（环境科学专业论文）马铁菊头蝠冬眠群体遗传多样性的rapd分析.pdf

a b s t r a c t i no r d e rt oh a v eas i g h ti n t o g e n e t i cd i v e r s i t y a n dr e l a t i v er e l a t i o no fr h i n o l o p h u s f e r r u m e q u i n u m ，r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) a n a l y s i s w a s a p p l i e dt ot h e t w oh i b e r n a t e d g r o u p s c a r r i e df r o mj ia ni nj i l i np r o v i n c e e l e c t r o p h o r e t i cb a n d sa n d e x p e r i m e n t a ld a t aw e r eu s e d t oc a l c u l a t et h ea v e r a g e g e n e t i cs i m i l a r i t ya n dg e n e t i cd i s l a n c e b e t w e e nt w oa r b i t r a r yi n d i v i d u a l s ，a n ds p s s l l 0w a sa p p l i e dt oc o n s t i t u t et h ep h y l o g e n e t i c t r e e t w e n t y 1 0 一m e rp r i m e r s ( s 1 3 1 - s 1 4 0 ，$ 2 0 0 1 $ 2 0 1 0 ；s a n g o n ；c a n a d a ) w e r es c r e e n e da n d s i x t e e nw e r es e l e c t e dt oa m p l i 奇g e n o m i cd n af r o mt w e l v es a m p l e sr e p r e s e n t i n gt h et w o p o p u l a t i o n s at o t a lo f1 0 4r a p d l o c iw e r eo b t a i n e da m o n gt h et w op o p u l a t i o n s ，a n dt h e m a x i m u mf r e q u e n c yo fp o l y m o r p h i s mw a sa c c o u n t e d1 1 1 1 p e r c e n lt h em i n i m u mw a s a c c o u n t e d1 0 0 0 0p e r c e n t ，t h ea v e r a g ew a sa c c o u n t e d6 9 7 6p e r c e n t t h ea v e r a g eg e n e t i c s i m i l a r i t y a n d g e n e t i c d i s t a n c eb e t w e e nt w o a r b i t r a r y i n d i v i d u a l sw e r eo 9a n d0 1 r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ed e g r e eo fg e n e t i cs i m i l a r i t ya m o n gi n d i v i d u a l so ft h et w o p o p u l a t i o n sw a sv e r yh i g hw h i l et h el e v e lo fg e n e t i cd i v e r s i t yi nt h ep o p u l a t i o nw a sl o w a c c o r d i n g l y f u r t h e r m o r ep a l r w i s ec o m p a r i s o n sa n dh a r d - - w e i n b e r gb a l a n c ew e r ef o u n d a c c o r d i n g t ot h ed a t ao ft h er e s e a r c h t h i ss i t u a t i o ns h o u l db eo w e dt oar a t h e rf r e q u e n c yo f i n b r e e d i n ga m o n g t h et w op o p u l a t i o n sw h i c hw es t u d i e do n l yh a sf o r t yo rf i f t yr h i n o l o p h u s f e r r u m e q u i n u m ，c a n tc o p u l a t er a n d o m l yb e t w e e ni n d i v i d u a l s f i n a l l y , t h i ss i t u a t i o nc a u s e d p a l r w i s ec o m p a r i s o n sa n dh a r d - - w e i n b e r gb a l a n c e i ti sn e c e s s a r yf o ras p e c i e s a d a p t a t i o n a n de v o l u t i o n a r yp o t e n t i a lt ok e e pg e n e t i cv a r i e t ya tar e l a t i v el e v e l g e n e t i cd i v e r s i t yi nt h e p o p u l a t i o nm u s tn o tb el o s tf u r t h e r m o r ea n dg e n ee x c h a n g ea m o n gi n d i v i d u a l ss h o u l db e e n h a n c e da sm u c ha sp o s s i b l et oa v o i de x t i n c t i o no f r h i n o l o p h u sf e r r u m e q u i n u m a tt h e s a l n e t i m e ，c l o s eb r e e d i n g s h o u l db e s t r i c t l ya v o i d e d ，t o o p r o t e c t e dp o l i c y w o u l db e e s t a b l i s h e di no r d e rt oa v o i dt h ef u r t h e rl o s to fg e n e t i cd i v e r s i t ya c c o r d i n gt ot h eb a c k g r o u n d o fg e n e t i c d i v e r s i t y a n dt h e i rh a b i t a t i o n n l a tm e a n sg e n e t i c d i v e r s i t y i n r h i n o l o p h u s f e r r u m e q u i n u mc a nb es u s t a i n e d ，a n do nt h eb a s et h ep o p u l a t i o n s a d a p t i v ec a p a c i t ya n d e v o l u t i o n a r yp o t e n t i a ls h o u l db ep r o m o t e d i nt h i sw a y , r h i n o l o p h u sf e r r u m e q u i n u mw i l lb e p r o t e c t e dm o r e s u c e e s s f u l l y k e yw o r d s ：r h i n o l o p h u s f e r r u m e q u i n u m ；r a p d ；p e d i g r e e ；g e n e t i cd i v e r s i t y ；k i n s h i p i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致 谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：专彰 日期：逍、! 髟 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位 论文的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机 构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) ，i 学位论文作者签名：垂塑!指导教师签名：2 圣匹 日 期：诬l6 ，垆日期：丑虹j 髟 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第一章引言 1 1 马铁菊头蝠的生物学和生态学特征 1 1 1 马铁菊头蝠的分类和分布 马铁菊头蝠( r h i n o l o p h u s f e r r u m e q u i n u m ) 隶属小蝙蝠亚目( m i c r o c h i r o p t e r a ) 、菊 头蝠科( r h i n o l o p h i d a e ) 、菊头蝠属( r h i n o l o p h u s ) 。马铁菊头蝠主要生活在热带、亚热 带和温带地区。分布从欧洲、亚洲，直达日本、菲律宾和澳大利亚。马铁菊头蝠在国内 的分布较为广泛，在吉林、辽宁、北京、河北、山西、河南、陕西、甘肃、山东、福建、 安徽、江西、上海、四川i 、云南、贵州1 6 个省市均有分布。 1 1 2 马铁菊头蝠的形态学特征 马铁菊头蝠的体型较大，属大中型蝙蝠( 表1 一1 ) ，前臂长4 9 - - 6 4 m m ，胫长2 3 3 0 m m ，尾长是胫长的1 _ 3 倍，耳长2 2 - - 3 0 m m 。耳壳特别大且宽阔，没有耳屏，有非常 明显的对耳屏。鼻吻部皮肤衍生的鼻叶形态复杂。鞍状叶两侧缘内凹，如提琴状，联结 叶前后较长，前端起自鞍状叶的顶端，蹄状叶宽低于l o m m 。第三和第四指的第二指节 一般占各自第一指节的1 5 倍。第二上前臼齿很小，为齿列外，有时消失。犬齿与第四 上前臼齿的齿基缘靠近或接触。下唇只有中央的纵沟，两侧的消失，翼膜相对宽而短小， 起于足踝。背色亮灰或浅褐棕，由浅褐色毛基和深色毛尖构成，毛色与年龄、性别及季 节有关，幼蝠毛色略呈灰色，雌蝠老年呈栗色。马铁菊头蝠头骨坚硬，犬齿非常发达。 最长寿命可达到3 2 年之久，为一般蝙蝠所不及。马铁菊头蝠性别之间的个体差异不显 著，可能利用相同的捕食生境和猎物等。 表1 - - 1 马铁菊头蝠( r h i n o l o p h u s f e r r u m e q u i n u m ) 的形态特征 体重( 曲 2 3 9 9 2 5 4 翼宽( m m ) 7 9 9 2 4 1 7 头体长( m m ) 6 0 2 5 4 9 7 胫长( m m ) 2 4 o o 1 5 4 前臂长( m m ) 5 4 3 3 2 3 1 后足长( m m ) 1 1 6 7 0 9 8 掌m ( m m ) 3 6 9 2 2 2 3 尾长( m m ) 3 4 o o 3 0 5 一指( m m ) 1 8 9 2 1 0 0 距长( m m ) 1 5 5 0 2 2 4 二指( 姗m ) 3 2 7 5 1 7 l 耳长( m m l 2 2 7 5 2 8 3 掌i v ( m m ) 4 2 1 7 土1 4 7 耳宽( m m ) 1 5 1 7 1 3 4 掌v ( m m ) 4 3 0 0 1 6 0 对耳屏长( m m l 7 9 2 0 6 7 翼长( m m ) 1 7 3 7 5 6 0 8 对耳屏宽( n u n ) 8 2 l 0 4 0 翼展( m m l 3 8 3 3 3 1 0 5 2蹄状叶前宽( m m )1 2 l 0 2 6 蹄状叶后宽( m m ) 8 7 9 0 4 0 蹄状叶最宽( r a m ) 9 8 3 0 3 3 鞍状叶高( m m l 3 7 5 0 1 4 鞍状叶宽( m m 、 2 4 3 0 2 8 马铁菊头蝠的目声定位声波是由一段长的c f 组分加上尾部下调的f m 组分组成 的，有时还出现前部上调的f m 组分，即( f m ) c f f m 型( f r a n c i s a n dh a b e r s e t z e r ，1 9 9 8 ； h e l l e ra n dh e l v e r s e n ，1 9 8 9 ：j o n e s ，1 9 9 0 ；l i n ke ta l ，1 9 8 6 ) ，属典型的长c f f m 叫声， 其恒频部分持续时间均超过】0 m s ，而调频( f m ) 部分一般不超过4 m 一”。c f 的频率与 前臂长成线性负相关。在c f f m 声波中，f m 组分极短，用于确定目标距离，这是因 为f m 组分可以精确计时，蝙蝠可以借以计算发出的f m 声波和回声之间的时间间隔， 得到与目标之间的相对距离。c f 组分像电波之中的载波样，携载有关目标运动的信 息。 马铁菊头蝠的回声定位声波有多个谐波，最常见的有三个，第一谐波频率最低，称 为基频，其它几个谐波的频率都大致是基频的整数倍。叫声的第一谐波较弱或不出现， 第二谐波较强。例如：山东地区的马铁菊头蝠自由悬挂时回声定位声波的第一谐波为 4 2 1 k h z ，第二谐波恰好是8 4 2 k h z 。在正常状态下，第谐波总是很弱，一般比最强 的第二谐波低3 0 d b ，能量集中于第二谐波可以让声波传播更远距离，提高蝙蝠的探测 范围 2 1 。马铁菊头蝠的每个声脉冲包括1 6 个谐波，声脉冲呈明显的分组现象，即每 组2 3 个声波之间的间隔明显小于其他两个声波之间的距离，同时每组声脉冲中的第 一声脉冲以上调的f m l 开始，以下调的f m 2 结束，但后面的声脉冲往往只有f m 2 ， f m l 经常缺失或不明显。f m l 的频带宽较小，持续时间长于f m 2 ，频率变化率则小于 f m 2 ，两者的频带宽都较小。声强均小于c f 部分。 马铁菊头蝠利用高频声波的原因主要有两点：一是由于不需要探测太远距离上的目 标，高频声波在空气中的快速衰减不会成为限制条件；二是马铁菊头蝠往往把能量集中 在极窄的波段，可以保证这一波段的声波有足够的强度。与此相应，蝙蝠的听觉系统中 各级结构上都存在对应这一频率的超敏感区和对纯音回声的窄带过滤机制【3 】。 1 2 马铁菊头蝠遗传多样性的研究现状 1 。2 1 置外研究现状 关于蝙蝠的研究已经有2 0 0 多年的历史了，美国、加拿大、泰国、英国、俄国、丹 麦、德国、澳大利亚、日本等国家对蝙蝠都有着较为深入的研究。研究内容已涉及到许 多方面，包括蝙蝠的分类、形态构造、起源和进化、飞行行为、食性及捕食行为、栖息 地选择、生活史、体温调节、繁殖与发育、回声定位行为、生理学、人与蝙蝠的关系及 蝙蝠的区系分布等方面的研究。 马铁菊头蝠已被世界自然保护联盟物种生存委员会( i u c n ) 收录，列为低危接近 受胁( l r n t ) 级，逐渐受到了国内外研究人员的广泛关注，目前成为国际上的研究热 点。国外的研究人员对马铁菊头蝠的飞行行为【4 】、回声定位行为5 州肌【s 、生殖与发育 2 呲【1 0 】，i 、生理学，【1 3 】，f 1 4 】、分类与进化f 1 5 】、保护对策和种群结构【1 6 增各方面均进行了 较为广泛的、细致的研究。 随着对马铁菊头蝠的研究越来越深入，研究人员发现当对其飞行行为、群居行为和 夜间活动进行研究时，特别是当其群体规模较大时或是想弄清楚其整个生活周期( 包括 迁徙和冬眠等活动) 时，仅依靠传统的生态学方法很难进行全面而准确的研究。二十世 纪八十年代以来，分子生物学技术问世并得到了飞速发展，研究人员发现分子生物学技 术可以为获得这些重要的物种信息提供宝贵的资源，对蝙蝠的生态学研究提供了重要的 信息和一个全新的研究领域。其中，应用分子生物学方法对马铁菊头蝠的研究主要集中 在系统发育与分子进化【1 7 】，【1 8 1 和种群的基因流动【19 1 ，1 2 0 与基因变异【2 1 1 等方面。 1 2 2 图内研究现状 国内对马铁菊头蝠的研究起步较晚，从近年来发表的论文来看主要集中于以下几个 方面：区系，主要为各地区的分布状况；生态特征，包括生活习性观察，环境的影响， 亲缘关系等；回声定位，包括回声定位声波分析，回声定位和捕食策略等 2 2 1 ， 2 - 3 1 ， 2 4 】，口5 1 ； 系统发育与分子进化研究，主要是对菊头蝠科蝙蝠进行了系统发育重建，并应用分子生 物学方法证明了其与蹄蝠科的近缘群关系【2 6 】。此外，李明( 1 9 9 9 ) 等应用r a p d 技术 对白腹管鼻蝠冬眠群体的亲缘关系进行了研究【2 7 l ，【2 s 1 。而应用r a p d 技术对马铁菊头蝠 冬眠群体的遗传多样性研究在国内还未见报道。 1 。3 遗传多样性的研究方法 遗传标记是研究遗传多样性的有力工具，随着现代遗传学的不断发展，遗传标记的 种类和数量也在不断增加，目前公认的观点是将遗传标记分为四种类型：形态标记 ( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) 、细胞标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r s ) 、生化标记( b i o c h e m i c a l m a r k e r s ) 和分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r s ) 。 1 3 1 形态标记 形态标记是与目标性状紧密连锁，表型上可识别的等位基因突变体。通常所利用的 表型性状主要有两种，一是符合孟德尔遗传规律的单基因性状，如质量性状和稀有突变 等；另一类是根据多基因决定的数量性状，如大多数形态性状和生活史性状等【2 引。在许 多情况下，利用形态性状来估测遗传变异是最现实的方法，尤其是当需要在短期内对变 异性有所了解或在其它方法无法开展之时，形态学标记不失为种有价值的选择。但是 形态标记由于其表达不稳定、多态性差、易受环境条件影响及基因显隐性等缺点还远远 不能满足遗传育种的需要。 1 3 2 细胞标记 随着生物学研究进入细胞水平后，细胞遗传学的诞生和发展，使细胞标记得到了应 用。细胞标记的方法是进行染色体组型分析即染色体多态性研究。染色体变异主要体现 为染色体组型特征的变异，包括染色体数目变异及结构变异。通过比较细胞分裂时期染 色体的数目和形态参数，如相对长度、着丝点位置、臂比值等将每条染色体按各自的特 征区分开，得到一定的染色体组型。细胞标记虽然可以克服形态标记的某些不足，但这 类标记材料的产生需要大量的人力和时间，并且有些物种对染色体数目和结构变异反应 敏感，或适应此种变异的能力较差，难以获得标记材料，从而限制了细胞标记在遗传育 种上的应用。 1 3 3 生化标记 生化标记主要指同工酶技术，同工酶是指来源相同，催化反应的性质相同而分子结 构有差异的酶蛋白分子。由于不同同工酶所带电荷不同，可通过电泳分离，并经与底物 反应或染色，检测它们的存在与否和分子质量的大小，因此可作为一种遗传标记，已被 广泛用于建立遗传图谱和种群分析等研究中。但是由于同工酶是基因表达的产物而非基 因本身，在翻译后还可能会被修饰，其活性也经常受到环境及发育状态的影响。此外， 它所能检测的位点数目也很有限，只能检测出导致同工酶中氨基酸组成发生变化的核苷 酸突变，所以其应用在很大程度上受到了限制。 1 3 4 分子标记 随着分子生物学的快速发展，遗传标记的概念发展为在核酸分子水平上具有相对差 异的等位区域( 也称等位基因) 。因它们广泛地分布于高等生物d n a 的编码区和非编 码区，故称之为d n a 分子标记。d n a 分子标记( m o l e c u l a r m a r k e r ) 是指可遗传并可检测 的d n a 序列是以d n a 多态性为基础的遗传标记。与其它遗传标记相比，分子标记具 有其特殊的优越性，包括：直接以d n a 形式表现，不受实验材料、时间、环境等因素 的影响；可检测的位点多，可遍及整个基因组；多态性高，自然界存在着许多等位 变异；能够鉴别出纯和基因型和杂和基因型，提供完整的遗传信息。 1 3 4 1 限制性片段长度多态( r f l p ) 限制性片段长度多态。陛( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简称r f l p ) 是 g r o d z i c k e r 等在1 9 7 4 年创立的，是发展最早的d n a 标记技术，至今仍被广泛使用。 r f l p 是用特定的方法将核( n ) d n a 、叶绿体( c p ) d n a 或者总d n a 提取出来。然后 根据所提d n a 选择合适的限制性内切酶，待狈4d n a 经酶切后可产生许多大小不等 的d n a 片段。由于每一种限制性内切酶都具有独特的识别位点，因此特定的d n a 序列经酶切后能产生特定的d n a 片段。由于不同个体所具有的基因型不同，d n a 序列本身的差异会影响到限制性内切酶的酶切位点，因而就会产生一系列大小不同 的d n a 片段。从而可显示出不同材料的多态性图谱，即所分析序列间的r f l p 。 1 3 4 2 扩增片段长度多态性( a f l p ) 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简称a f l p 标记) 是由荷兰k e y g e n e 公司z a b e a u 和v o s 等于1 9 9 3 年发明的一种新的d n a 标记技术， 该项技术于1 9 9 3 年获得欧洲专利局的专利，k e y g e n e 公司于1 9 9 4 年推出了商品化 的试剂盒，称为a f l p 分析系统i 。该试剂盒由中心试剂盒和引物试剂盒组成。a f l p 原理非常简单，引物设计十分巧妙。基因组d n a 经限制性内切酶完全消化后，在 限制性片段两端连接上人工接头作为扩增的模板。设计的引物与接头和酶切位点互 补，并在37 端加上2 3 个碱基，因此在基因组被酶切后的无数片段中，只有- d , 部分限制性片段被扩增，即只有那些与引物3 端互补的片段才能进行扩增，称为 选择性扩增。为了对扩增片段的大小进行灵活的调节，一般采用两个限制性内切酶。 一个是切点多的酶，如具有4 碱基识别位点的m s e i ，它产生较小的d n a 片段，另 一个是切点少的酶，如具有6 碱基识别位点的e c o r i ，它产生较大的d n a 片段。 1 3 4 3 可变数目串联重复序列( v n t r ) 可变数目串联重复序列( v 2 血a b l en u m b e ro ft a n d e mr e p e a t ，简称v n t r ) 是指 由一段核苷酸序列多次串联重复所形成的高度可变区域，如果核心序列由1 4 个 核苷酸组成称为微卫星( m i c r o s a t e l l i t e s ) d n a ，如果核心序列由几个到几十个核苷 酸组成称为小卫星d n a 。微卫星d n a 一般重复1 0 一6 0 次形成一个v n t r ，小卫 星d n a 一般重复几次到几百次形成一个v n t r 。 微卫星d n a 1 9 8 1 年，m i e s f e l d 等从人类基因文库中首先发现了微卫星d n a 。随后人们发现这 种简单重复序列在真核生物中广泛存在，1 9 8 2 年，h a m a d a 等发现从酵母到脊椎动物都 有( d t - d g ) 。的拷贝序列，1 9 8 4 年t a u t z 证实了这种序列的存在，1 9 8 9 年，l i t t 和l u t y 扩增到了人类基因组微卫星序列，并把这种序列正式定义为微卫星( m i o r o s a t e l l i t e ) ”，以 后其他研究者又把其称为简单重复序歹l j ( s i m p l es e q u e r m e er e p e a t ，s s r ) ，或者短串联重 复序列( s h o r t t a n d e m r e p e a t ，s t r ) 。它是广泛分布于基因组中的一段特殊序列，主要由串 联重复单元组成，每单元长度在l l o b p 之间，常见的微卫星有( t g ) 。和( a t t ) 。 等，它们广泛分布于真核基因组中，因重复单元数目不同而呈现出高度多态性。 小卫星d n a 8 0 年代初期，研究人员就发现了d n a 序列存在着高变区。1 9 8 4 年，w e l l e r 等发现 人肌红蛋白基因第一内含子中存在3 3 b p 的串状重复，重复数为4 。1 9 8 5 年，j e f f r e y s 等 将该重复序列进行克隆、酶切、标记后制成探针，与h i n f 或h a e 酶切的人类基因组 d n a 进行s o u t h e r n 杂交，发现人基因组呈现多条杂交带。家系分析表明，子女的每条带 均可在其父母的图谱中找到，因而呈共显性遗传。该探针就是有名的j e f f r e y s 3 3 1 5 探针。 j e f f r e y s 等第一次用杂交的方法证实了人类基因组上小卫星高变区的存在并正式提出 “小卫星( m i n i s a t e l l i t e ) ”这个术语。小卫星d n a 的组成基元较短，通常为1 0 一6 0 b d ，在 基因组成千上万个位点上形成较低程度的重复。由于所得到的杂交图谱具有极强的个体 特异性，因此它可作为多态性检测的一种有效方法。 1 3 4 4 随机扩增多念性d n a ( r a p d ) 随机扩增多态性d n a ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a ，简称r a p d ) ，是由 美国杜邦公司的w i l l i a m s 和加利福尼亚生物研究所w e l s h 领导的两个研究小组在 1 9 9 0 年发展起来的一种建立在p c r 技术基础上的新型d n a 标记。它利用一系列人 工合成的不同的随机序列的寡核苷酸片段( 通常为8 1 0 个碱基) 为引物在未知序 列的d n a 上进行随机的p c r 扩增，通过扩增产物d n a 片段的多态性来检测基因 组d n a 的多态性。虽然r a p d 所使用的随机引物序列各不相同，但是对于某个特 定的引物来说，它与目标基因组的d n a 序列一定有其特定的结合位点和扩增d n a 特定的区域片段。如果基因组的这些区域发生了d n a 片段或碱基的插入、缺失等 突变，就会导致这些特定结合位点或扩增片段发生相应的变化，使r a p d 扩增产物 在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳( r a g e ) 图谱中的d n a 带数增加、减少或片段长 度发生相应的变化，从而可以通过溴化乙锭( e b ) 染色来检测基因组d n a 在这些 区域的多态性。用于r a p d 分析的引物是人工合成的，要求g + c 的含量为5 0 7 0 ，且不能含有回文序列。引物的碱基序列虽然是随机的，但是只要该引物在模板 d n a 上有两个或两个以上的互补位点，且这些位点之间的距离适当，就可扩增出 d n a 片段。不同引物在模板d n a 上的互补位点及数目不同，扩增片段的大小和数 量也不同，同一引物可能只能检测出基因组d n a 部分区域上的多态性，但一系列 引物所能检测到的区域就会覆盖整个基因组。所以r a p d 可以对整个基因组的d n a 进行多态性检测。 目前，r a p d 主要用于以下几个方面：一是动物的系统发育与进化及其亲缘关系的 分析，由于r a p d 标记位点多，大量随机引物的使用，使r a p d 标记覆盖物种的整个 基因组，一套完整全面的r a p d 资料能够反应出品种( 间) 的系统发育情况及亲缘关系： 二是用于动物的分类鉴定；三是进行性别鉴定。对于两性同形的物种，从形态进行性别 鉴定是非常困难的。另外，根据狩猎物种和特定狩猎季节的要求，有时只能猎取雄性动 物，而猎取雌性动物则是违法的，这时性别鉴定就尤为重要；四是进行遗传多样性及亲 缘关系的研究。 对于r a p d 反应来说，不同的引物在扩增同一基因组d n a 产生的片段数目不 同，同一引物扩增不同基因组d n a 产生的片段数目也不同。扩增的多态性d n a 即 可通过r a p d 图谱来检测。大量研究表明，r a p d 具有个体、群体、亚种、种等各 层次水平的特异性，且这种变异是按照孟德尔方式遗传的，因而是一类优良的遗传 标记。r a p d 与r f l p 、d n a f p 一起成为检测群体水平上遗传变异和分类所应用的 三大诊断技术。与其它d n a 多态性分析方法相比，r a p d 技术表现出以下独特的 优势和特点： ( 1 ) 不需d n a 探针，设计引物也无须预先知道待测基因组的d n a 序列，可 在对物种没有任何分子生物学研究的情况下，直接对物种的基因组进行d n a 多态 性分析； ( 2 ) r a p d 标记能够覆盖整个基因组，随机引物可以大量合成，同时r a p d 引物无严格的种属界限。虽然就某一引物来说，其检测基因组d n a 多态性的区域 是有限的，但是利用一系列引物则可使检测区域覆盖整个基因组，而且两个基因组 之间即使很微小的差异也可以反映出来，灵敏度极高。同一套引物适用于任何生物 的研究，具有更广泛的实用性和通用性； ( 3 ) r a p d 技术程序简单灵敏，一次r a p d 扩增就可直接对生物的基因组d n a 进行多态性分析。引物的设计是随机的，无需预先知道特异位点序列的信息，这就 避免了s o u t h e r n 杂交中筛选探针的复杂程序，也省去了制备克隆、分子杂交这些 r f l p 等方法进行d n a 多态性分析时所必须进行的准备性工作： ( 4 ) 分辨率高，能够迅速提供遗传分析中大量的遗传标记； ( 5 ) d n a 样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； ( 6 ) 无需借助于有伤害性的放射性同位素，减少了对操作人员的危害。 1 4 研究目的及意义 马铁菊头蝠在世界大部分地区都处于濒危状态，引起了国际上的广泛关注，许多国 家都采取了相应的保护措施来阻止其种群数量的下降。而保护工作的重点在于雌性群 体、冬眠群体和捕食地点的保护上。中国境内的马铁菊头蝠分布比较广泛，群体数量 也较大是非常珍贵的物种资源，具有很高的科研价值，但可惜的是马铁菊头蝠的珍贵性 在国内没有得到足够的重视，进而导致对它们的研究严重缺乏更谈不上采取有效的保护 措施了。迷信和无知使得人们或将其杀死，或破坏其栖息地，使得近几年来马铁菊头蝠 的数量急剧下降，分布范围迅速缩小。因此，我们应该马上采取措施对其进行保护，以 防止这一珍贵物种的灭绝。 本研究从马铁菊头蝠冬眠群体的分子机制入手，应用r a p d 技术对其进行d n a 分 析，构建其谱系关系，弄清该物种冬眠群体集群的影响因子并探讨其遗传多样性，讨论 群体之间的亲缘关系，通过本研究，弄清该物种的遗传多样性背景，有助于政府主管部 门掌握其遗传结构现状，为制定中国境内马铁菊头蝠这一濒危物种的保护策略、管理策 略和行动计划提供科学依据。 第二章实验材料与方法 2 1 研究区域及实验点概况 研究地点位于吉林省集安市榆林镇治安村( e 1 2 5 。5 0 9 8 ”，n 4 1 。3 5 5 8 ”) 。集安市 ( 介于e 1 2 5 。4 5 1 2 6 。3 0 、n 4 0 。5 2 4 1 0 3 5 之间) 地处吉林省东南部，北与通化市、通 化县、白山市毗邻，西北与通化县以浑江为界，西南与辽宁省的宽甸县、桓仁县接壤， 东南隔鸭绿江与朝鲜民主主义人民共和国的满浦市、慈城郡、楚山郡、渭源郡相望，是 中朝贸易三大口岸之一。集安市境内群山环抱，河流纵横，鸭绿江、浑江一南一北从境 内流过，九条支流河网纵横，山间盆地交错其中。长自山系老岭山脉由东北向西南横贯 全市中部，将全境分为三个特殊自然气候区：岭南鸭绿江沿岸属温暖湿润区，岭北苇沙 河、新开河流域属中温气候区，岭上属高寒山区。实验点属于温暖湿润区。集安市四季 分明，光照充足，雨量充沛，年均气温6 5 ，降水量约1 0 0 0 毫米，年积温3 2 6 0 ， 无霜期1 4 0 一1 6 0 天，素有吉林“小江南”之美誉。 实验点大砬子洞位于治安村的一个半山腰上，当地日出时间：6 ：1 8 l 当地日落时间： 1 6 ：2 2 ，地理位置：东经4 1 03 7 5 7 ”，北纬1 2 5 0 5 0 7 8 ”，海拔：3 1 1 米，洞口：温度： 2 。c ，湿度：5 4 ，坡度：4 5 0 ，朝向：南偏西6 5 0 ，该山洞洞口宽敞，宽7 m ，高2 m 。该 山洞内部分为三个支洞。另一个实验点天洞地洞位于距离治安村大约3 千米的第二支队 的一个半山腰上，当地日出时间：6 ：2 0 ，当地日落时间：1 6 ：2 1 ，地理位置：东经4 1 0 5 5 1 7 ”，北纬1 2 5 0 4 9 1 7 1 ”，海拔：4 5 6 米，洞口：温度：7 ，湿度：7 0 ，坡度： 6 5 。，朝向：南偏西7 0 。，宽：2 m ，高：1 5 m 。实验点附近的植物主要是以椴树、核 桃楸、板栗树、刺槐、曲柳、杨树等树种构成的夏绿阔叶林，林下的灌木层不发达，草 本层几乎没有。山坡下是农田，主要作物为玉米、谷物及大豆等。山间形成小河，常年 流水，冬天不结冰。水面宽约为1 5 2 5 m ，水流速度较快，水流比较清澈，没有叶片 之类。 图2 一i 集安市治安村地理位置示意图 8 2 2 材料 2 2 1 样品 本研究所用的马铁菊头蝠样品于2 0 0 3 年1 1 月在吉林省集安市治安村采集的，所有 标本均保存于无水乙醇中带回实验室用于实验分析。共有两个不同的冬眠群体，分别采 自大砬予洞和天洞地洞，两洞相距大约3 千米。这两个洞中大概分别有四、五十只马铁 菊头蝠：洞口狭小；洞内潮湿，地面水较多；洞内蝙蝠并不像夏季那样全部聚集在一起， 而是三五成群，它们之间相隔0 5 1 米左右。样品的采集地点和样本数量等如表2 1 所示。群体一的6 只马铁菊头蝠中有三只雌性，三种雄性；群体二的6 只马铁菊头蝠中 有5 只雄性，1 只雌性。 表2 1 实验材料 2 2 2 药品和试剂 2 2 2 1 药品 ( 1 ) 随机引物s 1 3 1 1 4 0 ，$ 2 0 0 1 - - 2 0 1 0 ( o d 2 6 0 = 0 2 ) 干粉( 上海s a n g o n ) ( 2 ) 含d n t p 的t a q 聚合酶( t a k a r a ) ( 3 ) l t a e 电泳缓冲液 ( 4 ) 相对分子质量标记( l a m b d a d n a e c o ri + h i n d 和d l 2 0 0 0 ) ( 5 ) 凝胶上样缓冲液( 0 2 5 溴酚兰，4 0 ( w v ) 蔗糖水溶液) ( 6 ) 溴化乙锭( 1 0 m g m 1 ) ( 7 ) 琼脂糖 ( 8 ) 双蒸水 2 2 2 2 试剂及其配锦4 方法 ( 1 ) p r o t e i n a s e k 浓度为1 0 m g m l ，- - 2 0 1 2 贮存 ( 2 ) e d t a ( p h = 8 0 ) 1 8 6 i g e d t a ( 二水乙二胺四乙酸二钠) 8 0 0 m l 蒸馏水 + 适量的n a o h 调节p h 到8 0 + 蒸馏水定容到l l ( 3 ) t r i s h c l ：贮存浓度为l m m 1 2 1 1 9 埘s 碱 q 8 0 0 m l蒸馏水 用浓h c l 将其调节到所需值( 8 0 ，8 8 等) + 蒸馏水定容到1 l ( 4 ) 细胞裂解液：4 。c 贮存，高压灭菌 1 0 m mt f i s c l ( p h8 0 ) 1 0 m me d t a 1 5 m mn a c l 0 5 s d s ( 5 ) t e 缓冲液( p h = 8 0 ) ：4 c 贮存，高压灭菌 1 0 m m i r i s c l ( p h 8 + o ) l m me d t a ( p h 8 o ) ( 6 ) t e r 用t e 将r n a s e 稀释到所需的使用浓度 ( 7 ) t a e ( 电泳缓冲液) 贮存浓度：5 0 x t a e ；使用浓度： 1x t a e 5 0 t a e ( t f i s 一乙酸) 2 4 2 9 r i f t s 一碱 5 7 1 m l乙酸 10 0 m l0 5 me d t a ( p h 8 0 ) + 蒸馏水定容到1 l ( 8 ) 溴化乙锭( e b ) 1 0 0 m l 水中加入l g 溴化乙锭。磁力搅拌数小时，以确保其完全溶解。然后用铝箔 包裹容器或将溶液转移到棕色瓶中，常温下贮存。 ( 9 ) 6 x 凝胶加样缓冲液：4 c 存放 o 2 5 ( m v )溴酚蓝 4 0 ( m )蔗糖 ( 1 0 ) r n a s e ：贮存浓度：1 0 m g m l ；- - 2 0 贮存 2 2 5 m g 的n a c l 和2 5 u l 的1 mt f i s ( p h = 7 5 ) 用灭菌水定容到2 5 m l ，将2 5 m g 的r d _ a s c 溶于其中。1 0 0 * c 煮沸1 5 m i n ，在沸水中缓慢冷却到室温后分装 2 2 3 仪器设备 p e 9 6 0 0p c r 扩增仪：p e 公司 d u r 6 4 0 型核酸蛋白分析仪：b e c k m a n 公司 d y y - 6 b 型电泳仪：北京六一仪器厂 台式高速冷冻离心机：b e c k m a n 公司 t g l 一1 6 h 台式高速离心机：上海安亭科学仪器厂 l o h z q x 10 0 振荡培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 电子精密天平：特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 s z l 型快速混匀器：江苏金坛市金城国胜实验仪器厂 s b d 5 0b i o 恒温水浴摇床：h e t o 公司 t h e r m o m i x e rt o m f o r t5355 ：e p p e n d o r f 公司 l g 微波炉 2 3 实验方法 z 3 1 基因组d n a 的提取 ( 1 ) 取少量肌睫样品，液氮下碾碎，然后加入3 7 0 扯1 的t n e 缓冲液( o 。1 m n a c l ；1 0 m m t r i s h e l ，p h7 5 ；l m me d t a ，p h8 0 ) ，1 0 0 i _ t l 的1 0 s d s ，1 0 i t l 的1 0 m g m l 蛋白 酶k ，2 0 t l 的l m o l l 的d t t ，混匀后放入5 6 0 c 下消化至透明。 ( 2 ) 4 0 0 0 r p l r d m i n 离心5 分钟，取上清。 f 3 ) 加入等体积的酚，在自动混匀器上混匀1 0 分钟，1 0 0 0 0 r p m m i n 离心1 0 分钟，取 上清。 ( 4 ) 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，在自动混匀器上混匀1 0 分钟， 1 0 0 0 0 r p m m i n 离心1 0 分钟，取上清。 ( 5 ) 重复以上步骤。 ( 6 ) 加入氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，在自动混匀器上混匀1 0 分钟，1 0 0 0 0 r p m m i n 离心 1 0 分钟，取上清。 ( 7 ) 在上清中加入1 1 0 体积的3 mn a a c 和2 倍体积的冰无水乙醇，混匀后放入- 2 0 0 c 沉淀3 0 分钟。 ( 8 ) 1 2 0 0 0 r p m m i n 离心1 0 分钟，弃无水乙醇，再用冷的7 0 乙醇洗涤沉淀。 ( 9 ) 真空干燥，加入1 0 0 p lt e 溶解沉淀。 r a p d 反应主要是依靠单一引物与基因组某些特定的d n a 序列退火扩增。这些能 扩增的特定序列要求在0 1 3 k b 范围内有与引物匹配的反向互补序列存在，即在3 0 0 0 b