放菌) 防治多 种农林和卫生害虫( 蒲蛰龙和李增智，1 9 9 6 ) 。 白僵菌制剂的主要剂型包括可湿性粉剂、颗粒剂、油剂等，白僵菌分生孢子 第一章前言 粉剂是以分生孢子与粉状载体( 直径为o 1 4 0 m m ) 混合使用的产品形式，一般以高 龄土、滑石粉和草木灰作为粉剂填充料，在此基础上加入湿润剂则成为可湿性粉 剂，以水稀释喷雾使用，但由于湿润剂成分对孢子活力影响较大，故迄今成功不 多。颗粒剂是分生孢子与载体( 直径为1 1 5 r a m ) 混合搅拌而成的一种颗粒剂型，具 有制作简便、载体来源广等优点。乳剂则是利用乳化剂将分生孢子制成乳悬液的 一种制剂形式，该剂型有利于分生孢子分散和喷后在植物表面及昆虫体表的附 着，但多数对孢子活力影响较大，迄今成功的也不多。自1 9 8 2 年开始，我国广 东省就尝试用白僵菌乳剂防治马尾松毛虫旺，并于1 9 8 5 年研制出了一种适合白 僵菌分生孢子超低容量喷雾的油剂。采用油将白僵菌孢子粉稀释成悬液同时加入 一定量的助剂混合而成的制剂即为油剂，殷风鸣等曾用二线油配置白僵菌油剂， 但二线油来源有限，价格较高，大量使用有困难。m o o r e 等在研究黄绿绿僵菌 ( m e t a r h i z i u mj l a v o v i r i d e ) 分生孢子油剂时，证明以菜子油、花生油或色拉油作溶 剂油对孢子活性影响较小，加硅胶干燥后孢子制成的油剂( 同时加入有抗氧化 剂) ，分别在1 7 和8 c 下保存，1 2 7 周后，孢子的发芽率分别维持在6 0 和8 0 以上2 羽。 1 4 2 生防菌油剂概述 油剂是采用油将生防菌孢子粉稀释成悬液同时加入一定量的助剂混合而成 的一种制剂。由于油( 植物油和矿物油) 与亲脂性的孢子相容性良好，而且还是良 好的喷洒助剂，所以在开发杀虫剂和杀菌剂过程中备受青睐。与粉剂、水剂相比， 真菌孢子油剂比传统的水质悬浮剂更有传热力 2 33 , 油可充分提高对寄主的效果 ，2 钉。研究表明，在不同的温湿度条件下，相对于气生孢子，油剂的效果更好 2 4 - 2 7 ，最普遍的原理是由于植物、昆虫表皮的亲脂性，油滴比水滴的粘附性、 渗透性更好。植物油( 如向日葵、花生、大豆等) 具有有机物产生系统的优点，但 是它们易变质，也会残留下粘性物质而堵塞喷洒装置眩们。矿物油中很多成分具 有生物活性，且粘度不大。而且油剂可以使用超低容量喷雾而更引人注目 2 9 2 。 相对而言，石蜡油挥发快，残留少，它们常用于降低植物和矿物油的粘性 2 8 1 。 油剂的缺点是重量过大( 因此运输费高) ，有些植物油含有植物性毒素。 一般认为孢子粉含水量和贮存温度是影响白僵菌孢子粉贮存寿命的重要因 素 2 9 - 3 1 ，因为含水量过高会导致孢子提前萌发和自溶 2 7 , 2 9 。冯明光和应盛华 3 2 3 第一章前言 研究发现，球孢白僵菌孢子粉含水量和贮存温度通过交互影响内贮总糖和蛋白质 的代谢水平而影响孢子活力，贮存中孢子粉的活孢率与内贮营养物质的代谢水平 显著或极其显著相关。如在4 c 下含水量1 5 的白僵菌孢子粉仅能贮存6 个月， 而含水量降至8 贮存1 年，活孢率仍达8 1 3 ，故孢子粉含水量不超过1 0 才 有利于贮存 3 3 3 国外学者对黄绿僵菌m e t a r h i z i u mf l a v o v i r i d e ( g a m s & r o z s y p a l ) 贮存条件进行了深入研究，发现未经干燥的新鲜孢子粉在1 7 和8 c 下贮存，分 别经历9 周和3 2 周后活孢率均下降至4 0 以下；而经硅胶干燥保存的孢子粉在 相同条件下贮存1 2 7 周后活孢率分别为6 0 和8 0 ，1 6 0 周后分别为4 7 和6 8 b 们。将干燥的黄绿僵菌孢子粉及其油剂( 油中加入孢子粉) 分别在1 0 1 4 c 和2 8 3 2 的变温条件下进行贮存，8 0 天后油剂中的活孢率在分别为9 6 和8 5 ，同期 孢子粉的活孢率在较低变温下为9 5 ，而在较高变温下活孢率仅剩2 7 d 卯。通 过对7 株球孢白僵菌不同含水量( 2 3 3 2 ) 的孢子粉在1 0 、2 0 、3 0 、4 0 及5 0 的 梯度恒温下贮存的活孢率观察及模拟分析，5 左右的含水量被认为有利于贮存 3 6 3 。理想的白僵菌油剂，溶剂油必须新鲜、纯净、含水率低；孢子粉的含孢量 必须大于1 0 1 1 g ，活孢率在9 0 以上，含水量必须低于8 3 7 - 4 1 。 微生物农药虽然不会产生环境污染和残留等问题，但与化学农药相比，田间 防治效果慢且不稳定，因此在制剂开发和实际应用方面还需进一步研究m ，4 ”。 在剂型上也存在如下几个需要解决的难题：( 1 ) 产品在常温下保存期的延长。( 2 ) 超低容量使用的技术。( 3 ) 产品质量的主要指标及检测方法的确定4 引。按照 c o u c h & i g n o f f o d 的早期提法，生防菌制剂中的活性成分的常温贮存期必须达到 1 8 个月以上才有可能商品化，这对以活体孢子为基础的生防菌制剂而言显然过 于苛严，应急使用的制剂要求有3 - 6 个月的稳定期，但从实际角度，制剂中的孢 子在贮存一年以后的活孢率应达到7 0 以上。 1 5 化学农药制剂 1 5 1 现有化学农药剂型的种类 剂型加工好坏或制剂化程度的高低，已成为微生物农药开发成功的瓶颈。据 农药工业协会的调查报告，目前，国际上有5 0 多种剂型，按其形态可以分为3 大 类；即固体制剂、液体制剂和其他制剂。液态制剂主要有水基制剂和油基制剂。 水基制剂可以在细菌液体发酵后加入如稳定剂、黏着剂、表面活性剂、着色剂、 第一章前言 抗冻剂及附加的营养成分等制成，也可以先将液体发酵的细菌浓缩，乃至干燥后 重新再悬浮于液态培养基中进行加工。典型的油基制剂由预先处理过的发酵产物 ( 过滤、干燥) 、矿物油( 或植物油) 和乳化剂混合而成，可以用水稀释。 干制剂主要有可湿性粉剂、干悬浮剂和粒剂。干制剂加工中首先需要对发酵 物进行干燥处理( 可采用喷雾干燥、冷冻干燥或流化床空气干燥) ，然后再将干 燥的发酵物和载体、分散剂、湿润剂等助剂粉碎或造粒。加工干制剂的载体应廉 价、易灭菌、无毒、质地均一，而且必须保证原药能充分分散，同时须保护原药 免受环境中不利因素的影响。常用的有细黏土、泥炭、蛭石、褐藻酸盐或粒状聚 丙烯酰胺。 现阶段，我国农药剂型仍以乳油、可湿性粉剂等老剂型为主。据国际农药制 造商协会联合会( g 1 f a p ) 公布的资料，目前有6 2 种剂型。我国目前已登记的农药 剂型已有5 0 余种，但无论从制剂数量上，还是从制剂产量上，乳油、可湿性粉剂 剂均占有相当大的比重。以1 9 9 8 年为例，获得登记的1 9 6 8 种农药制剂，乳油9 1 9 种。可湿性粉剂4 4 7 种，分别占总量的4 6 1 7 和2 2 7 ，如以产量计算，则比例 更大。占总产量5 0 - 6 0 的乳油每年要耗费2 5 万t 、价值7 5 9 亿元的有机溶剂， 造成石油资源的大量浪费，而且严重污染环境1 。乳油是由农药原药、乳化剂、 溶剂制成均匀一致透明的油状液体h 们。可湿性粉剂是由农药加湿润剂和填料， 经机械粉碎而制成的混合粉状制剂。在水中容易被湿润、分散、悬浮，一般用于 加水喷雾使用。 发达国家从可持续发展的战略出发，限制或禁止大量使用甲苯、二甲苯配置 的农药乳油新品种注册登记。为了符合环境保护的要求和可持续发展的需要，国 际农药加工剂型的发展方向是：以水代替现有制剂( 乳油等) 中使用的有机溶剂( 甲 苯、二甲苯) 、以降低毒性，减轻药害，防止环境污染；以水分散颗粒剂代替粉 剂、可湿性粉剂，防止粉尘危害和使用时漂移到靶标外的作物上；控制药剂释放， 改进施药方法，以达到提高药效、节省劳力及减轻重量的目的。 1 。5 2 化学农药剂型的发展方向 农药制剂的传统剂型如：粉剂、乳油、可湿性粉剂、油剂等，有的药效低、 使用不便、对施药者安全性低和环境污染大。随着农药行业的发展和人们对环境 要求的提高，效果好、安全性高、操作省力方便的新剂型不断出现并陆续实用化。 第一章前言 新剂型发展表现出以下几个特点： ( 1 ) 剂型水基化以降低毒性、减轻药害及减少危险性。出现了微乳剂、水 乳剂、悬浮剂、悬乳剂等水基剂型。这些剂型是以水代替( 或部分代替) 传统的 有机溶剂作基剂，与传统剂型相比，该类制剂对生态与环境有益，几乎没有不愉 快的气味；不易燃烧，因此在运输与贮藏时较为安全；以水代替有机溶剂，通常 可以降低制剂对使用者的毒性，也可降低药害；还可节省大量有机溶剂；由于新 剂型一般具有较好的界面性质，药效高于传统剂型m 1 。 由于农药制剂理论和加工水平的发展，这些剂型无论在制剂性状、加工成本 还是对环境的影响方面都有很大改进。例如：过去由于微乳剂表面活性剂用量大， 成本高，制剂稳定性较低等原因，在大田用农药制剂中未得到推广。随着加工方 法与助剂品种及搭配的改进，目前很多微乳剂产品理化性质已相当稳定，成本大 为降低。例如，以水乳剂取代乳油制剂，不用或少用芳烃等有机溶剂，大大降低 了制剂毒性，同时降低制剂成本。 ( 2 ) 新型固体制剂再受青睐h 引。固体制剂主要是指制剂形态是固体的制 剂，主要包括粉剂、可湿性粉剂、粒剂、片剂等。在2 0 世纪8 0 年代以前，固体制 剂是农药制剂主要剂型，但随着有机氯产品的限制以及粉剂的粉尘、飘移和药效 低等诸多问题，固体制剂的用量大大降低。近年来，随着水分散粒剂、可湿性粒 剂、泡腾片剂等的大量使用，固体制剂的用量又有回升的趋势。新型固体制剂有 诸多特点：无粉尘污染，加工使用安全；易包装、运输；流动性好、使用方便、 药效稳定；有些制剂有效成分含量较高；适用于多种有效成分：与水的亲和性好， 分散均匀。 其中水分散粒剂与水有很