（发酵工程专业论文）细菌l乳酸发酵培养基及发酵条件的优化.pdf

_1一】，1，刚 “u111 o f 天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集 体已经发表或撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：剐、晓冕 日期：瑚年狷必日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天 津科技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：烈、吮见 日期：? f 年刁月西日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密ii ( 请在方框内打”) ，在 年解密后适用本授权 书。 本学位论文属于 一 不保密囫( 请在方框内打“v ”) o， 作者签名：剥、啦咒 日期：如孑年弓月彩日 导师签 压二 日期： 年月日 摘要 本文以原生质体融合技术选育获得高产。乳酸菌株1 1 ，3 为出发株，经高酸、高 糖驯化与筛选获得的数了株菌，并对t l 一3 一r _ 1 6 菌株的发酵特性、培养基、发酵条件 进行研究。最后在5 l 发酵罐上进行发酵试验，进一步提高菌株的产酸性能。 根据l 一乳酸菌的特性，利用c a c 0 3 平板反复筛选，得到1 6 株利用葡萄糖为碳源 的产l - 乳酸量较高的菌株，5 0 、摇床1 5 0 r p m 振荡培养7 2 h ，l 一乳酸产量在8 0 9 l 以上。经过复筛及发酵试验，确定了一株为出发菌株，记为t l 一3 一r - 1 6 ，l 一乳酸的产 量达到了1 0 6 9 l ，l 一乳酸的纯度达到9 6 以上。测定了此菌株的生长曲线和在驯化培 养基中p h 的下降趋势。 通过单因素试验，研究了不同碳源、氮源种类对l 一乳酸产量的影响，最终确定了 碳源为玉米糖化液，氮源为小肽和玉米浆，并进一步对其用量进行了实验，得到最适 玉米糖化液浓度为葡萄糖含量1 6 0g l ，小肽1 0g l ，玉米浆4 0 m l l 。在单因素试验 的基础上，利用响应面分析法优化了培养基中影响l 一乳酸产量的主要因素，得到了玉 米糖化液、小肽、玉米浆及摇床振荡培养时间最佳组合分别为：1 6 0 9 l 、l o g l 、5 9 l ， 其对应的l 一乳酸产量为1 5 5 9 l ，对结果进行验证得到l 乳酸的产量为1 5 3 8 9 l ，说 明模型与实际情况拟合的很好。 通过单因子实验对菌株t l - 3 一r 一1 6 的培养条件进行了优化，确定了最佳发酵方式为 摇床1 5 0 r p m 振荡培养2 4 h 后静置培养至7 2 h ，最佳接种量为1 0 ，最佳种龄为1 8 h ， 最佳发酵温度为5 2 。 对t l - 3 一r - 1 6 菌株进行5 l 罐发酵，结果确定了5 l 发酵罐上的发酵条件为通风量 1 8 0 l h ，通风时间为2 0 h ，l - 乳酸产量达到了1 2 5 9 l ，转化率达到了9 2 6 。发酵周 期由摇瓶发酵的7 2 h 缩短到4 8 h 。 关键词：l 一乳酸：响应面；筛选：乳酸发酵 a b s t r a c t t l - 3w h i c hi ss e l e c t e db yp r o t o p l a s tf u s i o nw a su s e da so r i g i n a ls t r a i n ，t h r o u g h h i g h - a c i da n dh i g h - s u g a rd o m e s t i c a t e d , an u m b e ro fs t r a i na r es e l e c t e d , a n df e r m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s ，c u l t u r e sa n dc o n d i t i o n so ft l - 3 - r - 1 6a l es t u d i e d t h ef e r m e n t a t i o ni n5 l r e a c t o re n h a n c e di t sc a p a b i l i t yo fp r o d u c i n gl - l a c t i ca c i d b a s e do nt h eb a c t e r i ac h a r a c t e r i s t i cw h i c hi sh i g hp r o d u c i n gl - l a c t i ca c i d ，t h r o u g h s e l e c t i v ec u l t u r e1 6s t r a i n su t i l i z i n gg l u c o s ep r o d u c i n gl - l a c t i ca c i dw e r eo b t a i n e d , t h e y i e l do fl - l a c t i ca c i de x c e e ds 0 9 lu n d e rt h et e m p e r a t u r e5 0 i n7 2h o u r s b yt h es e c o n d s c r e e n i n ga n dt h ee x p e r i m e n to ff e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ，1s t r a i n su t i l i z i n gg l u c o s e ， w h i c hh a da h i g h e ry i e l do fl - l a c t i ca c i d1 0 6 9 lw e r ed e t e r m i n e d , n a m e dt l - 3 - r 1 6 ，a n d l - l a c t i ca c i da c c o u n tf o r9 6 t h eg r o w t hc u r v eo fs t r a i na n dt h ed o w n t r e n do fp hw e r e d e t e r m i n e d 田1 eo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i aa b o u tt h es t r a i nt l - 3 r 一1 6w a sr e s e a r c h e d d i f f e r e n ts o r t so fc a r b o na n dn i t r o g e nr e s o u r c e sw e r es t u d i e db a s e do nt h es i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t c o ms y r u pi st h eb e s tc a r b o nr e s o u r c e ，p e p t i d e i na n dc o r ns t e e pf i q u o ra r e t h eb e s tn i t r o g e nr e s o u r c e t h r e ei n g r e d i e n t s r a t i oo fm e d i u mw a so p t i m i z e dt h r o u g h r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ( c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n ) t h ef u n c t i o n a lr e l a t i o n s h i p b e t w e e nm a i nf a c t o r sa n dr e s p o n s ev a l u e ( l - l a c t i ca c i dy i e l d ) w a se s t a b l i s h e d ，a n dt h e r e g r e s s i o ne q u a t i o nw a so b t a i n e d t h r o u g ha n a l y z i n gt h er e g r e s s i o ne q u a t i o n ，t h eo p t i m a l c o n c e n t r a t i o n so ft h ef a c t o r sw e r eo b t a i n ：r i c hs a c c h a r i f y i n gl i q u i d1 6 0 9 化p e p t i d e l o g 化 c o i l ls t e e pl i q u o r5 m l l t h ey i e l do fl - l a c t i ca c i dr e a c h e d l 5 5 9 化t h er a t i oo fg l u c o s ea b o u t 9 5 n ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so ft h es t r a i nt l - 3 - r - 1 6w e r es t u d i e da n dt h eo p t i m a l c o n d i t i o n s w e r ea sf o l l o w e d ：t h ec u l t i v a t em a n n e r - s h a k i n g2 4 ht h e ns t o p ，t h ei n o c u l a t i o n s i z e1 0 ，t h ea g e1 8 h ，t h ef e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e5 2 c u s i n gt l - 3 一r - 1 6t of e r m e n ti n5 lr e a c t o r , s e l e c t1 8 0 l ha st h eb e s tv e n t i l a t i o n q u a n t i t y , a f t e r2 0 h , s t o pv e n t i l a t i o n , t h ef e r m e n t a t i o nt i m ei s4 8 h , a n d t h el - l a c t i ca c i dr e a c h 1 2 5 9 化t h e r a t i ow a s9 2 6 k e yw o r d s ：l - l a c t i ca c i d ，r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ，f i l t r a t i o n ，l a c t i ca c i df e r m e n t a t i o n 目录 1 前言1 1 1 乳酸的性质及应用- 1 1 1 1 乳酸的性质。：1 1 1 2 乳酸的应用2 1 2 乳酸的生产方法4 1 2 1 化学合成法。4 1 2 2 酶法4 1 2 3 发酵法5 1 2 4 乳酸生产方法的比较。7 1 3l - , t 酸生产菌株的选育7 1 3 1 优良l 广乳酸菌株应具有的特性。8 1 3 2 诱变育种8 1 3 3 基因工程育种8 1 3 4 原生质体融合育种9 1 4 发酵法生产乳酸的工艺h 9 1 4 1 分批发酵。9 1 4 2 糖化发酵并行式( s s f ) ：1 0 1 4 3 半连续发酵1 0 1 4 4 连续发酵1 0 1 4 5 细胞固定化发酵1 0 1 4 6 细胞循环发酵1 0 1 5l 乳酸的研究进展及生产现状1 0 1 5 1 研究进展1 0 1 5 2 生产现状：。1 1 1 6 发酵过程中培养条件的控制1 1 1 6 1 温度的控制。1 1 1 6 2p h 的控制。1 2 1 6 3 溶氧的控制1 2 1 6 4 补料分批发酵：j 1 2 1 7 本论文研究的主要内容、目的及意义1 2 1 7 1 本论文研究的目的及意义1 2 1 7 2 本论文研究的主要内容1 3 2 材料与方法，1 4 2 1 实验材料1 4 2 1 1 菌种。1 4 2 1 2 实验仪器1 4 2 1 3 主要试剂。1 4 2 1 4 主要溶液1 5 2 1 5 主要培养基1 5 2 2 分析方法1 6 2 2 1 残糖的测定方法：3 ，5 一二硝基水杨酸比色法1 6 2 2 2l 乳酸的测量：s b a - 4 0 c 型生物分析传感仪。1 7 2 2 3 总酸的测定1 7 2 2 4 菌体浓度的测定1 7 2 2 5l 乳酸纯度的测定1 8 2 2 6p h 值的测定1 8 2 2 7 碳氮比的测定1 8 2 3 实验方法1 8 2 3 1l - 乳酸菌高产菌株的筛选1 8 2 3 2l 乳酸产生菌的发酵实验1 8 2 3 3 稳定性验证。1 8 2 3 4 出发菌株生长曲线的绘制1 8 2 3 5 出发菌株的产酸实验厶1 9 2 3 6 成品分析1 9 2 3 7 种子培养方式的确定1 9 2 3 8 【广乳酸菌发酵培养基的优化1 9 2 3 9 发酵条件的优化2 1 2 3 1 0 响应面分析法优化培养基2 2 3 结果与讨论2 3 3 1 初始菌株的分离和筛选2 3 3 1 1l 乳酸产生菌的初筛实验2 3 3 1 2 高产菌株复筛实验2 4 3 1 31 i ，3 r 1 6 在5 0 培养时的生长曲线2 5 3 1 4t l - 3 r 1 6 的降酸实验。2 5 3 1 5 成品分析。：拓 3 2 种子培养方式的确定2 6 3 3l 乳酸发酵培养基的优化。2 8 3 3 1 不同碳源对l 乳酸发酵的影响。2 8 3 3 2 不同浓度初糖对l 乳酸发酵的影响一。2 8 3 3 3 不同氮源对l 乳酸发酵的影响。2 9 3 4 发酵条件的优化3 6 3 4 i 不同发酵方式对l 乳酸发酵的影响。3 6 3 4 2 摇床振荡培养时间对l 乳酸发酵的影响3 7 3 4 3 先振荡后静置培养乳酸发酵过程中的降糖、产酸及菌体生长曲线。3 7 3 4 4 接种量对i ，乳酸发酵的影响3 8 3 4 5 种龄对发酵的影响3 8 3 4 6 发酵温度对l 乳酸发酵的影响。3 9 3 5 响应面分析试验确定最佳发酵条件4 0 3 5 1 试验条件分析4 0 3 5 2 试验设计及结果。4 1 3 5 3 二次回归模型拟合及方差分析4 2 3 5 4 二次拟合响应面分析4 3 3 5 5 优化条件与初始条件摇瓶发酵比较。4 5 3 6t l - 3 r 0 1 6 菌株5 l 罐发酵试验4 5 3 6 1 通风量对l 乳酸的影响4 5 3 6 2 优化条件下5 l 罐发酵动力学曲线4 6 4 结论：4 8 5 展望。：。4 9 6 参考文献5 0 7 硕士期间发表论文情况5 6 8 致谢5 7 l i i 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 乳酸的性质及应用 1 1 1 乳酸的性质 乳酸( l a c t i ca c i d ) 的学名为a 一羟基丙酸( 2 羟基丙酸，2 - h y d r o x y p r o p a n o i ca c i d ) ， 分子式为c 3 h 6 0 3 ，是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生 物中。由于其分子内含有一个不对称的c 原子，所以存在光学异构现象，具有d 型 和i 广型两种，d l 乳酸为消旋型。其结构式见图1 - 1 。乳酸的相对分子质量为9 0 0 8 ， 相对密度在2 5 时约为1 2 0 6 。纯净的无水乳酸是白色晶状固体，乳酸异构体的理化 性质见表1 1 【1 1 。 i - 怡o c h 吣 举 l 一孚l 酸 c o o 一 ； 耖洲 t ，泓 u d 一乳酸 图1 - 1 乳酸的结构式 f i g 1 - 1t h e s 血 u c t u r eo fl a c t i ca c i d 表1 - 1 乳酸异构体的性质 t a b l e1 - 1p r o p e r t i e so fl a c t i ca c i di s o m e r 乳酸与水可以完全互溶，不易结晶析出，6 0 以上浓度的乳酸溶液有很强的吸湿 性。乳酸通常为无色或浅黄色糖浆状的粘性溶液，在6 7 1 3 3 p a 的真空条件下反复分 馏，可得到高纯度乳酸，进而获得单斜晶体的结晶乳酸i z j 。 乳酸可分为工业级、食品级和药典级。工业级乳酸是乳酸含量为5 0 一9 0 的溶 液，具有吸湿性。食品级乳酸的乳酸含量在8 0 以上，药典级乳酸的乳酸含量为8 5 一9 0 3 1 。 1 前言 由于乳酸分子内含有羟基和羧基，所以具有自动酯化能力，乳酸浓度越高，这种 趋势越强，所以乳酸通常是乳酸和乳酰乳酸的混合物。乳酸能与水、乙醇、乙醚、丙 二醇、甘油、丙酮混溶，几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯。乳酸可以参与多 种反应，如氧化反应、还原反应、缩合反应和酯化反应等【3 j 。 由于乳酸含有羟基和羧基，故具有自身酯化的能力，乳酸越浓这种趋势越强。一 般浓乳酸溶液中2 0 或更多的乳酸自动酯化生成直链的乙酰乳酸聚合体，又称聚乳 酸。反应可表示为： c 墙 c t t 3c t t s c r r v 2 ) c h 3 明( o h ) c 0 0 h - 哟占稍乇o b 稍毫。占删h + 时1 ) h 2 0 若加热脱水，乙酰乳酸可通过自身酯化为环状的内爻酯，多聚乳酸乙刚的目身朴 化可形成树脂状高分子的聚乳酸。 c t t s l oi h c l t t s。c i - i c i loc 0 0 。夕c h 6 0 h 1 1 2 乳酸的应用 乳酸是一种古老而重要的有机酸。乳酸及其衍生物，广泛应用于食品、医药、饲 料和化工等领域【4 o l 。 1 1 2 1 乳酸在食品方面的应用 由于乳酸酸性柔和且稳定，在食品工业上广泛用作酸味剂、防腐剂和还原剂。可 用于清凉饮品、糖果、糕点的生产，也可用于鱼、肉、蔬菜的加工和保藏。罗伯特伊 格的食品配方字典中说乳酸可用在西班牙橄榄中防止腐烂和提供风味，在蛋粉中提高 分散度和搅打特性，它还用于干酪的涂布剂和色拉调料的配制1 1 1 】。在美国，乳酸用于 软饮料方面，很大程度上取代了柠檬酸、磷酸等。在啤酒酿造上，美国禁止使用磷酸 盐等无机盐调节p h ，而全部改用乳酸。世界上四分之一的乳酸用来生产硬脂酰乳酯 酸。乳酸的盐类硬脂酰乳酯酰钙( c s l ) 和硬脂酰乳酯酰钠( s s l ) ，大量用于面包加工， 不但使面包质地松软、细腻，而且可延长保存期。 由于人体只具有代谢工广乳酸的酶，d 乳酸不能被人体吸收，若摄入d 乳酸或d l - 乳酸，会导致血液中富含d 哥l 酸，引起疲劳、代谢紊乱甚至酸中毒。因此，世界卫生 组织( w h o ) 规定成人每日摄取d 乳酸量不得超过1 0 0 m g k g 体重，对于三个月以下的 幼儿食品中不应加入d 乳酸或d l 乳酸，而对l 乳酸则无此限制。人们普遍希望以 【广乳酸代替d 乳酸用作食品添加剂，促进了i 广乳酸研究和生产的发展。世界卫生组 织提倡使用【，乳酸作为食品添加剂和内服药品，取代目前普遍使用的d l 乳酸。 在保健食品方面，l - - 孚l 酸钙在日本年销售量相当大，称为发酵乳酸钙，以区别化 学合成的d l - 孚l 酸钙，其它如i 广乳酸锌补锌剂、l 乳酸亚铁补铁剂等都有一定的需求 量【埘。 1 1 2 2 乳酸在医药行业的应用 乳酸可直接配制成药，乳酸盐可作为消毒剂【b 1 。乳酸盐具有亲水性，能溶解蛋白 质、角质及许多难溶药物，且对病变组织腐蚀作用相当敏感，能增加药物吸收量、防 止副作用，可用于治疗喉头结核、白喉、狼疮等病。此外，用乳酸可制作红霉素糖衣， 在收敛性杀菌方面用作含漱剂、洗净剂等。乳酸菌有改善肠道微生物群分布，促进肠 道蠕动的作用，还能降低血清胆固醇，增加人体免疫力。另外，高度光学异构的聚 l ( + ) 乳酸( l m d 9 2 ) 在骨外科、人造手术缝合线、血管外科及药物释放材料 方面都有良好的应用前景【1 4 j 。 1 1 2 3 可生物降解材料聚乳酸 【，乳酸的聚合物一聚l 乳酸( p l a ) 是无毒高分子化合物，具有生物相容性。在 人体内可以被分解为l 乳酸，为人体所代谢，不会引起变态反应。因此，聚乳酸可用 于生产缓释胶囊制剂，从而使血液循环中药物浓度相对降低，大大提高疗效，降低副 作用；由聚乳酸制成的手术缝合线，可随伤口的愈合而被机体分解吸收，不需拆线， 特别适合机体深部组织的缝合，减少病人的痛苦并可促进病人的提前康复；聚乳酸还 可用于制作生物植片、u 型钉、伤口夹以修复骨折或其他机体损伤m j 。 “白色污染”已成为威胁全球环境的主要因素之一，为解决塑料废弃物对环境造成 的污染问题，许多国家已开始研究、生产和使用可降解塑料n 酊。经多年研究发现， 以乳酸为原料合成的乳酸聚合物具有很好的生物降解性。这种高分子材料在空气、水 和普通细菌存在下可完全分解成水和二氧化碳，形成良好的生态循环。聚乳酸具有良 好的初期机械性能，熔点约1 7 0 ，其模材对氧、水汽有良好的透过性，又有较好的 透明性，另外还有较好的抗菌、防霉性，使用寿命可达2 - - - 3 年，因此，成为良好的 绿色材料。聚乳酸除在医药行业中使用外，聚乳酸可与其它材料共聚制成的生物降解 塑料可用于生产缓释农药，延长农药的使用时间；用聚乳酸和淀粉制造的生物地膜， 细菌分解后可用于生产透明的、可生物降解的热塑性塑料，通过调整其组成及分子量 来控制其货架寿命，在塑料食品器具、医用服装、个人卫生用品、婴儿尿布、垃圾袋 及各种包装行业中都具有重要的应用【1 7 1 。世界著名的生物技术公司( a d m 公司) 、化 工公司( d u p o n t 公司、d o w 化学公司) 及农业公司( c a r g i l l 公司) 等已把聚乳酸作 为一个环境友好且具有广泛应用的全新聚合物平台而加以大力开发，并力图早日形成 新产业【阍。 i i 2 4 乳酸在化妆品行业的应用 乳酸是一种重要的羟基酸，为皮肤固有天然性保湿因子的一部分。乳酸及乳酸钠 被广泛用于许多护肤品的滋润剂、保湿剂，用于各种洗浴用品中，如沐浴露、肥皂和 1 前言 润肤蜜中。在配制清洁霜、嫩肤霜、浴液时，乳酸用于p h 值调节，对改善皮肤组织结 构，消除皱纹，色斑、治疗皮肤干燥、痤疮等有显著疗效。乳酸及还具有抗微生物的 作用，被应用于抗粉刺产品中。乳酸盐可作为新一代皮肤增自剂，与其它皮肤增白剂 结合使用会产生协同效果。因此，乳酸在化妆品配方中已备受青睐【1 9 刎。 1 1 2 5 乳酸在其它化工行业的应用 在卷烟业中，用乳酸能去除烟草中的杂质，清除苦辣味提高烟草档次：在制革业 中，用4 0 含量的乳酸能除去革鞣皮中的石灰，俗称脱灰。用乳酸脱灰后，皮革质量 比用其它酸脱灰好，因此，高级皮革多用乳酸处理；在毛纺工业中，乳酸可用于染料 的预铬媒染，以降低羊毛的铬盐含量和防止纤维氧化；在丝绸和人造丝的后处理中， 用乳酸作p h 调节剂，可用于增艳和增加纱的色泽。乳酸铵可作为反刍动物的饲料添加 剂，乳酸铜可用于电镀业【2 1 1 。 1 2 乳酸的生产方法【2 3 删 1 2 1 化学合成法 由化学合成法生产乳酸可通过多种途径，其中具有意义的是乳腈法。该法是乙醛 与氢氰酸经碱性催化作用生成乳腈，这是一个液相反应，在常压下进行，粗乳腈通过 蒸馏回收纯化并用浓盐酸或硫酸水解为乳酸，还产生相应的氨基酸副产物，粗乳酸用 甲醇酯化得到乳酸甲酯，蒸馏后再进行水解生成乳酸，甲醇可再循环利用。 乳酸的其他一些可行的化学合成途径包括糖的碱性催化水解，丙烯乙二醇氧化， 乙二醇的氧化，乙醛、一氧化碳和水在高温高压下反应等。这些途径都无法形成技术 上或经济上可持续发展的过程。 1 2 2 酶法 1 2 2 11 ，2 氯丙酸酶法转化 日本东京大学的本崎等【3 】研究了用酶法生产乳酸，他们分别从恶臭假单孢菌( p s e e u a d e ) 和假单孢菌细胞中提取纯化l - 2 卤代酸脱卤酶( 简称为l 酶) 和d l - 2 卤代酸脱 卤酶( 简称为d l - 酶) ，作用于底物d l - 2 氯丙酸，即可制得l 乳酸或d 乳酸。l 酶催 化l - 2 卤代酸脱卤，而d l - 酶既可以催化l - 2 卤代酸脱卤，又可以催化d 2 卤代酸脱 卤在催化时可发生构型的转化，如下式所式： l 酶 i ，型c h 3 一c h c o o h4 - h 2 0 - d - 型c h 3 - c h - c o o h4 - h c i il c io h d l - 酶 d 型c h 3 一c h - c o o h4 - h 2 0l - 型c h 3 一c h c o o h4 - h c i 。 或i 厂型 l 或d 型 i i l ao h 1 2 2 2 丙酮酸酶法转化 ” h u m m e l 等【3 】从d 乳酸脱氢酶活力最高的混乱乳杆菌伍配c o n f u s e s ) d s m 2 0 1 9 g 菌 体中得到d 乳酸脱氢酶，以无旋光性的丙酮酸为底物得到d 乳酸。 1 2 3 发酵法 发酵法制备乳酸是以淀粉、葡萄糖等糖类或牛乳为原料，接种微生物经发酵而生 成乳酸。用于乳酸发酵的菌种【3 1 】有细菌和根霉。 1 2 3 1 细菌乳酸发酵 ( 1 ) 细菌乳酸发酵的主要代谢途径 按细菌发酵糖类经由的过程和生成产物的不同，可将细菌乳酸发酵分为同型乳酸 发酵、异型乳酸发酵和双歧乳酸发酵【3 2 l 。 同型乳酸发酵 葡萄糖经e m p 途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸。 发酵方式如下： c d - 1 1 2 0 6 垫垂噬堡：2 c h 3 c o c o o h 塾堕堕氢堕一2 c h 3 c h o h c o o h + 2 a t p 2 ( a d p + p i ) n a d h + h 经过这种途径，l m o l 葡萄糖可以生成2 m o l 乳酸，理论转化率为1 0 0 。但由于 发酵过程中微生物有其它生理活动存在，实际转化率不可能达到1 0 0 。一般认为转 化率在8 0 以上者，即认为是同型乳酸发酵。工业上较好的转化率可达9 6 。 异型乳酸发酵 异型乳酸发酵是某些乳酸菌利用h m p 途径，分解葡萄糖为5 磷酸核酮糖，在经 差向异构酶作用变成5 磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶催化裂解反应，生成乙酰磷酸。 乙酰磷酸进一步还原为乳酸。 葡萄糖6 磷酸葡萄糖) c o 僻2 酸木酮糖 j 磷酸酮解酶 r 1 乳酸+ 一丙酮酸+ 一3 磷酸甘油醛 发酵反应式为： g 6 h 1 2 0 6 + a d p + p i - c h 3 c h o h c o o h + c h 3 c h 2 0 h + c 0 2 + f 册 此反应过程i m o l 葡萄糖生成l m o l 乳酸、i m o l 乙醇、i m o l c 0 2 。乳酸对糖转化率 5 0 。 双歧发酵途径 双歧发酵是双歧杆菌( b i f u t o b a c t e r i u mb i f u t u m ) 发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。 1 前言 此途径中有两种酮解酶参与反应，即6 磷酸果糖磷酸酮解酶和5 磷酸木酮糖磷酸酮解 酶，分别催化6 - 磷酸果糖和5 磷酸木酮糖的裂解反应，产生乙酰磷酸、4 i 磷酸赤藓糖 和3 磷酸甘油醛、乙酰磷酸。其发酵途径如下： ( 2 工乙酰磷酸_ 乙醇 j6 磷酸果糖z 二4 - 磷酸赤藓糖 葡萄糖乙酰磷酸乙醇 、6 磷酸果禧 ( 1 ) 、3 磷酸甘油醛一丙酮酸_ 乳酸 ( 1 ) 5 磷酸木酮糖磷酸酮解酶( 2 ) 6 - 磷酸果糖磷酸酮解酶 在该途径中2 t o o l 葡萄糖产生3 m o l 乙酸和2 m o l 乳酸，乳酸的转化率为5 0 。发 酵总方程式为： 2 c 。h 1 2 0 6 一2 c h 3 c h o h c o o h + 3 c h 3 c o o h ( 2 ) 影响乳酸产量的因素【3 3 吲 菌体自身的生产能力。乳酸最终产量高的菌株往往乳酸得率和生产速率也较 高，l a d e l b r u e c k i i 种属的菌株是较高产的菌株f 1 9 2 1 1 。 碳源。用于乳酸发酵的碳源主要有葡萄糖、乳清、糖蜜、淀粉和木质纤维素等。 纯的葡萄糖为碳源的乳酸发酵可以得到较纯的乳酸产品，降低分离工艺的费用，但是 纯糖的价位较高。 氮源。常用的氮源有酵母抽提物、蛋白胨和玉米浆【z 2 ，2 3 】。 发酵方式。乳酸发酵常用的方式有间歇发酵( t h eb a t c hm o d e ) 、补料分批发酵 ( t h ef e d - b a t c hm o d e ) 、连续发酵( t h ec o n t i n u o u sc u l t u r e ) 和半不连续发酵( t h e s e m i c o n t i n u o u s l r c p e a t c db a t c hf e r m e n t a t i o n ) ，采用何种方式应该考虑到菌种本身的生产 特性。 影响菌种乳酸产量的因素还有发酵温度、p h 控制和副产物的生成等。一般情况 下要加入中和剂控制发酵液的p h 。或者采用电渗析、液相萃取等方法把乳酸从发酵 液种提取出来，防止p h 过低而造成酸抑制，最终影响乳酸的产量【舻2 8 j 。 1 2 3 2 米根霉的乳酸发酵 米根霉产生淀粉酶和糖化酶，能利用葡萄糖、淀粉和淀粉质原料直接发酵生成 i ，乳酸。米根霉能将大部分糖转化为乳酸，但同时生成乙醇、富马酸、琥珀酸、苹果 酸和乙酸等物质，各种酸之间的比例随着菌种和工艺的不同而异。米根霉的糖代谢主 要有以下几种： 1 ) 正常呼吸：g 沮1 2 0 6 + 6 0 2 - 6 c 0 2 + 6 h 2 0 2 ) 同化作用( 生成菌体) ：干菌体量的9 5 来自碳水化合物。 3 ) 富马酸发酵：c d - l x 2 0 6 + 3 0 2 ：- - c 4 h 4 0 4 + 2 c 0 2 + 4 h 2 0 4 ) 酒精发酵：c 6 h 1 2 0 6 - 2 c 2 h 5 0 h + 2 c 0 2 5 ) l 乳酸发酵：c 6 h 1 ：o 。- 2 c 3 h 。o ， 天津科技大学硕士学位论文 抑制1 ) ，3 ) ，4 ) 反应，乳酸得率就可以提高。米根霉发酵生产水平约在1 1 0 9 i , 左 右，有采用固体发酵方式l 乳酸浓度达到1 3 7 9 l 2 9 1 。 1 2 3 3 细菌发酵和根霉发酵的比较 根霉发酵为混合酸发酵，对糖的转化率理论值为7 5 ，而细菌乳酸发酵理论转化 率1 0 0 ，且根霉发酵生产乳酸需要通气搅拌，动力消耗比较大，通风搅拌费用比较 高。细菌发酵乳酸可以在兼性厌氧条件下静置发酵，可以减少通气的能量消耗，降低 成本。在发酵工艺方面，根霉发酵生产乳酸主要采用的工艺是气升式反应器和固定化 方法 3 0 , 3 1 1 ，而细菌乳酸发酵可以和产物提取相耦合，采用原位分离技术在发酵过程中 进行产物提取，减少工艺流程。因此，现在国内外都开展了对细菌乳酸发酵生产l 乳酸的研究，以发挥细菌发酵生产l 乳酸的优势，弥补根霉发酵生产l 广乳酸所存在 的缺陷和不足。 ? 1 2 4 乳酸生产方法的比材3 刀 化学合成法的缺点是产品为外消旋乳酸即d l 乳酸，另外，由于合成法所用原料 是乙醛和剧毒物一氢氰酸，尽管美国食品和药物管理局( a ) 已将合成乳酸列为安全 品，但发达国家还是不能放心地使用合成法制得的乳酸，因而，合成法生产乳酸大大 受到了限制，此外，其生产成本也较高。 酶法生产乳酸虽然可以得到旋光性专一的乳酸，但工艺比较复杂，应用到工业上 还有待于研究。 微生物发酵法生产乳酸，可以通过菌种和培养条件的选择而获得具有立体专一性 的d 乳酸或l 乳酸或者两种异构体以一定比例混合的d i ，乳酸消旋体，以满足生产 聚乳酸的需要。发酵法生产乳酸除能以葡萄糖等单糖为原料外，还能以淀粉、纤维素 为原料进行生产，利用这些可再生资源不会导致大气中c 0 2 的净增加，不引起温室效 应。因此，微生物发酵法生产乳酸因其原料来源广泛、生产成本低、产品光学纯度高、 安全性高等优点而成为生产乳酸的重要方法。 1 3l 乳酸生产菌株的选育【3 8 】 优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和 质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。直接从自然界得到的菌株为 野生型菌株，事实上，从自然界直接获得的野生型菌种往往低产甚至不产所需的产物， 只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产。传统的诱变筛选方法、基因 工程育种和原生质体融合都可用于改变乳酸细菌的性能。 ： 1 3 1 优良i 广乳酸菌株应具有的特性 适于乳酸工业生产的乳酸细菌应具有如下一些特性： 、1 ) 为同型乳酸发酵类型的乳酸菌。该类型乳酸菌的糖转化率高，理论转化率为 1 0 0 ，且副产物少。 2 ) 营养要求简单。乳酸菌属于化能异养型微生物，营养要求复杂，必须提供各种 1 前言 氨基酸、维生素、核酸等营养因子，如能简化培养基组成，可大幅度降低生产成本， 并且可以简化后提取工艺。 3 ) 耐高酸。耐高酸菌受乳酸的反馈抑制小，对乳酸有较高的耐受性，能大量积累 乳酸，有益于乳酸产量的提高。 4 ) 耐高温。乳酸菌生长的最适温度一般为3 0 - 4 0 ，如能在5 0 以上温度进行发 酵，不仅可以提高发酵速度，缩短发酵周期，还可以避免染菌。 1 3 2 诱变育种 凡是能够显著提高突变率的理化因素均可称为诱变剂。一般地，诱变剂可分为物 理诱变剂和化学诱变剂，前者包括紫外线、x 射线、y 射线、快中子、激光、超声波 等，后者包括亚硝酸、烷化剂、羟胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍等。目 前，经常采用的诱变剂主要是紫外线、亚硝酸、硫酸- 7 , 酯( d e s ) 、亚硝基胍邮) 。 1 3 3 基因工程育种 基因工程是指将一种或多种生物体( 供体) 的基因在体外进行拼接重组，然后转入 另一种生物体( 受体) 内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。基因工程的整 个过程由工程菌( 细胞) 的设计构建和基因产物的生产两大部分组成。 随着分子生物学的进一步发展，基因工程技术也被用于构建【广乳酸生产菌株。通 常要得到一株l 乳酸的高产菌株，需要连续一代又一代的诱变和筛选，这个过程不仅 耗时长，而且由于诱变剂作用的非特异性，使得人们无法知晓诱变后通过筛选而得到 的高产突变株所发生的分子水平的变化，因而也就无法了解其乳酸产量提高的机制。 然而，利用可获得的基因组序列信息及相应的基因工程技术，就可达到上述目的，进 而构建得到高产l 乳酸的基因工程菌。k 撕k y l a - n i k k i l a l 4 2 】等采用基因工程方法重建 l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s 的基因，用基因l d h l 代替基因z 幽d ，使l 乳酸产量提高了2 0 ： d o n g - e t mc h 觚g 【4 3 l 等人将k 础圯硷c 啪时的基因j 抛导入e c 棚中，l - 乳酸产量达到了 4 5 扎