（动物学专业论文）隆额网翅蝗线粒体基因组全序列的测定与分析.pdf

隆额网翅蝗线粒体基因组全序列的测定与分析 刘念 摘要昆虫线粒体d n a 是共价闭合的环状双链d n a 分子，大小一般为1 5 ，4 1 6 3 k b ，以高拷贝数目存在于线粒体内。线粒体d n a 的分子质量小，核酸序列和 组成比较保守，基因组中不含间隔区和内含子，无重复序列和不等交换，拷贝数 多，易于提取、扩增和分析；在遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等突变， 严格遵守母系遗传方式，只需少量个体材料就能反映群体的遗传结构；基因组的 替换率比核d n a 高5 1 0 倍，适合做进化生物学研究。 本文测定和分析了隆额网翅蝗线粒体全序列，并且将其于已经测出全基因组 的2 种其他直翅目昆虫的m t d n a 进行了比较，并联合其他直翅类昆虫的m t d n a 进行了线粒体全基因组水平的系统发育分析。获得的主要结果如下： 1 隆额网翅蝗线粒体基因组基因组成与基因排列 隆额网翅蝗线粒体d n a 序列全长1 5 7 8 3 b p ，包括1 3 个蛋白质编码基因，2 个 核糖体基因，2 2 个转运r n a 基因，及1 个长8 9 4 个碱基的a + t 丰富区，全线粒 体基因组的a + t 含量为7 6 4 。其基因排列顺序与非洲飞蝗的致。隆额网翅蝗 线粒体基因组在8 个基因之间共有3 6 b p 的重叠区域，重叠范围在l b p 到8 b p 之间 变化。有1 1 4 b p 的基因间隔区，它们分散在2 0 个基因之间，最长的间隔区长2 l b d ， 短的只有2 b p 。a + t 丰富区位于核糖体1 2 s 小亚基和t r n a “。基因之间，a + t 含量 为8 6 o ，包括8 9 4 个碱基，比其他昆虫的短些。 2 隆额网翅蝗线粒体基因组蛋白质编码基因 隆额网翅蝗的密码子总数为3 7 1 8 ，与非洲飞蝗的密码子( 3 7 1 3 ) 总数接近。 隆额网翅蝗编码基因的a + t 含量为7 5 8 ，它比非洲飞蝗的编码基因a + t 含量高 约1 7 。除c oi 基因外，隆额网翅蝗的蛋白质编码基因的起始密码子都是典型 的a t n 密码子。其中n d 2 、c o i i 、a t p 6 、c o i i i 、n d 4 l 、n d 6 、c y tb 这7 个基 因使用a t g 作为起始密码子，a t p 8 、n d 3 、n d 5 基因使用a t t ，n d 4 和n d l 基 因分别使用a t c 和a r a 。除c o i i 、n d 5 、n d 4 和n d l 外，其他基因都是以”a 为终止密码子。亮氨酸l e u c i n e ( 1 3 8 8 ) 、异亮氨酸i s o l e u c i n e ( 1 0 8 7 ) 、丝氨 酸s e r i n e ( 9 7 1 ) 、苯丙氨酸p h e n y l a l a n i n e ( 9 2 3 ) 是隆额网翅蝗线粒体蛋白质 中使用频率最高的4 种氨基酸，总计占4 3 6 9 。 3 膛额网翅蝗线粒体基因组t r n a 基因及t r n a 二级结构 隆额网翅蝗线粒体d n a 编码的2 2 个t r n a 基因零散分布于整个基因组中。 从预测的二级结构来看，除t r n a s “( a g 如外，所有t r n a 都具有典型的三叶草结 构。t r n a ”( a g n ) 中，双氢尿嘧啶( d h u ) 臂只是形成了个简单的环。t r n a 的 氨基酸接受臂，反密码子环和反密码子臂较为保守，t w c 和d h u 臂变异比较大。 4 隆额网翅蝗线粒体基因组r r n a 基因结构 隆额网翅蝗m t d n a1 6 sr r n a 基因长1 3 1 7 b p ，1 2 sr r n a 基因长8 4 2 b p ，它们 分别位于t r n a v “基因和a + t 丰富区及t r n a i - x u ( c u n ) 和t r n a v “之间。大亚 基的长度相对其它物种而言适中的，但是1 2 s 小亚基的长度却仅次于最长的 p e t r o b i u sb r e v i s t y l & 8 4 5 b p 核糖体小亚基。 5 隆额网翅蝗、非洲飞蝗和东方蝼蛄线粒体基因组比较分析 隆额网翅蝗、非洲飞蝗和东方蝼蛄的序列长度和碱基组成比较接近，但是隆 额网翅蝗和非洲飞蝗之间更加相近。这三种昆虫蛋白质编码基因序列比较发现， 细胞色素氧化酶的3 个亚基( c oi 、c o i i 、c o i i i ) 是较为保守的基因，其中c o i 是最保守的基因。n d l 、n d 4 、n d 4 l 、n d 5 、a t p 8 相对变异较大，n d 4 和n d 4 l 是1 3 种蛋白质编码基因氨基酸序列变异最大的两个基因。 1 2 sr r n a 序列较1 6 sr r n a 更保守。从序列之间的核苷酸差异可以看出1 2 s 基因比蛋白编码基因还要保守，而1 6 s 基因较细胞色素氧化酶亚基( c oi 、c o 1 i 、c o i i i ) 的进化快些，但比其他蛋白编码基因保守。蛋白质编码基因和1 2 s 基 因比较结果发现隆额网翅蝗与非洲飞蝗之间的亲缘关系较近，而1 6 s 基因则支持 隆额网翅蝗与东方蝼蛄之间分歧更小，这种结果有可能是分析过程中导入的误差。 a + t 丰富区比些蛋白编码基因序列之间的差异还小，可能是由于在a + t 丰 富区中发生了多重替换，对分析结果产生误导。所以用a _ 盯丰富区的序列数据来 比较直翅目这三个种之间的亲缘关系还有待考虑。 6 8 种多新翅类昆虫线粒体d n a 系统进化分析 将8 种多新翅类昆虫线粒体蛋白质编码基因连接成一个联合数据集。采用n j 和m p 分析方法建树，所得拓扑结构很类似，只是c t o r e n t a l i s 与 ( l m i g r a t o r i a + a c o r e a n a ) 以及s p a r e s i s e n s i s 、t e a l i f o r n i c u m 和g s c u l l e n i 分枝间 的次序不同。l m i g r a t o r i a 和a c o r e a n a 同属直翅目蝗亚目，它们之间的单系性得 到很高的b o o t s t r a p 支持( b o o t s t r a p 都是1 0 0 ) 。与它们同为直翅目属于螽亚目的东 方蝼蛄与这两个物种之间的亲缘关系比较远，在m p 树与n j 树中它的分支次序不 同。 螳( 虫修) 目的s p a r e s i s e n s i s 、竹节虫目t c a l i f o r n i c u m 和蛩蠊目g s e u l i e h i 在 n j 法和m p 法建树中都聚为一枝，但这三者之间的具体关系则不明确。在此次分 析中，蜚蠊目尸扣垤i n o s a 和螳螂目t t a m o l a 在n j 树和m p 树都以很高的自举值 聚合在一起，这与n c b 【分类基本一致。 该项目为导师黄原教授所承担的国家自然科学基金项目的重要组成成分，首 i i 次从比较及进化基因组学角度对隆额网翅蝗的线粒体基因组进行详细的基因组织 结构和序列进化的研究，可为理解线粒体基因组结构和序列进化提供重要线索和 数据，也为用完整线粒体基因组序列大规模地研究直翅目高级阶元之间的系统发 育关系奠定了基础。同时本项目研究中所设计的一套通用引物，可以成功扩增出 相互覆盖的直翅目昆虫全线粒体基因组，建立起对直翅目昆虫全线粒体测序工作 的平台，能够快速、精确地完成更大量蝗总科昆虫的全线粒体测序工作，为尽早 实现从全线粒体基因组水平完整研究直翅目系统发育关系提供重要保证。因此， 该论文在比较及进化基因组学、分子进化和分子系统学领域将具有重要的实践价 值和理论意义。 关键词隆额网翅蝗线粒体基因组基因组成与结构a + t 含量系统发育进化 i l l s e q u e n c i n ga n da n a l y s i so ft h ec o m p l e t em i t o c h o n d r i a l g e n o m eo fa r c y p t e r ac o p e a n a l i u n i a n a b s r a c tt h em i t o c h o n d r i a ld n a ( m t d n a ) ，w h i c hi st y p i c a l l yas i n g l ec i r c u l a r d u p l e xm o l e c u l ew i t hs i z er a n g i n gf r o ma p p r o x i m a t e l y15 4 1 6 3k i l o b a s e s e x i s t si n a l m o s ta l le u k a r y o t i cc e l l sw i t hh i g h l yc o p yn u m b e r s b e c a u s eo fs m a l ls i z e ， c o m p o s i t i o n a l a n dn u c l e o t i d e s e q u e n c ec o n s e r v a t i o n ，m a t e r n a li n h e r i t a n c e , a n d r e l a t i v e l yr a p i de v o l u t i o n a r yr a t e ，l a c k o fi n t e r m o l e c u l a r g e n e t i cr e c o m b i n a t i o n , e x c l u d i n gi n t r o na n di n t e r g e n i cs p a c e rs e q u e n c e ，b e i n ge a s yt oa m p l i f i c a t i o na n d a n a l y s i s ，m t d n ah a sb e e ne x t e n s i v e l yu s e df o rs t u d y i n gp o p u l a t i o ns t r u c t u r e sa n d p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sa tv a r i o u st a x o n o m i c l e v e l s w ed e t e r m i n e dt h ec o m p l e t em i t o c h o n d r i a ld n a s e q u e n c eo fa r c y p t e r ac o r e a n a ( i u s e c t a ：o r t h o p t e r a ：a r c y p t e r i d a e ) a n dc o m p a r ei tw i t ht h eo t h e rt w oo r t h o p t e r a n s p e c i e s ，l o c u s t am i g r a t o r i aa n dg r y l l o t a l p ao r i e n t a l i s t h ec o n c a t e n a t e dn u c l e o t i d e s e q u e n c e so ft h e1 3p r o t e i n c o d i n gg e n e sf r o m8p o l y n e o p t e r ai n s e c t sa n da no u t g r o u p t a x o nw a sa n a l y z e df o rr e c o n s t r u c t i o nt h e i rp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p f r o mt h es t u d y w eo b t a i n e dt h ef o l ! o w i n gc o n c l u s i o n ： 1 c o m p o s i t i o na n dg e n eo r d e r o f a c o r e a n am i t o c h o n d r i a lg e n o m e a ，c o r e a n ag e n o m e ( 1 5 ，7 8 3 b p ) c o n t a i n e dt h es a m e3 7g e n e s ( t w or r n a s ，2 2 t r n a s ，a n d13p r o t e i n s ) p l u st h ep u t a t i v ec o n t r o lr e g i o n ( 8 9 4 b p ) a sf o u n di no t h e r a r t h r o p o d s ，a n ds h a r et h ei d e n t i c a lg e n eo r d e rw i t hl o c u s t am i f n | o r 泌at o t a lo f 3 6b p o v e r l a pr e g i o n sa m o n ga ，e o r e a n am tg e n e sa r ef o u n di ne i g h tl o c a t i o n sw i t hs i z ev a r i e d f r o m1 - 8b p ，at o t a lo f1 1 4b po fi n t e r g e n i cs p a c e rs e q u e n c ei ss p r e a do v e ri n2 0 l o c a t i o n sw i t hs i z ev a r i e df r o m2 2 1b p t h ea + t - r i c hr e g i o nk n o w nf o rt h ei n i t i a t i o n o f r e p l i c a t i o nj nv e r t e b r a t e sa n di n v e r t e b r a t e si sl o c a t e db e t w e e nt h es r r n aa n dt r n a “。 g e n e s ，a n dc o n t m n st h eh i g h e s ta + tc o n t e n t ( 8 6 0 ) a n ds p a n s8 9 4b p ，w h i c hi ss h o r t e r c o m p a r e dw i n lt h a tf r o mo t h e ri n s e c t s 2 p r o t e i n - c o d i n gg e n e sa n dc o d o nu s a g e t h et o t a ln u m b e ro fc o d o n si nt h ea c o r e a n ap r o t e i nc o d i n gg e n e sw a s3 7 1 8 ， e x c l u d i n gt e r m i n a t i o nc o d o u si ne a c hg e n e ，t h en u m b e ri sc l o s et o 三m i g r a t o r i a ( 3 7 1 3 ) t h ea + tc o n t e n to ft h e1 3a c o r e a n ap r o t e i n c o d i n gg e n e si s7 5 8 w h i c hi sal i t t l e h i g h e rt h a nt h a to f l m i g r a t o r i a ( 7 7 5 ) f o u rg e n e s ( c o n 、n d 5 、n d 4 和n d l lh a v e i v a l l i n c o m p l e t et e r m i n a t i o nc o d o n l e u e i n e ( 1 3 8 8 ) ，i s o l e u c i n e ( 1 0 8 7 ) ，s e f i n e ( 9 7 1 ) ，p h e n y l a l a n i n e ( 9 2 3 ) a r et h em o s tf r e q u e n t l yu s e da n l i n o a c i d si nt h e a c o r e a n am tp r o t e i n s ，w i t hat o t a lu pt o4 3 6 9 3 t r a n s f e rr n a sa n dt h e i rs e c o n d a r ys t r u c t u r e a c o r e a n am tt r n ag e n e sa r es c a t t e r e da r o u n dt h em t d n a a l lt r n a sh a v et h e t y p i c a lc l o v e rl e a fs t r u c t u r ee x c e p tf o rt r n a s 弋a g n ) ，w h i c ht h ed i h y d r o u r i d i n e ( d h u ) a r n lf o r m sas i m p l el o o pa si ns e v e r a lo t h e rm e t a z o a ns p e c i e si n c l u d i n gi n s e c t s t r n a s p o s s e s si n v a r i a b l ea m i n o a c y ls t e m ，a n t i c o d o nl o o p ，a n da n t i c o d o ns t e m m o s to ft h e s i z ev a r i a t i o na m o n ga c o r e a n at p , n a ss t e m m e df r o ml e n g t hv a r i a t i o ni nt h et 皿ca n d d h ua r m s 4 r i b o s o m a lr n a g e n e s a si na l lo t h e rs e q u e n c e dm i t o g e n o m e s t w og e n e so fr r n a sw e r ep r e s e n ti n a c o r e a n a t h e yl o c a t e db e t w e e nt r n a t ma n dt h ea + t - r i c hr e g i o n ，a n db e t w e e n t r n a h “( c u a n dt r n a t m l ，r e s p e c t i v e l y t h el e n g t h so ft h ea c o r e a n al r r n aa n d s r r n a w e r ed e t e r m i n e dt ob e1 3 1 7b pa n d8 2 4b p ，r e s p e c t i v e l y 5 c o m p a r a t i v es t u d ya m o n ga c o r e a n a ，l m i g r a t o r i aa n dg o r i e n t a l i sm i t o g e n o m e s a c o r e a n aa n dl o c u s t am i g r a t o r i aa r em o r ec l o s e l yr e l a t e da m o n ga c o g e a b a ， l m i g r a t o r i aa n dg o r i e n t a l i si nr e s p e c t so f m i t o g e n o m e s ，a l t h o u g ht h es e q u e n c el e n g t h a n dc o m p o s i t i o nw e r es i m i l a r c y t o c h r o m eo x i d a s es u b a n i t s ，p a r t i c u l a r l yc o i ，w e r et h e m o s tc o n s e r y e dg e n e si n13p r o t e i n c o d i n gg e n e s n d l ，n d 4 ，n d 4 l ，n d 5 ，a t p 8a r e n l o l - ev a r i a b l et h a nt h eo t h e rp r o t e i n c o d i n gg e n e s ，a n dn d 4a n dn d 4 la r et h em o s t v a r i a b l ep r o t e i n c o d i n gg e n e s a m o n ga l im i t o c h o n d r i a lg e n e s 1 2 sr r n ai st h em o s t c o n s e r v e dg e n e t h ev a r i a t i o no f1 6 sg e n ew a ss i m i l a rw i t hm o s to fp r o t e i n c o d i n g g e n e se x c e p tf o rc o i ，c o i i ，a n dc o i i i s e q u e n c ea n a l y s i so ft h ep r o t e i n c o d i n gg e n e s a n d1 2 sr r n ar e v e a l e dm o n o p h y l yo fa c o r e a n a ，l m i g r a t o r i a ，w h i l e1 6 sr r n a s u p p o r t e dc l u s t e r i n go f a c o r e a n at o g e t h e rw i t ht h eg o r i e n t a l i s 6 p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s t op l a c et h ea c o r e a n am t d n as e q u e n c ei n p e r s p e c t i v et oo t h e rp o l y n e o p t e r a i n s e c tm i t o g e n o m e sa n dt ok n o wt h eu t i f t yo fm t d n as e q u e n c e sf o ri n s e c tp h y l o g e n y , a d a t as e tc o n t a i n i n gt h en u e l e o t i d es e q u e n c e so fa l l1 3m i t o c h o n d r i a lp r o t e i n c o d i n g g e n e sw a sg e n e r a t e d t h em pa n dm la n a l y s e sg e n e r a t e dd i f f e r e n tt o p o l o g i e sw i t h b r a n c h i n go r d e ra m o n gg o r e n t a l i s ，m i g r a t o r i a + a c o r e a n a ) ，a n ds p a r e s i s e n s i s ， t c a l i f o r n i c u m g s c u l l e n i v t h em o n o p h y l yo fc a e l i f e r a ，r e p r e s e n t e db ya c o r e a n aa n dl m i g r a t o r i a t l i g h l y s u p p o r tb yd a t a g o r e n t a l 捃b e l o n g e dt oe n s i f e r ah a sd i f f e r e n tp o s i t i o ni nn ja n dm p t r e e s n ja n dm pm e t h o d sb o t hg r o u p e ds p a r e s i s e n s i s ，z c a l i f o r n i c u m ，a n dg s c u l l e n i t o g e t h e r , b u tt h er e l a t i o n s h i p so f t h e s eo r d e r sw i t h i ng r o u pd i f f e r e n ti nt w ot r e e s t a k e n ja n dm pt r e ei na c c o u n t ，w ec a nc o n c l u d et h a tp 丘l i g i n o s aa n dz t a m o l ai sas i s t e r g r o u pa sc l a s s i f i c a t i o ni nn c b i t h i ss t u d yi sa ni m p o r t a n tp a r to fp r o f e s s o rh u a n g sp r o j e c ts u p p o s e db yn a t u r a l s c i e n c ef o u n d a t i o no fc h i n a i t st h ef i r s tt i m ed e s c r i b e do r g a n i z a t i o na n ds e q u e n c e e v o l u t i o no f a c o r e a n am i t o c h o n d r i a lg e n o m ei nd e t m li nt h ev i e wo fc o m p a r a t i v ea n d e v o l u t i o n a r yg e n o m i c s i tp r o v i d e si m p o r t a n tc l u e sa n dd a t af o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ho n m i t o c h o n d r i a l o r g a n i z a t i o n ，s e q u e n c ee v o l u t i o n ，a n da l s om a d ef o u n d a t i o nf o r o r t h o p t e r aa d v a n c e dt a x ap h y l o g e n e t i ca n a l y s i si nl a r g es c a l e m e a n w h i l e ，i ti sp r o v i d e s as e to f p c r p r i m e r st oa m p l i f yo r t h o p t e r ai n s e c t sm i t o c h o n d r i a lg e n o m e a l lo ft h e s e w i l li n s u r et h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i s0 1 2o r t h o p t e r ab e c a m ef a s t e r s ot h es t u d yw i l l m a k ec o n t r i b u t i o no nc o m p a r a t i v ea n de v o l u t i o n a r yg e n o m i c s ，m o l e c u l a re v o l u t i o na n d p h y l o g e n e t i c s ， k e y w o r d ：a r c y p t e r ac o r e a n a ；m i t o c h o n d r i a lg e n o m e ；g e n o m ec o m p o s i t i o na n d o r g a n i z a t i o n ；a + tc o n t e n t ；p h y l o g e n e t i c s ；e v o l u t i o n v i 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：滥日期：塑亡匿 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：童险日期：醴! ：竖 第一部分动物线粒体基因组概述 物种的形态解剖特征、生物学性状以及生物地理信息等是传统的昆虫分类学 和系统发育研究的主要依据。由于这些分类依据比较直观，容易得到，在大多数 情况下能清晰的反映出个物种的分类地位或系统发育关系。但传统方法难以解 决近缘种、生态型和高级分类阶元之间的关系等方面的问题。 核酸( d n a 和r n a ) 作为生物体内的生物大分子之一，携带了生物的全部遗 传信息。它们在生物进化过程中不断积累着变异，能够提供物种进化历史的精确 信息。而且核酸的进化具有一定的规律性，可以用数学模型来描述其变化，由此 来比较生物类群间的关系，特别是在亲缘关系较远的生物类群间，这是分子特征 与形态特征最重要的区别之一。另外，生物的基因组是由较长的核酸序列组成， 比形态性状包含的系统发育信息多的多。因此，利用分子数据有望澄清经典分类 难以解决的难题。 基因组学的兴起，为全面系统地进行核酸研究提供了新的契机。截止2 0 0 6 年 3 月被g e n b a n k 序列数据库收集的有记录的物种数达2 0 万余种，己测序的生物基 因信息量就已超过1 0 0 g ( n c b i ) 。已有2 6 种古细菌、2 8 8 种真细菌和2 0 种真核生 物的全部基因组测序工作已经完成。基因组学的发展必将给生物学和人类社会带 来巨大的冲击，为探讨生命起源与进化，基因表达与调控等生物学难题提供新的 证据。 线粒体基因组作为核外遗传信息系统，具有小型性、半自主性和多态性等特 点。有关线粒体基因组的研究将有利于研究诸如：基因结构与功能、基因表达的 时空调控、核质互作、分子进化规律、物种的起源与进化以及线粒体的起源等生 物学重要课题 1 l 。所以自1 9 6 3 年n a s s 发现线粒体基因以来伫】，越来越多生物学家 对m t d n a 的结构、组成、复制、转录以及基因表达调控等方面进行了研究。同时， 线粒体d n a 也被广泛地用于群体遗传学、系统学和生物地理学等学科中。上世纪 7 0 年代m t d n a 的限制性片段长度多态性技术开始在脊椎动物和无脊椎动物的种 群结构研究中应用，到了8 0 年代后期，对m t d n a 部分序列及全序列的研究日益 成为动物分子系统学研究的重要手段。以下介绍动物m t d n a 结构和遗传特点及 其在分子系统中的应用情况。 1 1 动物线粒体基因组的基本特征 线粒体是真核生物的胞质细胞器。一般未分化的细胞、淋巴细胞、表皮细胞 内的线粒体数目较少，而肝细胞、胃壁细胞、肾脏细胞中的线粒体数目较多。线 粒体生长和分化阶段分别接受核d n a 和自身d n a 两个独立遗传系统的控制，因 此，它不是一个完全自我复制的独立实体p 】。从a n d e r s o n 等( 1 9 8 1 ) 测定人线粒 体基因组的全序列，已完成8 0 0 余种生物的线粒体基因组全序列测定，在n c b i g e n e b a n k 数据库中收录的线粒体基因组序列中，后生动物7 5 7 种，真菌4 0 种，植 物1 3 种。 1 1 1 动物线粒体基因组的大小 1 1 1 1 分子较小 相对于其他类型生物，多细胞动物线粒体基因组最小，绝大部分都在1 5 。7 1 9 5k b 的范围内。已发表的全序列测定工作表明，脊椎动物线粒体基因组的长度 大多在1 6k b 左右，但目前已有人发现鸟类中有的m t d n a 可达到2 3 5k b 4 。海 扇( p l a c t o p e c t e nm a g e l l a n i c u s ) 拥有大于3 0 k b 的基因组【5 j ，是一般动物的两倍， 而且还有较大的个体间差异( 高达7 k b ) 。p l a c t o p e c t e n 中基因组的个体间差异可能 是由于某些片断的重复数目不等所致，其大小则可能是由于整个原来的基因组倍 增所致( 未能证实 5 】) ，因此也有可能是含有较多的非编码序列) 。 1 1 1 2m t d n a 长度有变异 多细胞动物线粒体基因组的大小是所有类型生物中变异最少的。尽管这种变 异可以在不同种、同种不同个体间以及同一个体内存在，但这种长度差异并不是 因为基因数目，主要由于重复序列的存在一】。 1 1 2 线粒体基因组的基因组成 动物m t d n a 是一种环状的共价闭合的超螺旋分子，包括与线粒体内膜相结 合的酶复合体的亚单位：细胞色素b 、2 个a t p 酶的亚单位、3 个细胞色素c 氧 化酶的亚单位( c oi ，i i 和i i i ) 、7 个n a d h 还原酶复合体的皿单位、2 个r r n a 基因、2 2 个t r n a 基因和一段控制区( d l o o p ) 组成。但国内已有报道，通过酶学 原理在小鼠线粒体d n a 中初步发现了新的r - l o o p 结构i7 1 。m t d n a 的两条链因 所含碱基成分不同，一条轻链，一条重链，其中轻链编码n d 6 和8 种t r n a ，其 余基因由重链编码。绝大多数的蛋白编码基因及两个r r n a 基因模板均在重链上， 基因、转录物和产物呈现完全的共线性关系哺】。 1 1 2 1 蛋白质编码基因 线粒体上基因排列方式极为紧凑，无内含子，基因间分隔常少于1 0 b p 。多数 蛋白质基因之问有t r n a 基因隔开，只有n d 4 l n d 4 、a t p a s e 6 a t p a s e 8 、 a t p a s e 6 c o i i 、n d 5 n d 6 ( 在哺乳动物m t d n a 中分别由l m 链编码) 基因紧密 相连，甚至彼此重叠。对基因组转录的产物分析发现，人的重叠基因n d 4 l n d 4 和鸡的重叠基因a t p a s e 6 a t p a s e 8 分别只有一个转录本 9 】。基因编码也有不同于核 2 d n a 的方式：启动子和终止子采用极为压缩的方式进行连接，有时甚至重叠多个 碱基，有报道认为是因为r n a 自我剪接的结果。不同动物m t d n a 相应基因序列 的比较显示，c y tb 、c oi 、c o i i 、c o i i i 基因最保守，同源性最高，a t p a s e 6 、 a t p a s e 8 和n d 基因变异比较大。 在已测序的线粒体蛋白质基因中，翻译起始密码子的使用比较一致。a t a ， a t g 是最常用的，g t g 是真核生物线粒体基因组特有的起始密码子，如：鱼和鸡 的c oi 基因，鼠的n d l 、a t p a s e 8 基因，果蝇的n d 5 基因等都是以g t g 作起始 密码子f l o 】。另外，蜜蜂的n d 2 基因的起始密码子是a t c ，这是少见的。还有些生 物线粒体基因组以a t t 为起始密码子。线粒体蛋白质基因的终止密码子分为两类： ( 1 ) 完全终止子，为密码子t a a 和t a g 。( 2 ) 不完全终止子，只有t 或t a ， 另外所需的a 推测出由初级转录本的p o l y a 尾提供。终止密码子的使用在不同种 类中存在一些差异，完全终止子t a a 和t a g 较常见，a g a 和a g g 少见，以t a 或t 不完全终止子结尾的基因各物种有所不同 1 l 】。 动物线粒体基因组遗传密码的使用存在偏向性( b i a s ) 。密码子的第三位碱基 为a 、c 的比例明显高于g 、t ，其中a 的比例最高，在3 3 4 4 2 2 之间，g 最 低，在3 8 8 ，9 之间。另外，密码子的第二位碱基为嘧啶的比例( 6 8 o 左右) 明显高于嘌呤，由于n y n 类型的密码子多编码疏水氨基酸，所以嘧啶的偏向性直 接反映了线粒体基因组编码的蛋白质氨基酸组成中疏水氨基酸的偏向性，另外这 些蛋白质都是与线粒体内膜结合的呼吸链组分，因此疏水氨基酸的偏向性与其功 能是相适应的 1 2 - 1 8 】。 1 1 2 2t r n a 基因 线粒体基因组的解码是由一个很小的t r n a 系统完成，而不象在核基因组摆动 假说中所要求的3 2 个。动物线粒体基因组含有2 2 个t r n a 基因，可以满足线粒体 蛋白质翻译中所有密码子的需要。h 一链编码的t r n a 基因散布于蛋白质基因和 r r n a 基因之间，相邻基因间隔1 3 0 个碱基或紧密相连，甚至重叠。一般t r n a m “、 t r n a “8 、t r _ _ n a l “等保守性最高( 8 0 的同源性) ，而t r n a 8 盯的变异最大，同源 性只有5 4 6 4 t “j 。 线粒体t r n a 也能形成三叶草型二级结构，含有t o p 的氨基酸接受臂，5 b p 的 t 姗c 臂，反密码子臂及4 b p 的双氢尿嘧啶( d h u ) 臂，各臂碱基对存在高比例的 错配。线粒体t r n a3 一端与核t r n a 一样也不编码一c c a ，而在转录后经酶的作用 加上。氨基酸接受臂和反密码子环较保守，反密码子环由7 个碱基组成，其中包 括3 个碱基的反密码子。t 皿c 环和d h u 环变异大，t 皿c 环缺少t 5 4 一皿一c p u a 序 列，d h u 环碱基数目明显减少，如七鳃鳗t r n a 跏的d h u 环只有一个碱基【1 7 】， 这可能是正确终止仅有两个r r n a 基因的转录本转录所必需的。例外的是t r n a t * ” 的d h u 环最保守，甚至与虹鳟的与人的序列完全相同。t r n a s “的d h u 在鱼中保 守，而在其他大多数动物中丢失口4 1 。鲤鱼、爪蟾、鲸、鸡、小鼠、牛和人等6 种 脊椎动物t r n a p u 。的d h u 臂存在一段1 3 b p 的保守区，而这一区域在其他2 1 种线 粒体t r n a 中最不保守，暗示了t r n a p k 在功能上可能存在特殊性 1 9 l 。 1 1 2 3r r n a 基因 哺乳动物线粒体d n a 的1 2 s 和1 6 sr r n a 基因定位于h 一链t r n a p l l 。和t r n a k “ 基因之间，中间以t r n a v “基因隔开。在无脊椎动物中，由于t r n a 基因排列位置 的变异，使r r n a 基因的位置也发生变化，但1 2 s 和1 6 sr r n a 基因之间仍以 t r n a v a 基因间隔。 r r n a 基因的二级结构很保守，形成多个大小不一的茎环结构。环的核苷酸替 代率高于茎，而且c 。t 转换是一种常见的形式。茎区的碱基替换大多为补偿突变， 以保证碱基对的存在，维持二级结构。茎和环的碱基组成表现出偏向性，即环富 含a ，而茎富含g 。这也可以解释环是r r n a 与蛋白质结合的部分，和蛋白质发生 疏水相互作用，而a 是四种碱基中极性最小的，多位于与蛋白质结合的部位：g c 碱基对间的氢链强于a u 和g - u 对，在茎区更有利于维持r r n a 的二级结构 2 0 - 2 2 j 。 对线粒体基因组转录产物的研究发现，r r n a 的