（发酵工程专业论文）绿色啤酒生产工艺研究.pdf

摘要 摘要 随着经济飞速发展，人们对于食品的安全性越发重视，啤酒作为一种大众消费品，实现 啤酒生产的安全化、绿色化已成为各大啤酒生产企业的发展趋势，农业部也出台了绿色食 品啤酒标准，提出了绿色食品啤酒的概念。本论文主要研究啤酒中甲醛的形成及其控锖， 在保证啤酒非生物稳定性的前提下，使成品啤酒甲醛含量在2 0 0 p g l 以下，符合绿色食品啤 酒标准。 研究发现，啤酒酿造原料中甲醛含量很低，带入麦汁中的甲醛只有7 0 p g i , 左右。在麦汁 煮沸过程中由于发生氧化，甲醛含量提高到1 4 0 “g l 左右，但远小于添加甲醛工艺( 3 0 0 “g i _ , 左右) 酵母代谢也能产生甲醛，峰值达到1 0 0 0 p g l 左右，通过对甲醛代谢影响因素研究后 发现，麦汁溶氧、麦汁浓度、酵母代数、接种酵母数、还原温度等工艺参数均会对甲醛代谢 产生影响。对发酵工艺参数研究后制定如下方案：充氧锅次麦汁溶氧在1 2 m g l 左右，接种3 代以内酵母，接种酵母数为2 1 07 个毫升左右，可降低成品啤酒中的甲醛含量。 本论文系统研究了啤酒贮藏过程中混浊物质的产生机理，不同的贮藏条件下，多酚物质 对敏感蛋白的选择性不同，造成啤酒非生物稳定性的不同，对敏感蛋白选择性越高，多酚物 质只能和敏感蛋白结合，啤酒非生物稳定性就好，反之则非生物稳定性较差，要增加啤酒的 非生物稳定性必须降低啤酒中的聚合多酚含量，同时也要控制总多酚含量，防止啤酒贮藏过 程中多酚物质发生氧化，结合对敏感蛋白的去除，啤酒的非生物稳定性将大大提高，很好的 解决了弃用甲醛带来的非生物稳定性问题。 本论文研究了啤酒稳定剂p v p p 和硅胶的吸附性质及其专一性，制定合理的添加方案， 节约成本。p v p p 在添加量较低的情况下有一定的吸附专一性，主要吸附高分子的聚合多酚， 但在添加量较高的情况下，不具备此性质，对单体酚的吸附迅速增加，会降低麦汁或啤酒的 抗氧化能力硅胶对混浊敏感蛋白质有一定的吸附专一性，而对泡沫蛋白影响较小，对硅胶吸 附的蛋白质进行氨基酸分析也证实了这一点。p v p p 和硅胶相互之间会产生干扰，影响其吸 附效果，在麦汁煮沸过程中添加p v p p ，p v p p 的吸附效果并没有太大损失，同时麦汁质量有 了很大提高，抗氧化能力增加，蛋白质沉降也比较彻底。 通过对混浊产生机理和啤酒稳定剂作用性质的研究后，制定了合适的无甲醛酿造工艺： 麦汁煮沸结束前2 0 r a i n 添加2 0 0 m g l 的p v p p ，啤酒过滤时添加1 5 0 m g l 的硅胶。通过5 0 千升大罐生产后，啤酒非生物稳定性与添加甲醛工艺相差不大，啤酒品质有了较大提升，风 味稳定性明显提高，结合对工艺参数的控制，使最终成品啤酒甲醛含量在2 0 0 熠几以下，检 测n 0 3 - 和游离二氧化硫的含量，分别为1 2 m g l 和6 m g l 左右，符合绿色食品啤酒的要求。 ， 关键词：甲醛，啤酒，绿色食品，p v p p ，硅胶 江南大学硕士论文 a b s t r a c t a st h ef a s td e v e l o p m e n to fs o c i a le c o n o m y , p e o p l ea r en o w p a y i n gm o r ea n dm o r ea t t e n t i o nt o f o o ds a f e 锣b e e ri sae o n n d _ o nc o n s u m a b l e ，t h ed r a s t i cc o m p e t i t i o n so c c u re v e r yy e a ri nc h i n a b e t w e e nb e e rp r o d u c e r s t h e yh a v et oi m p r o v eb e e rq u a l i t yt oa t t r a c tm o r ee o l 岱n n l e r s ，s og r e e n f o o db e e ri sag o o dc h o i c e a g r i c u l t u r a ld e p a r t m e n ta l s oi s s u et h e “g r e e nf o o db e e r s t a n d a r dt o g u i d eb e e rp r o d u c e r s n 塘f o r m a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o nc o n t r o lw a ss t u d i e di nt h i sp a p e r , i n c l u d i n g n o n e f o r m a l d e h y d eb r e w i n gt e c h n i q u ea n df a c t o r si n f l u e n c i n gf o r m a l d e h y d em e t a b o l i s m l i t t l ef o r m a l d e h y d ew a so b s e r v e di nb r e w i n gr a wm a t e r i a l ，l o w e rt h a n7 0 j t g l s o m e f o r m a l d e h y d ew a sp r o d u c e dd u r i n gw o r tb o i l i n gd u et oo x i d a t i o n y e a s tm e t a b o l i s ma l s op r o d u c e s f o m a l d e h y d e ，f a c t o r si n f l u e n c i n gf o r m a l d e h y d e m e t a b o l i s m i n c l u d i n g d i s s o l v e d o x y g e n c o n c e n t r a t i o n , o r i g i n a le x i r a c tc o n c e n t r a t i o n , y e a s tg e n e r a t i o n , i n o e u l u ms i z e ，r e d u c t i o nt e m p e r a t u r e a f t e r o r t h o g o n a lt e s t , t h eo p t i m a lb r e w i n gt e c h n i q u ew a s1 2 1 3 m g lo fo x y g e nc o n c e n t r a t i o n , y e a s t g e n e r a t i o n b e l o w 3w i t h a i n o c u l u ms i z e o f 2 x 1 0 7 e e l l m 1 i nt h i sp a p e rt h ep o s s i b l em e c h a n i s mo f h a z ed e v e l o p m e n tw a so b s e r v e d ，d i f f e r e n ta d s o r p t i o n s e l e c t i v i t yt oh a z ea c t i v ep r o t e i no fp o l y p h e n o lw a sf o u n du n d e rd i f f e r e n ts t o r a g ec o n d i t i o n t o i m p r o v eb e e rn o n - b i o l o g i c a ls t a b i l i t y ，t h ec o n c e n t r a t i o no fp e l y m e r i z e dp o l y p h e n o lm u s tb e d e c r e a s e d ，e x o r b i t a n tt o t a lp o l y p h e n o lc o n c e n t r a t i o na l s or e s u l t e dt ow o r s en o n - b i o l o g i c a ls t a b i l i t y o t h e r w i s e ，o x i d a t i o nw a sai m p o r t a n tf a c t o ri n f l u e n c i n gh a z ed e v e l o p m e n t i no r d e rt oe s t i m a t et h ee f f e c t i v e n e s so f b e e r n o n - b i o l o g i c a ls t a b i l i z e r , t h ea d s o r p t i o nc h a r a c t e r o fp v p pa n ds i l i c ag e lw a sa l s os t u d i e di nt h i sp a p e r , h p l ca n a l y s i ss h o w e dt h a tp v p ph a sa s e l e c t i v ea d s o r p t i o nt op o l y p h e n o lp o l y m e r sa tl o wp v p pd o s a g e ，b u tt h e 韶f l t l er e s u l tw a sn o tf o u n d a t1 1 i g hp v p pd o s a g e w h i l et h ec o n c e n t r a t i o no fs i m p l e p o l y p h e n o l sa n dm o n o m e r ss h a r p l y d e c r e a s e d t h ea m i n oa n a l y s i sr e s u l ts h o w e dt h a ts i l i c ag e lh a das e l e c t i v ea d s o r p t i o nt oh a z ea c t i v e p r o t e i n t h ei n t e r a c t i o no fp v p pa n ds i l i c ag e lw o u l dd e c r e a s et h e i ra d s o r p t i o ne r e c t i v e n e s s s o p v p pw a sa d d e dd u r i n gw o r tb o i l i n g ，t h ew o r tq u a l i t yw a si m p r o v e db yp v p p ，w o r ta n t i o x i d a t i n g a b i l i t yw a so b v i o u s l yi n c r e a s e dt o g e t h e rw i t l lat h o r o u g hp r o t e i nd e p o s i t i o n t h ea d d i t i o nt e c h n i q u ew a so b s e r v e da f t e ra d s o r p t i o nc h a r a c t e rw a ss t u d i e d 2 0 0 m g lo f p v p pw a sa d d e dt ow o r td u r i n gw o r tb o i l i n g , 1 5 0m g lo fs i l i c ag e lw a sa d d e dt o g e t h e rw i t hb e e r f i l t r a t i o n t h eb r e w i n gt e s tw a so p e r a t e di n5 0t o nv e s s e l b e e rb r e w e dw i t h o u t a d d i n g f o r m a l d e h y d eh a dab e t t e rf l a v o rs t a b i l i t ya n das a m en o n - b i o l o g i c a ls t a b i l i t yc o m p a r e dt ob e e r a d d i n gf o r m a l d e h y d e t h eb r e w i n g i n d e xw a sa l s oc o n t r o l l e d r u d i m e n t a l f o r m a l d e h y d e c o n c e n t r a t i o nw a sb e l l o w2 0 0 g l k e yw o r d s ：f o r m a l d e h y d e ，b e e r , g r e e nf o o d ，p v p p ，s i l i c ag e l ” 独创性声明 本人声嘲所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文串誉包含其他入毫经发表或撰写逑的褫究成果，氇不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与貔一蜀工作的辩恚对本研究所镞瓣经何贡献均邑在论文孛作7 饔 确的说明并表示谢意 麓名：招! ! ! ：筮日期：“年月廖日 关于论文使用授投的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：旺南大学鸯投保留劳良国家有关部n 或机构送交论文的复印件和 磁擞，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 t ， 入有关数据瘁进行硷索，珂跃采用影印、缩印或扫描等复制罩蟹黛存、 。+ 、 枢缎学位论文，并且本人电子文档的内容和纸鲠论文鼹内释相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名：毽! 坠 毯期：j 。菇笨5 月理秘 第一章绪论 第一章绪论 1 1啤酒非生物混浊概述 澄清饮料在被消费者购买之前应当始终保持澄清。啤酒在贮藏过程中保持澄清的性质称 为啤酒非生物稳定性，造成啤酒非生物稳定性变差的原因有很多，如淀粉质、戊聚糖以及草 酸盐的结晶，但是啤酒中最常见的混浊便是蛋白质一多酚混浊。 虽然像混浊活性蛋白和多酚为何会具有混浊活性等方面的研究已经进行一段时间了，但 是最近研究得出的两者含量之比与混浊形成之问的关系，使人们对一些测定混浊活性物质的 方法原理以及一些稳定化处理方法的机理有了更深的理解。 1 1 1啤酒非生物混浊 啤酒的非生物混浊主要包括冷雾浊和永久性混浊( 又称氧化混浊) 。欧洲酿造协会( e b c ) 定义如下：冷雾浊主要是指那些在0 1 2 保藏时产生而当温度上升到2 0 又溶解的混浊，永久混 浊是指那些在2 0 以上温度仍不能溶解的混浊。 1 1 。2啤酒非生物混浊形成机理 蛋白质+ 多酚 j1 ( 蛋白质) 。( 多酚) 。由氧、金属离 ( 蛋白质) 。( 多酚) b 靴 ( 蛋白质) 。( 多酚) y 冷雾浊永久混浊 图1 1 啤酒非生物混浊形成机理 1 1t h ep a t t e r no f f o r e j a gb e e rh 从图1 1 可以看出。啤酒的非生物混浊主要是蛋白质和多酚物质( 单宁) 的结合所致， 在开始阶段多酚和蛋白质的反应进行的很微弱，形成的结合物很容易重新解离成游离的蛋白 质和多酚，是一个可逆过程。在氧和金属离子的作用下，多酚类物质发生进一步的氧化聚合， 同时结合蛋白质的能力很快上升，且形成的结合物不易被解离，便形成了永久性混浊。 1 1 3 多酚蛋白质反应模式s i e b e r t 反应模式和c h a p o n 嘲平衡方程 s i e b e r t 在实验的基础上，提出了一种蛋白质、多酚作用模式( 见图1 2 ) 该模式认为一 个多酚物质最多能接两个蛋白质，如果啤酒中敏感蛋白过量，则每个多酚分子都与两个蛋白 分子作用形成二聚体，但不能进一步形成交联结构，产生混浊；如果敏感多酚过量，则蛋白不 能提供足够的结合点与之交联，也形不成混浊；如果啤酒中混浊敏感蛋白与混浊敏感多酚基本 等量，含量也较高，便能形成大量的混浊。即使是低分子的多酚以及简单酚，只要它们的浓 度足够大，也能在蛋白质的表面形成疏水层而使蛋白质沉淀出来。 江南大学硕上论文 够i t g = 嚏白周 料牲长 她。乒 图1 2s i b e r t 多酚和蛋白质反应模式图 脚1 2c o n c e p t u a lm e c h a n i s mo f p r o t e i n - p o l y p h e n o li n t e r a c t i o nb y $ i e b e r t s i e b e r t 的多酚与蛋白质反应模式与c h a p o n 提出蛋白质一多酚平衡方程相一致： p + 1 l p t ( 可溶性) 一一p t ( 不可溶) p ：蛋白质t ：多酚 c h a p o n 认为，正常情况下，成品啤酒中p 、t 单体物质平衡存在；若除去待滤酒中的p 或t ， 则会使平衡向单体方向移动，增强啤酒的稳定性。 1 1 4 混浊活性蛋白质的本质 很久以前就有人研究发现混浊啤酒中的混浊蛋白是大麦醇溶蛋白( 一系列醇溶的，富含 脯氨酸的蛋白质，主要来自于啤酒大麦) ，此后，对混浊蛋白的氨基酸分析结果证实了这一 观点【3 】。啤酒中的混浊活性蛋白由很多不同分子量的物质组成，说明啤酒混浊蛋白不是来自 于大麦中的醇溶蛋白就是来自于一种或多种这类蛋白在糖化过程中的水解物。 由于混浊蛋白质富含脯氨酸，混浊物质产生量与蛋白多肽中脯氨酸摩尔含量成线性关系 ( 见图1 3 ) ，而不含脯氨酸的蛋白多肽则不显示混浊活性，尝试几种蛋白多肽后，结果均是 如此，甚至把这些蛋白多肽和多羟基脯氨酸结合也不出现混浊【4 】。此外，多酚物质同蛋白质 结合能力还与多酚物质的聚合度有关，随着聚合度的增加，多酚物质结合蛋白质的能力增加， 形成混浊的能力也相应增加( 见图1 4 ) 。 位质结置酚感多辕 铺 繇 一长 脯氨酸含量( m o 舶) 圈i j 脯氨酸含量与混浊物质产生量关系p l f i g 1 3 r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e m o l e p e r c e n t o f p r a l i n e a n d h a z e f o r m e d 莓 v 舞 1 6 1 2 8 4 0 0l2 3 4 聚合度 图1 4 聚合度与混浊物质产生关系用 脚1 4 e f f e c to f d e g r e eo f p o l y m e r i z a t i o no l lh a z ef o r m e d 1 1 5 混浊活性多酚的本质 单酚和绝大部分的单体多酚与敏感蛋白结合后均不能产生混浊【6 l 。但是一些二聚体以上 的花色素原具有很强的混浊活性，并且混浊产生量随着聚合度的增加而增加。 多酚物质结合蛋白质能力还与多酚物质所带酚羟基的数量以及酚羟基的相对位置有关， 邻位的酚羟基结合蛋白质的能力要高于间位的酚羟基，多酚物质所带酚羟基越高则结合蛋白 质能力越强( 见图1 5 ) 。 01234 j 多酚物质含量( m o l , i c g ) 图1 5 不同多酚物质与蛋白质结合后的释放能量【_ 7 】 f i g 1 5e n e r g yr e l e a s e dw h e np o l y p h e n o l sb o u n dt ob o v i n es e r u ma l b u m i n o 彩 渤 彤 啪 io膏蚕v m m 母皿 r 江南大学硕上论文 h 。o t - o h 洲h v o h ( ) - c a t e c h m o h e f3 c a t e c h i n o h 护1 l o c d t 吼h 图1 6 啤酒中主要的原花色素单体结构 n 粤1 6 $ t r n c 4 u r ( 目mo f t h ep r o a n t h o c y a n i d i nm o n o m e r s t y p i c 曩i 眇f o u n di nb e e r h 咯h 婚h o h o ho h p r o c y a m d mb 3p r o d e l p h m l d i nb 3 图1 7 啤酒中两种主要的二聚体多酚物质原花青素岛与原花翠素码结构 f 嘻1 7 s t r u c t u r e so f p r o c y a n i d i n1 1 3a n dp r o d e l p h i n i d i n 甄t h ep r o m i n e n tp r o a n t h o c y a n i d i nd i m e r si n b e e r 啤酒中的混浊敏感多酚主要是由一系列的类单宁类物质构成，它们是儿茶素、表儿茶素、 蓓儿茶素的单体、二聚体、三聚体以及多聚体( 见图1 6 ) 。其中两种最重要的二聚体原花色 素物质原花青素b 3 ( 儿茶素- - ) l 茶素) 、原花翠素b 3 ( 蓓儿茶素- ) l 茶素) ( 见图1 7 ) 的含量与混浊的形成呈线性关系( r = o 9 6 5 ) 。如果按照图1 5 所述的结合力关系，儿茶素和 表儿茶素都有一个中等结合力位点和一个弱结合力位点。蓓儿茶素应该有一个强结合力位点 和一个弱结合力位点。原花青素b 3 ( 儿茶素- ) l 茶素) 应该有两个中等结合力位点和两个弱 结合力位点，而原花翠素b 3 ( 蓓儿茶素- ) l 茶素) 则有一个强结合力位点、一个中等结合力 位点和两个弱结合力位点，因此原花翠素b 3 比原花青素b 3 有更强的混浊活性【8 j 。 1 1 6 混浊物质生长模式 混浊物质的生长要经过两个时期凹，第一个阶段样品的浊度几乎保持不变，然后在第二 阶段，样品的浊度呈线性增加。在开始阶段，蛋白质一多酚结合物不够大，因此保持可溶状 态，同时，其他化学反应却在不断的进行，当蛋白质一多酚结合物足够大的时候，就会析出 产生混浊，使浊度线性增加。m c g u i n n e s s 和g a r d n e r 提出了两种可能的机理( 见图1 8 ) 。一 o 墨= 兰丝丝 种机理是由于多酚物质的氧化聚合，分子量变大，使得其更容易和蛋白质发生反应，产生混 浊。另一种机理是由于多酚被某种物质活化，使其更容易和蛋白质发生反应，产生混浊。有 人通过用放射性同位素示踪显示，表儿茶素在啤酒中并不发生聚合【l o 】，只产生少量的混浊， 但是二聚体的儿茶素却很容易和蛋白质结合产生混浊，似乎第一种机理的可能性大一点。 d e r d e l i n c l x 和j e r u m a n i s 发现二聚体的原花色素在啤酒或麦汁中会发生解聚，m c g u i r l r t e s s 等 人研究发现在溶氧很低的情况下，高二聚体儿茶素含量的啤酒可以有很长的货架期，同样高 溶氧的啤酒，如果二具体儿茶素含量很低的话也可以有很长的货架期，似乎又支持第二种假 设。到底是哪一种机理可能性更大还有待进一步的研究工作。 单酚 l聚合( 机理复杂) t 聚合酚 i i多种蛋白质 t 蛋白质一多酚结合物物 i l结合及。长大” ， 混浊物 聚合酚 i i活化( 氧化过程) 活性多酚物质 i i多种蛋白质 ， 蛋白质一多酚结合物物 i i 结合及。长大” t 混浊物 图1 8 两种可能的混浊生长模式 n 备1 s p o s s i b l em e c h a n i s m sa c c o u n t i n gf o r t h eo b s e r v e dp a t t e r no f h a z ed e v e l o p m e n ti nb ( r o 1 2绿色食品啤酒概述 1 2 1绿色食品啤酒 农业部在2 0 0 2 年制定了绿色食品啤酒标准( g b n y t 2 7 3 2 0 0 2 ) ，对绿色食品啤 酒的概念做了明确规定，绿色食品啤酒更注重啤酒的营养型和安全性，着重提出了啤酒中超 过一定限量的、对人体有害的游离二氧化硫、甲醛和硝酸根离子的限量标准，以及它们含量 的检测方法，在这三个指标中，游离二氧化硫和硝酸根离子的来源有限也比较容易控制，二 氧化硫可以作为啤酒抗氧化剂添加到啤酒中去，使啤酒中游离二氧化硫含量大大增加，但目 前在啤酒中已经很少采用硝酸根离子主要来源于酿造用水，与发酵过程关系不大，因此只 要对酿造用水进行预处理便能有效减少成品啤酒中硝酸根离子的含量。啤酒中甲醛含量的控 制比较复杂，甲醛来源很广，糖化外加甲醛，酿造原料中也普遍存在甲醛，甚至酵母代谢也 会产生，控制起来比较复杂，因此本论文主要研究成品啤酒中甲醛含量的控制。 1 2 2 啤酒中的甲醛 啤酒残留甲醛的来源有很多方面( 见图1 9 ) ，首先是啤酒酿造原料( 麦芽、酒花、辅料、 酿造用水等) 中含有微量的甲醛，一般不足5 0 峙，l 。然后便是糖化过程中添加甲醛，这也是 目前争议最多的，一般添加量在1 5 0 2 5 0 m g k g 麦芽，但是这部分甲醛在经过煮沸后大部分 被挥发掉了，残留量一般在2 0 0 舭以下。在发酵过程中酵母代谢也会产生一部分甲醛，而酵 母代谢甲醛过程包括产生甲醛和还原甲醛两个阶段，要降低啤酒中甲醛的残留量必须从工艺 上控制甲醛的生成，加大甲醛的还原程度。 矗 江南大学硕士论文 麦芽添加甲醛酵母代谢 辅料，原料-糖化卜发酵+ 啤酒 酿造用水 图1 9 啤酒中甲醛的来源情况 脚1 9 t h eo r i g i no f f o r m a l d e h y d ei nb e e rp r o d u c t i o n 1 2 - 3无甲醛酿造绿色啤酒生产工艺的提出 国内的啤酒生产厂家特别是中小型企业在糖化过程中添加甲醛，目的是为了除去花色苷， 作用机理是甲醛与蛋白质分解物酰胺生成内酰胺树脂，它能吸附花色苷形成沉淀，从而去除 麦汁中一部分花色苷类物质。然而，甲醛添加后主要减少的是啤酒中的小分子多酚，啤酒多 酚的聚合度迅速上升，造成啤酒还原力下降，很容易造成啤酒老化i l “，风味粗糙，且由于甲 醛具有很强的毒性，是被我国法律明令禁止添加到食品中去的，虽然甲醛在糖化煮沸后残留 量很少。但是从保护消费者健康以及提升产品自身品质的角度考虑，越来越多的啤酒生产商 正在努力寻求合理的低成本的无甲醛酿造啤酒工艺以达到彻底弃用甲醛的目的，这也是啤酒 行业发展的趋势。 无甲醛酿造工艺取消了在糖化过程中添加甲醛，带来的啤酒非生物稳定性方面的问题可 以通过两方面加以解决，一是改善啤酒生产工艺，降低啤酒中蛋白质或多酚的含量，提高啤 酒非生物稳定性。二是寻求有效的甲醛替代品。现在企业采用比较多的主要有蛋白酶类如木 瓜蛋白酶等，蛋白质吸附剂如硅胶、单宁、卡拉胶等，多酚吸附剂如p v p p 等，企业主要面 临的主要困难是如何既保证产品非生物稳定性，又不增加较多的生产成本。 1 2 4目前主要几种啤酒非生物稳定剂 1 2 4 1 卡拉胶 卡拉胶是一种从海藻中提炼的高分子聚合碳水化合物，卡拉胶作用机理是其阴离子基因 可与麦汁中带正电荷的高分子蛋白质通过静电吸引形成结合物并迅速的促使各种微小蛋白质 凝聚成大片絮状物以加快沉降。 卡拉胶一般在麦汁煮沸或回旋沉淀时添加，添加量在3 0 m g l 。可很好地去除麦汁热凝物 质，但对成品啤酒中蛋白质组分影响不大。一般与其他麦汁澄清剂结合使用。 1 2 4 2 硅胶 啤酒硅胶类型主要是：一种是硅水凝胶，含有约7 0 水分；另一种是硅干凝胶，含有约 一一一5 的水分使用水合硅胶可以减少企业粉尘污染。两种类型都是多孔结构，表面覆盖着硅羟 基( s i o h ) 基团，这些基团键合蛋白质的脯氨酸位置的能力相当强，因此，硅胶对敏感蛋白的 吸附有很强的专一性。而对泡沫蛋白的吸附不是很大，只有当硅胶用量过大的时候才会吸附 一些泡沫蛋白，因此硅胶使用时一般在7 0 0m g l 以下，一般添加量在3 0 0 6 0 0m g l ，可以 岳 第一章绪论 同其他稳定剂结合使用。 1 2 4 3 单宁 单宁是与多酚类物质具有十分相近结构的黄烷醇类物质聚合体。酿造过程中加入单宁相 当于增加了敏感多酚的含量，与蛋白质发生作用，形成更多的混浊沉淀。单宁产品主要包括 两种：单宁b 和单宁r ，分别在糖化麦汁煮沸和啤酒过滤时添加，用量在3 0 7 0m g l 之间。 单宁的分子量大小及分布不一，可能影响蛋白质的去除效果，这是在选择和使用单宁类 物质时特别需要注意的方面。此外，使用单宁处理会形成凝胶状沉淀，啤酒损失大，且需要 低温贮藏一段时间，以防止过滤时造成堵塞，同时过量添加单宁会影响啤酒的泡沫和风味。 1 2 4 4p v p p 聚乙烯聚吡咯烷酮( p o l y v i n y l p o l y p y r r o l i d o n e ，简称p v p p ) 是一种经提纯的乙烯毗咯烷酮均 聚物在催化条件下，通过聚合和交联作用所得的一种聚合物。 在p v p p 分子结构中存在着与聚合度相同数量的酰胺键，而p v p p 的吸附机理就是通过和 啤酒中的物质以氢键结合以达到吸附的目的，啤酒中的类单宁物质的分子量在5 0 0 3 0 0 0 ，主 要是低聚多酚、花色苷类物质，含有较多的酚羟基，酚类物质结构中的碳原子和氧原子的p 电子对可以形成共轭的大兀键，使酚羟基上的氢原子带上正电荷，极易与p v p p 的酰胺键作用， 因此p v p p 可以特异性吸附啤酒中的单宁类多酚物质。 p v p p 一般在啤酒过滤时添加，与啤酒接触时间短，p v p p 一般分为两种，可再生型p v p p 和不可再生型p v p p ，一般用量分别为5 0 0m g l 和1 0 0 2 0 0m g l 。可再生型p v p p 使用一次损 失在4 6 。 1 2 4 5 蟹白酶类 。 添加蛋白酶主要是分解啤酒中的蛋白质，使蛋白质分子减小，多酚一蛋白质复合物也相 应减小，不容易产生沉淀。蛋白酶一般在糖化过程中添加，添加量一般在2 0 m g a 3 0 m g l 。 蛋白酶本身也是蛋白质，过量添加反而会增加啤酒混浊。同时由于蛋白酶也可以切割啤酒中 的泡沫蛋白，影响啤酒泡沫稳定性，生产中需要添加泡沫稳定剂，所以需慎重使用蛋白酶。 1 3立题背景和意义 随着人民生活水平的提高，人们对食品安全、健康状况的关注也多了起来，从2 0 0 3 年开 始，每次的啤酒甲醛风波更是在国内引起轩然大波，对我国啤酒企业形象造成的很大的伤害。 我国是啤酒生产大国，去年的产量已经达到了3 0 6 0 万千升。2 0 0 5 年，绿色啤酒已经成为了 各大啤酒节上的热点，更是啤酒品质提升和价格上涨的头块招牌。生产健康啤酒的呼声也越 来越高，绿色啤酒的概念也日益深入人心，这必将成为今后中国啤酒业的发展趋势。 目前虽然有啤酒厂家开发出了无甲醛酿造工艺，但是存在着一定的局限性，适用性不广 泛，成本较高，一般只适用于高档酒的酿造；同时甲醛残留量也不稳定，甚至有些批次啤酒 中的甲醛含量还高于添加甲醛工艺的产品。 无甲醛酿造工艺的开发是一项系统工程，各个啤酒生产企业原料、设备条件参差不齐， 要想解决无甲醛酿造带来的非生物稳定性问题，就必须了解一些稳定剂的吸附性质以及作用 效果，针对自身企业实际，确定合适的添加工艺和添加量，在保证质量的同时，尽量降低生 产成本。此外，还必须控制甲醛在成品啤酒中的残留量，国家农业部也出台了绿色啤酒中的 江南大学硕士论文 甲醛限量指标，对啤酒中甲醛含量做了明确的规定，规定绿色啤酒中甲醛残留量不得高 2 0 0 p g l 本课题的关键便是寻求合适的啤酒稳定剂，通过对其吸附性质的系统研究，根据啤酒非 生物混浊的产生机理，确定合适的添加工艺，保证弃用甲醛后啤酒非生物稳定性；同时研究 啤酒酿造各个环节甲醛的代谢情况，降低甲醛在成品啤酒中的残留量，使成品啤酒中甲醛含 量符合农业部绿色啤酒标准。 1 4 课题主要的研究内容 本课题的研究内容主要包括： 对啤酒非生物混浊的产生机理进行研究，寻求控制啤酒非生物混浊的有效途径以及关键 控制点。 啤酒稳定剂( 硅胶、p v p p ) 吸附性质研究，确定合适的添加工艺，保证无甲醛酿造啤酒 非生物稳定性，并对不同吸附剂的作用效果进行评价。 研究酿造过程中影响甲醛代谢的因素，优化工艺，降低甲醛在成品啤酒中的残留量，并 通过工业化生产实验，使最终的产品符合农业部绿色食品啤酒标准。 第二章甲醛来源及代谢影响因素研究 第二章甲醛来源及代谢影响因素研究 2 1 前言 啤酒中的甲醛主要来源于外加以及酵母代谢过程，甲醛本身是一种毒性物质，并且 能在人体中有一定的积累0 2 1 0 出于对食品安全以及提升啤酒品质的考虑，国内绝大部 分企业已经停止了在啤酒酿造过程中外加甲醛。国家农业部也制定了绿色食品啤酒标 准，明确规定了绿色食品啤酒中甲醛含量要受o o “g l 。 啤酒残留甲醛的来源有很多方面，首先便是啤酒酿造原料( 麦芽、酒花、辅料、酿 造用水等) 中含有微量的甲醛，一般不足5 0 i l g l 然后便是糖化过程中添加甲醛，这也 是目前争议最多的，一般添加量在1 5 0 2 5 0 m g k g 麦芽，但是这部分甲醛在经过煮沸过 程后大部分的甲醛均被挥发掉了，残留量一般在2 0 0 p g l 以下。由于微生物代谢也会产 生甲醛，因此在发酵过程中由于酵母代谢，也会产生一部分甲醛，而酵母代谢甲醛包括 产生和还原两个阶段。 目前有关甲醛代谢的研究表咧1 3 - 1 0 】甲醛代谢途径主要如图2 1 所示，当中涉及的酶 类主要有甲醇脱氢酶( m e t h a n o ld e h y d r o g c n a s e ，简称m o d h ) 、甲醛脱氢酶( f o r m a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e ，简称f d d h ) 、甲酸脱氢酶( f o r m a t ed e h y d r o g e n a s e ，简称f d h ) ，啤酒 中的甲醛主要来自于甲醇的氧化脱氢，在甲醛脱氢酶的作用下又继续氧化成甲酸，然后 在甲酸脱氢酶作用下继续氧化生成二氧化碳，而同时m o d h 的作用是双向的，在甲醛产 生以后，其也会将甲醛还原，这一点类似于双乙酰在醇脱氢酶作用下的还原，因此甲醛 只是甲醇氧化的一个中间代谢产物，其经历一个先积累后还原的过程。在这过程中与甲 醛积累最关键的酶便是f d d h ，f d d h 的活性与微生物耐受甲醛能力有很大关系，而谷 光甘肽( o l u t a t h i o n e ，简称g s h ) 的存在能加大f d d h 的作用效果【1 7 4 9 l 。 f d l ) i - i c h 3 0 h h d +n a d i i i i + l 图2 1 酵母甲醛代谢途径i 枷 f i g 2 1 t h em e t a b o l i s ma p p r o a c ho f f o r m a l d e h y d e 缸y e a s t 2 2 材料与方法 2 2 1 试剂与设备 4 - a m i n o 3 - h y d r a z i n o - 5 m e r c a p t o 1 ，2 ，4 一t r i a z o l ( 4 一氨基一3 一联氨- - 5 巯基一l ，2 ，4 一三氮杂茂，简称a h m t ) ，分析纯： s i g m a 公司提供； 甲醛、k 1 0 4 、e d t a 、k o h ，分析纯； 悉 h 弋 o 蝴 一 c 槲 一 缸 村 一 蝌 了n 日一、， 7 p 删i - 一 m 一o，酉 辄， 一 k ( 一 。y l l 肿 啦，一 ， 毗、面i f罢 江南大学硕士论文 7 2 1 数字式分光光度计，上海；o r b i s p h e r e3 6 5 0 型溶氧测定仪，瑞士； 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 甲醛含量的测定 参见农业部 绿色食品啤酒标准，g b n y 厂r 2 7 3 2 0 0 2 。 2 2 2 25 0 千升大罐发酵工艺 选择优质的麦芽，辅料为大米，用量为3 5 ，糖化麦汁浓度9 度，煮沸时间为8 0 r a i n ， 主酵温度为9 ( 1 1 度麦汁主酵温度为1 1 ) ，接种酵母数为1 5 x 1 0 7 个毫升，当双乙 酰降至o 1 m e , l 以下时，开始降温，在0 y 2 低温贮藏6 7 天，然后倒罐，3 天后过滤。 2 2 。2 3 三角瓶发酵实验 ( 1 ) 麦汁溶氧对甲醛形成的影响 取6 组5 0 0 m l 三角瓶，灭菌，每组依次加入充氧时间2 0 m i n 、4 0 r a i n 、6 0 m i n 、8 0 m i n 、 l o o m i n 、1 2 0 r a i n 的麦汁3 0 0 m l ，同时记录麦汁的溶氧，每组设三个平行样，接种量为 1 5 x 1 0 7 个毫升，进行发酵，每天跟踪检测甲醛含量。 ( 2 ) 不同酵母代数对甲醛形成的影响 取5 组5 0 0 m l 三角瓶，加入3 0 0 m l 麦汁，灭菌，依次接入o 代到4 代酵母接种量 为1 , 5 1 0 7 个毫升，进行发酵，每天跟踪检测甲醛含量。 ( 3 ) 还原温度对甲醛还原的影响 取4 组5 0 0 m l 三角瓶，每组6 个，加入3 0 0 m l 麦汁，灭菌，接种量为1 5 x 1 0 7 个， 毫升，进行发酵，3 天后( 甲醛含量在3 天时达到峰值) ，各组分别置于9 、1 2 、 1 4 、1 6 进行甲醛的还原过程，跟踪记录甲醛的还原过程。 ( 4 ) 麦汁浓度对甲醛形成和还原的影响 取4 组5 0 0 m l 三角瓶，分别加入浓度为7 度、9 度、1 l 度、1 4 度的麦汁3 0 0 m l ， 灭菌，接种量为1 5 x 1 07 个，毫升，进行发酵，每天跟踪检测甲醛的含量。 2 3 结果与讨论 2 3 1啤酒酿造原料中甲醛含量跟踪检测 酿造原料中普遍存在甲醛，从原料中检测甲醛结果来看( 见表2 。l 2 4 ) ，啤酒原 料中的甲醛含量均比较低，带入麦汁中的甲醛也相应很少，从表2 5 可以看出，煮沸前 麦汁中的甲醛含量只有7 0 肛g ，l 。 表2 1 啤酒麦芽中甲醛含量 t a b 2 1 f o r m a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o ni nm a r 蔓三兰一! 竺鲞塑墨垡塑墅堕里鲞竺壅 表2 2 啤酒辅料中甲醛含量 t a b 2 2 f o r m a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o ni nr i c ea n ds y r u p 糖浆 2 4 8 6 2 表2 3 啤酒酿造用水甲醛含量 山泉水1 8 表2 4 啤酒酒花中甲醛含量 t a b 2 4 f o r m a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o ni nm t ”u s e di 。nh o p 2 豇广雨酾晤面霸雨蟊疆匿硒酹r 表2 5 啤酒酿造过程中甲醛含量跟踪检测( 单位：l g i ) t i b 坫一e o n t i n u o e sd e t e r m l i n a t z i o no z f f o = r m a l d e h y d econcentrationduringb e e rb r e w i n g 一丽硒而雨西磊丽丽丽f 一 煮沸前麦汁 煮沸后麦汁 发 酵 天 数 天 7 0 1 1 5 2 4 9 4 3 1 5 3 3 6 6 0 5 8 2 4 6 5 4 0 5 3 7 2 2 1 9 4 2 8 6 3 7 4 4 6 1 5 9 1 6 2 2 6 4 8 7 5 6 6 0 0 5 2 3 跟踪检测麦汁制造以及发酵过程甲醛菱花鬲沅可西看百弋页裹1 j i f 虽然经过麦 汁煮沸，大部分的甲醛已经除去，但是与不添加甲醛麦汁相比，糖化添加甲醛后麦汁中 残留甲醛量偏高。 在发酵过程中，甲醛含量经历了一个先增大后减小的过程，存在一个甲醛峰值( 见 图2 2 ) ，进步研究后发现甲醛峰值的高低与发酵过程工艺参数有关，并且从含量上 看甲醛峰值远大于麦汁中甲醛的残留量，因此要降低啤酒中残留甲醛含量，必须加强对 发酵工艺参数的控制。从不加甲醛煮沸前后麦汁甲醛含量变化来看，煮沸过程也会产生 一部分甲醛，原因是煮沸过程发生的s t r e c k e r 裂解反应，氨基酸发生裂解，使甲醛含量 上升。 江南大学硕士论文 嘲 隧 澎 睁， 粤 ，中 、_ 捌 024 681 01 21 4 发酵夭数( 天) + 甲醛含量+ 群母数 图2 2 啤酒大罐发酵过程中甲醛含量的变化情况 f t g 2 2 t h ed i v e r s i t yo f f o r m a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o nd u r i n gb e e rb r e w