（有机化学专业论文）几种基于苝系衍生物荧光探针的构建及性质研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 摘要 花及其衍生物具有优异的化学、热和光化学稳定性，对从可见区到红外区的 光有很强的吸收，是一类性能特异的分子电子学材料，在激光材料、液晶显示材 料、电致发光器件、感光体及太阳能电池方面已经有着很广泛的应用，对它们的 发光性质及其他光物理性质的研究一直以来都是异常活跃的课题。本文设计并合 成了多种新颖的高荧光量子产率的花系衍生物，并以其为信号单元构建新型荧光 探针进行了研究。论文主要包括以下内容： 第一章：概述了分子荧光探针的分类，机理以及花系衍生物的合成、性质等 研究现状，提出了采用以花系衍生物作为荧光信号单元构建分子荧光探针为本文 的主要研究内容。 第二章：探索了高水溶性、高荧光量子产率花系衍生物的合成方法，合成了水 溶性达到l m ，荧光量子产率达到1 0 0 的3 ，4 ：9 ，1 0 一花四羧酸铵盐，并对其结构进行 了表征。通过理论计算分析了其具备高水溶性高荧光量子产率的原因，四个羧基阴 离子使花母体分子具有很好的平面性和很强的负电势，有效的防止了其聚集，实现 了其在保持高荧光量子产率的同时获得了良好的水溶性。光物理性质及生物细胞荧 光标记研究表明其是一种优异生物荧光标记物。 第三章：基于高荧光量子产率的3 ，4 ：9 ，1 0 花四羧酸铵盐，设计了一种新颖的 响应范围可调的p h 荧光探针。以3 ，4 ：9 ，1 0 花四羧酸铵盐作为信号单元，在顺磁 性的三价铁离子存在条件下，由于荧光团与铁离子之间的p e t 效应，使得荧光团 的荧光淬灭。随着p h 增大，当f e 3 + 离子与0 h 。离子形成f e ( o h ) 3 沉淀，荧光团被 释放，从而荧光恢复。在不同的f e ”的良好配体存在条件下，f e 3 + 与信号单元分 离的响应区间发生变化，实现了响应范围的可调。该探针具有很多优异的性能： 高水溶性，高荧光量子产率，响应的p h 范围可调且近中性，荧光和颜色变化明 显，检测灵敏、响应快，在应用于生物体系时具有重要的意义。 第四章：以顺磁性f e 3 + 抗磁性f e 2 + 与3 ，4 ：9 ，1 0 花四羧酸铵盐构建荧光开关， 当以j 顷磁性的f e ”存在时，荧光团和f e ”之间发生p e t 效应，荧光淬灭，而当以 抗磁性的f e 2 + 存在时，p e t 过程被阻止，荧光恢复，这样就实现了荧光的开关。 氧化剂h 2 0 2 可以把f e 2 + 氧化成为f e 3 + ，而还原性的v c 则可以使f e 3 + 还原成为 f e 2 + ，通过磁性的可逆变化，可以检测对于生物体有重要意义的h 2 0 2 及v c 。 山东师范大学硕士学位论文 第五章：设计合成了三种连有吡啶基团的花二酰亚胺的衍生物，都具有高的 荧光量子产率，可以和多种金属离子发生配位作用并导致荧光淬灭。对三种化合 物与不同金属离子之间的作用及在不同的溶剂中的溶剂效应做了比较和分析。其 中二吡啶花二酰亚胺除对二价铜离子具有良好的识别作用外，其对于酸性气体和 氧化性气体也具有十分敏感的检测效果。设计了检测有害酸性气体的荧光探针并 对作用机理进行了探讨。 关键词：花；水溶性；荧光探针；荧光开关；传感器 分类号：0 6 2 5 1 5 i i 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t i i l s p i r e d b y 曲i g u i i l ga p p l i c a t i o ni nm o l e c u l a re l e c 仰1 1 i c s ，l i 曲te n e r g yc o n v e r s i o n ， p h o t o c a t a l y s i s ，如d 斌i f i c i a lp h o t o s y n t l l e s i s ，t 1 1 ep h o t o i l l d u c e d 曲e 珊，肌de l e c 们n 吣f e ri nd o n o r - a c c 印t o rs y s t e m sa t t r 。a c te x t e n s i v ea t t e m i o n a s 觚i m p o r t a mc l 嬲so f 劬c t i o n a lm a t 甜a l s ，p e r y l e i l eb i s i m i d ed 耐v a t i v ep o s s e s sm a n ya d v 肌t a g e so f 嘲b l e 咖c n 珊，o u s t a l l d i n gp h o t o e l e c 仃c np r o p e n i 韶，1 1 i 曲n l e 册甜s t a l ) i l i t y 船de x m b i t 谢d e a b s o r p t i o n 姐de i n i s s i o nb 弛d si n 血e 、r i s i b l er e g i o n ，、h i c hc 姐b e 谢d e l y 哪e di i l o 唱a i l i cs o l a rc e l l ，o 玛撕cs 0 1 i ds t a t ep h o t o v o l t a i cd e 、，i c e ，o r g 蚵c 血i i l f i l i n 丘e l d e f r e c t 锄n s i s t o ra l l ds oo n h 也i sp a p as 谢e so fl l i 曲s 0 1 u b l e 缸d1 l i 曲n u o r e s c e n t p e 聊e n ed e r i v a t i v e sh a v e b e e nd e s i g n e d 趾1 dsy i l _ t h e s i z e d 1 1 l e nt h ec h a r a c t e r su s e df o r n u o r e s c e n tp r o b ew e r er e s e a r c h e d c h a p t e r1 ：t h er e s e a r c ha n da p p l i c a t i o 璐o fn u o r e s c e n tp r o b ea n dp e r y l e i l e d 耐v a t i v e sh 删eb e r e v i e w e di nc l k l p t e r1 t h en u o r e s c e i l tp r o b eb 觞e d0 nt h e p r e y l e i l ed 耐v a 廿v e si st h en o v e li l l l l o v a t i o n c h a p t e r2 ：s e v e r a lw a y st 0s o l v et t l ew a t e r - s o l u b i i i 锣a n d1 1 i g hf i u o r c s c 既t q u a n t u m 姐e l do fp e 巧l e n cd e r i v a l i v e sw e r ed e s i 盟e da n da tl 嬲t 觚i d e a lc o m p o u n d 3 ，4 ：9 ，1o p e r y l e i l et e 仃a c a r b o xy ：l i ca m m o l l i u mw 舔a c ( 埘r e dw h i c h m e da l lm c e x c e n e n tc h a c t e r su s e d 祁t 1 1 ef l u o r o c h r o m e sf o rs t a i l l i i l go f l i v i i l gc e l l s t h er e 蠲。璐 w h yi th a db o t l lm ew a t e r - s o l u b i l i t y 锄d1 1 i 曲n u o r e s c e n tq u a i ：岫my i e l dw e r e 粕m y z e d 锄da 枷o n a lr e a s o nw 勰a c q u i r e d t h cf o u r h y d r o p l l i l i cc a r b o x y l si i l c r e 硒e d l e w a t e r - s o l u b i l i 妙a n da l s oi n c r e 嬲e dt 1 1 es 缸o n gi l e g 撕v ee l c c t r o s t a _ t i cp o t e l l t i a lo f 吐l c p e r y l e n ec o r et 0p r e v 衄t t 1 1 ea g g r e g a t i o n t h ee x p e r i i n e m a t i o ns t a i 血go nh i p p o c 卸叩a 1 n e u r 0 i l si 1 1 d i c a t e dt l l ep e r y l e n ed 耐v a t i v ec o u l db eu s e da s9 0 0 dn u o r e s c e ml a b e l c h a p t e r3 ：n o v e lf l u o r e s c e n tp hs e l l s o rw i mt l l n a b l er e s p o i l s er a n g ew 嬲d e s i g n e d b a s e do n1 1 i g hn u o r e s c e m3 ，4 ：9 ，1 0 - p e 巧l e n et e t r a c a r b o x y l i ca m m o m u m ，w k c hc o u l d c o o r d i i l a t em ep a r 锄a 印e t i cf e i o 璐t 0s 丽t c ho 行i t s e l f b yp e t q u 肌c ga u l dc o u l d r e l e a s ef e ”t ot u mo nt h en u o r c s c e n c ea g a i nb yf o m i n gf e ( o h ) 3a th i g h e rp ha i l da t i i i 山东师范大学硕士学位论文 e v 锄h i 曲e rp hi nt h ep r e s e i l c eo fd i 疵r e n tl i g a n d si na q u e o u ss o l u t i o n c h a p t e r4 ：n o v e ln u o r e s c e n ts w i t c hw a s c o n s t i c t e db 舔e d0 n3 ，4 ：9 ，l o - p e r y l 朗e t e 吮莉o x y l i c 锄m o n i 啪i i lp r e s e n c eo fd i 姗a 印e t i cf e 2 + o rp 盯撇a 印e t i cf e ”1 1 l e s 砒c ht u n l so f ri i lp r e s e n c eo fp a r 锄a 印e t i cf e o w i n g t 0m ep e tq u e n c h w h i l ei t t u n l0 ni i lp r e s e n c eo f d i 锄a g n e t i cf e 2 + b e c a u s eo f t l l ep r e s 肌c eo f m ep e tq u e n c h t h em a 鲫e t i s m 仃a 咀s f e rb e 铆e e l lf e 2 + 姐df e 3 + c 锄b eu s e dt 0d e t e c th 2 0 2a 1 1 dv c c h a p t e r5 ：1 1 _ l r e et ) ，p e s o fp e r y l e 鹏i m i d ed e r i v a t i v e s c o n t a i l l i l l gp 如血1 e 鲫【b s t i t l l e n t sw e r es y n t h e s i z e d 1 1 1 e1 1 i g l lf l u o r e s c e n tp e 巧l e n ei n l i d e 捌v a t i v e sc a nb e q u e n c h e db yc o o r d i l l a t i i l gs e v e r a l lm e t a li o 璐t h es o l v 髓te f f e c tw 勰s m d i e d 心n g 廿1 a t ，l ，7 2 ( 3 - h y d r o x y - p 妒d i l l e ) - n ，n 一2 一c y c l o h e x y l 一3 ，4 ：9 ，1 0 - p e r y l 锄e i n l i d e d 锄o i l s 仃a t e ds e l l s i t i v i t yt ot 1 1 ec u z 十觚do x i d a t i v e0 ra c i m cg 豁t h em e c h a i l i s mw 勰 r e s e a r c h e da n dan 0 v e lp r o b ef o rt h eh a n n 血1o x i d a t i v e0 r i d i cg 蠲w 弱d e s i 印e d p 叫饥ed 唧枷v e ；w a t 昏s 唑垒! 当撕s c 髓tp r o b e ；n u o r e s c e n t 刚t c h ； c a t e g o l 。yn u m b e r ： 0 6 2 5 1 5 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 躲鸣参未 新等毛 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本 人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名 签字日期：2 0 0 缛铲月卢爱拨新糠矽签字日期：2 0 0 辨q 月2 白 山东师范大学硕士学位论文 1 1 荧光探针概述 第一章前言 随着人们对荧光化合物电子光谱和光物理行为的深入研究，在利用荧光分子作 为探针，检测各种不同体系的状态及其变化，或某种反应历程及其动态学问题等方 面，都有了巨大的进展l ，2 。近年来新发展起来的荧光化学敏感器更使荧光探针的方 法和应用有了很大程度的提高和扩充，不仅在药物学、生理学研究方面有重要价值 而且在环境科学、信息科学方面也做出了很大的贡献。当某种物质或体系的某一 物理性质发生变化时该分子的荧光信号能发生相应的改变的分子就可称为某一物 质或某一物理性质的荧光分子探针。分子识别是广泛存在的自然现象，特别是在生 命过程中，分子识别起着极其重要的作用。但分子识别作为分子之间发生的事件， 人们需要借助一定的技术手段才能感知伴随分子事件发生所产生的物理信号。分子 荧光作为传感信号具有以下优点：可达到单分子检测的高灵敏性、可开关、可实现 人与分子的通讯、对亚微粒具有可视的亚纳米空间分辨并且是亚毫秒时间分辨的。 另外人们已经积累了许多关于分子结构、超分子结构以及环境因素对分子荧光影响 的知识并在一定程度上揭示了其内在的规律3 。所以人们设计、合成了大量能够将 分子识别事件通过分子的荧光信号有效表达的复杂荧光分子，这些分子也就是所谓 的荧光分子探针。 荧光分子探针的主要应用领域是生物、医学和环境监测，所以在水溶液中的荧 光探针才具有潜在的广泛应用价值。另外，许多探针分子的荧光性质会受质子的影 响，在水溶液中可以通过缓冲溶液控制稳定p h 值，使识别研究的结果更可靠。由 于水分子对金属离子较强的水合作用以及水分子对探针分子识别基团较强的结合， 使水溶液中的金属离子识别比有机溶剂中具有更大的难度4 。通常评价荧光分子探 针的性能应主要考虑灵敏性、选择性、实时性和原位检测性能四方面因素。灵敏性 中包括许多因素；首先，探针与被检测物的结合强度是识别灵敏性的前提；其次， 识别信息的荧光信号转换效率同样影响识别灵敏性，荧光增强的探针一般会比荧光 淬灭的相应探针灵敏性高；另外，荧光团的荧光发射波长、量子产率、斯托克斯位 移、背景荧光干扰等也会影响探针的检测灵敏性；灵敏性还与仪器性能有关。选择 山东师范大学硕士学位论文 性主要取决于探针与被检测物的结合选择性：有时某些被结合的客体可直接影响荧 光团的荧光发射性能，这种情况下识别选择性还与被结合的客体性质有关；专一选 择性是最好的。实时性主要包括识别响应的速度和可逆性两方面，如果可逆响应的 速度快于或与被检测客体的变化速度相匹配，则可称之为实时响应探针( 传感器) 。 目前，化学走向超分子科学并与生命科学、材料科学等学科高度交叉，分子荧光探 针从而更加得到各研究领域的广泛关注，充满着未知和挑战。 1 2 荧光探针的分类和机理 荧光探针按照机理一般可以分为：光诱导电子转移、分子内电荷转移、荧光共 振能量转移等，其中研究最为广泛的应该属光诱导电子转移，论文的工作也主要围 ? 绕这一机理展开。 光诱导电子转移3 ，5 ( p e t ，p h o t o i i l d u c e de l e c 缸o nt m s 矗。r ) 。典型的p e t 荧光 探针体系是由具有电子给予能力的识别基团，连接基团，荧光基团三部分构成。其 中荧光团的功能是光吸收和荧光信号的发射。识别基团的功能是结合客体并且将信 息传递给荧光团，两部分通过连接基团连接起来。在p e t 荧光探针中，识别基团与 荧光团之间的识别信息与荧光信号之间的转化是靠光诱导电子转移完成的。具有给 电子能力的识别基团将其处于最高能级的电子转入激发态，荧光团因电子激发而空 出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁回原基态轨道发射荧光，荧光淬灭。 而当识别基团与客体结合后，降低了识别基团的给电子能力，p e t 过程被终止，荧 光团荧光恢复，所以这类探针也可以被称为荧光开关( 图1 1 ) 。 2 年l u i ei i ih o l e x c i t e da c c e p t o r d o n o r h o h o r a d i c a la n i o nr a d i c a lc a t i o n 图1 一lp e t 机制的前线轨道理论示意图 山东师范大学硕士学位论文 p e t i n 图1 2p e t 荧光开关原理示意图 n 1 巳_ 夕 p e t 图1 3 几种p e t 荧光探针 分子内电荷转移3 5 ( i c t ，h t r 锄0 1 e c u l a rc h a 唱et r a l l s f i 神。这类探针的荧光 团上分别连有供电子基和吸电子基，而且供电子基和吸电子基又能充当识别基团。 分子被光激发后，会进一步增加从电子给体到电子受体的电荷转移。识别基团与 客体结合时，会对荧光团的推拉电子产生影响( 减弱或强化电荷转移) ，从而导 致荧光光谱的变化，主要是光谱蓝移或红移。一般情况下，i c t 荧光探针对荧光 强度的影响不像p e t 荧光探针那样显著( 图1 4 ) 。 渤 豇 甲瞅 、咩 q 气- 尸j 图1 _ 4 几种i c t 荧光探针 荧光共振能量转移6 。7 ( f r e t ，f l u o r e s c 即c er e s o n a n c ee n e r g yt r a 璐f e r ) 。当能 量给体荧光团与能量受体荧光团相隔的距离远大于两者的碰撞直径时，只要给体 与受体的基态和第一激发态两者的能级间能量差相当，或者说给体的发射光谱与 受体的吸收光谱能有效重叠，就可能发生从给体到受体的非辐射能量转移，又称 为长距离能量转移( 甚至相距远达7 0 1 0 0a 8 ) 。实际上发生能量转移两者除了光 谱重叠外，还必须以适当的方式排列。受体可以是荧光团，也可以是荧光淬灭团。 前一种情形，激发给体时，由于能量转移，将观察到受体的荧光发射。而后一种 情形，则只能观察到给体的荧光变化，多用于核酸检测9 ( 图1 5 ) 。 4 图l 一5 两种典型的f 砌玎荧光探针 除此之外，还有很多基于其他机理的荧光探针，也有非常好的效果1 0 1 2 。 山东师范大学硕士学位论文 1 3 荧光探针的组成部分 荧光探针的组成部分包括荧光团和识别基团。 荧光团是荧光分子探针的最基本组成部分，作用是将分子识别信息表达为荧 光信号。通常选择芳香族化合物做荧光分子探针的荧光发色团如稠环芳烃，以葸、 萘、芘为主要代表的稠环芳烃类都具有强而稳定的荧光。它们作为结构最简单的 荧光团，经常用于基础理论的研究。 目前应用比较广泛的并且实现生物应用的有荧光素和罗丹明为代表的咕吨类 荧光化合物1 3 ，1 4 和菁类荧光染料”。其特点是波长可调范围特别大，可以进入近 红外区，能有效避开生物体系的背景荧光，提高探针的灵敏性。吡咯甲j i i 类荧光 团7 的特点是荧光量子产率高，随取代基变化其荧光波长可调范围大，不易受 环境p h 的影响。1 ，8 萘酰亚胺也是一类重要的荧光化合物1 8 ，”，特别是4 位有强 烈供电基团如氨基的衍生物都能够发射强荧光、光稳定性好、荧光发射波长适中、 斯托克斯位移大，也经常被用于荧光分子探针的合成。探索环境相容性好、荧光 量子产率高、稳定抗干扰能力强的新型荧光分子仍然是荧光探针研究的一个重要 内容。 识别基团是为实现对目标物种的识别而合成的探针的结构单元。对于阳离子 识别，除少数荧光化合物本身所带的基团对离子具有识别能力外，绝大多数荧光 分子探针需要一个主要为结合客体而合成的识别基团。荧光分子探针中常用的识 别基团有冠醚2 0 、开链聚醚2 1 、多乙烯多胺、多羧甲基胺2 2 ，2 3 、环糊精、杯芳烃 “、多肽2 5 等。 除上述的几种识别基团外，近年来吡啶及其衍生物作为荧光分子探针的识别 基团得到了广泛应用，用于各种金属离子的荧光分子探针中2 8 。近几年这类探 针研究得非常活跃，许多有关的荧光分子探针已成功地用于了活细胞的显微荧光 成像研究中。 1 4 花系衍生物概述 目前，荧光探针的荧光团的选择大多数还是一些小分子的化合物，而在我们 的工作中主要选择花系衍生物作为荧光团。茈为稠环芳烃，是一类有强烈荧光的 山东师范大学硕士学位论文 芳香烃化合物，具有大的共轭兀体系。茈及其衍生物具有优异的化学、热和光化 学稳定性，对从可见区到红外区的光有很强的吸收，是一类性能特异的分子电子 学材料2 9 ，在激光材料、液晶显示材料、电致发光器件、感光体及太阳能电池方 面已经有广泛的应用3 0 ，3 1 ，对它们的发光性质及其他光物理性质的研究一直以来 都是异常活跃的课题。 茈四羧酸二酰亚胺母体分子( p d i ) 可以看作两个萘分子单元的组合，每一 个又连着一个酰亚胺单元，两个萘单元通过s p 2c c 杂化轨道键合形成一个大的 平面芳香体系，分子结构如图1 6 。p d i 被认为是一个封闭的发色团，荧光量子 产率几乎是定量的，且产率和寿命不受氧的影响。p d i 是缺电子的染料，非常容 易被还原，而难以被氧化，其缺电子特征也是它具有高度光稳定性的一个先决条 件。另外，大多数这些染料在光激发态下都有强还原作用，这一性质已经被广泛 的应用到建立长寿命的电荷分离态中。 图1 - 6p d i 的分子结构 茈系衍生物无论在学术研究领域还是在染料颜料等工业应用领域都引起了人 们的广泛兴趣。由于其良好的光、热、化学稳定性以及其着色牢固性，并且通过不 同的化学修饰可以得到红、紫罗兰甚至黑色等各种颜色，1 9 5 0 年即被应用于汽车颜 料领域3 2 ，3 3 。经过化学修饰后的花酰亚胺类化合物的溶解性能得到了很大程度的提 高，从此这类化合物所具有的一些光电化学方面的优异性能得到了空前的发展，并 在各种各样的领域内都有良好的应用。例如应用于分子电子器件，包括光电池3 4 ， 有机场效应晶体管( o f e t s ) 3 5 ，发光二极管( o l e d s ) j 6 ，3 7 ，这些染料也应用于电 子照相技术( 静电复印的光感受器) 3 8 ，荧光集电极和激光器3 9 。同时一些包含花 核的自然产品己经被研究应用于抗病毒剂和细胞抑制剂4 0 ，4 1 。以下的内容就是近年 来花类化合物经不完全修饰后所取得的在合成、性质及应用等方面的一些有代表性 的研究成果。 山东师范大学硕士学位论文 1 5j 苣系衍生物的合成 花系衍生物的合成通常是以3 ，4 ：9 ，1 0 花四羧酸二酐为初始原料，对称的茈系衍 生物常采用l 觚曲a l s 等人报道的方法4 2 ，即用花四羧酸二酐和伯胺以喹啉，咪唑或 n 烷基吡咯烷酮( 舯) 为溶剂，以醋酸锌为催化剂在惰性气体的保护下回流 反应。对于脂肪胺，花酐的酰胺化条件比较缓和。但由于芳香胺的碱性比脂肪胺要 弱得多，从而芳香胺与茈酐的酰胺化条件要苛刻，一般以新蒸高沸点的喹啉为溶剂， 在很高的温度下( 大约2 0 0 ) 反应，并用醋酸锌作催化剂。 图1 7部分茈二酰亚胺的合成路线 a o 。2 a o 一。但是当单体开始聚集时，0 1 和0 _ 2 跃迁丌始增加9 5 ，9 6 。图2 3 显示了p t c a m 的水溶液在1 0 。3m 和1 0 5m 浓度时的吸收光谱，因为我们只关注其峰型，所以我们把两个吸收强度都进行了 归一化。从图中可以看出，从1 0 巧m 到1 0 m ，p t c a m 的0 1 跃迁吸收没有 任何增加，这就说明在高浓度时，花四羧酸阴离子仍然以单体形式存在，并没有 发生聚集，这是因为花平面的高电子密度导致了强烈的电子排斥作用，所以使得 其即使在高浓度也不易发生聚集。荧光光谱显示了其k a x = 5 0 9m ，伴随着4 3 啪 的斯托克斯移动，而用罗丹名6 g 作为标准物测得的p t c a m 的荧光量子产率为 】0 2 士0 0 5 9 7 。 4 0 04 5 05 0 05 5 06 0 0 w a v e i e n g h ( n m ) 0 6 0 5 0 4 0 3 段 v 0 2 1 0 ) 或p h ( 、 j 力 c 粤 c w a v e i e n g t h ( n m ) p ? e f o i l 3 图3 2 归一化的1 0 5 m 的盯c a m 水溶液的吸收光谱与p h 值的对应图( p h ：3 7 9 ，4 1 2 ，4 2 8 ， 4 6 4 ，5 2 1 ，65 1 ，7 0 ，7 6 4 ，8 2 4 ) 2 6 刍 山东师范大学硕士学位论文 作为一个弱酸弱碱盐，p t c 剐几乎是中性的，其在宽的p h 范围内显示了 高度的稳定性和水溶性。其水溶液中的吸收在4 0 0 5 0 0 姗之间，在p h 6 时的荧 光量子产率为唧：1 0 2 士o 0 5 ( 罗丹名6 g 做标准物测量) 。图3 2 显示了p t c 削 在不同p h 下的吸收光谱，因为只关注峰型，所以我们把它进行了归一化。作为 花的单体，正常的f r a n c k c o n d o n 因数的级数应该是a 1 6 p j p 3 ，然而， 当单体开始聚集时，0 1 和o - 2 跃迁的吸收就会增加。从p h8 2 4 到4 6 4 ， o 一1 跃迁吸收( 4 3 9 皿) 有小幅增加，这说明在这个p h 范围的兀- 兀聚集作用是 非常弱的，当p h 继续降低到4 2 8 甚至是更低的时候，o _ 1 跃迁吸收发生明显的 增大，初始的吸收峰发生红移，最终在整个检测波段内出现吸收。这个结果说明 p t c a m 在低p h 值时发生了聚集从而阻止了光的透射。在高p h 值时，p t c a m 是以羧酸根的形式存在，花核平面的高的负电势防止了它的聚集从而获得高的水 溶性。而随着p h 值的降低，越来越多的羧酸根负离子变成了花四羧酸，表面的 负电势降低，分子间的电子排斥力也降低，于是具有良好平面性的茈四羧酸就开 始发生兀7 c 作用从而聚集。从上图中可以看出，p t c a m 可以在p h 5 时稳定存 在。 o c 仍 d o o 们 d w a v e i e n g t h ( n m ) o c o l o 3 止 图3 3f e 3 + 滴定l o 5m 的p t c a m 水溶液的吸收( 左) 与荧光光谱图( 右) ( f e 3 + 与p t c a m 的比分别为0 ，l ：2 ，1 ：1 ，2 ：l 和4 ：1 ) 所有数据均在p h = 5 o 的磷酸缓冲体系中测得。 山东师范大学硕士学位论文 在弱酸性环境中，盯c a m 是以羧酸的形式存在，当有f e 3 + 离子存在时就形 成了花四羧酸f e 3 + 的复合物。图3 3 显示了1 0 巧mp t c a m 随着f e 3 + 的不断加入， 吸收、荧光的变化( p b s 缓冲体系，p h = 5 o ) 。当0 5 倍的f e 3 + 加入时，4 6 7 和4 3 9 衄处的吸收峰发生明显的降低并伴随着轻微的红移。直到2 倍的f e ”加入时，两 个吸收峰变成4 6 4 咖的一个主要的吸收峰。再增大f e ”的浓度，吸收没有明显变 化。这说明形成了稳定的茈四羧酸f e 3 + 的复合物，f e 3 + 是一个非常典型的荧光淬 灭剂，像这种p e t 效应导致的荧光淬灭已经有很多报道1 1 0 。1 1 2 。p t c a m 的荧光 发射光谱出现在4 8 1 5 和5 1 0 5n m 处，随着f e 3 + 的加入，荧光不断降低，当加入 到2 倍的f e 3 + 时，荧光完全淬灭，和紫外吸收光谱相吻合。这说明，在形成茈四 羧酸f e 3 + 的复合物之后，顺磁性的f e ”导致了非常有效的p e t 效应从而使得荧光 发生淬灭。 e 、 p h 图3 _ 41 0 5m 的盯c w 水溶液的i i 一与p h 值的对应图( k ；4 6 8 姗) ，2 1 0 3m 的磷酸 缓冲体系，f e c l 3 溶液浓度1 0 4m o l 【，配体浓度1 0 。f l i ，。 p t c 川m 本身就是p h 敏感的，图3 4 所示，1 0 。5m 的盱c a m ( 在2 1 0 3m p b s 缓冲溶液中) 用标准的k o h 或h c l 水溶液滴定时的荧光强度随p h 变化的 曲线图。在这里i 是在某个p h 时的荧光强度，i m 戕是最大的荧光发射强度。当用 k o h 水溶液滴定时，荧光强度随着p h 值的增大逐渐增大，在p h = 8 o 时达到最 大。用h c l 水溶液滴定时，荧光强度随着p h 值减小逐渐减小，在p h = 5 o 时发生 2 8 山东师范大学硕士学位论文 明显降低，在p h = 4 o 时降低到最小值。在1 0 4mf e 3 + 存在下，1 0 巧m 的p t c a m 的水溶液( 2 1 0 弓mp b s 缓冲溶液p h = 5 0 ) 的荧光被完全淬灭。随着p h 的不断 升高，荧光逐渐恢复，在p h = 1 1 0 时，荧光完全恢复，达到最大值( 图3 4 所示) 。 引入l o 倍的f e 3 + 是为了使p t c a m 的荧光能完全淬灭。随着p h 值的增大，由于 o h 与f e ”发生作用生成f e ( o h ) 3 ，荧光团被释放出来，从而荧光恢复。在引入 f e ”后，p h 响应范围向高p h 方向移动了1 5 个p h 单位，进入了对生物体系有重 要意义的中性p h 范围。在其他配体存在下，可以形成花四羧酸f e 3 + 配体的三重 复合结构，在这里我们选择了三种配体，三乙胺( l 1 ) ，吡啶( l 2 ) ，邻菲罗啉 ( l 3 ) ，实验在2 1 0 弓mp b s 缓冲溶液中进行，p t c 蝴的浓度为1 0 5m ，f c 3 + 的浓度为1 0 4m ，配体浓度为1 0 。3m 。在不同的配体存在下，体系随p h 值变化 呈现出不同的“s ”型的曲线。在低p h 值时，形成花四羧酸屉e 3 + 配体的复合结构， 荧光淬灭。而三重复合结构中的f e 3 + 比起在花四羧酸】陀3 + 中的f e 3 + 可以在更高的 p h 环境下稳定存在。但是随着p h 的继续增大，茈四羧酸f e 3 + 配体的f e 3 + 最终 被o h 沉淀出来，从而指示剂的荧光恢复。那么配体的p h 的调节作用归因于它 们与f c 3 + 不同的配位能力，三乙胺由于三个乙基的保护作用，其与f e 3 + 的配位作 用最弱，所以在p h 响应范围上仅仅比没有配体的情况有很小的移动。而吡啶的 配位能力比三乙胺要强，所以响应曲线向高p h 方向移动了0 8 个单位。邻菲罗啉 是一个双齿配体，与f e 3 + 的配位能力最强，所以使得p h 的响应范围进入弱碱范 围。这样就实现了响应范围的可调节性。荧光强度在一个非常窄的p h 范围内发 生明显的变化。 空 。历 c o 三 3 0 0 2 5 0 2 0 0 1 5 0 山东师范大学硕士学位论文 图3 5p t c a m f e 3 + n 比啶体系在p h = 6 o 和p h = 8 0 的静态荧光图，p h = 6 ，o ( 左) 平p h = 8 0 ( 右) 的荧光照片( 在紫外灯激发f 拍照) 缀震震麓粼瓣蠢 5 兰蛐脚蚴蝴幽幽删删 051 0152 02 53 0 t i m e ( m i n ) 图3 6p t c a m f e 3 + 吡啶体系在p h = 6 0 和p h = 8 o 的动态荧光图 旮 c a ) 一 c 图3 7p t c 脚e 3 + 日比啶体系在p h 为6 o 和8 0 之间调节时的荧光强度的可逆变化图 在p t c a 。m 佰e 3 + 邝比啶的体系中，在p h = 6 0 时荧光处在“关”的状态，而p h = 8 o 时，荧光“开”，这个过程可以很明显的用肉眼观测。图3 5 的插图显示了这两个 状态的明显差别，一个几乎没有荧光，另外一个有强的绿色荧光。图中分别表示 了p t c a m f e 3 + 吡啶体系在p h = 6 o 和8 o 时的荧光光谱，从荧光光谱图中可以看 出，该体系的荧光强度变化大，荧光开启时的强度大约是荧光关闭时强度的1 0 倍以上。而在动态荧光图中( 图3 6 ) 可以看出，该体系对p h 值变化的响应时间 3 0 o o o o 0 0 9 0 5 0 5 0 3 3 2 2 1 1 =西cm_c一 山东师范大学硕士学位论文 很短，几乎瞬间达到稳定状态而且保持长时间不变。图3 6 中可以看出在p h 调 至8 时，荧光强度瞬间达到3 0 0 左右( 任意单位) 而且在3 0 m i n 内保持不变，同 样在p h 调制6 0 时，荧光减弱至2 0 左右，保持稳定。图3 7 则说明该荧光传感 器可以可逆调节，在p t c 舢e 3 + 吡啶体系中，p h 值在6 o 和8 0 之间可逆的调 节时，荧光强度也发生可逆的变化，图3 7 中实现了五次p h 值在6 o 和8 o 之间 的可逆调节，而且每次调节荧光团的荧光强度几乎都可以回到原来的位置，而且 几乎是瞬间实现荧光的开启和关闭。重要的是，p h 值在6 o 和8 o 之间的近中性 的p h 响应范围对于生物体系有着非常重要的意义。 3 6 结论 基于高荧光量子产率的3 ，4 ：9 ，1 0 花四羧酸铵盐( p t c 蝴) 设计了一种新颖 的具有可调响应范围的p h 荧光传感器，在顺磁性的f e ”离子存在条件下，由于 p e t 效应，荧光淬灭，随着p h 增大，f e ”离子与o h - 形成f e ( o h ) 3 ，荧光团被释 放，从而荧光恢复，在引入不同的f e 3 + 的配体之后，响应的区间可以调谐。而且 荧光强度在一个非常窄的p h 范围内变化明显，荧光发射在生物体系中可以有效 防止背景荧光，提高信噪比。 山东师范大学硕士学位论文 4 1 摘要 第四章荧光开关的构建及h 2 0 2 检测研究 利用f e 2 + 与f e 3 + 的磁性的不同，使其与3 ，4 ：9 ，1 0 花四羧酸铵盐结合，通过外 来氧化剂还原剂h 2 0 2 和v c 的作用使得f e 2 + 与f e 3 + 发生可逆的变化，从而导致荧 光发生可逆的增强减弱，当顺磁性的f e ”存在时，荧光团和f e 3 + 之间发生p e t 效 应，荧光淬灭，而当抗磁性的f e 2 + 存在时，p e t 效应被阻止，荧光恢复，这样就 实现了其氧化还原荧光开关的功能。并且利用此性质，用来检测对于生物体有重 要意义的h 2 0 2 。该荧光开关设计新颖，荧光变化明显，并且具有一定的应用价值。 关键字：花；水溶性；荧光开关：p e t 效应 4 2 引言 近来的研究结果表明茈系衍生物分子在分子导线，逻辑门，分子开关等分子光 电器件领域具有较好的应用前景2 9 ，1 1 3 5 ，可逆，可控，可读的分子开关由于其在 纳米级的分子机器、逻辑控制方面的用途受到了广泛的关注。近年来，大量的基于 p h l l 6 ，1 1 7 、温度1 1 8 、光照1 1 9 、氧化还原1 2 0 ，1 2 1 和金属离子驱动1 2 2 ，1 2 3 的荧光开关被报道。 前面的工作中我们已经介绍了茈系衍生物的优异的光物理和光化学性质。并且合成 出具有高水溶性高荧光量子产率的3 ，4 ：9 ，1 0 茈四羧酸铵盐( 盯c a m ) 。在此我们进 一步研究了其作为荧光开关的一些功能。根据f e 2 + 与f e 3 + 的磁性的不同( f e 2 + 为抗磁 性，而f e ”为顺磁性) ，设计了基于3 ，4 ：9 ，1 0 花四羧酸铵( p t c 蝴) 的荧光开关。 当荧光团与顺磁性离子结合时会发生p e t 效应而荧光淬灭，而抗磁性离子的则不会 发生p e t 效应，所以荧光不受影响。在合适的还原剂、氧化剂存在条件下，f e 2 + 和 f e ”之间发生可逆互变，从而实现了荧光的开与关。 过氧化氢是生物体内主要的活性氧之一，它虽不是自由基，但分子中含有较易 断裂的过氧键，常被诱发均裂，产生羟自由基，同时它又在体内继续分解生成超氧 阴离子o 二等多种自由基，参与生物细胞的衰老过程。它是最活泼的活性氧，又被 称为侵袭性自由基，活性氧分子在病理条件，慢性病，也在一定的正常生理过程中 发挥关键作用1 2 4 ，最近的研究认为，h 2 0 2 在小动脉内壁驱动的超极化因素1 2 5 及大脑 3 2 山东师范大学硕士学位论文 动脉中通道活动方面发挥作用1 2 6 。尽管h 2 0 2 在生物体系中的重要作用被大量报道， 由于在检测方法上的限制，其作用机理方面的研究十分不足。由于目标分子的相关 时间、空间信息在活的有机体内可以被灵敏地监测到，荧光探针法在研究生物体系 中生物分子的功能方面是非常有效的。尽管各种检测活性氧分子的荧光探针在近年 得到长足发展1 2 7 啦9 ，但针对h 2 0 2 的荧光探针还很少报道。若设计出高选择性、高 灵敏性及高稳定性的h 2 0 2 荧光探针将对探索h 2 0 2 的生理作用以极大地推动。在此， 我们通过上述机理设计了可以用来检测对生物体有重要意义的h 2 0 2 的荧光探针，该 探针具有良好的水溶性，高荧光量子产率，而且荧光变化明显，具备进入生物体进 行细胞内检测的所有优异的性质。 4 3 试剂和仪器 4 3 1 主要试剂及处理 3 ，4 ：9 ，1 0 花四甲酸二酐，氢氧化钾，氨水，盐酸，氯化铁，氯化亚铁，双氧 水，维生素c 。 4 3 2 主要仪器设备 b m k e r 产1 h s o r - 2 7 型红外光谱仪( 溴化钾压片) ；。 b r i e r 筒，a n c e3 0 0 核磁共振仪( 内标均采用1 m s ) ； p h a m 唧e cu v - 1 7 0 0s h 啪z u 紫外分光光度计； v a r i a nc a 巧e c l i p s e 荧光仪； f l s 9 2 0 荧光光谱仪 4 4 实验部分 p t c 创的合成前面章节已有介绍。 二次水的除氧：缓慢通入氩气，大约一小时，将水中空气鼓出。封口。 双氧水的滴定：为防止f e 2 + 被空气中的氧气氧化，双氧水的滴定在氩气环境下 进行。每次滴定完成，迅速用荧光方法进行测量。 3 3 山东师范大学硕士学位论文 4 5 结果和讨论 一i 囊。一 蔷丢囝。蔷 圈4 - 1 氧化还原荧光开关的示意图 4 5 1 p t c a m 与f e 3 + ，f e 2 + 离子的作用 o o c 仍 丘 l - o ，) q m o c c 】 巴 。 三 u _ w a v e i e n g f h ( n m ) 图4 _ 2lo - 5m 的p t c a m 水溶液与f e 2 + 作用的吸收( 左) 荧光光谱( 右) ( t 打s - h c l 缓冲p h o 的 环境下测得，x 。= 4 6 8 i l i l l