（发酵工程专业论文）重组人adam15去整合素结构域蛋白的制备及其作用机理.pdf

摘要 墒尊 - 。，- ，1 a d a m ( ad i s i n t e g r i na n dm e t a l l o p r o t e i n a s e ) 是一类含有七个功能结构域并在细胞间 相互识别和相互作用中发挥重要作用的跨膜糖蛋白家族。a d a m l 5 作为该家族唯一在 去整合素结构域( d i s i n t e g r i n ) 含有r g d ( a r g g l y a s p ) 基序的成员，在细胞外基质降解、细 胞粘附、细胞内信号转导和肿瘤的病理变化等过程中发挥重要作用，但是其抗肿瘤机理 需进一步阐释。本文在成功获取高表达水平的重组人a d a m l 5 去整合素结构域蛋白片 段( r h d d a d a m l 5 ) 的基础上，以小鼠黑色素瘤细胞( b 1 6 ) 为研究模型，研究r h d d a d a m l 5 对b 1 6 细胞体外增殖、粘附和迁移等细胞行为的影响，通过筛选r h d d a d a m l 5 特异结 合的1 2 肽以及r h d d a d a m l 5 在b 1 6 细胞上相互作用的靶点蛋白，探讨r h d d a d a m l 5 干预肿瘤细胞行为的生理机制。主要研究结果如下： 1 ) 为获得大量具有生物活性的r h d d a d a m l 5 蛋白，在详尽分析目标蛋白的e d n a 序列的 基础上，( 1 ) 选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额多 b t r n a 的大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l i r o s e t t a ( d e 3 ) 作为宿主菌，将目标蛋白以g s t ( g l u t a t h i o n e s t r a n s f e r a s e ) 融合蛋白形式 表达，在最佳诱导表达条件下融合蛋白g s t a d a m l 5 浓度为2 9 8m g l ，最佳凝血酶 酶切条件下，r h d d a d a m l 5 浓度为4 2m g l ； ( 2 ) 采用p c r 体外定点突变技术将凝血 酶识别序列附近稀有密码子g g a ( g i y ) 替换为g g c ，同时消除p r o g l u p h e 残基，构建 突变表达质粒，提高凝血酶酶切效率。在相同的表达和酶切条件下获得 g s t 一a d a m l 5 7 1 1 1 r h d d a d a m l 5 蛋白浓度分别为3 2 6m g l 和6 8 m g l ，比野生型分别 提高9 4 和6 1 9 。这一结果表明，在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达 宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达； 2 ) 采用m 1 v r 法测定r h d d a d a m l 5 对b 1 6 、m c f 7 厂w 以及h m e c 1 细胞体外增殖的作用， 采用创伤愈合实验、m a t r i g e l 基质胶以及t r a n s w e l l 侵袭小室法观察r h d d a d a m l 5 对 b 1 6 细胞体外迁移、粘附和侵袭的影响：采用台盼蓝染色法分析细胞活力、流式细胞 仪检、狈1 r h d d a d a m l 5 5 f j b 1 6 细胞周期的影响。结果表明r h d d a d a m l 5 对肿瘤细胞和正 常内皮细胞生长均有一定的抑制作用( 其i c 5 0 分别为9 5 、1 1 8 和1 4 9p e g m l ) ，且明显 抑制b 1 6 细胞的体外增殖、迁移、粘附和侵袭。台盼蓝染色法表明低剂量的 r h d d a d a m l 5 并不能导致b 1 6 细胞出现坏死，且r h d d a d a m l 5 并不导致b 1 6 细胞出现 典型的凋亡峰，而是将细胞阻滞于g 2 m 期，并且这种作用呈剂量依赖关系； 3 ) 采用亲和甄别磁珠技术筛选r h d d a d a m l 5 在b 1 6 细胞上的结合蛋白。将 r h d d a d a m l 5 采用蛋白生物素化方法标记生物素，借助生物素亲和素系统，将生物 素化的r h d d a d a m l 5 固定于亲和素标记的免疫磁珠。从b 1 6 细胞裂解液中钓出与之 相互作用的蛋白，经浓缩富集后，采用双向电泳分离技术分离获得主要的结合蛋白 点，然后对这些蛋白点进行电喷雾串联质谱技术( e s i m s ) 分析，在蛋白数据库中检 索，共鉴定了8 个蛋白质，按功能可分为如下三类：( 1 ) 临床应用的肿瘤标志物( 苹果 摘要 酸脱氢酶、磷酸甘油醛脱氢酶和谷氨酸脱氢酶) ；( 2 ) 能量代谢相关蛋白( 烯醇酶、磷 酸丙糖异构酶、原肌球蛋白和血红蛋白) ；( 3 ) 信号转导通路成员( p 3 8 m a p k 激酶) 等。 在此基础上通过分子对接软件m o l s o f li c m 模拟计算获得r h d d a d a m l5 与p 3 8 激酶 相互作用的最佳模式和重要的结合位点； 4 ) 采用噬菌体展示技术筛j 鹚r h d d a d a m l 5 特异性相互作用的多肽序列。采用噬菌体随 机十二肽库对固定有r h d d a d a m l 5 的亲和磁珠系统进行生物淘洗，获得4 条与 r h d d a d a m l 5 特异结合的1 2 肽。将获得的1 2 肽与蛋白质库进行序列比对，发现细胞 周期相关蛋白如c d c 2 5 并d p 5 3 ，信号通路相关蛋白受体，如整合素钒b 3 的胞外区，丝 裂原活化蛋白激酶p 3 8 a 等与所获得的4 条1 2 肽具有高度同源性； 5 ) 基于上述研究所获得的r h d d a d a m l 5 在b 1 6 细胞上潜在的靶点蛋白，进一步研究 r h d d a d a m l 5 与p 3 8 m a p k 激酶的体外相互作用，结合r h d d a d a m l 5 对b 1 6 细胞行 为的抑制作用，采用蛋白点杂交和激酶活性测定方法分析r h d d a d a m l 5 在体外与重 组p 3 8 激酶蛋白的结合情况，同时研究不同剂量r h d d a d a m l 5 对b 1 6 细胞中 p 3 8 m a p k 激酶磷酸化水平的影响，并观察r h d d a d a m l 5 对p 3 8 激酶活性受到部分 抑制的b 1 6 细胞的增殖和细胞周期抑制作用的变化。发现：( 1 ) r h d d a d a m l 5 在离体 低温条件下能够和重组p 3 8 激酶蛋白结合，但r h d d a d a m l 5 ( 0 1 0p g m l ) 在体外对 p 3 8 m a p k 激酶活性没有影响；( 2 ) 同样剂量的r h d d a d a m l 5 作用于b 1 6 细胞2 4h 后， 细胞中p 3 8 m a p k 激酶的磷酸化水平提高( 被激活) ；( 3 ) p 3 8 激酶的特异性抑制剂 s b 2 0 3 5 8 0 ( 0 5m m o l l ) 预处理b 1 6 细胞3 0m i n 后，r h d d a d a m l 5 对细胞增殖的抑制 作用减弱( i c 5 0 由未经处理的9 5l a g m l 增加到1 1 4l l l g m l ) ，对细胞周期的阻滞作用 也减弱( g 2 m 期细胞比率从未经处理的的2 8 7 7 降到1 6 5 9 嘲。上述结果表明， p 3 8 m a p k 信号转导通路参与了r h d d a d a m l 5 对b 1 6 细胞增殖和细胞周期的抑制作 用，同时也表明生理条件下r h d d a d a m l 5 与p 3 8 m a p k 激酶相互作用的复杂性。 关键词：r h d d a d a m l 5 ；小鼠黑色素瘤细胞( b 1 6 ) ；亲和甄别磁珠技术；噬菌体展示技术； 靶点蛋白：p 3 8 m a p k a b s t m c t a b s t r a c t a d i s i n t e g r i na n dm e t a l l o p r o t e a s e s ( a d a m ) p r o t e i n sa r eaf a m i l yo fm u l t i f u n c t i o n a l p r o t e i n sc o n t a i n i n gd i s i n t e g r i na n dm e t a l l o p r o t e i n a s ed o m a i n s t h a tp e r f o r mb o t l la d h e s i v ea n d p r o t e o l y t i cf u n c t i o n si nc e l l - c e l la n dc e l l - m a t r i xi n t e r a c t i o n s a d a m l5i su n i q u ea m o n gt h e s e p r o t e i n si nh a v i n ga na r g g l y - a s p ( r g d ) m o t i fi n i t s d i s i n t e g r i n - l i k ed o m a i n 1 1 1 i s d i s s e r t a t i o nc h o s et h eb16r o u t i n em e l a n o m ac e l la sam o d e l ，t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to ft h e r e c o m b i n a n th a m a na d a mi5d i s i n t e g r i nd o m a i n ( r h d d a d a m15 ) o nb16c e l l sg o w t h ，a n d t h et a r g e tp r o t e i no fr h d d a d a m15o nb 6c e l l s ，a n df u r t h e rs t u d yt h ei n v o l v e m e n to ft h e t a r g e tp r o t e i ni nt h ea n t i c a n c e l e f f e c to fr h d d a d a m 15 1 1 1 em a i nr e s u l t sw e r ed e s c r i b e da s f o l l o w s ： 1 ) i no r d e rt oe n h a n c et h ep r o d u c t i o na n db i o a c t i v i t yo fr h d d a d a m 15i ne s c h e r i c h i ac o l i ， t w od i f f e r e n ts t r a t e g i e sw e r ee x a m i n e db a s e do nt h eg e n e t i ca n a l y s i so fc o d i n gs e q u e n c e o fr h d d a d a m15 ：t os e l e c tt h es u i t a b l eh o s ts t r a i n , a n dt oo p t i m i z et h er a r ec o d o n sa n d d e l e t et h ea m i n oa c i d sr e s i d u e s i tw a sf o u n dt h a t ( 1 ) w h e nc h o o s i n gec o l ir o s e t t a ( d e 3 ) a st h ee x p r e s s i o nh o s tt h a t s u p p l y sa d d i t i o n a lt r n af o r 础c o d o n s ，2 9 8m g r l g s t - a d a m15a n d4 2m g lr h d d a d a m15w e r ea c h i e v e du n d e rt h eo p t i m a le x p r e s s i o n a n dt h r o m b i nd i g e s t i o nc o n d i t i o n s ，r e s p e c t i v e l y ；( 2 ) w h e ni n t r o d u c i n gec o l ip r e f e r r e d c o d o ng g ca n dd e l e t i n g “p r o g l u p h e r e s i d u e sb yp c r - b a s e ds i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ， 3 2 6m g lg s t - a a d a m15a n d6 8m g lr h d d a d a ml5w e r ea c h i e v e du n d e rt h es a m e c o n d i t i o n ，r e s p e c t i v e l y , h i g h e r19 4 a n d61 9 t h a nt h a to ft h ew i d et y p es t r a i n t h e d a t ap r e s e n t e dh e r ed e m o n s t r a t e dt h a th i 9 1 1e x p r e s s i o no fh e t e r o l o g o u sp r o t e i nc o u l db e a c h i e v e db yr e l e a s i n gr a r ec o d o nu s a g ea n da m i n oa c i d sr e s i d u e sr e s t r i c t i o n 2 ) t h ee f f e c to fr h d d a d a m15o nt h ep r o l i f e r a t i o no fb 16 ，m c f - 7 wa n dh m e c - 1c e l l s w e r ee x a m i n e db ym t ta s s a y t h ee f f e c to fr h d d a d a m15o nb 16c e l lm i g r a t i o n , a d h e s i o na n di n v e n t i o nw e r et e s t e db yt h ew o u n d m i g r a t i o na s s a y , c e l l - m a t r i g e la d h e s i o n a s s a ya n dt h et r a n s w e l lc h a m b e r s ，r e s p e c t i v e l y ；t h eg r o w t ha n da c t i v i t yo fb i6c e l l s w e r e e x p l o r e db yu s i n gt r y p a nb l u es t a i n i n g t h ec e l lc y c l ea n da p o p t o s i sw e r e d e t e r m i n e db yf l o wc y t o m e t r y t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tr h d d a d a m15c o u l di n h i b i t t h ep r o l i f e r a t i o no fn o r m a lc e l l s ，b u te x h i b i ts t r o n g e ri n h i b i t o r ye f f e c to nt h et u m o rc e l l s m o r e o v e r , r h d d a d a m15i n h i b i t e db 16c e l lm i g r a t i o n ，a d h e s i o na n di n v a s i o ni nt h e d o s e t i m e - d e p e n d e n t m o d ea n dt h en e c r o s i sc o u l dn o tb eo b s e r v e di nt h el o w c o n c e n t r a t i o no fr h d d a d a m15 t h ea p o p t o t i cp e a k sw e r en o tf o u n di nc e l lc y c l ea n a l y s e s a n dt h ec e l l sr r ea r r e s t e di ng 2 mp h a s e 3 ) t h ep r o t e i np u l l - d o w na s s a y u s i n gt h e b i o t i n a v i d i n s y s t e ms u p p o r t e db y t h e i m m o l l u n o m a g n e t i cb e a d sw a su s e dt oc a p t u r et h eb i n d i n gp r o t e i no fr h d d a d a m 15 f r o mt h ec e l ll y s i sb u f f e ro fb16 t h em i x t u r eo ft h eb i n d i n gp r o t e i nw a sc o n c e n t r a t e da n d s e p a r a t e db yt h et w o - d i m e n s i o n a le l e t r o p h o r e s i s ( 2 d e ) a n de i g h to ft h ep r o t e i ns p o t sw e r e i d e n t i f i e d b yt h ee s i m s m s b yu s i n gt h e s o f h a r eb i o w o r k sa n dt h ep r o t e i n d a t a b a s ei p im o u s ev 3 2 6 ，t h eb i n d i n gp r o t e i n sw e r em a i n l yi d e n t i f i e da sf o l l o w s ：( 1 ) t u m o rm a r k e r si nt h ec l i n i c a l a p p l i c a t i o n ：m a l a t ed e h y d r o g e n a s e ，p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s ea n dg l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ；( 2 ) e n z y m e si ng l y c o l y t i cp a t h w a y ： a l p h a - e n o l a s ea n dt r i o s e p h o s p h a t ei s o m e r a s e ；( 3 ) t h ei m p o r t a n tc o m p o n e n t s i n c y t o s k e l e t o n ：t r o p o m y o s i n - 3 ；( 4 ) p r o t e i n si no x y g e nt r a n s p o r t a t i o n ：h e m o g l o b i ns u b u n i t b e t a l ；( 5 ) m e m b e r si ns i g n a lt r a n s d u c t i o n ：p 38 m a p k i na d d i t i o n ，t h ei n t e r a c t i o nm o d e s b e t w e e nr h d d a d a m15a n dp 38 m a p kw e r ep r e l i m i n a r i l ya n a l y z e du s i n gt h em o l e c u l a r d o c k i n gp r o g r a m ，m o l s o f ii c m - p r o - 3 5 4 ) t h et a r g e tp e p t i d c so fr h d d a d a m 15w e r ee x p l o r e db yt h ep h a g ed i s p l a yt e c h n i q u e f i r s t l y ，t h er h d d a d a m 15w a s b i o t i n y l a t e d a n di m m o l l o b i l i z e do nt h e i m m o l l u n o m a g n e t i cb e a d s 诵t ha v i d i nl a b e l e d s e c o n d l y ，f o u rs p e c i f i cb i n d i n gp e p t i d e s ( p e p t i d ea ，b ，ca n dd ) w e r es c r e e n e df r o map h a g ed i s p l a y - 12p e p t i d el i b r a r yb ya s c r e e n i n gp r o t o c o l t o w a r d si m m o l l o b i l i z e dr h d d a d a m15 b yu s i n gt h es o f t - w a r e b l a s ta n dt h er e l e v a n tp r o t e i nd a t a b a s e ，s o m et a r g e tp r o t e i n sw e r es c r e e n e d ，s u c ha st h e c d c 2 5p h o s p h a t a s e ，t y r o s i n ek i n a s ep 5 6 ，i n t e g r i n a v p 3 ，a n dt h ep 38m i t o g e na c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ( p 3 8 m a p k ) ，r e l a t e d 州t l lt h ec e l lc y c l e sa n dt h es i g n a lt r a n s d u c t i o n 5 ) t h ep 3 8 m a p kw a ss e l e c t e d f o rf u r t h e r i n v e s t i g a t i o no ft h ei n v o l v e m e n ti n t h e a n t i p r o l i f e r a t i v ee f f e c to fr h d d a d a m 15o nm e l a n o m ac e l l s f i r s t l y , t h ee f f e c to f r h d d a d a m15o n a c t i v i t y o f p 38m a p k 历v i t r o w a s o b s e r v e d s e c o n d l y , p h o s p h o r y l a t i o no fp 3 8k i n a s ei nm e l a n o m ac e l l sw a sd e t e c t e db yw e s t e r nb l o ta n a l y s i s u p o nt r e a t m e n t 谢t l lr h d d a d a m 15 ( o 一10i 上g m l ) t h i r d l y , t h es p e c i f i ci n h i b i t o ro fp 38 k i n a s e ( s b 2 0 358 0 ) w a se m p l o y e dt op a r t l ys u p p r e s st h ea c t i v i t yo fp 38k i n a s ei nb 16 c e l l s ，a n dt h ei n h i b i t o r ye f f e c to fr h d d a d a m 15w a st h e no b s e r v e d t h er e s u l t sw e r e d e m o n s t r a t e da sf o l l o w s ：( 1 ) r h d d a d a m15c o u l db i n dt ot h er e c o m b i n a n tp 38k i n a s ea t4 o cb u th a dn oe f f e c to nt h ea c t i v i t yo fp 38k i n a s e nv i t r o ；( 2 ) r h d d a d a m15h a d i n h i b i t o r ye f f e c to nt h ea c t i v i t yo fp 3 8l d n a s ei nb 1 6c e l l s ；( 3 ) ad e c r e a s ei nt h e n r h d d a d a m15i n h i b i t o r ye f f e c to nm e l a n o m ac e l lp r o l i f e r a t i o n ，a n dt h ev a l u eo fi c s ow a s i n c r e a s e df r o m9 5g g m lt ol1 4 “鲈1 1 l ，w h e nt h ea c t i v i t yo fp 38k i n a s ew a sp a r t l y s u p p r e s s e d ；( 4 ) ar e l e a s ei n t h ec e l l c y c l ea r r e s t , t h ec e l l r a t i oi ng 2 mp h a s ew a s d e c r e a s e df r o m2 8 7 7 t 0 16 5 9 ，u n d e rt h ec o n d i t i o no fs u p p r e s s i n gt h ep 3 8k i n a s e t h e s er e s u l t sp r o v i d e de v i d e n c e st h a tr h d d a d a ml5i n h i b i t i n gt h ep r o l i f e r a t i o na n dt h e c e l lc y c l eo ft h em e l a n o m ac e l l sw a sp a r t l yt h r o u g hp 3 8l 【i n a s ea c t i v a t i o na n dt h e p 38 m a p ks i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a yw a si n v o l v e di nt h ee f f e c to fr h d d a d a m15o n b 1 6c e l l s k e y w o r d s ：r h d d a d a m 15 ；m u r i n em e l a n o m ac e l lb 16 ；p r o t e i np u l l - d o w na s s a y ；p h a g e d i s p l a yt e c h n i q u e ；t a r g e tp r o t e i n ；p 38m a p k v 英文缩略词 英文缩略词 英文缩写 英文全称 中文名称 a d a m l 5 a b t s b s b s a b n h s c d k c h o c d c 2 5 d m s o d a b d n l 廿 d 匝 e g f r e c m e l i s a e s i m s m s f c m g p c r h b e g f h p l c m s h i 冲 i p t g m t t 队p k n h b e p i p c r p a g e p b p b s p m s f s d s a d i s i n t e g r i na n dm e t a l l o p r o t e i n a s e a z i n o - - b i s ( 3 - e t h y l b e n z t h i o l i n e - 6 - s u l f o l i c a c i d ) b o v i n es e n l m b o v i n es o f t u r na l b u m i n b i o t i nn - h y d r o x y s u c c i n i m i d ee s t e r c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e c h i n e s eh a m s t e ro v a r y c e l l d i v i s i o nc y c l e 2 5 d i m e t h y ls u l f o x i d e d i a m i n o b e n z i d i n e 4 - d i m e t h y l a m i n o p y r i d i n e d i m e t h y l f o r m a m i d e e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r e x t r a - c e l l u l a rm a t r i x e n z y m e - l i n k e di m m o l l u n o s o r b e n ta s s a y e l e c t r o s p r a yi n t e r m i t t e n t m a s ss p e c t r u m f l o wc y t o m e t r y g p r o t e i n - c o u p l e dr e c e p t o r s h e p a r i nb i n d i n g - e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r l l i g hp e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i s o p r o p y p d t h i o g a l a c t o s i d e t h i a z o l y lb l u et e t r a z o l i u mb r o m i d e m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e n o r m a lh u m a nb r o n c h i a le p i t h e l i a l p r o p i d i n ei o d i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t eb u f f e r p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 去整合素金属蛋白酶 2 ，2 连氮2 邓2 ( 3 乙基并噻6 磺酸) 小牛血清 牛血清白蛋白 n 一羟基琥珀酰亚胺生物素 细胞周期依赖性蛋白激酶 中国仓鼠卵巢细胞 细胞分裂周期蛋1 兰t 2 5 二甲亚砜 二氨基联苯胺 4 二甲氨基吡啶 二甲基甲酰胺 表皮生长因子受体 细胞外基质 酶联免疫吸附分析 电喷雾串联质谱 流式细胞术 g 蛋白偶联受体 肝素结合表皮生长因子 液相串联质谱分析系统 辣根过氧化物酶 异丙基硫代一p d 半乳糖 噻唑兰 丝裂原活化蛋白激酶 人支气管上皮细胞 碘化吡啶 聚合酶链锁反应 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 磷酸盐缓冲液( 含n a c l ) 苯甲基磺酰氟 十二烷基磺酸钠 英文缩略词 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名：日期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、；1 2 编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 基箍 导师签名： 7 日 期： 第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论 恶性肿瘤( 癌症) 已经成为威胁人类健康的重大疾病之一。美国癌症协会最新公布的 一份全球癌症调查报告显示，在2 0 0 7 年，大约有7 6 0 万人死于癌症，平均每天近2 万 人! 目前我国癌症患者约为4 5 0 万人，死亡率在3 0 0 0 以上，而且每年新增的患者人数高 达2 0 0 万人以上。因此，如何有效地医治癌症已成为临床医学研究的重要课题。临床治 疗癌症的方法主要包括：手术切除、放射线治疗、化学药物治疗。但是，放、化疗在杀 死癌细胞的同时，也严重损伤人体的正常细胞。近年来，随着人们对肿瘤发生发展机制 的深入理解，以及肿瘤免疫学、分子生物学和生物工程技术等的发展，肿瘤的生物治疗 及靶向治疗技术发展迅速，已成为肿瘤预防和治疗中最活跃和最具有前景的研究领域【l 】。 肿瘤生物治疗是将生物高技术产品( 如细胞、细胞因子、单抗、疫苗等) 输入体内， 以调节机体的生物反应，增强机体的防御功能，抑制或杀伤肿瘤细胞，达到预防或治疗 肿瘤的目的。在所有肿瘤生物治疗中，分子靶向治疗是靶向治疗技术中具有最高特异性 的治疗技术，它针对可能导致细胞癌变的环节，如细胞信号传导通路、原癌基因和抑癌 基因、细胞因子及受体、抗肿瘤血管形成、自杀基因等，在分子水平上逆转这种恶性生 物学行为，从而抑制肿瘤细胞生长，甚至使其完全消退的一种全新的生物治疗模式【2 】。 目前，学术界已将肿瘤的分子靶向治疗归于生物治疗的范畴。然而，分子靶向治疗更加 符合肿瘤自身的特性，即肿瘤是一种多因素起因、多步骤发展的全身性、系统性疾病。 在肿瘤治疗时，应集中攻击肿瘤特有或高表达的分子靶点，以避免对其它正常细胞、特 别是免疫细胞的损伤，亦即在杀灭肿瘤时尽量保护好机体自身的免疫系统。 目前抗肿瘤药物占全球药品市场总销售额的4 6 ，年增速1 5 以上，2 0 0 4 年，全 球抗肿瘤药品市场规模已突破2 3 8 亿美元，其中细胞毒药物、分子靶向药物和其他类型 抗肿瘤药物所占市场份额分别为3 0 、3 0 和4 0 。预计到2 0 1 0 年抗肿瘤药品市场规 模将突破5 0 0 亿美元，而分子靶向药物的市场份额将突破4 0 11 9 9 7 年1 1 月，美国f d a 批准g e n e n t e c h 公司的r i t u x i m a b ( 美罗华) 用于治疗某些n h l ( 非霍奇金淋巴瘤) ，揭开了 肿瘤分子靶向治疗的序幕。目前，全球共有近8 0 种靶向治疗药物正在进行临床研究或 已获f d a 批准应用于临床治疗。如用于治疗晚期非小细胞肺癌( n s c l c ) 的吉非替尼( 抗 表皮生长因子单克隆抗体) ；治疗慢性粒细胞性白血病( c m l ) 的甲磺酸伊马替尼( 酪氨酸 激酶抑制剂) ；治疗转移性乳腺癌的曲妥珠单抗( 抗h e r 2 单克隆抗体) 等【3 卅。尽管靶向 治疗药物的研发已涉及包括乳腺癌、肺癌、淋巴癌等在内的所有类别肿瘤，但特异性靶 向肿瘤治疗策略的发展还有待于进一步对癌症精确分子机制的了解。因此，获得包括 致癌基因、相关信号途径引发癌症分子迁移和扩增等癌症发生发展机制的理解是目前靶 向药物研发的瓶颈1 3 j 。 金属蛋白酶去整合素家族( ad i s i n t e g r i na n dm e t a l l o p r o t e i n a s e ，a d a m ) ，又称 m d c ( m e t a l l o p r o t e i n a s e d i s i n t e r g r i n c y s t e i n r i c h ) ，是近年来新发现的一类跨膜糖蛋白家 族，具有蛋白水解、细胞外基质降解、生物活性因子释放、细胞附着、融合、迁移、信 自大学博十学位论立重组人a d a m l 5 击整台素# 椅域蛋白的制备拉其怍月机理 号传导等功能n 在3 0 多种a d a m 家族成员中，a d a m l 5 ( m e 鹕砌i n ) 被发现与人类多 种实体瘤，如胃癌、肠癌、乳腺癌和前列腺癌等的发生和发展密切相关，并且具有典型 的药物分子靶点结构与特征，有望用于指导抗肿瘤药物的研究与开发4 。然而，由于 天然来源的a d a m l 5 蛋白十分有跟，如何获得高表达量的重组a d a m 5 蛋白或其片段， 进而深入研究其在肿瘤发生发展中的分子生理机制已成为肿瘤新型药物开发领域的研 究热点。 i 2 a d a m 家族蛋白的国内外研究进展 1 2 1a d a m 家族的结构特点和生物功能 a d a m 蛋白与蛇毒金属蛋白酶( s n a k ev e n o mm e t a l l o pr o t e i n a s e ，s v m p ) 家族具有很高 的同源性，其家族成员具有相似的结构，通常由8 0 0 1 2 0 0 个氨基酸组成，含有多个结 构域，主要包括：前导域( p r o 、d o m a i n ) 、类金属蛋白酶功能域( m e t a l l o p m t e i n a s e l i k e d o m a i n ) 、去整合素功能域( d i s i m e g i n l i k ed o m a i n ) 、富含半胱氨酸功能域( c y s t e i n e - r i c h d o m a i n ) 、类表皮生长因子功能域( e 面d e r m a lg r o w t hf a c t o r - l i k ed o m a i n ) 、锚定于细胞膜上 的跨膜域( t r a n s m e m b r a n ed o m a i n ) 和c 端的胞质尾区( e y t o p l a ! s r n i ct a i ld o m a i n ) ( 图i - 1 1 。其 中：( 1 ) 前导域半胱氨酸开关( c y s t e i n e - s w i t c h ) ，控制着金属蛋白酶的激活时间：( 2 ) 金届蛋 白酶功能域与基质金属蛋白酶家族的结构和功能类似，约由2 0 0 个氨基酸构成， h e x g h n l g x x h d 为其共同的序列，其中3 个h 结合z n 2 + ，g 发生链转角，e 是催化 位点，具有裂解基质蛋白和改建组织结构的作用；( 3 ) 去整合素功能域由6 0 - 9 0 个氨基酸 构成，包括6 1 5 个c 残基，含有整合素配体，通过1 3 个氨基酸组成的去整台素环与整 合素作用ih ) 胞外域保守基序参与细胞问的粘附运动，如精一卵结合和成肌细胞融合， 参与细胞的相互作用和延伸运动；( 5 ) 富含半胱氨酸功能域含有1 6 0 个氨基酸( 包括1 0 1 4 个c ) ，是一种细胞粘附分子s y n d e c a n 的配体i ( 6 ) 类表皮生长因子功能域含有4 0 个氮基 c u s 悟【i e 图1 1 跨8 l 糖