（生物化学与分子生物学专业论文）基因重组蛛丝蛋白作为组织工程支架材料的研究.pdf

幕因重组蛛丝蛋白作为组织工程支架材料的研究 内容提要 蜘蛛丝是一种特殊的纤维蛋白，它具有很高的强度、弹性、柔韧性、伸长度 和抗张强度，以及轻盈、耐紫外线、生物可降解等优点，是新一代的天然高分子 纤维生物材料，其中尤其以蜘蛛拖丝的力学性能最好。本实验室研究人员利用基 因工程方法，合成含有细胞粘附位点r g d ( 精氨酸甘氨酸天冬氨酸) 的重组蜘 蛛拖丝蛋白基因，构建了工程菌p n s r - 1 6 b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 。本论文建立了工程菌 p n s r - 1 6 1 3 l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 的高密度发酵工艺和重组蛛丝蛋白规模化纯化方法。以 此为基础原料，制各组织工程用生物材料丝蛋白纤维薄膜和多孔支架，对所制备 的材料进行了体外降解、细胞毒性实验。 在工程菌p n s r - 1 6 b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 摇瓶优化培养的基础上，进行1 0 l 发酵 罐高密度发酵。采用d o s t a r 补料分批发酵，晟终菌体密度o d 6 0 0 可在6 0 9 0 范围， 产物表达量约占总蛋白量的1 1 1 2 。 通过h i s b i n d 亲和层析小量纯化重组蛛丝蛋白，经等电聚焦电泳测定等电 点为6 4 5 ，蛋白质印迹分析证明表达蛋白为重组蛛丝目的蛋白。超声破碎细胞， 调节p h 至9 1 ，6 0 加热g - 1 0 m i n s ，1 5 饱和度硫酸铵沉淀等步骤，可以得到纯 度达9 0 以上的制备性重组蛛丝蛋白。 本研究首次报道了利用重组蛛丝蛋自制备生物支架材料及其部分力学性能的 测定。纯化的重组蛛丝蛋白经透析、冷冻干燥后，以9 8 甲酸为溶剂，制各丝蛋 白溶液。将丝蛋白溶液平铺于塑料板上可制各薄膜：加n a c i 晶体为致孔剂，通过 盐沥滤法可制得多孔支架材料。为改善支架材料的力学性能，将丝纤维蛋白与聚 合物共混改性，探讨了变性剂、致孔剂及其比例、干燥方法等对共混支架的结构 与性能的影响。 选用弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶，探讨重组蛛丝蛋白支架材料的体外 降解行为，证实了重组蛛丝蛋白支架材料具有生物可降解性。 初步进行了重组蛛丝蛋白支架材料体外细胞毒性实验。 关键词：蛛丝蛋白高密度发酵纯化支架降解 基因重组蛛丝蛋白作为组织工程支架材料的研究 a b s t r a c t s p i d e rs i l ki sas p e c i a lf i b r i n i th a sh i g hs t r e n g t h ，e l a s t i c i t y , f i e x i l i t y ，e l o n g a t i o na n d t e n s i l es t r e n g t h ，a l o n gw i t hl i g h t n e s s ，t h ee n d u r a n c eo fu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ，b i o d e g m d a t i o n ， a n ds oo n s p i d e rs i l ki san e wg e n e r a t i o no f t h en a t u r a lm a e r o m o l e c u l ef i b r o u sb i o m a t e r i a l s e s p e c i a l l y , t h es p i d e rd r a g l i n es i l ki so f t h eb e s tm e c h a n i c a lp r o p e r t i e s o u rl a b o r a t o r ys t a f f s y n t h e s i z e dt h eg e n eo ft h er e c o m b i n a n ts p i d e rd r a g l i n es i l kp r o t e i nw i t hr g dm o t i fw h i c h i n v o l v e dt h ec e l la d h e s i o ns i t e b yt h eg e n ee n g i n e e r i n gm e t h o d ，a n dc o n s t r u c t e dt h e e n g i n e e r i n gs t r a i np n s r - 1 6 1 3 l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s t h i sp a p e re s t a b l i s h e dt h eh i g h - d e n s i t y f e r m e n t a t i o no ft h ee n g i n e e r i n gs t r m np n s r - 1 6 b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s sa n dt h e l a r g e - s c a l e p u r i f i c a t i o nt e c h n i c so ft h er e c o m b i n a n ts p i d e rs i l kp r o t e i n b a s e do ni t , w ep r e p a r e dt h e f i b r i nf i l ma n dt h ep o r o u s s c a f f o l d ，a n ds t u d i e dt h ed e g r a d a b l eb e h a v i o u ra n dt h e c y t o t o x i c i t yi nv i t r o b a s e do nt h eo p t i m u mc u l t u r eo f t h ee n g i n e e r i n gs t r a i np n s r - 1 6 b l 2 1 ( d e 3 ) p l ) 7 s si n s h a k e b o t t l e ，w ec a r r i e do u tt h eh i g h - d e n s i t yf e r m e n t a t i o ni ni o lf e r m e n t a lj a r t h ee n dc e l l d e n s i t yo d 6 0 0o ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i np n s r - 1 6 b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s sw a s6 0 - 9 0 ，a n dt h e e x p r e s s i o no ft h er e c o m b i n a n ts p i d e rs i l kp r o t e i nw a su pt ot h el1 1 2 o ft h et o t a lp r o t e i n b yt h ed o - s t a rf e d b a t c hc u l t u r e t h es m a l l s c a l ep u r i f i c a t i o no ft h er e c o m b i n a n ts p i d e rs i l k p r o t e i nw a sc a r r i e do u t t h r o u g ht h eh i s b i n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h ei s o e l e c t r i cp o i n tw a s6 4 5b yi e et h e p u r i f i e dp r o t e i nw a sf a r t h e rp r o v e da st h er e c o m b i n a n ts p i d e rs i l kp r o t e i nu s i n gw e s t e r nb l o t u l t r a s o n a t i n gt h ec e l l ，a d j u s t i n gp h9 1 0 ，6 0 ch e a t i n gf o r8 1 0m i n s ，1 5 ( n h 4 ) 2 s 0 4 p r e c i p i t a t i o n ，w ec a l la c h i e v et h er e c o m b i n a n ts p i d e rs i l kp r o t e i nw i t ht h ep u r i t y9 0 a t l e a s t t h i sp a p e rr e p o s e dt h ep r e p a r a t i o no fb i o m a t e r i a lf r o mt h er e c o m b i n a n ts p i d e rs i l k p r o t e i na n dt h ep a r tm e c h a n i c a lp r o p e r t i e so ft h eb i o m a t e r i a lf o rt h ef i r s tt i m e t h es i l k f i b r o u sp r o t e i ns o l u t i o nw a sp r e p a r e db yd i s s o l v i n gt h er e c o m b i n a n ts p i d e rs i l kp r o t e i ni n 9 8 f o r m i ca c i da f t e rd i a l y z e da n dl y o p h i l i z e d t h ef i l mc a nb em a d et h r o u g hs c r a p i n gt h e p r o t e i ns o l u t i o no nt h ep l a s t i cd i s k n a c ia sp o r o g e n ，t h ep o r o u s s c a f f o l dc a nb e m a n u f a c t u r e db ys a l t - l e a c h i n g t h em e c h a n i c a lp r o p e r t i e so ft h es c a f f o l dm a t e r i a lc a nb e i m p r o v e db ym i x i n gt h ep o l y m e ra n dt h ef i b r o i np r o t e i n t h ee f f e c to fm a n yf a c t o ro nt h e s t r u c t u r ea n dm e c h a n i c a lo f s c a f f o l dw a sd i s c u s s e d i i 基因重组蛛丝蛋白作为组织工程支架材料的研究 e x a m i n i n gt h ed e g r a d a t i o nb e h a v i o u ro f t h er e c o m b i n a n ts p i d e rs i l kp r o t e i nb i o m a t e r i a l i nt h es o l u t i o nc o n t a i n i n gw i t ht h ed i f f e r e n te n z y m e ( s u c ha se l a s t a s e 、a - c h y m o c r y p s i n 、 t r y p s i n ) ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l tc o n f i r m e dt h a t t h er e c o m b i n a n ts p i d e rs i l k p r o t e i n b i o m a t e r i a lw a sb i o d e g r a d a t i o n t h ee y t o t o x i e 姆e x p e r i m e n to fs c a f f o l dm a t e r i a lf r o mr e c o m b i n a n ts p i d e rs i l kp r o t e i n w a sc o n d u c t e d k e yw o r d s ：s p i d e r s i l k p r o t e i n ；h i g h - d e n s i t yf e r m e n t a t i o n ；p u r i f i c a t i o n ；s c a f f o l d ； d e g r a d a t i o n i i i 基因重组蛛丝蛋白作为组织工程支架材料的研究 英文缩略词表 英文缩写英文全称中文全称 k a n a k a n a m y c i n卡那霉素 c m c h l o r o m y c e t i n氯霉素 e d t a e t h y l e n ed i a m i n et e t r a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 p m s f p h e n y l m e t h y i s u l f o n y lf l u o r i d e苯甲磺酸酰氟 i p t g i s o p r o p y l t h i o - 3 - d - g a l a c t o s i d e 异丙基- b - d - 硫代半乳糖苷 l bl u f i a - b e r t a n im e d i u ml b 培养基 o d o p t i c a ld e n s i t y光密度 k d k i l od a l t o n千道尔顿 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s l s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 t e m e d n ，n ，n ，n t e t r a m e t h y e t h y l e n e d i a m i n en ，n ，n ，n - 四甲基乙二胺 i r i s t r i - ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e三( 羟甲基) 氨基甲烷 r p m r o u n dp e rm i n u t e每分钟转数 mm o l l 摩尔 m mm m o l l毫摩尔 d t e xd e c i t e x分特克斯 e ne e n t i n e w t o n 厘牛顿 hh o u r 小时 m i nm i n u t e 分钟 ss e c o n d 秒 m t t m e t h y t h i a z o l y st e t r a z o l i u mb r o m i d e四甲基偶氮唑盐 d m s o d i m t h y ls u l p h o x i d e二甲基亚砜 序言 序言 1 蜘蛛丝的研究进展 蜘蛛丝是自然界综合性能优良的天然蛋白质纤维，作为组织工程的新材料，有其 得天独厚的条件，逐步受到生物学、医学、材料科学等学科领域研究者的重视，尤其 是蜘蛛大囊状腺和鞭毛状腺产生的拖丝和鞭毛丝，最受关注。研究者对蜘蛛丝的组成、 结构、力学性能等性质作了大量研究二十世纪九十年代后期，利用现代生物技术在 细菌、酵母、植物和哺乳动物系统，表达获得重组蛛丝蛋白产物。期望不久的将来能 大量人工仿制蜘蛛丝，并为组织工程提供一种新的支架材料。 1 1 蜘蛛丝的组成与结构特点 蜘蛛属节肢动物，蛛形纲，蛛形目。蜘蛛、网、丝三者总是同时存在，不存在完 全没有丝的蜘蛛，也不存在没有网的蜘蛛。不同腺体分泌不同功能类型的蛛丝，以金 园网蜘蛛( n e p h i l ac l a v i p e s ) 为例，它的腹部有七种不同的腺体，包括大囊状腺( m a j o r a m p u l l a t eg l a n d ) 、小囊状腺( m i n o ra m p u l l a t eg l a n d ) 、葡萄状腺( a e i n i f o r mg l a r i d ) 、梨状 腺( p i n i f o r mg l a n d ) 、管状腺( c y l i n d r i c a lg l a n d ) 、集合状腺( a g g r e g a t eg l a n d ) 以及鞭毛状腺 ( p l a g e l l i f o r mg l a n d ) ”】。蜘蛛丝形成了一个极有意义的纤维蛋白家族，每种丝都有它特 定的机械属性，其中最重要的两种丝是拖丝和鞭毛丝。表l 总结了金园网蜘蛛( n e p h i l a c l a v i p e s ) 每种丝的功能以及分泌这些丝的腺体【2 j 。除了环境可以赢接影响丝的形成外， 其它一些因素也可以对丝的形成有间接的影响，如蜘蛛体重、体积。 蜘蛛丝的主要成分是纤维蛋白质。与蚕丝相似，蜘蛛丝的主要组成单位也是小侧 基的甘氨酸和丙氨酸，研究者对由大囊状腺分泌的拖丝的研究最为深入，蜘蛛拖丝蛋 白为高度重复序列的纤维蛋白。小侧链丙氨酸和甘氨酸的重复分别达到2 5 和4 2 ， 组成丝蛋白的结构单元主要有( a i a ) 5 - l o ，g l y - g l y - x ( x 为s e r ，g l y ，t y r ) 和 g l y - p r o - g l y x - x 等几种类型i jj 。此外，与蚕丝明显不同的是，蜘蛛丝含有较多的谷氨 酸、脯氨酸等大侧基氨基酸。 在蜘蛛的腺体中蛋白质是以液态形式存在的，当它通过腺体输送管变成固定形态 时，蛋白质可能从含3 0 u 一螺旋、4 0 无规则卷曲、3 0 1 3 - 转角的分子构象转变为反 向平行1 3 - 折叠构象【4 】。蜘蛛丝蛋白的小肽模体可以分为四个类型：( 1 ) g p g x x g p g q q ： ( 2 ) ( g a ) n a m ( 3 ) g g x ：( 4 ) 间隔区。g p g x x g p g q q 形成争转角螺旋结构，( o a ) n a n 形成d 一折叠结构，g g x 形成每三个氨基酸一个转角的螺旋结构，间隔区包括带电基团 起到连接的作用【5 i 。蜘蛛丝中含有结晶区和非结晶区，结晶区主要为聚丙氨酸链段， 序言 表1 金园嘲蜘蛛( n 印h u ac l a r i p 神产生的丝及其功能、腺体的总结 t a b l e 1s u m m a r yo f s i l k ，t h e i r f u n c t i o n s ，a n dg l a n d so f o r i g i nf o r t h eg o l d e no r bw e a v e r n e p h l l ac l a v i p e s 构象为b 折叠结构，分子链沿着纤维轴线的方向里反向平行排列，形成曲折的p 片层 结构进而相互重叠在一起构成结晶区。片层间为非结晶区，主要由大侧基氨基酸组成。 由于结晶区的分子链间以氢键结合，因而分子间作用力很大，使得丝纤维在外力作用 下有较多的分子链能承受外力作用，这是蜘蛛丝具有高强度性能的主要原因【6 l ”。非结 晶区由甘氨酸、丙氨酸以外的大侧基氨基酸组成，这些氨基酸由于侧基较大，且在侧 基中含有活泼基团，阻碍了肽链的整齐排列而形成非结晶区。在非结晶区，大分子多 呈b 螺旋状结构【8 j 。 1 2 蜘蛛丝的特性 1 2 1 理化性质 蜘蛛丝光滑、闪亮，耐紫外线，耐高温和低温，直径5 m 到几百微米，物理密 度为1 3 4 9 c m 3 。不溶于水、稀酸、稀碱，仅溶于浓硫酸、l i b r 、甲酸等，并且对大多 数蛋白酶具有抗性“。热分析表明，蜘蛛丝在2 0 0 c 以下表现热稳定性，3 0 0 c 以上 丝的颜色才变黄。零下4 0 c 时丝仍有弹性，只有在更低的温度下脆性增强 z q 。 1 2 2 力学性能 d a i 等1 1 2 1 在研究了不同蜘蛛丝单个丝蛋白分子弹性理论后，得出了以下结果：( 】) 当张力小于1 0p n 时，不同丝蛋白的拉伸属性是相似的；( 2 ) 当张力为1 0 1 0 0 p n 时， 不同丝蛋白的拉伸属性是不同的：小囊状腺蛋白以轴向线、网框线的形式被抽出，强 2 序言 度最高；大囊状腺蛋白以拖丝的形式被抽出。可被用于能量吸收、捕获昆虫等。( 3 1 当 张力高于1 0 0p n 时，丝蛋白几乎都伸展开了，邻近肽链间的相互作用很小，不同丝蛋 白内部相互作用的差别几乎可以忽略，所以它们的机械属性也是相似的。因此可以认 为丝蛋白机械属性与氨基酸的组成是密切相关的。 应力一应变曲线决定了纤维对其在轴心方向上变形的应答，而这种应答是由材料 中的分子控制的。s h a o 等”测定了再生丝的起始模量为6 0g p a ，断裂强度为0 1 l 0 1 4 g p a ，断裂伸欧率为1 0 2 7 。根据对屈服点后应力一应变曲线的分析得出，再 生丝具有聚合物材料冷收缩的典型行为但与天然蜘蛛丝相比仍有较大差别。图1 是 牵引丝典型的应力- 应变曲线，可以看山，在大约2 应变时有一个较大偏离直线点即 屈服点f l ”。在屈服点上，当丝纤维受到更大的负载时就会发生可塑性形变。研究者认 为这可能是由于丝纤维内部氢键的断裂造成的。 s l r a i nf l 圈1 牵引丝典型的应力一应变曲线 f i g iat y p i c a ls t r e s s - s t r a i nc u r v ef o ras i n g l ef i l a m e n to f t h ed r a g l t n es i l k 力学特性实验表明十字圆蛛“p t 2 n e l l 3d i a d e m a t u s ) 拖丝的起始硬度低于k e v l a r 、 碳纤维、高弹性钢等工程材料，但其硬度比其它的聚合生物材料都高。在强度方面，拖 丝略低于k e v l a r 、碳纤维、商弹性钢，但明显高于其他生物材料。从弹性看，十字圆 蛛拖丝伸长率为0 2 7 ，而一般工程材料的伸长率则在0 0 1 0 0 3 之间，高伸长率使得 十字圆蛛拖丝具有比一般工程材料更好的韧性，其断裂能( 韧度) 为1 6 0m j m ，是工程 材料的3 1 0 倍。因此拖丝被认为是目前已知的具有高硬度、高强度、高韧皮特性 的生物材料之一i l ”。表2 总结了蜘蛛丝与其它几种材料的机械属性。 序言 表2n e p h i l a c l a v l p e s 蜘蛛丝与天然、合成材料机械属性比较 t a b l e - 2m e c h a n i c a lp r o p e r t i e so f s e v e r a ls p i d e r s i l k sf r o mn e p h l l ac l a v i p e sc o m p a r e dw i t h o t h e ro t h e rn a t u r a la n ds y n t h e t i cm a t e r i a l s 1 2 3 蜘蛛丝的超浓缩现象 蜘蛛丝不溶于，但当它接触水时，就会发生超浓缩现象。直径膨胀为原来的两倍， 机械性能也发生变化的这种现象定义为超浓缩。h o l l a n d 等【1 6 】将蜘蛛拖丝与接触水长 度收缩为初始长度的5 0 。拖丝浸水时，b 折叠区不发生链运动，而在富甘氨酸区和 新分离丙氨酸螺旋区却发生了较大的链运动。通过x 射线衍射可以观察到，易变的丙 氨酸区在化学转变中保持一致。排布成一个松散的螺旋环境，起着连接结晶区与无定 形区、促进结晶区重排的作用。也正是这种易变的丙氨酸螺旋区，使湿超浓缩拖丝的 弹性增强，强度减弱。拖丝最大超浓缩应力为断裂强度的2 2 。超浓缩应力维持最多 不超过5 分钟，即使湿度持续上升，也会降为零【1 7 】。 1 3 利用现代基因工程技术获取蜘蛛丝 蜘蛛是肉食动物而且不喜欢群居，难以规模饲养，所以希望通过基因工程技术， 获得大量重组蜘蛛拖丝蛋白。 1 3 1 动物表达系统 加拿大n e x i a 生物技术公司的研究员经过研究，可以从转基因山羊奶提取生产出 高性能蜘蛛丝纤维。利用转基因山羊技术生产的高性能轻型纤维材料，强度比钢材高， 且弹性好，被誉为“生物钢材，1 ”。 因为蚕与蜘蛛有相似之处，同为生物纺丝体，许多科学家试图将蜘蛛的基因转移 到蚕的体内。期望使蜘蛛丝高强力高弹性的基因体现在蚕丝中，利用基因技术使蚕“吐” 出类蜘蛛丝，弥补蚕丝的易变形、缺乏弹性、易折皱等缺陷，使蚕丝性能得到改进 2 0 1 中科院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所的科研人员首次实现了绿色荧光 蛋白与蜘蛛拖牵丝融合基因在家蚕丝基因中的植入，获得了荧光蚕。 4 序言 1 3 2 植物表达系统 英国的科学家已成功在烟草、马铃薯中通过基因工程技术生产出蜘蛛丝蛋白川。 s c h e l l e 等t 2 2 ) 已在植物中提取到占总蛋白2 的蜘蛛丝蛋白。 1 3 3 细菌表达系统 由于l e w i s 等在ec o i l 表达蛛丝c d n a ，表达量低，推测可能是由于密码子的 偏好不同而引起。因此根据在e c o l i 使用频率较高的密码子重新设计了保守的氨基酸 重复序列，利用p e t 载体系统来生产蜘蛛拖丝蛋白m a s p 2 ，表达水平可达到每克湿菌 体1 0 m g 蛛丝蛋白。p r i n c e 等 2 4 1 根据n e p h i l ac l a v i p e s 拖丝蛋白序列反转录得到相应的 d n a 序列。d n a 单聚体通过“头尾”接合的构建策略，得到的多聚体再克隆到e c o l i ， 经i p t g 诱导表达蛛丝蛋白。f a h n e s t o c k 等”锻据n e p h i l ac l a v i p e s 拖丝的两种蛋白， s p i d r o i n s1 和2 ，设计了编码类似物的合成基因。基因由至少3 0 0 b p 的d n a 序列串联， 编码的蛋白分子量可达6 5 1 6 3 k d a 。 1 3 4 酵母表达系统 甲醇营养型酵母p i c h i a p a s t o r i s 可做为长片段、重复序列蛋白聚合物的表达宿主。 蜘蛛拖丝蛋白类似物的合成基因可在甲醇诱导的a o x i 启动子下得到高效表达，并且 没有在大肠杆菌中表达所出现的截短现象1 2 6 2 7 1 。 1 4 蜘蛛丝的应用前景 1 4 1 人造皮肤 影响人造皮肤和烧伤包被层性能最大的因素是水汽的通透性，而蛛丝纤维的通透性 与天然皮肤很接近，作为生物材料，又具有比较发达的伸展性，非常适合来来的人造皮 肤的要求。 1 4 2 人工肌腱 肌腱是连接骨骼肌与骨骼之间的致密结缔组织，每一块肌肉都有不同长度的肌腱与 骨骼附着，由于肌腹的收缩，通过肌腱的牵拉，带动骨骼产生运动，使人体完成生活及 工作所需要的各种动作，因此肌腱在人一生的生命活动中，有十分重要的作用。2 0 世纪 8 0 年代以后出现的肌腱组织工程研究仍以修复手的屈指肌腱为主要内容【2 b 】。当将磷酸 基团嵌入丝后丝纤维可以吸附到骨骼的主要成分羟磷灰石形成坚固的晶体外层。而蛛 丝本身还具有高强度、韧性以及良好的柔性和可塑性，这一切都使其成为适宜替代肌腱 的前景材料。 1 4 3 支架材料 丝纤维蛋白有良好的生物相容性、无毒、无刺激性、可降解性等，引起了人们的关 序言 注。已有研究者采用蚕丝纤维与软骨细胞进行复合培养，探索了蚕丝作为软骨细胞体外 培养支架的可行性。蜘蛛丝也是一种丝纤维蛋白，其力学更优越于蚕丝，但目前还没有 做为支架材料的相关报道。 1 4 4 酶等生物大分子的固定材料 丝类蛋白纺织系统特殊分子结构赋予其比例适中的亲水性和疏水性，同时水溶性的 丝类蛋白可以加工成各种形态及形状的材料以适合不同用途。例如，固定在丝蛋白薄膜 中的葡萄糖氧化酶就被用来作为检测血液中葡萄糖浓度的传感器。 1 4 5 生物传感器 固定了特异抗原的丝类纤维膜可以用作检测相关疾病的生物传感器。被固定的抗原 物质与体内产生的特异抗体相作用形成固定在纤维上的抗原抗体复合物，而这种特异的 结台反应可以通过电讯号的形式被检测到。 1 4 6 军事及民用防护领域 蛛丝在理化性质方面与目前军事及民用防护领域所用的k e l v e r 等材料相当，甚至略 优越一些。更重要的是蛛丝本身的重量要轻得多，而且柔韧性和通气性要远远优于上述 材料，因此在未来的防护领域蛛丝将有非常乐观的广阔前景。 1 4 7 纺织新材料 据观察，南美产的蜘蛛所分泌的蛛丝具有非常特殊的性能，它非常结实并富有弹 性，能挡住射来的子弹，此外还特别耐寒，到一5 0 - - 6 0 。c 时才会断裂，而一般强力 台成纤维却无法保持此弹性，因此蛛丝是一种优异的纺织原料。蜘蛛结网时液态蛛 丝蛋白经过一管道到达纺绩突，在这里可以观察到液态蛛丝蛋白己具备某些液态晶体 的性质。当蛛丝蛋白从纺绩突被压出时，就成为不溶于水的固体。这说明在整个过 程中，蛛丝蛋白发生了某种物理和化学变化。x i n 等报导当人为控制纺丝条件时， p h 值6 3 与蜘蛛吐丝管末端的p h 值最为相近，并且当吐丝液中添加有l ，+ 时，可以白 发地产生微纤维，随后聚集、沉淀。k n i g h t 等研究发现，蜘蛛拖丝溶液沿着吐丝管传 递，其中n 矿、c i 减少，而k + 、p 和s 增加】。 2 基因工程菌高密度发酵工艺研究进展 重组d n a 技术和大规模培养技术的有机结合，使得原来无法大量获得的天然蛋白 质能够规模生产。目前，已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。 分批朴料培养通常被用于微生物发酵，这种方法通过在培养过程中克服细胞的调节机 制：苹果酸影响、催化阻遏、产生抑制，使细胞密度达到较高水平 3 2 - 3 3 】。 大肠杆菌高密度培养被广泛地应用于重组蛋白的生产，这主要是由于大肠杆菌的 6 序言 遗传学和生理学特性研究得最为透彻”。产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白 的表达含量。但在培养过程中也存在一些问题，比如氧、基质的利用率，小分子物质、 生长抑制物的积累。因此为减少抑制物的形成，提供良好的生长条件是必要的。 2 1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素 2 1 1 宿主菌的选择 不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。现在普遍 应用的大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 因其带有编码t7 溶菌酶的小质粒，可有效降低杂蛋 白的表达，但不影响异丙基b - d 琉代半乳糖苷( i p t g ) 诱导目的蛋白的表达水平，从而 成为近年来最为常用的宿主菌嘲。在大肠杆菌体内形成的表达产物有三种存在形式： 第一，形成稳定的天然构象，可溶且有活性，不易被降解：第二，蛋白也是可溶性的。 但构象为非天然状态，易被胞内的各种蛋白酶识别降解；第三，多肽链间彼此聚集形 成不可溶的包涵体，并且有蛋白酶抗性p ”。因此，宿主菌的选择对表达产物的积累以 及下游分离纯化都有至关重要的作用。 2 1 2 质粒载体 重组大肠杆菌中构建的质粒载体对外源基因的表达也产生了很大影响。常用的基 因表达载体有p e t 、p s c 、p p b r 、p u c 系列以及由它们衍生的一系列优化载体。 质粒载体的拷贝数和稳定性不仅受宿主菌生理状况及生长环境的影响，而且还取 决于自身的遗传特性。质粒载体的拷贝数并不是越高越好，因为有些克隆的编码基因， 当用高拷贝数质粒作载体时其产物含量过高会严重地扰乱寄主细胞正常的新陈代谢 活动。质粒不稳定性通常有以下两种情况：( 1 ) 分离不稳定性：( 2 ) 结构不稳定性。 另外环境条件也会影响质粒的拷贝数，如葡萄糖( o l u ) 、n h 4 + 等因子的限量供应以及p h 的变化都会引起质粒拷贝数的下降。已有报道通过正交实验考察了e c o l i h b l 0 1 ( p b r 3 2 2 ) 高密度培养过程中，不同培养条件对质粒稳定性的影响，结果表明当 温度在3 3 3 9 c 、p h 为6 4 7 2 、d o 为4 0 8 0 时质粒没有丢失现象 3 7 】。 2 2 培养条件 2 2 1 营养源 高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物，需投入几倍于生物量的基质以满 足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要。一般使用的培养基为半合成培养 基，培养基各组分的浓度和比例要恰当，过量的营养物质反而会抑制菌体的生长，特 别是碳源和氮源的比例。o l u 因细菌利用快且价廉易得，已被广泛用作重组菌高密度发 7 序言 酵的限制性基质。一般g l u 浓度控制在l o g m 左右，如果超过2 0 9 l 将会抑制细胞的 生长。已有人用甘油代替g l u 作为细菌生长的碳源，可减少代谢抑制物质乙酸的 积累，更易达到重组菌的高密度培养和外源蛋白的高表达。n 0 3 、胰蛋白胨( t r ) 、酵 母提取物( y e ) 作为氮源有利于细胞的生长。比如，在硅藻( n i t z s c h i al a e v i s ) 高密度培 养过程中提高十二碳五烯酸e p a 的产量时，n 0 3 ：t r ：y e 的最佳比例为1 ：2 6 ：1 3 ，g l u ： n 0 3 。的最佳比例为3 2 ：1 p ”。有些营养物质在高密度培养过程中可以控制细胞的死亡 率，曾有报道在非洲绿猴肾成纤维细胞系( v e r oc e l l ) 培养过程中，半乳糖和谷胱甘 肽可以阻止细胞程序性死亡1 3 。 还有实验数据表明，在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质 有利于蛋白表达量的提高。比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽( g s h ) 时，在发酵 开始和进行1 2h 后，各添加2 0 9 l 腺苷三磷酸( a t p ) 和9 m m 前体氨基酸，可以使细 胞浓度和g s h 产量分别比不添加这两种物质的发酵提高2 4 喻1 11 4 倍【4 。 同时，种子培养基与发酵培养基营养源的不同也会使延迟期延长。这可能是因 为细胞被转到新环境中时，某些胞内酶或酶所需辅酶和活化剂的缺乏或向外流失，造 成营养源不能即时被利用而引起。在重组大肠杆菌生产蛛丝蛋白过程中，当种子培养 基与发酵培养基营养源相同时，细胞的延迟期就会减短。 2 2 2 控制条件 2 2 2 1 接种量 接种量大小的控制对很多细胞培养和代谢物积累都起到重要作用】。接种量对基 因表达的影响不大，但对菌体生长影响较明显。接种量小( 0 5 4 ) 时，比生长速 率大，对数生长期持续时间长：接种量大( 8 ) 时细菌较快地达到了稳定期。持 续生长时间短，自溶也较快，所以接种量一般选择在4 以下m 】。 2 , 2 2 2 溶氧浓度 溶氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一。大肠杆菌的生长代 谢过程需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大，溶解氧的 浓度过高或过低都会影响细菌的代谢。在高密度发酵过程中，由于菌体密度高，发酵 液的耗氧量大，一般通过增大搅拌转速和增加空气流量以增加溶氧量。随着发酵时间 的延长，菌体密度迅速增加溶氧浓度随之下降。因此在高密度发酵的后期，需要维持 较高水平的溶氧浓度。 目前，提高溶氧量的方法主要有：通入纯氧来提高氧的传递水平可能局部混合 不均匀，易使微生物氧中毒：在菌体中克隆具有提高氧传递能力的透明颤藻蛋白 ( v h b ) 4 3 ；培养基中添加h 2 0 2 ，利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生0 2 ；提高氧的分 8 序言 压h ”。 2 2 2 3p h 值 稳定的p h 值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。由于外界的p h 值变化会改 变菌体细胞内的p h 值，从而影响细菌的代谢反应，进而影响细胞的生物量和基因产物 的表达。e c o l i 发酵时产生的有机酸( 主要是乙酸) 可导致发酵液的p h 值降低。细胞释 放的c 0 2 溶解于发酵液内与h 2 0 作用生成的碳酸也会导致发酵液p h 值的降低在高 密度发酵条件下。细胞产生大量的乙酸和c 0 2 ，可使p h 值显著降低。必须及时调节 p h 值使之处于适宜的p h 值范围内，避免p h 值剧烈变化对细胞生长和代谢造成的不 利影响。 菌体生长和产物合成过程中，常用于控制p h 的酸碱有h c l 、n a o h 和氨水等，其中 氨水最常用，因为它还具有补充氮源的作用。但有研究发现，n h 4 + 浓度对大肠杆菌的 生长有很大影响，当n h 4 + 浓度高于1 7 0 m m 时会严重抑制大肠杆菌的生长。 2 2 2 4 温度 培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素，较高的温度有利于细菌的 高密度发酵，低温培养能提高熏组产物的表达量，而且在不同培养阶段采用不同的培 养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量，并可缩短培养周期。当培养 温度偏低时，细胞的生长速率较低：在一定范围内，随着温度的升高，生长速率增大。 但细胞生长的温度突然升高细胞内就会生成某些热激蛋白，以适应变化的环境，外源 蛋白相对含量降低，给后续的纯化造成困难。如果温度升高的范围不太大，热激蛋白 合成的速度会很快下降，恢复正常蛋白的合成。对于采用温度调控基因表达或质粒复 制的重组菌，发酵过程一般分为生长和表达两个除段，分别维持不同的培养温度。但 也会因为升温而引起质粒的丢失，而导致重组蛋白量减少。 2 2 2 5 诱导剂及诱导时间控制 乳糖基因( 1 a c ) 及其衍生的启动子被广泛地应用于大肠杆菌表达系统中重组蛋白 的表达生产。这类启动子通常都用i p t g 作为诱导剂进行外源蛋白的表达，但它成本高， 会污染环境，因而不适于工业生产已有人用乳糖代替i p t g 做为诱导剂”或者以一 定比例混合【4 6 】，诱导外源蛋白的表达。 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都会影响到外源蛋白的表达水平。浓度 较低时，外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高；当浓度超过一定限 度时，就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。 诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数 生长期或对数申后期。 9 序言 2 2 2 6 补料控制 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键在于补料策略，即采用合理的营养流加方式。 常用的流加模式：非反馈补料，反馈补料：其主要工作原理见表3 ，表4 。 表3 非反馈补 t a b l e 3n o n - f e e d b a c kf e d 非反馈补料工作原理 恒速补料 变速补料 指数补料 预先设定的恒定的营养流加速率，细菌的比生长速率逐渐 下降，菌体密度呈线性增加 在培养过程中流加速率不断增加( 梯度、阶段、线性等) 比生长速率在不断改变 流加速度呈指数增加，比生长速率为恒定值，菌体密度呈 指数增加 恒p h 值法 恒溶解氧法 菌体浓度反馈 c e r 法 d o s t a r 法 通过口h 值的变化，推测细菌的生长状态，调节流加葡萄 糖速度，调节p h 为恒定值 以溶解氧为反馈指标，根据溶解氧的变化曲线调整碳源的 流加量 通过检测菌体的浓度，拟合营养的利用情况，调整碳源 的加入量 通过检测二氧化碳的释放率( c e r ) ，估计碳源的利用情 况，控制营养的流加 通过控佧4 溶解氧、搅拌和补料速率维持恒定的溶解氧 控制减少有机酸的生成 除了朴料技术的影响外，补料培养基成分及补料时间的选择对外源基因的表达也 是至关重要的。比如在重组大肠杆菌表达重组绵羊生长激素( r - o g h ) 时，补料培养基 的成分就包含有葡萄糖和酵母提取物，且在培养1 6h 后进行补料h ”。 2 3 生长抑制因子 1 0 序言 2 3 1 乙酸的积累 以葡萄糖为碳源的大肠杆菌的生长，常伴随着乙酸的分泌，进而影响细胞生长和 蛋白表达。乙酸的分泌可以通过维持较低浓度的葡萄糖或补充酵母提取物等来减少合 成代谢。当残留的葡萄糖浓度 h a p s o 。 3 2 3 生物复合材料 序言 随着组织工程的发展，人们对组织再生的生物支架材料提出了新的要求，期望研 究和开发利于细胞黏附、增殖和分化的支架材料，并使材料的力学性能与移植部位相 适应，因此各种复合材料备受关注。李明忠等通过聚乙烯醇、明胶与丝索混合来制多 孔丝膜，期望可以克服丝纤维在干燥状态下力学性能差的缺点。c h a n g 等【8 1 】采用磷灰 石、胶原共沉淀方法制浆，再加入0 2 戊二醛，3 8 c 下交联制得磷灰石胶原复合材料。 w u 等1 ”1 在8 5 士2 c 氮气环境中，用丙烯酸嫁接聚已酸丙酯，在6 h 内完成嫁接，再与壳 聚糖混合，1 0 0 ( 2 下倒于模具上，干燥器中冷却，即可制得复合材料。聚( l 乳酸) ( p l l a ) 是一种脆的生物可降解热塑性聚合物，可通过与聚( 顺1 ，4 一异戊二烯) ( p i p ) 混合，减 小脆性。p i p 是天然橡胶的主要成分，与p l l a 没有亲和性，因此研究者先将p i p 与聚 乙酸乙烯酯嫁接，再将嫁接后的聚乙酸乙烯酯与p l l a 混合制得复合材料。 3 3 生物支架材料制备技术 3 3 1 编织技术 早期组织工程用支架中的纤维生物可降解纺织物是通过编织技术制备的。